MP v2.3 - Immuno Concepts

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RELISA® ENA
Multiparameter
Antibody Screening Test
Sm RNP SSA SSB Scl-70 Jo-1
For Professional Use
Pour l’Usage Professionnel
Per Uso Professionale
Para El Uso Profesional
Für Professionellen Gebrauch
För yrkesmässigt bruk
English
2
Français
7
Italiano
12
Español
17
Deutsch
22
Svensk
27
Bibliography
32
Bibliographie/Riferimenti
Bibliografici/Bibliographie/Bibliografi
RELISA® ENA
SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST
After washing to remove unbound antibody and other
serum proteins, the wells are incubated with goat antihuman antibodies that are labeled with horseradish
peroxidase. The horseradish peroxidase-conjugated
antibody preparation that is included in the test system
is specific for human IgG heavy and light chains.
Intended Use: This is an enzyme immunoassay (EIA) test
system for the detection of antibodies to the extractable nuclear antigens Sm (Smith), RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70, and Jo-1 in human serum. The results from this
assay can be used as an aid in the diagnosis of autoimmune diseases.
After incubation with horseradish peroxidase conjugate,
if results are positive, a stable three part complex is
formed. This complex consists of horseradish peroxidase-conjugated anti-human antibody bound to human anti-ENA antibody, which is bound to the antigen
stabilized on the plastic surface.
Antibodies to extractable nuclear antigens (ENA) have
been associated with several autoimmune syndromes,
and appear to be of diagnostic and/or prognostic
significance in systemic sclerosis (1, 2), mixed connective tissue disease (3-5), Sjögren’s syndrome (6, 7),
polymyositis (8), dermatomyositis (9), systemic lupus
erythematosus (5), and rheumatoid arthritis (10). The
antinuclear antibody (ANA) test has been used as
a screen for these antibodies, but the ANA does not
indicate the specificity of the antibody, and antibodies
to some ENA do not show a positive ANA test (11, 12).
Thus, secondary confirmatory testing for antibodies to
ENA is highly recommended (13).
After another washing step, this complex is detected
by adding a solution of tetramethylbenzidine (TMB)
and H2O2 as a chromogenic substrate. The degree of
color development in each well is proportional to the
concentration of anti-ENA antibodies in each serum
sample. Each microwell is read in a spectrophotometer
at 450 nm.
Sm RNP SSA SSB Scl-70 Jo-1 MULTIPARAMETER
ANTIBODY SCREENING TEST
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE
SYSTEM COMPONENTS (MATERIALS PROVIDED)
Storage: All components should be stored under refrigeration between 2-10°C. Do not freeze.
Stability: All components remain stable at least 12
months from date of manufacture. Do not use any
component beyond its expiration date.
The Sm (Smith) antigen was identified in 1966 by Tan
and Kunkel as a saline soluble, non-histone glycoprotein, which is not dependent on DNA or RNA for its
antigenicity (14). Antibodies to the Sm antigen are
considered a specific serologic marker due to their high
degree of specificity for systemic lupus erythematosus
(SLE). These antibodies are seen in up to 30% of SLE
patients, and have been associated with active renal
disease and cerebritis (15-17).
REACTIVE REAGENTS
Extractable nuclear antigen coated microwell strips:
Catalog No. 7008-09. Eight well strips coated with
stabilized solutions of affinity purified extractable
nuclear antigens. One eight well strip is sealed in each
individual foil pouch.
Antibodies to Sm antigen are frequently found in
conjunction with antibodies to U1-RNP in the sera of
patients with SLE (18, 19). In contrast to antibodies to
Sm antigen, antibodies to RNP are not considered a
specific serologic marker because they are found in
patients with a variety of rheumatic diseases including
SLE, scleroderma, Sjögren’s syndrome, and rheumatoid
arthritis. However, high levels of antibody to RNP are
highly associated with an overlap syndrome called
mixed connective tissue disease (MCTD). Patients with
MCTD are characterized by a combination of clinical
features seen in SLE, scleroderma, and polymyositis.
These patients frequently demonstrate a good response
to corticosteroid treatment and have a lower incidence
of renal disease when compared to patients with SLE
(20, 21).
SSA and SSB were originally described as nuclear RNAprotein antigens in patients with Sjögren’s syndrome
(6, 7). Ro and La were described as cytoplasmic RNAprotein antigens in patients with SLE (22, 23). It is now
widely accepted that SSA and Ro are analogous, SSB
and La are analogous, and these antigens are found in
both the nucleus and cytoplasm. Antibodies to SSA/Ro
alone or SSA/Ro and SSB/La are found in up to 62% of
patients with subacute cutaneous lupus (24), and in 85%
of patients with Sjögren’s syndrome who develop vasculitis (25). Antibodies to SSA/Ro alone occur in patients
who have a homozygous deficiency of the C2 complement fraction (26), in primary biliary cirrhosis patients
who develop Sjögren’s syndrome (27), and in up to two
thirds of patients with “ANA negative SLE” (28).
The Scl-70 antigen has been identified as a cellular enzyme, DNA topoisomerase I, an auxiliary protein to DNA
polymerase delta (29). Antibodies to Scl-70 have been
reported in up to 56% of patients with progressive systemic sclerosis (PSS), particularly the subset of patients
with diffuse scleroderma (30). These autoantibodies are
considered a marker for PSS, since they are not seen in
other connective tissue diseases.
Antibodies to Jo-1, which is the cellular enzyme histidyl
tRNA synthetase, are found in 25-30% of patients with
polymyositis or dermatomyositis, but not in other myopathies (11, 31). Anti Jo-1 antibodies have also been
shown to have a high association with interstitial lung
disease seen in conjunction with myositis (31).
Sample Diluent: Catalog No. 7015 (15 ml). Proprietary
buffered sample diluent used to dilute patient samples.
Enzyme Antibody Reagent - Human IgG heavy and light
chain specific: Catalog No. 7009-09 (6 ml). Goat antihuman IgG (H&L) conjugated to horseradish peroxidase
(HRP). Reagent is ready to use.
Substrate Solution: Catalog No. 7035 (6 ml). HRP-specific enzyme substrate solution, containing stabilized
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) and hydrogen
peroxide (H2O2). Reagent is ready to use.
Stopping Reagent: Catalog No. 7033 (6 ml). Proprietary stopping reagent for Immuno Concepts EIA test
systems. Reagent is ready to use. CAUTION: Corrosive.
This reagent contains hydrochloric and sulfuric acids
(less than 3% each, by volume), and should be handled
with care. Keep out of the reach of children. In case
of contact with eyes, flush immediately and thoroughly
with water and consult a physician. Never add water
to this reagent.
Multiparameter ENA Positive Control: Catalog No. 702109 (1 ml). Human positive control serum that contains
antibodies to Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, and Jo-1
antigens. This serum is at working dilution and is ready
to use. This reagent contains 0.1% sodium azide as a
preservative.
ENA Negative Control: Catalog No. 7031 (1 ml). Human
negative control serum that does not contain antibodies to Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, or Jo-1 antigens.
This serum is at working dilution and is ready to use. This
reagent contains 0.1% sodium azide as a preservative.
NON-REACTIVE COMPONENTS
Holder for microwells
Wash Buffer Solution:
PBS Buffer: Catalog No. 1011. Phosphate-buffered
saline powder
(0.01 M, pH 7.4 ± 0.2). Each pouch contains sufficient
buffer powder to make one liter. (Two pouches of buffer powder are supplied for each 96-microwell plate in
complete test kits).
PRINCIPLE OF THE TEST
Wash Buffer Concentrate: Catalog No. 1031 (10 ml). 5%
Tween 20 solution to be used in the wash buffer. (Two
vials of buffer concentrate are supplied for each 96microwell plate in complete test kits).
This test is a qualitative indirect EIA. Stabilized preparations of affinity-purified extractable nuclear antigens
have been coated onto the surface of the microwells
to serve as an antigenic substrate in this system. Dilutions of the patient samples are placed in the microwells and incubated, allowing specific antibodies in the
sample to react with the antigen on the solid phase.
Preparation: Dissolve one pouch of buffer powder in
one liter of deionized or distilled water. Add the entire
contents of one bottle of Wash Buffer Concentrate
2
to the dissolved PBS. Mix well and store refrigerated
between 2-10°C for up to 4 weeks or until signs of
contamination or other visible changes occur. Wash
buffer solution must be at room temperature (19-23°C)
before use.
of hemolysis, icterus, lipemia, or microbial growth
should not be used because these conditions may
cause aberrant results. Specimens containing visible
particulate matter should be clarified by centrifugation
before testing.
ADDITIONAL MATERIAL REQUIRED (BUT NOT PRO-
Storage: Sera may be stored at 2-10°C up to one week.
If testing is further delayed, sera should be stored frozen
at -20°C or lower. Serum should not be stored in a selfdefrosting refrigerator or freezer.
VIDED)
Volumetric precision pipettors to deliver 25-1000 µl
volumes
Squeeze bottle for delivering wash buffer solution to
microwells, or an automated or semi-automated
wash system for microwells
One liter container for PBS wash buffer solution
Deionized or distilled water
Plate reading spectrophotometer capable of reading absorbance at 450 nm
Test tubes to prepare serum dilutions
Bibulous paper or paper towels
Multichannel pipettor capable of delivering to 8 wells
Disposable latex gloves
Lab timer
CAUTION: Repeated freeze/thawing of patient samples
may yield false positive or false negative results.
GENERAL PROCEDURAL NOTES
1. It is extremely important to have all kit components
and serum samples at room temperature (19-23°C)
before use. A full liter of wash buffer may require
several hours to warm to 20°C after removal from
the refrigerator. Incubation temperatures above
or below the stated range may cause inaccurate
results. Return unused samples and reagents to
refrigerated storage after use.
2. Mix reagents well before use by gentle inversion.
Do not vortex or shake reagents. Avoid foaming.
3. When preparing sample dilutions, pipette tips
should be wiped prior to dispensing serum into
specimen diluent. Excess sample adhering to the
outside of the pipette tip will affect results.
4. The use of a multichannel pipettor is recommended
because it provides more uniform reagent dispensing, incubation times, and reaction times.
5. Adequate washing of wells is extremely important.
Inadequately washed wells will exhibit high background values, and may show false positive values.
For manual washing, aspirate the contents of the
wells, then fill each well with wash buffer solution.
Avoid cross-contamination of the wells, particularly in the first wash after aspiration. Drain all of
the wash buffer from the wells by inverting, then
shaking residual wash buffer from the wells with a
sharp “snapping” motion of the wrist. Repeat the
filling and draining steps for a total of 3 to 5 washes.
The wells should then be rapped vigorously on a
paper towel or other absorbent material to remove
all traces of residual wash buffer. The use of an
automated microwell washing system will assure
consistent washing of the wells, and is recommended.
NOTE: Due to the various types of wash techniques
and automated systems, the number of washes
may be adjusted to obtain optimal results. Each
laboratory should determine the most efficient
number of washes for their washing system.
6. Inadequate removal of residual wash buffer can
cause inconsistent color development. Microwell
strips should be blotted on absorbent paper or
towels to minimize residual wash buffer.
7. Timing of all steps is critical. All serum samples
should be diluted before beginning the procedure,
and they must be dispensed into the microwells
in as short a period of time as possible (not more
than five minutes). Batch sizes should be set so that
specimen handling can be accomplished comfortably within this time period. The use of a multichannel pipettor facilitates the handling of samples and
reagents, and is recommended.
8. With the exception of the last incubation (substrate
solution), the start of each incubation period begins
with completion of sample or reagent dispensing.
The substrate solution incubation must be exactly
five minutes for each well. All samples and reagents should be dispensed in the same sequence
and at a constant rate.
PRECAUTIONS
1. All human source materials used for this product
have been tested and found negative (not repeatedly reactive) for antibodies to Human immuno-deficiency virus-1 (HIV-1), Human immunodeficiency
virus-2 (HIV-2), hepatitis C virus (HCV), and for hepatitis B surface antigen (HBsAg) by FDA approved
methods. However, no test method can offer
complete assurance that HIV-1, HIV-2, hepatitis C,
hepatitis B, or other infectious agents are absent.
Thus, all kit materials should be handled in the same
manner as potentially infectious materials.
2. All patient samples should be handled at the Biosafety Level 2 as recommended for any potentially
infectious human serum or blood specimen in the
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health Manual: Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. Dilution of the components or substitution of components other than those provided in this system
may yield inconsistent results.
4. Sodium azide (0.1%) is used as a preservative in the
control sera. Sodium azide may react with lead or
copper plumbing and form highly explosive metal
azides. When disposing of reagents, flush with
ample volumes of tap water to prevent potential
residues in plumbing. Sodium azide is a poison and
may be toxic if ingested.
5. This kit is for in vitro diagnostic use.
6. Never pipette by mouth and avoid contact of
reagents and specimens with skin and mucous
membranes. If contact occurs, wash with a germicidal soap and copious amounts of water.
7. Do not smoke, eat, or drink in areas where specimens or kit reagents are handled.
8. Avoid splashing or generation of aerosols at all
times.
9. Incubation times and temperatures other than
those specified may give erroneous results.
10. Cross contamination of reagents or samples may
give false results. Samples must remain confined to
microwells during testing.
11. Reusable glassware must be washed and thoroughly rinsed free of detergents prior to use. All
glassware must be clean and dry before use.
12. Bring all reagents, microwells, and specimens to
room temperature (19-23°C) prior to use.
13. Wear disposable latex gloves when handling specimens and reagents, and wash hands thoroughly
afterwards.
14. Microbial contamination of reagents or samples
may give false results.
15. The stopping reagent is corrosive and may cause
burns. This reagent contains hydrochloric and
sulfuric acids (less than 3% each, by volume), and
should be handled with care. Keep out of the
reach of children. In case of contact with eyes,
flush immediately and thoroughly with water and
consult a physician. Never add water to this
reagent.
INTERPRETATION OF RESULTS
QUALITY CONTROL
1. The blank control well should have an absorbance
value of less than 0.250. Blank absorbance values
greater than 0.250 indicate inadequate washing, or
contamination of reagents.
2. The absorbance reading of the blank control
well (row G) is subtracted from the absorbance
readings of the RELISA® Procedure Check (RPC)
well (row H) and each of the antigen wells (rows
A through F). Net values less than zero are considered to be zero values.
3. The RELISA® Procedure Check (RPC) well (row
H) should have a net absorbance greater than
0.300. Absorbance values less than 0.300 indicate
inadequate color development, and an invalid run.
Inadequate color development is usually due to
the use of cold reagents or incorrect timing of one
SPECIMEN COLLECTION
Collection: Serum is the preferred specimen. Approximately 5 ml of whole blood should be collected aseptically by venipuncture using a sterile vacuum collection
tube or other suitable collection system. Allow blood to
clot at room temperature (19-23°C). Serum should be
separated from the clot by centrifugation as soon as
possible to minimize hemolysis.
Interfering Substances: Sera exhibiting a high degree
3
4.
5.
6.
7.
or more steps of the assay. Allow reagents to warm
to room temperature (19-23°C), and repeat the run
with particular attention paid to the timing of all
steps.
Net absorbance values are each multiplied by 100
to obtain the value for each antigen in ENA Units.
The positive control serum is a pool of human serum
that contains antibodies to all six autoantigens in
this test. Each antigen well should show a value of
30 ENA Units or more.
The negative control serum is a pool of human
serum that does not contain antibodies to any of
the six autoantigens in this test. Each antigen well
should show a value of less than 20 ENA Units.
Each laboratory should establish the frequency
for running positive and negative control sera,
based on the frequency of patient tests and the
laboratory’s experience with this assay.
negative for antibodies to the other antigens. Based on
these data, the normal cut-off values were established
as less than 20 ENA Units. Good laboratory practice
dictates that each laboratory must establish its own
normal ranges based on its patient population and
other local factors.
LIMITATIONS OF TEST
INTERPRETATION OF PATIENT RESULTS
1. This is a qualitative assay. The levels of antibody
detected have no known clinical significance and
the Unit values obtained in this assay are designed
merely to separate patients into the following three
broad groups. Patient sample wells that have
calculated values greater than 30 ENA Units are
considered to be positive. Patient sample wells
that have calculated values less than 20 ENA Units
are considered to be negative. Values between 20
Units and 30 Units are considered to be borderline
positive and should be repeated. Each laboratory
must establish its own reference range and cut-off
values based on the population of patients that are
being tested. Unit values are affected by patient
factors, mechanical considerations (such as pipetting precision and accuracy), and assay conditions
(such as temperature and timing of steps.)
2. The Sm and Sm/RNP wells are used together to
determine the presence of these two autoantibodies. If the Sm/RNP well is positive, and the Sm well is
negative, the patient has antibodies to RNP. If both
wells are positive, with approximately equal values,
the patient has antibodies to Sm. If both wells are
positive, and the Sm/RNP well is 30 ENA Units or
more higher than the Sm well, it is indicative of the
presence of both Sm and RNP autoantibodies. The
presence of both antibodies can be confirmed
using Immuno Concepts AUTO-ID® immunodiffusion
system, catalog number 6030.
3. The other wells are coated with affinity purified
monospecific antigens and react only with the
homologous antibody. However, patient sera with
multiple antibody specificities are commonly seen
in SLE and other autoimmune syndromes, so an
individual serum may show a positive reaction in
more than one well.
4. The wells are coated with affinity purified antigens
in the following order, from top (well A, and the
solid tab end of the strip) to bottom (well H, and the
notched tab end of the strip):
REPORTING OF RESULTS
PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The Immuno Concepts RELISA® Screening Assay was
compared to other similar ELISA assays in commercial
distribution; to double immunodiffusion and counterimmunoelectrophoresis tests done in reference
laboratories; and to immunoblotting (Western Blot)
results obtained with an in-house method. The results
of all methods and the clinical diagnosis of the patient
were considered in determining the expected or “correct” results for each sample tested. Based on these
comparisons, the data in Table 2 were obtained.
The discrepancies in specificity are attributed to the
increased sensitivity of ELISA assays in comparison to
“traditional” methods such as counterimmuno-electrophoresis and immunodiffusion.
CROSSREACTIVITY
Seven samples were used for crossreactivity studies.
These samples were well-characterized by Western
Blot, CIE, and immunodiffusion as monospecific sera for
each of the autoantibodies in the RELISA® Screening
Test. No cross-reactivity was noted in any of these
samples. See table 3.
REPRODUCIBILITY
For each of the six antigen specificities, six samples were
run on three different lot numbers of antigen strips, on
three different occasions. Two of the samples were
negative, but close to the 20 ENA Unit cut-off value;
two samples were positive, but close to the 20 ENA Unit
cut-off value; and two samples were clearly positive
above the 30 ENA Unit level. In no case did a negative
sample show positive results; all of the “borderline” positives consistently gave results between 20 and 30 ENA
Units; and the clearly positive samples consistently gave
clearly positive results.
��
��
��
��
��
��
��
��
Results should be reported as positive or negative for
the corresponding antibodies to extractable nuclear
antigens.
The�levels
��
� ��of antibodies have no known clinical significance.
��
��
EXPECTED VALUES
��
�� of� ��
The incidence
autoantibodies to various nuclear
��
� depending
� ��
antigens
varies
upon the patient popula��
� � ��
tion, and
the incidence
of clinical rheumatic diseases in
that population.
association
of the antibodies with
�� The
��
��
specific rheumatic ��
diseases��
is summarized in table 1.
REFERENCE RANGE
The reference range was established by testing sera
��
� � ��
from 206
healthy blood
donors, 105 females and 101
males, none
of whom
had any known history of rheu��
� � ��
matic diseases.
��Additionally,
� � ��data were obtained from
143 rheumatic disease patients who had antibodies
��
to one or more of the antigens in this assay, but were
��
��
1. Diagnosis cannot be made on the basis of antibodies to extractable nuclear antigens alone. The
physician must interpret these results in conjunction
with the patient’s history and symptoms, the physical findings, and other diagnostic procedures.
2. Treatment should not be initiated on the sole basis
of a positive test for antibodies to extractable
nuclear antigens. Clinical indications, other laboratory findings, and the physician’s clinical impression
must be considered before any treatment is initiated.
3. Some patients with autoimmune diseases may have
undetectable or insignificant levels of antibodies to
extractable nuclear antigens, and some individuals
may have high levels of antibodies to extractable
nuclear antigens, but little or no evidence of clinical
disease. The physician must interpret the results of
tests for antibodies to extractable nuclear antigens
in conjunction with the patient’s history and symptoms, the physical findings, and other diagnostic
procedures.
4. The levels of antibody detected with this test system
do not necessarily indicate severity or duration of
disease.
4
TABLE 1
Antibodies to:
Sm
Disease Association:
Highly specific marker antibody seen in 25-30% of SLE patients
U1-RNP
Mixed Connective Tissue Disease >95%; SLE 35%; lower frequency in
SSA/Ro
SSjögren's syndrome 60-70%; SLE 50%
discoid lupus or progressive systemic sclerosis (PSS)
SSB/La
Scl-70
Jo-1
Sjögren's syndrome 40-50%; SLE 15%
Highly specific marker antibody seen in 15-20% of PSS patients
Highly specific marker antibody seen in 25-30% of patients with
polymyositis or dermatomyositis
TABLE 2
Anticorps Associattions cliniques:
dirigés contre:
��
��
��
��
��
��
��
Sm
Anticorps marqueur extrêmement spécifique observé chez 25 à 35 %
��
U1-RNP
��
��
SSA/Ro
��
SSB/La
��
Scl-70
��
des patients atteints de LED
��
��
��
Connectivité mixte > 95 %, LED 35 %, fréquence plus faible en cas de
��
��
��
lupus discoïde ou de sclérodermie généralisée
��
��
��
Syndrome de Sjögren 60-70 %, LED 50 %
��
��
��
Syndrome de Sjögren 40-50 %, LED 15 %
��
��
��
��
��
��
des patients atteints de sclérodermie généralisée
Jo-1
��
��
��
ou de dermatomyosite
des patients atteints
de polymyosite��
TABLE 3
��
��
��
��
��
Anticorpi
Associazione con patologie:
diretti
contro:
��
��
�
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Sm
Anticorpo
specifico visto
nel 25-30%
di pazienti��
��
�� marcatore
��altamente
��
��
��
��
��
�
��
con SLE
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��U1-RNP
�� Patologia
�� mista del
��
��
��
�� frequenza
��
tessuto connettivo
>95%;
SLE 35%; minore
��
��
�
��
��
��
��
��
��
��
nel lupus discoide o nella sclerosi progressiva sistemica (PSS)
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Sindrome di Sjögren 60-70%; SLE 50%
��SSA/Ro
��
��
��
��
��
��
��
Sindrome
15%
SSB/La
��
��
�� di Sjögren
��40-50%; SLE
��
��
��
��
��
��
��
Scl-70
Anticorpo marcatore altamente specifico visto nel 15-20% di pazienti
��
��
��
��
con PSS
��
Anticorpo marcatore
altamente
specifico
visto
�� con
��
�
��
� nel 25-30% di pazienti
��Jo-1
o dermatomiosite
��
��
�
�� polimiosite
��
��
��
��
��
��
��
�
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Anticuerpos
��
Asociación
��
anti:
�� a enfermedades:
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
�
��
��
�� marcador
��
�� que��
��
Sm
Anticuerpo
muy específico
se��
observa
en el
25-30% de ��
los
��
��
��
��
��
��
��
pacientes con LES
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
U1-RNP
Enfermedades mixtas
del tejido conjuntivo
>95%; LES 35%; menor
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
frecuencia en el lupus
discoide o la esclerosis
sistémica progresiva
(ESP).
SSA/Ro
��
SSB/La
Síndrome de Sjögren 60-70%; LES 50%
�� LES ��
��
Síndrome de Sjögren 40-50%;
15%
��
�
�� específico
� �� que se
�� en ��
�� Anticuerpo
��
�� marcador
��
��
Scl-70
muy
observa
el 15-20%��
de ��
los
��
��
��
�� pacientes con ESP
��
��
��
��
��
��
��
�
��
�
��
�
��
Jo-1
Anticuerpo marcador muy específico que se observa en el 25-30%��
de los
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
o dermatomiositis.
�� pacientes
�� con polimiositis
��
��
��
��
��
��
��
�
��
�
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Antikörper
��gegen:
��
��
��
��
��
��
Assoziierte
Erkrankung:
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Hoch-spezifischer Marker-Antikörper, der bei 25-30 % der SLESm
��
U1-RNP
��
��
��
��SSA/Ro
��
��
��SSB/La
��
��
�� Scl-70
��
��
Patienten auftritt��
��
��
��
Gemischte Bindegewebskrankheit
>95
%;
SLE
35
%;
weniger
häufig
bei
��
�
��
��
��
��
��
discoidem Lupus oder
Sklerose (PSS)
��
�� progressiver systemischer
��
Sjögren-Syndrome
60-70
50 % ��
��
��
��
��
��
��
� %; SLE
�
��
��
��
��
��
��
Sjögren-Syndrom 40-50
��
�� %; SLE 15 % ��
5 ��
��
��
��
��
��
Hoch-spezifischer Marker-Antikörper,
der
��
��bei
� 15-20 % der PPS- ��
RELISA® ENA TEST PROCEDURE
All samples, reagents (including the wash buffer solution), and
microwells must be at room temperature before use.
1.
Prepare Worksheet: Label the worksheet that is
10.
enclosed in the kit to indicate the identification of
each eight well strip of microwells.
2.
Tween Wash Buffer Solution. For manual washing,
aspirate the contents of the wells, then fill each
well with wash buffer solution. Avoid cross-contamination of the wells, particularly in the first
wash after aspiration. Drain all of the wash buffer
from the wells by inverting, then shaking residual
wash buffer from the wells with a sharp “snapping” motion of the wrist. Repeat the filling and
draining steps for a total of 3 to 5 washes. The
wells should then be rapped vigorously on a paper towel or other absorbent material to remove
all traces of residual wash buffer.
Prepare Wash Buffer Solution (PBS-Tween):
Dissolve contents of one PBS buffer pouch in one
liter of deionized or distilled water. Add the entire
contents of one bottle of Wash Buffer Concentrate to the one liter container of dissolved
PBS. Mix well. The wash buffer solution may be
covered and stored at 2-10°C up to four weeks.
3.
Dilute Patient Samples: Dilute patient samples
1:40 by adding 25 µl of serum to 975 µl of Sample
Diluent. Mix well. The controls are provided at the
working dilution and do not require any further
dilution.
4.
11.
12.
13.
14.
Wash Strips (See General Procedural Notes
5 and 6): Wash the wells 3 to 5 times with PBSTween Wash Buffer Solution. For manual washing,
aspirate the contents of the wells, then fill each
well with wash buffer solution. Avoid cross-contamination of the wells, particularly in the first
wash after aspiration. Drain all of the wash buffer
from the wells by inverting, then shaking residual
wash buffer from the wells with a sharp “snapping” motion of the wrist. Repeat the filling and
draining steps for a total of 3 to 5 washes. The
wells should then be rapped vigorously on a paper towel or other absorbent material to remove
all traces of residual wash buffer.
8.
For Technical Assistance:
1-800-251-5115 (Toll Free)
or e-mail: [email protected]
Dispense Enzyme Antibody Reagent:
Dispense 50 µl of Enzyme Antibody Reagent into
each of the wells.
9.
Read Absorbance of Wells: Within 30 minutes
after addition of the Stopping Reagent, the wells
must be read in a plate reading spectrophotometer. The wells are read at 450 nm against
the blank control well. If a dual wave-length
spectrophotometer is available, the wavelength
for the reference filter should be set at 600-650
nm. Reading the microwells without a reference
filter will result in higher absorbance values.
temperature for 30 minutes. The strips should be
protected from drafts or shifts in temperature
during incubation. If desired, the strips can be
covered with transparent tape or a paper towel
to protect them from dust or other foreign bodies.
7.
Dispense Stopping Reagent: After the first well
has incubated for exactly five minutes, add 50 µl
of Stopping Reagent to each well, in the same
order and at the same rate that the Substrate Solution was added to the wells. Upon addition of
stopping reagent, blue substrate solution will turn
yellow and colorless solution will remain colorless.
Dispense Serum Dilutions: Dispense 50 µl of
Incubate Strips (30 minutes at room temperature, i.e. 19-23°C): Incubate at room
Incubate Strips (Exactly five minutes at
room temperature, i.e., 19-23°C): Incubate
at room temperature for exactly five minutes. The
strips should be protected from drafts or shifts in
temperature during incubation.
diluted patient sample into each of the eight
wells of one multiparameter strip.
6.
Dispense Substrate Solution: Using a timer
to assure consistent intervals, dispense 50 µl of
Substrate Solution to each of the wells. The
Substrate Solution must be added to the wells at
a steady rate, so that each well is incubated for
exactly the same length of time (five minutes).
The substrate solution in wells incubated with positive samples will turn blue, and the solution in wells
incubated with negative samples will be colorless
to very pale blue.
Prepare Microwell Strips: Remove the required
number of microwell strips from their pouches,
and place them in the frame holder. The
microwell strips must be firmly seated in the frame
holder. Place the frame holder on a solid surface,
with the letters A through H on the left and the
numbers 1-12 on the top edge of the frame
holder. Place the strips in the frame holder so the
notched end of the strip fits over the small peg at
the bottom edge of the frame holder. Press down
firmly on both ends of the strips so that they securely snap into the frame holder. Strips that are
properly seated in the frame holder will not fall
out when the frame holder is inverted. Label the
frosted top end of the strip to indicate the patient
identification and position in the frame holder.
5.
Wash Strips: Wash the wells 3 to 5 times with PBS-
Incubate Strips (30 minutes at room temperature, i.e., 19-23°C): Incubate at room
temperature for 30 minutes. The strips should be
protected from drafts or shifts in temperature
during incubation. If desired, the strips can be
covered with transparent tape or a paper towel
to protect them from dust or other foreign bodies.
6
RELISA® ENA
Ce test est un immunodosage enzymatique indirect
qualitatif. Des préparations stabilisées d’antigènes
nucléaires solubles purifiés par affinité ont été déposées
à la surface des micropuits pour servir de substrat antigénique dans ce système. Les dilutions des échantillons
de patient sont placées dans les micropuits et mises
à incuber, ce qui permet aux anticorps spécifiques
de l’échantillon de réagir par rapport à l’antigène
pendant la phase solide. Après le lavage visant à
éliminer les anticorps non liés et les autres protéines
sériques, les puits sont mis à incuber avec des anticorps
anti-humains de chèvre marqués par de la peroxydase
de raifort. La préparation d’anticorps conjugué à de la
peroxydase de raifort incluse dans le système est spécifique aux chaînes lourdes et légères de l’IgG humaine.
TEST DE DÉPISTAGE DES ANTICORPS À PARAMÈTRES
MULTIPLES Sm RNP SSA SSB Scl-70 Jo-1
POUR UTILISATION DIAGNOSTIQUE IN VITRO
RÉSUMÉ ET EXPLICATION DU TEST
UTILISATION PRÉVUE : Il s’agit d’un système de test par
immunodosage enzymatique (EIA) pour la détection
des anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires
solubles Sm (Smith), RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et Jo-1
dans le sérum humain. Les résultats de ce dosage
peuvent être utilisés comme aide au diagnostic des
maladies auto-immunes.
Les anticorps anti-antigènes nucléaires solubles (ENA)
ont été associés à plusieurs syndromes auto-immuns
et semblent avoir une valeur diagnostique et/ou
pronostique dans la sclérodermie (1, 2), la connectivité
mixte (3-5), le syndrome de Sjögren (6, 7), la polymyosite (8), la dermatomyosite (9), le lupus érythémateux
disséminé (5) et la polyarthrite rhumatoïde (10). Le
test ANA (anticorps anti-nucléaires) a été utilisé pour
dépister ces anticorps mais il n’indique pas la spécificité
de l’anticorps, et les anticorps dirigés contre certains
antigènes nucléaires solubles ne sont pas positifs au
test ANA (11, 12). Par conséquent, un second test de
confirmation de la présence d’anticorps anti-antigènes
nucléaires solubles est fortement recommandé (13).
Après incubation avec le conjugué de peroxydase de
raifort, si les résultats sont positifs, on observe la formation d’un complexe tripartite stable. Ce complexe se
compose d’un anticorps anti-humain conjugué à de
la peroxydase de raifort lié à un anticorps anti-ENA
humain, lui-même lié à l’antigène stabilisé sur la surface
en plastique.
Après un deuxième lavage, ce complexe est détecté
par ajout d’une solution de tétraméthylbenzidine
(TMB) et de H2O2 servant de substrat chromogène. Le
degré de développement de la couleur dans chaque
puits est proportionnel à la concentration en anticorps
anti-ENA dans chaque échantillon de sérum. Chaque
micropuits est lu à l’aide d’un spectrophotomètre à
450 nm.
L’antigène Sm (Smith) a été identifié en 1966 par Tan et
Kunkel. Il s’agit d’une glycoprotéine non histone soluble
saline, non dépendante de l’ADN ou de l’ARN quant à
son antigénicité (14). Les anticorps anti-Sm sont considérés comme un marqueur très spécifique en raison de
leur degré élevé de spécificité au lupus érythémateux
disséminé (LED). Ils sont présents chez plus de 30 %
des patients atteints d’un LED et ont été associés à la
néphropathie évolutive et à la cérébrite (15-17).
COMPOSITION DES SYSTÈMES (MATÉRIELS FOURNIS)
Conservation : Tous les composants doivent être
conservés au réfrigérateur entre 2 et 10 °C. Ne pas
congeler.
Stabilité : Tous les composants sont stables pendant
12 mois à partir de la date de fabrication. Ne pas utiliser
les composants au-delà de leur date de péremption.
L’anticorps Sm est souvent associé à l’anticorps U1-RNP
dans les sérums de patients atteints d’un LED (18, 19).
À l’inverse de l’anticorps Sm, l’anticorps RNP n’est pas
considéré comme un marqueur sérologique spécifique
car on observe sa présence chez les patients atteints
de diverses maladies rhumatismales, notamment d’un
LED, du syndrome de Sjögren et de polyarthrite rhumatoïde. Un taux élevé d’anticorps anti-RNP est toutefois
souvent associé à un syndrome de chevauchement
appelé connectivité mixte (MCTD). Les patients atteints
d’une MCTD présentent la plupart du temps une association de signes cliniques observés dans le LED, la
sclérodermie et la polymyosite. Ces patients réagissent
souvent bien à un traitement corticostéroïde et présentent une incidence de néphropathie plus faible que les
patients atteints de LED (20, 21).
RÉACTIFS
Bandelettes de micropuits recouvertes d’antigènes
nucléaires solubles : Référence catalogue 7008-09.
Bandelettes à huit puits recouvertes de solutions stabilisées d’antigènes nucléaires solubles purifiés par affinité.
Chaque sachet métallisé contient une bandelette de
huit puits emballée hermétiquement.
Diluant pour échantillon : Référence catalogue 7015
(15 ml). Diluant tamponné propriétaire, utilisé pour diluer
les échantillons de patient.
Réactif immuno-enzymatique – Spécifique aux
chaînes lourdes et légères d’IgG humaine : Référence
catalogue 7009-09 (6 ml). Globuline de chèvre anti-IgG
humaine (chaînes lourdes et légères) couplée à de
la peroxydase de raifort (HRP). Le réactif est prêt à
l’emploi.
Les SSA et SSB ont initialement été décrits comme des
antigènes nucléaires protéine-ARN chez les patients
atteints du syndrome de Sjögren (6, 7). Les Ro et La
ont été décrits comme des antigènes cytoplasmiques
protéine-ARN chez les patients atteints de LED (22, 23).
Il est maintenant largement reconnu que, d’une part,
le SSA et le Ro et, d’autre part, le SSB et le La sont analogues et que ces antigènes se trouvent à la fois dans
le noyau et le cytoplasme. Les anticorps anti-SSA/Ro
seuls ou anti- SSA/Ro et SSB/La sont observés chez 62 %
des patients souffrant de lupus cutané subaigu (24) et
chez 85 % des patients atteints du syndrome de Sjögren
qui développent une vascularite (25). Les anticorps
anti-SSA/Ro seuls apparaissent chez les patients ayant
un déficit homozygote de la fraction C2 (26), chez les
patients souffrant de cirrhose biliaire primitive qui développent le syndrome de Sjögren (27) et chez deux tiers
des patients atteints de « SLE négatif aux ANA » (28).
Solution de substrat : Référence catalogue 7035 (6 ml).
Solution de substrat enzymatique spécifique à la HRP,
contenant de la 3,3’,5,5’-tétraméthylbenzidine (TMB) et
du peroxyde d’hydrogène (H2O2) stabilisés. Le réactif
est prêt à l’emploi.
Réactif d’arrêt : Référence catalogue 7033 (6 ml).
Réactif d’arrêt propriétaire pour les systèmes de test
EIA d’Immuno Concepts. Le réactif est prêt à l’emploi.
ATTENTION : Corrosif. Ce réactif contient des acides
chlorhydrique et sulfurique (moins de 3 % chacun par
volume) et doit être manipulé avec précaution. Conserver hors de portée des enfants. En cas de contact
avec les yeux, laver immédiatement et abondamment
avec de l’eau et consulter un spécialiste. Ne jamais
ajouter d’eau à ce réactif.
L’antigène Scl-70 a été identifié comme une enzyme
cellulaire, l’ADN topoisomérase de type I, une protéine
auxiliaire de l’ADN-polymérase delta (29). Les anticorps
anti-Scl-70 ont été observés chez 56 % de patients souffrant de sclérodermie généralisée (PSS), particulièrement le sous-groupe de patients atteints de sclérodermie diffuse (30). Ces auto-anticorps sont considérés
comme un marqueur de la sclérodermie car ils ne sont
pas observés dans d’autres collagénoses.
Contrôle positif ENA à paramètres multiples : Référence
catalogue 7021-09 (1 ml). Sérum de contrôle positif humain qui contient des anticorps anti-antigènes Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 et Jo-1. Ce sérum est prédilué
et prêt à l’emploi. Ce réactif contient 0,1 % d’azide de
sodium (conservateur).
Les anticorps anti-Jo-1, qui est l’enzyme cellulaire
histidyl-ARNt-synthétase, sont observés chez 25 à 30 %
des patients atteints de polymyosite ou de dermatomyosite et non dans les autres myopathies (11, 31). Il a
également été démontré que les anticorps anti-Jo-1
sont fortement corrélés à la pneumopathie interstitielle
associée à la myosite (31).
Contrôle négatif ENA : Référence catalogue 7031 (1 ml).
Sérum de contrôle négatif humain qui ne contient pas
d’anticorps anti-antigènes Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70 ou Jo-1. Ce sérum est prédilué et prêt à l’emploi. Ce
réactif contient 0,1 % d’azide de sodium (conservateur).
COMPOSANTS NON RÉACTIFS
PRINCIPE DU TEST
Support pour micropuits
7
que celles spécifiées peuvent donner des résultats
erronés.
10. La contamination croisée des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats. Pendant
le test, les échantillons doivent rester confinés dans
les micropuits.
11. Avant utilisation, la verrerie réutilisable doit être
lavée et rincée soigneusement afin d’éliminer tout
détergent. Toute la verrerie doit être propre et
sèche avant utilisation.
12. Avant utilisation, porter les réactifs, micropuits et
échantillons à température ambiante (19-23 °C).
13. Porter des gants en latex jetables pour manipuler
les échantillons et réactifs puis se laver soigneusement les mains par la suite.
14. La contamination microbienne des réactifs ou des
échantillons peut donner de faux résultats.
15. Le réactif d’arrêt est corrosif et peut provoquer des
brûlures. Ce réactif contient des acides chlorhydrique et sulfurique (moins de 3 % chacun par
volume) et doit être manipulé avec précaution.
Conserver hors de portée des enfants. En cas de
contact avec les yeux, laver immédiatement et
abondamment avec de l’eau et consulter un spécialiste. Ne jamais ajouter d’eau à ce réactif.
Solution tampon de lavage :
Tampon PBS : Référence catalogue 1011. Solution saline
tamponnée au phosphate en poudre
(0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Chaque sachet contient une
quantité suffisante de poudre tampon pour préparer
un litre de tampon. Chaque système complet contient
deux sachets de poudre tampon pour chaque plateau
de 96 micropuits.
Concentré tampon de lavage : Référence catalogue
1031 (10 ml). Solution Tween 20 à 5 % à utiliser dans le
tampon de lavage. Chaque système complet contient
deux flacons de concentré tampon pour chaque
plateau de 96 micropuits.
Préparation : Dissoudre un sachet de poudre tampon
dans un litre d’eau désionisée ou distillée. Ajouter tout
le contenu d’une bouteille de concentré tampon de
lavage au PBS dissous. Bien mélanger et conserver au
réfrigérateur entre 2 et 10 °C pendant 4 semaines maximum ou jusqu’à ce que des signes de contamination
ou de modifications visibles apparaissent. La solution
tampon de lavage doit être à température ambiante
(19-23 °C) avant utilisation.
PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS
MATÉRIEL SUPPLÉMENTAIRE REQUIS (MAIS NON
FOURNI)
Prélèvement : Le sérum est l’échantillon préférentiel.
Environ 5 ml de sang entier doivent être prélevés de
manière aseptique par ponction veineuse à l’aide d’un
tube à prélèvement sous vide stérile ou tout autre système de prélèvement adapté. Laisser le sang coaguler
à température ambiante (19-23°C). Le sérum doit être
séparé du caillot par centrifugation aussi rapidement
que possible, de façon à limiter l’hémolyse.
Pipeteurs volumétriques de précision permettant de
prélever 25 à 1 000 µl
Pissette en plastique pour distribuer la solution tampon de lavage dans les micropuits ou système de
lavage des micropuits automatisé ou semi-automatisé
Récipient d’un litre pour la solution tampon de
lavage PBS
Eau désionisée ou distillée
Spectrophotomètre lecteur de microplaques capable de lire la densité optique à 450 nm
Tubes à essai pour préparer les dilutions de sérum
Papier absorbant ou serviettes en papier
Pipeteur multicanaux capable de remplir 8 puits à
la fois
Gants en latex jetables
Chronomètre de laboratoire.
Substances interférentes : Les sérums présentant un
degré élevé d’hémolyse, d’ictère, de lipémie ou de
prolifération microbienne doivent être écartés car ces
anomalies peuvent engendrer des résultats aberrants.
Les échantillons contenant des particules visibles doivent être clarifiés par centrifugation avant de procéder
au test.
PRÉCAUTIONS
1. Tous les matériels d’origine humaine utilisés dans la
composition de ce produit ont été testés et se sont
révélés négatifs (non-réactivité répétée) vis-à-vis
des anticorps des virus de l’immunodéficience humaine 1 et 2 (vih 1 et 2), de l’anticorps du virus de
l’hépatite C (hcv) et de l’antigène de surface de
l’hépatite B (hbsag), selon les méthodes approuvées par la fda. Néanmoins, aucune méthode de
test ne peut assurer totalement l’absence de vih-1,
vih-2, hcv, hbv ou d’autres agents infectieux. Par
conséquent, tous les matériels du kit doivent être
manipulés de la même manière que des matériels
considérés comme potentiellement infectieux.
2. Tous les échantillons de patient doivent être manipulés conformément aux recommandations du
niveau de biosécurité 2, comme pour tout échantillon de sérum ou de sang humain potentiellement
infectieux, telles qu’indiquées dans le manuel du
Centers for Disease Control/National Institutes of
Health : Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. La dilution des composants ou l’utilisation de composants autres que ceux fournis dans ce système
peut produire des résultats incohérents.
4. L’azide de sodium (0,1 %) est utilisé comme
conservateur dans les sérums de contrôle. Il est
possible que l’azide de sodium réagisse au contact
des canalisations en plomb ou en cuivre et forme
des azides métalliques extrêmement explosifs. Lors
de l’élimination des réactifs, rincer abondamment
les canalisations avec de l’eau afin d’éviter toute
accumulation de résidus. L’azide de sodium est un
poison et peut être toxique en cas d’ingestion.
5. Ce kit est destiné à une utilisation diagnostique in
vitro.
6. Ne pas pipeter avec la bouche et éviter tout
contact de la peau et des muqueuses avec les
réactifs et les échantillons. En cas de contact, laver
abondamment avec un savon germicide et de
l’eau.
7. Ne pas fumer, manger ni boire dans les zones où
des échantillons ou des réactifs du kit sont manipulés.
8. Éviter toute éclaboussure ou pulvérisation
d’aérosols à tout moment.
9. Les durées et températures d’incubation autres
8
Conservation : Les sérums peuvent être conservés entre
2 et 10 °C pendant une semaine maximum. Si le test est
reporté, ils doivent être congelés à -20 °C minimum. Le
sérum ne doit pas être conservé dans un réfrigérateur
ou un congélateur à dégivrage automatique.
ATTENTION : Les congélations et décongélations successives des échantillons de patient peuvent induire des
résultats faussement positifs ou faussement négatifs.
REMARQUES GÉNÉRALES RELATIVES À LA
PROCÉDURE
1. Il est extrêmement important que tous les composants du kit et les échantillons de sérum soient à
température ambiante (19-23 °C) avant utilisation. Il
faut à un litre entier de tampon de lavage plusieurs
heures pour atteindre 20 °C à sa sortie du réfrigérateur. Les températures d’incubation au-dessus ou
en dessous de la plage indiquée peuvent donner
des résultats inexacts. Remettre les échantillons et
les réactifs non utilisés au réfrigérateur après utilisation.
2. Avant utilisation, bien mélanger les réactifs en les retournant doucement de haut en bas. Ne pas créer
de tourbillon dans les réactifs ou les secouer. Éviter
la formation de mousse.
3. Lors de la préparation des dilutions d’échantillon,
essuyer les embouts des pipettes avant de distribuer
le sérum dans le diluant pour échantillon. Si un excès d’échantillon adhère à l’embout de la pipette,
les résultats s’en trouveront affectés.
4. L’utilisation d’un pipeteur multicanaux est recommandée car il permet d’uniformiser la distribution
du réactif ainsi que les durées d’incubation et de
réaction.
5. Un lavage adéquat des puits est extrêmement
important. Des puits mal lavés afficheront des
valeurs de bruit de fond élevées ainsi que des
valeurs faussement positives. Pour le lavage
manuel, aspirer le contenu des puits puis remplir
ceux-ci de solution tampon de lavage. Éviter la
contamination croisée des puits, en particulier
lors du premier lavage suivant l’aspiration. Vider
toute la solution tampon de lavage des puits en
les renversant puis en les secouant d’un geste sec
du poignet afin d’éliminer tout résidu. Répéter ces
étapes (remplissage/élimination) jusqu’à effectuer
3 à 5 lavages au total. Frapper ensuite vigoureusement les puits sur une serviette en papier ou une
autre matière absorbante pour éliminer toute trace
résiduelle de tampon de lavage. Pour un lavage
homogène des puits, il est recommandé d’utiliser
un système automatisé.
REMARQUE : En raison des divers types de techniques de lavage et de systèmes automatisés, le
nombre de lavages peut être adapté pour obtenir
des résultats optimums. Chaque laboratoire doit
déterminer le nombre de lavages le plus efficace
pour son système de lavage.
6. Une élimination inadaptée des résidus de tampon
de lavage peut conduire à un développement
inadapté de la couleur. Sécher les bandelettes de
micropuits sur du papier ou des serviettes absorbants afin d’éliminer au maximum les résidus de
tampon de lavage.
7. Le respect du minutage de toutes les étapes est essentiel. Tous les échantillons de sérum doivent être
dilués avant le début de la procédure et déposés
dans les micropuits aussi rapidement que possible
(moins de cinq minutes). La taille des lots doit être
définie de manière à ce que la manipulation des
échantillons puisse être accomplie sans précipitation dans ce laps de temps. Il est recommandé
d’utiliser un pipeteur multicanaux qui facilite la
manipulation des échantillons et des réactifs.
8. À l’exception de la dernière incubation (solution
de substrat), chaque période d’incubation commence dès la fin de la distribution de l’échantillon
ou du réactif. L’incubation de la solution de substrat
doit durer exactement cinq minutes pour chaque
puits. Tous les échantillons et réactifs doivent être
déposés dans le même ordre et à un rythme constant.
population de patients testés. Les valeurs unitaires
sont affectées par des facteurs liés aux patients,
des considérations mécaniques (précision et exactitude du pipetage, etc.) et les conditions de dosage (ex. : température et minutage des étapes).
2. Les puits Sm et Sm/RNP sont utilisés ensemble pour
déterminer la présence de ces deux auto-anticorps. Si le puits Sm/RNP est positif et si le puits Sm
est négatif, le patient a des anticorps anti-RNP.
Si les deux puits sont positifs, avec des valeurs
quasiment égales, le patient a des anticorps
anti-Sm. Si les deux puits sont positifs et que le
puits Sm/RNP soit supérieur au puits Sm d’au moins
30 unités ENA, cela indique la présence des autoanticorps anti-Sm et RNP. La présence des deux
anticorps peut être confirmée à l’aide du système
d’immunodiffusion AUTO-ID® d’Immuno Concepts,
référence catalogue 6030.
3. Les autres puits sont recouverts d’antigènes
monospécifiques purifiés par affinité et ne réagis��
sent qu’avec l’anticorps homologue. Cependant,
��
des sérums de patient ayant plusieurs spécificités
��
� ��
anticorps
sont�généralement
observés dans le LED
��
� � ��
et d’autres
syndromes
auto-immuns, un sérum indi��donc
� � ��
viduel peut
présenter une réaction positive
dans plusieurs
�� puits.
� ��
4. Les puits��
sont recouverts
d’antigènes purifiés par af� � ��
finité dans
l’ordre
suivant, de
haut (puits��
A et onglet
��
� � ��
��
��
plein à l’extrémité de la bandelette) en bas (puits H
et onglet entaillé à l’extrémité de la bandelette) :
��
��
��
��
��
��
��
��
��
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS
CONTRÔLE QUALITÉ
1. Le puits de contrôle à blanc doit avoir une valeur
de densité optique inférieure à 0,250. Les valeurs
de densité optique à blanc supérieures à 0,250
indiquent un lavage inadéquat ou une contamination des réactifs.
2. Le relevé de densité optique du puits de contrôle à
blanc (ligne G) est soustrait des relevés de densité
optique du puits de vérification de procédure
(PRC) RELISA® (ligne H) et de chacun des puits
d’antigène (lignes A à F). Les valeurs nettes inférieures à zéro sont considérées comme étant égales
à zéro.
3. Le puits de vérification de procédure (RPC) RELISA®
(ligne H) doit avoir une densité optique nette
supérieure à 0,300. Les valeurs de densité optique
inférieures à 0,300 indiquent un développement de
la couleur inadéquat et une analyse non valide.
Un développement inadéquat de la couleur est
généralement dû à l’utilisation de réactifs froids
ou au non respect du minutage d’une ou plusieurs
étapes du dosage. Laisser tous les réactifs atteindre
la température ambiante (19-23 °C) et répéter
l’analyse en veillant à respecter le minutage de
toutes les étapes.
4. Les valeurs de densité optique nettes sont toutes
multipliées par 100 pour obtenir la valeur de
chaque antigène en unités ENA.
5. Le sérum de contrôle positif est un pool de sérum
humain qui contient des anticorps dirigés contre
l’ensemble des six auto-antigènes de ce test.
Chaque puits d’antigène doit présenter une valeur
d’au moins 30 unités ENA.
6. Le sérum de contrôle négatif est un pool de sérum
humain qui ne contient pas d’anticorps dirigés l’un
des six auto-antigènes de ce test. Chaque puits
d’antigène doit présenter une valeur inférieure à
20 unités ENA.
7. Chaque laboratoire doit établir la fréquence de
réalisation des analyses des sérums de contrôle
positif et négatif, en fonction de la fréquence des
tests de patient et de l’expérience du laboratoire
en la matière.
COMMUNICATION DES RÉSULTATS
Les résultats doivent être notés positifs ou négatifs aux
�� nucléaires
��
anticorps anti-antigènes
solubles correspondants. Les niveaux
d’anticorps
n’ont pas de signification
��
� � ��
clinique connue.
��
��
VALEURS ESCOMPTÉES
��
��
L’incidence des auto-anticorps dirigés contre divers
� � ��
��de la population
antigènes ��
nucléaires varie
en fonction
� � ��
��
de patients��
et de l’incidence
des maladies
rhumatis��
�� L’association
males cliniques dans cette
population.
anticorps/maladies rhumatismales spécifiques est
récapitulée dans le tableau 1.
PLAGE DE RÉFÉRENCE
��
��
La plage de référence a été établie en testant les
��
sérums de 206 donneurs de sang sains, 105 femmes et
� � ��
101 hommes,��
dont aucun
n’avait d’antécédents con��
� � �� En outre, on a obtenu
nus de maladies
rhumatismales.
� � �� atteints de maladies rhudes données��
de 143 patients
matismales qui
avaient
anticorps
dirigés contre un
��
� �des
��
��
ou plusieurs des
antigènes
de ce dosage
mais étaient
��
� � ��
��
négatifs aux anticorps dirigés
contre
d’autres antigènes.
��
��
Sur la base de ces données, les valeurs limites normales
ont été établies comme étant inférieures à 20 unités
ENA. Les bonnes pratiques de laboratoire imposent
que chaque ��
laboratoire établisse
� � �� ses propres plages
normales en fonction de sa population de patients et
��
d’autres facteurs locaux.
��
��
LIMITES DU TEST
��
��
� ��
1. Le diagnostic
ne peut �pas
être réalisé sur la base
des anticorps
anti-antigènes
nucléaires
��
� � ��
��solubles
seuls. Le médecin
doit�interpréter
résultats au
��
� ��ces
��
regard des antécédents et des symptômes du
��
INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS DU PATIENT
1. Il s’agit d’un dosage qualitatif. Les niveaux
d’anticorps détectés n’ont pas de signification clinique connue et les valeurs unitaires obtenues lors
de ce dosage sont simplement destinées à répartir
les patients dans les trois grands groupes suivants.
Les puits d’échantillon de patient dont les valeurs
sont supérieures à 30 unités ENA sont considérés
comme positifs. Les puits d’échantillon de patient
dont les valeurs sont inférieures à 20 unités ENA sont
considérés comme négatifs. Les valeurs comprises
entre 20 et 30 unités sont considérées comme étant
limites positives et le test doit être recommencé.
Chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs
de référence (limite et plage) en fonction de la
patient, des observations physiques et d’autres
procédures de diagnostic.
2. Le traitement ne doit pas débuter sur la seule base
d’un test��
positif aux
anticorps anti-antigènes nuclé� � ��
aires solubles. Les indications cliniques, les autres
��
analyses de laboratoire et le diagnostic clinique
��
du médecin doivent être pris en compte avant de
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� ��
commencer
tout�traitement.
� �� de maladies auto-im3. Certains ��
patients� souffrant
�� avoir
� ��
munes peuvent
des niveaux indétectables ou
insignifiants
d’anticorps
anti-antigènes
nucléaires
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� � ��
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solubles ��
et d’autres
des niveaux
� � peuvent
�� avoir
��
élevés mais présenter ��
peu ou��
pas de signe de
9
maladie clinique. Le médecin doit interpréter les
résultats des tests des anticorps anti-antigènes nucléaires solubles au regard des antécédents et des
symptômes du patient, des observations physiques
et des autres procédures de diagnostic.
4. Les niveaux d’anticorps détectés avec ce système
n’indiquent pas nécessairement la gravité ou la
durée de la maladie.
RÉACTIVITÉ CROISÉE
PERFORMANCES
REPRODUCTIBILITÉ
Sept échantillons ont été utilisés pour des études de
réactivité croisée. Ils ont été bien caractérisés par
Western-Blot, CIE et immunodiffusion comme sérums
monospécifiques pour chacun des auto-anticorps du
test de dépistage RELISA®. Aucune réactivité croisée
n’a été observée dans ces échantillons. Tableau 3.
Le test de dépistage RELISA® d’Immuno Concepts a
Pour chacune des six spécificités antigéniques, six
été comparé à d’autres tests ELISA similaires disponibles
échantillons ont été traités sur trois numéros de lot
sur le marché, à des tests d’immunodiffusion et de condifférents de bandelettes d’antigènes à trois occasions
tre-immuno-électrophorèse doubles réalisés dans des
différentes. Deux des échantillons étaient négatifs
laboratoires
de��
référence
et à des
résultats Western-Blot mais proches de la valeur limite de 20 unités ENA,
��
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obtenus par méthode interne. Les résultats de toutes
deux étaient positifs mais proches de la valeur limite
les méthodes et le diagnostic clinique du patient ont
de 20 unités ENA et deux étaient clairement positifs
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été pris en compte dans la détermination des résultats
au-dessus du niveau de 30 unités ENA. En aucun cas un
attendus��
ou « valables ��
» pour chaque
échantillon
testé.
échantillon
négatif
ne présentait
résultats positifs
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�� de
��
�� ;
Sur la base de ces comparaisons, les données dans le
l’ensemble des échantillons positifs « limites » donnaient
�� uniformément
��
��
tableau 2 ont été obtenues.
des résultats
entre 20 et 30 unités ENA et
les
échantillons
clairement
positifs donnaient uniformé��
��
Les divergences de spécificité sont dues à la sensibilité
ment des résultats clairement positifs.
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accrue des
dosages ELISA
par rapport
aux méthodes
« classiques » telles que la contre-immunoélectro��
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phorèse (CIE) et l’immunodiffusion.
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TABLEAU 1
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TABLEAU
2
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TABLEAU 3
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PROCÉDURE DE TEST ENA RELISA®
Tous les échantillons, réactifs (y compris solution tampon de lavage)
et micropuits doivent être à température ambiante avant utilisation.
1.
Préparation du formulaire : Étiqueter le
formulaire inclus dans le kit afin d’indiquer
l’identification de chaque bandelette de
micropuits à huit puits.
2.
Préparation de la solution tampon de
lavage (PBS-Tween) : Dissoudre le contenu
d’un sachet de tampon PBS dans un litre
d’eau désionisée ou distillée. Ajouter tout
le contenu d’une bouteille de concentré
tampon de lavage au récipient d’un litre
de PBS dissous. Bien mélanger. La solution
tampon de lavage peut être couverte
et conservée à 2-10 °C pendant quatre
semaines.
3.
Dilution des échantillons des patients :
Diluer les échantillons des patients à 1:
40 en ajoutant 25 µl de sérum à 975 µl de
diluant pour échantillon. Bien mélanger. Les
contrôles sont prédilués et ne doivent pas
être dilués de nouveau.
4.
Préparation des bandelettes de micropuits :
Sortir le nombre requis de bandelettes de
micropuits de leurs sachets et les placer
dans le support. Les bandelettes de micropuits doivent être correctement placées sur
le support. Placer le support sur une surface
stable, les lettres A à H à gauche et les
chiffres 1 à 12 sur le bord supérieur. Placer
les bandelettes dans le support de sorte
que l’extrémité dentelée de la bandelette
s’enclenche sur la petite fiche à la base
du support. Appuyer fermement sur les
deux extrémités des bandelettes pour les
enclencher correctement dans le support
afin qu’elles ne tombent pas lors du retournement du support. Étiqueter l’extrémité
supérieure glacée de la bandelette pour
identification du patient et position dans le
support.
5.
Distribution des dilutions sériques : Déposer
50 µl d’échantillon de patient dilué dans
chacun des huit puits d’une bandelette à
paramètres multiples.
6.
Incubation des bandelettes (30 minutes
à température ambiante, soit 19-23 °C) :
Mettre à incuber à température ambiante
pendant 30 minutes. Les bandelettes
doivent être protégées des courants d’air
ou des variations de température pendant
l’incubation. Recouvrir, le cas échéant, les
bandelettes d’un film transparent ou d’une
serviette en papier pour les protéger de la
poussière ou d’autres corps étrangers.
7.
8.
Lavage des bandelettes (voir Remarques
générales relatives à la procédure 5 et 6) :
Laver les puits 3 à 5 fois avec la solution
tampon de lavage PBS-Tween. Pour le
lavage manuel, aspirer le contenu des puits
puis remplir ceux-ci de solution tampon de
lavage. Éviter la contamination croisée des
puits, en particulier lors du premier lavage
suivant l’aspiration. Vider toute la solution
tampon de lavage des puits en les renversant puis en les secouant d’un geste sec du
poignet afin d’éliminer tout résidu. Répéter
ces étapes (remplissage/élimination)
jusqu’à effectuer 3 à 5 lavages au total.
Frapper ensuite vigoureusement les puits
sur une serviette en papier ou une autre
matière absorbante pour éliminer toute
trace résiduelle de tampon de lavage.
9.
Incubation des bandelettes (30 minutes
à température ambiante, soit 19-23 °C) :
Mettre à incuber à température ambiante
pendant 30 minutes. Les bandelettes
doivent être protégées des courants d’air
ou des variations de température pendant
l’incubation. Recouvrir, le cas échéant, les
bandelettes d’un film transparent ou d’une
serviette en papier pour les protéger de la
poussière ou d’autres corps étrangers.
10.
Lavage des bandelettes : Laver les puits 3
à 5 fois avec la solution tampon de lavage
PBS-Tween. Pour le lavage manuel, aspirer
le contenu des puits puis remplir ceux-ci de
solution tampon de lavage. Éviter la contamination croisée des puits, en particulier
lors du premier lavage suivant l’aspiration.
Vider toute la solution tampon de lavage
des puits en les renversant puis en les
secouant d’un geste sec du poignet afin
d’éliminer tout résidu. Répéter ces étapes
(remplissage/élimination) jusqu’à effectuer
3 à 5 lavages au total. Frapper ensuite
vigoureusement les puits sur une serviette
en papier ou une autre matière absorbante
pour éliminer toute trace résiduelle de
tampon de lavage.
11.
Distribution de la solution de substrat :
Utiliser un chronomètre pour respecter le
minutage et déposer 50 µl de solution de
substrat dans chacun des puits. La solution
de substrat doit être ajoutée aux puits
à un rythme constant, de manière à ce
que l’incubation de chaque puits ait la
même durée (cinq minutes). La solution de
substrat mise à incuber avec des échantillons positifs se colore en bleu et celle mise
à incuber avec des échantillons négatifs
variera d’incolore à bleu très pale.
12.
Incubation des bandelettes (exactement
5 minutes à température ambiante, soit
19-23 °C) : Mettre à incuber à température ambiante pendant exactement cinq
minutes. Les bandelettes doivent être protégées des courants d’air ou des variations
de température pendant l’incubation.
13.
Distribution du réactif d’arrêt : Après incubation du premier puits pendant exactement
cinq minutes, ajouter 50 µl de réactif d’arrêt
dans chaque puits, dans le même ordre
et au même rythme que pour l’ajout de
solution de substrat. Dès l’ajout de réactif
d’arrêt, la solution de substrat bleue devient jaune et la solution incolore demeure
incolore.
14.
Lecture de la densité optique des puits :
Dans les 30 minutes suivant l’ajout de
réactif d’arrêt, les puits doivent être lus à
l’aide d’un spectrophotomètre lecteur de
microplaques. Les puits sont lus à 450 nm
par rapport au puits de contrôle à blanc. Si
un spectrophotomètre à double longueur
d’onde est disponible, la longueur d’onde
pour le filtre de référence doit être réglée
sur 600-650 nm. La lecture des micropuits
sans filtre de référence donne des valeurs
de densité optique plus élevées.
POUR L’Assistance technique :
+1 916-363-2649
ou messagerie électronique :
[email protected]
Distribution du réactif immuno-enzymatique : Déposer 50 µl de réactif immuno-enzymatique dans chacun des puits.
11
ENA RELISA®
TEST DI SCREENING DEGLI ANTICORPI MULTIPARAMETRO
DIRETTI CONTRO Sm RNP SSA SSB Scl-70 Jo-1
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO
RIEPILOGO E INFORMAZIONI DI BASE
Uso previsto: sistema di analisi a dosaggio immunoenzimatico (EIA) per la determinazione nel siero umano di
anticorpi diretti contro gli antigeni nucleari estraibili Sm
(Smith), RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, e Jo-1. I risultati di
questa analisi possono essere usati come aiuto nella
diagnosi delle autoimmunopatie.
Gli anticorpi contro gli ENA (Extractable nuclear
antigens, antigeni nucleari estraibili) sono stati associati
a parecchie sindromi autoimmuni e sembrano avere
un significato diagnostico e/o prognostico nella sclerosi
sistemica progressiva,(1, 2) nella malattia mista del
tessuto connettivo, (3-5) nella sindrome di Sjögren,(6, 7)
nella polimiosite,(8) nella dermatomiosite,(9) nel lupus
eritematoso sistemico(5) e nell’artrite reumatoide.(10) Il
test ANA (Antinuclear antibody, anticorpi antinucleari)
è stato usato come screening per questi anticorpi,
ma l’ANA non indica la specificità dell’anticorpo e gli
anticorpi contro alcuni ENA non mostrano test ANA
positivi.(11, 12) Quindi è altamente raccomandata
un’analisi secondaria di conferma per gli anticorpi
contro gli ENA.(13)
L’antigene Sm (Smith) fu identificato nel 1966 da Tan e
Kunkel come soluzione fisiologica solubile, glicoproteina
non istone non dipendente da DNA o RNA per la sua
antigenicità.(14) Gli anticorpi anti-antigeni Sm sono
considerati come uno specifico marcatore sierologico
grazie al loro elevato grado di specificità per l’SLE
(Systemic Lupus Erythematosus, lupus eritematoso
sistemico). I livelli osservati di questi anticorpi che sono
stati associati a malattia renale attiva e ad encefalite
raggiungono fino al 30% dei pazienti.(15-17)
Gli anticorpi anti-Sm si trovano di frequente in connessione con gli anticorpi diretti contro il complesso U1-RNP
nel siero di pazienti affetti da SLE.(18, 19) A differenza
degli anticorpi anti-antigene Sm, gli anticorpi anti-RNP
non sono considerati un marcatore sierologico specifico
in quanto si trovano in pazienti con una serie di malattie
reumatiche compresi SLE, sclerodermia, sindrome di
Sjögren e artrite reumatoide. Comunque, elevati livelli
di anticorpi diretti contro l’RNP sono altamente associati
ad una sindrome coincidente denominata MCTD
(Mixed Connective Tissue Disease, malattia mista del
tessuto connettivo). I pazienti con MCTD tipicamente
mostrano un insieme di caratteristiche cliniche osservabili nell’SLE, nella sclerodermia e nella polimiosite.
Questi pazienti spesso mostrano una buona risposta
al trattamento corticosteroide ed hanno una minore
incidenza di malattia renale in confronto ai pazienti
affetti da SLE.(20, 21)
SSA e SSB furono originariamente descritti come antigeni nucleari RNA-proteina nei pazienti con sindrome
di Sjögren.(6, 7) Ro e La furono descritti come antigeni
citoplasmatici RNA-proteina nei pazienti con SLE.(22,
23) È ora comunemente accettato che SSA e Ro siano
analoghi, SSB e La siano analoghi e che questi antigeni
si trovino nel nucleo e nel citoplasma. Anticorpi diretti
verso l’SSA/Ro soltanto o l’SSA/Ro e l’SSB/La sono stati
rilevati nel 62% di pazienti con lupus cutaneo subacuto,(24) e nell’85% di pazienti con sindrome di Sjögren
che sviluppano vasculite.(25) Anticorpi diretti solamente
verso l’SSA/Ro si presentano nei pazienti che hanno
una deficienza a livello omozigotico della frazione del
complemento C2,(26) nei pazienti con cirrosi biliare
primaria che sviluppano la sindrome di Sjögren(27) e nei
due terzi di pazienti con “SLE ANA negativo”.(28)
L’antigene Scl-70 è stato identificato come enzima cellulare, topoisomerasi I del DNA, una proteina ausiliaria
del DNA polimerasi delta.(29) Anticorpi anti-Scl-70 sono
stati segnalati nel 56% dei pazienti con sclerosi progressiva sistemica (PSS), ed in particolare nel sottogruppo di
pazienti con sclerodermia diffusa.(30). Questi anticorpi
sono considerati come un marcatore per PSS, poiché
non sono osservati in altre patologie del tessuto connettivo.
Gli anticorpi anti-Jo-1, che è l’istidil tRNA sintetasi
dell’enzima cellulare, sono presenti nel 25-30% dei
pazienti con polimiosite o dermatomiosite, ma non con
altre miopatie.(11, 31) È stato anche dimostrato che gli
anticorpi diretti contro Jo-1 sono fortemente associati
all’enfisema interstiziale osservato in connessione con
la miosite.(31)
Questa analisi è un EIA (Enzime Immunoassay, dosaggio
immunoenzimatico) qualitativo indiretto. In questo sistema, la superficie dei micropozzetti è stata rivestita con
preparati stabilizzati di antigeni nucleari estraibili purificati per affinità che fungono da substrato antigenico.
Le diluizioni dei campioni del paziente sono messe nei
micropozzetti ed incubate lasciando reagire gli specifici
anticorpi presenti nel campione con l’antigene in fase
solida. Dopo il lavaggio per rimuovere l’anticorpo non
legato e le altre proteine del siero, i pozzetti sono incubati con anticorpi anti-umani di capra etichettati con
perossidasi di rafano. Il preparato di anticorpi coniugati
con perossidasi di rafano incluso in questo sistema di
analisi è specifico per catene anti-IgG umane pesanti
e leggere.
Se i risultati sono positivi, dopo l’incubazione col coniugato di perossidasi di rafano si forma un complesso
stabile in tre parti. Questo complesso consiste di anticorpo antiumano coniugato con perossidasi di rafano
legante l’anticorpo anti-ENA umano che è legato
all’antigene stabilizzato sulla superficie di plastica.
Dopo un’altra fase di lavaggio, questo complesso viene
rilevato aggiungendo una soluzione di tetrametilbenzidina (TMB) e H2O2 come substrato cromogenico.
Il grado di viraggio del colore in ciascun pozzetto è
proporzionale alla concentrazione di anticorpi anti-ENA
in ciascun campione di siero. Ciascun micropozzetto
viene letto con uno spettrofotometro a 450 nm.
COMPONENTI DEL SISTEMA (materiali forniti)
Conservazione: tutti i componenti vanno conservati alla
temperatura di 2-10°C. Non congelare.
Stabilità: tutti i componenti restano stabili per almeno 12
mesi dalla data di produzione. Non usare alcun componente oltre la data di scadenza.
REAGENTI REATTIVI
Strisce di micropozzetti rivestiti di antigene nucleare
estraibile: numero di catalogo 7008-09. Otto strisce di
pozzetti rivestiti di soluzioni stabilizzate di antigeni nucleari estraibili purificati per affinità. In ciascun sacchetto di
alluminio è sigillata una striscia con otto pozzetti.
Diluente del campione: numero di catalogo 7015 (15
ml). Esclusivo diluente tamponato per campioni utilizzato per la diluizione dei campioni dei pazienti.
Reagente enzimatico degli anticorpi (catena pesante e
leggera anti-IgG umane): numero di catalogo 7009-09
(6 ml). Anti-IgG umane di capra (H&L) coniugate con
perossidasi di rafano (HRP). Il reagente è pronto per
l’uso.
Soluzione di substrato: numero di catalogo 7035 (6 ml).
Soluzione di substrato enzimatica HRP-specifica, contenente 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) stabilizzata
e perossido di idrogeno (H2O2). Il reagente è pronto
per l’uso.
Reagente bloccante: numero di catalogo 7033 (6 ml).
Esclusivo reagente bloccante per sistemi di analisi EIA
della Immuno Concepts. Il reagente è pronto per l’uso.
ATTENZIONE: corrosivo. Questo reagente contiene acidi
cloridrico e solforico (meno del 3% ciascuno in volume),
e deve essere maneggiato con cura. Tenere fuori della
portata dei bambini. In caso di contatto con gli occhi,
lavare immediatamente con acqua abbondante e
consultare un medico. Non aggiungere mai acqua a
questo reagente.
Controllo positivo multiparametro ENA: numero di
catalogo 7021-09 (1 ml). Siero di controllo umano
positivo che contiene anticorpi diretti contro gli
antigeni Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 o Jo-1. Questo
siero è alla diluizione operativa ed è pronto per l’uso.
Questo reagente contiene sodio azide allo 0,1% come
conservante.
Controllo negativo ENA: numero di catalogo 7031
(1 ml). Siero di controllo umano negativo che non
contiene anticorpi diretti contro gli antigeni Sm, RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 o Jo-1. Questo siero è alla diluizione operativa ed è pronto per l’uso. Questo reagente
contiene sodio azide allo 0,1% come conservante.
COMPONENTI NON REATTIVI
Supporto per micropozzetti
PRINCIPIO DEL TEST
Soluzione tampone di lavaggio
12
pletamente liberata da ogni residuo di detergente.
Prima dell’uso, tutta la vetreria di laboratorio deve
essere pulita e asciutta.
12. Prima dell’uso, portare tutti i reagenti, i pozzetti e i
campioni a temperatura ambiente (19-23°C).
13. Indossare guanti a perdere in lattice quando si
maneggiano campioni e reagenti e dopo lavare
accuratamente le mani.
14. La contaminazione microbica dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi.
15. Il reagente bloccante è corrosivo e può causare
ustioni. Questo reagente contiene acidi cloridrico e
solforico (meno del 3% ciascuno in volume), e deve
essere maneggiato con cura. Tenere fuori della
portata dei bambini. In caso di contatto con gli
occhi, lavare immediatamente con acqua abbondante e consultare un medico. Non aggiungere
mai acqua a questo reagente.
Tampone PBS: numero di catalogo 1011. Polvere salina
tamponata al fosfato
(0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Ciascuna busta contiene polvere
tamponata sufficiente a fare 1 litro. (Nei kit per analisi
completi, per ogni piastra con 96 micropozzetti sono
forniti due sacchetti di polvere tamponata).
Concentrato tampone di lavaggio: numero di catalogo
1031 (10 ml). Soluzione al 5% di Tween 20 da usare nel
tampone di lavaggio. (Nei kit per analisi completi, per
ogni piastra con 96 micropozzetti sono fornite due fiale
di concentrato tamponato).
Preparazione: sciogliere il contenuto di una busta di
tampone in un litro di acqua deionizzata o distillata. Aggiungere l’intero contenuto di un flacone di
concentrato di tampone di lavaggio al PBS sciolto.
Mescolare bene e tenere alla temperatura di 2-10°C
fino a 4 settimane o fino a che non si presentino segni
di contaminazione o altri cambiamenti visibili. Prima
dell’uso, la soluzione tampone di lavaggio deve essere
a temperatura ambiente (19-23°C).
ALTRI MATERIALI NECESSARI (MA NON FORNITI)
Pipette volumetriche di precisione per l’erogazione di
volumi da 25-1000 µl.
Flacone morbido per erogare la soluzione tampone
di lavaggio nei micropozzetti o un sistema di
lavaggio automatico o semiautomatico per
micropozzetti.
Contenitore da un litro per soluzione tampone di
lavaggio PBS.
Acqua deionizzata o distillata.
Spettrofotometro per la lettura della piastra, capace
di rilevare la misurazione dell’assorbanza a 450
nm.
Provette per preparare le diluizioni dei sieri.
Carta bibula o assorbente.
Pipettatrice multicanale in grado di erogare i volumi
necessari in 8 pozzetti.
Guanti a perdere in lattice.
Timer da laboratorio.
PRECAUZIONI
1. Tutti i materiali di origine umana usati per questo
prodotto sono stati analizzati e trovati negativi (non
ripetutamente reattivi) per gli anticorpi del virus
dell’immunodeficienza umana tipo 1 (HIV-1), del
virus della immunodeficienza umana tipo 2 (HIV-2),
del virus dell’epatite C (HCV) e per l’antigene di
superficie dell’epatite B (HBsAg) con metodi approvati dalla FDA. Nessun metodo di analisi può garantire con completa sicurezza che siano assenti HIV-1,
HIV-2, epatite C, epatite B o altri agenti infettivi.
Quindi, tutti i componenti del kit vanno maneggiati
secondo le stesse modalità utilizzate per i materiali
potenzialmente infettivi.
2. Tutti i campioni dei pazienti devono essere maneggiati osservando le precauzioni di sicurezza biologica di livello 2, come raccomandato per ogni siero
umano potenzialmente infettivo o per campioni di
sangue nel manuale pubblicato per i CDC/NIHM
(Centers for Disease Control/National Institutes of
Health Manual, Centri per il Controllo delle Infezioni/
Istituti Nazionali per la Sanità): Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Edizione 1984.
3. La diluizione di componenti o la sostituzione di componenti diversi da quelli forniti in questo sistema può
dare risultati non coerenti.
4. Il sodio azide (0,1%) viene usato come conservante
nei sieri di controllo. Il sodio azide può reagire con
le tubature in piombo o rame formando azoturi
metallici altamente esplosivi. Quando si eliminano
i reagenti, far scorrere grandi quantità di acqua
del rubinetto per evitare la formazione di potenziali
residui nelle tubature. Il sodio azide è un veleno e
può essere tossico se ingerito.
5. Questo kit è per uso diagnostico in vitro.
6. Non pipettare mai con la bocca ed evitare il
contatto dei reagenti e dei campioni con la cute e
le mucose. In caso di contatto, lavare abbondantemente con un sapone germicida e acqua.
7. Non fumare, non mangiare o non bere nelle aree in
cui sono maneggiati i campioni o i reagenti del kit.
8. Evitare sempre gli spruzzi e la formazione di aerosol.
9. Tempi e temperature di incubazione diversi da
quelli specificati può dare risultati errati.
10. La contaminazione incrociata dei reagenti o dei
campioni può dare origine a risultati falsi. Durante
l’analisi i campioni devono rimanere confinati nei
micropozzetti.
11. Prima dell’uso, la vetreria di laboratorio riutilizzabile
deve essere lavata e sciacquata a fondo e com-
RACCOLTA DI CAMPIONI
Raccolta: il siero è il campione preferito. Devono
essere prelevati con tecnica asettica circa 5 ml di
sangue intero per venopuntura usando una provetta
di raccolta sterile a vuoto o un altro sistema di raccolta
adatto. Lasciare che il sangue si coaguli a temperatura
ambiente (19-23°C). Non appena possibile, il siero deve
essere separato dal coagulo per centrifugazione in
modo da minimizzare l’emolisi.
Sostanze interferenti: non vanno usati sieri che mostrano
un alto grado di emolisi, ittero, lipemia o crescita microbica, perché queste condizioni possono provocare
risultati atipici. Campioni contenenti sostanze particellari visibili vanno chiariti per centrifugazione prima
dell’analisi.
Conservazione: i sieri possono essere conservati a
2-10°C fino ad una settimana. Se l’analisi viene ulteriormente rimandata, i sieri devono essere conservati
congelati a -20°C o a una temperatura inferiore. Il siero
non deve essere conservato in frigoriferi autosbrinanti
o in freezer.
ATTENZIONE: il ripetuto congelamento e scongelamento dei campioni dei pazienti può dare origine a falsi
risultati positivi o a falsi risultati negativi.
NOTE PROCEDURALI GENERALI
1. Prima dell’uso è estremamente importante avere
tutti i componenti del kit e i campioni di siero a
temperatura ambiente (19-23°C). Per portare alla
temperatura di 20°C un intero litro di tampone
di lavaggio dopo averlo tolto dal frigo, possono
essere necessarie parecchie ore. Temperature di
incubazione superiori o inferiori alla gamma stabilita
possono essere causa di risultati non accurati. Dopo
l’uso conservare al freddo campioni e reagenti non
usati.
2. Mescolare bene i reagenti prima dell’uso capovolgendoli con delicatezza. Non far vorticare i
reagenti e non scuoterli. Evitare la formazione di
schiuma.
3. Quando si preparano le diluizioni dei campioni,
le punte delle pipette devono essere asciugate
prima di erogare il siero nel diluente per campioni.
L’eccesso di campione adeso alla parte esterna
della punta della pipetta influenza i risultati.
4. Si consiglia l’uso di una pipettatrice multicanale
perché garantisce erogazione, tempi di incubazione e tempi di reazione più uniformi.
5. Un adeguato lavaggio dei pozzetti è estremamente
importante. Pozzetti non lavati adeguatamente
mostreranno valori di fondo alti e possono dare falsi
valori positivi. Per il lavaggio manuale, aspirare il
contenuto dei pozzetti, poi riempirne ciascuno con
soluzione tampone di lavaggio. Evitare la contaminazione incrociata dei pozzetti, particolarmente
nel primo lavaggio dopo l’aspirazione. Drenare
tutto il tampone di lavaggio dai pozzetti capovolgendoli, poi eliminare i residui con un brusco
movimento “secco” del polso. Ripetere le fasi di
riempimento e di drenaggio per 3-5 lavaggi in tutto.
I pozzetti devono poi essere passati con forza su
carta assorbente o altro materiale assorbente in
modo da eliminare ogni traccia di residuo di tampone di lavaggio. L’uso di un sistema di lavaggio
automatico dei micropozzetti ne assicurerà il giusto
lavaggio ed è consigliato.
NOTA: a causa dei vari tipi di tecniche di lavaggio
e di sistemi automatici, il numero dei lavaggi può
essere adeguato in modo da ottenere risultati ottimali. Ciascun laboratorio deve decidere il numero
di lavaggi più efficace per il proprio sistema di
lavaggio.
13
6. Una inadeguata rimozione dei residui del tampone
di lavaggio può causare un viraggio incoerente del
colore. Per ridurre al minimo i residui di tampone di
lavaggio, le strisce di micropozzetti devono essere
tamponate su carta assorbente.
7. I tempi di tutte le fasi sono cruciali. Tutti i campioni
di siero devono essere diluiti prima di iniziare la
procedura e devono essere distribuiti nei micropozzetti nel minor tempo possibile (non più di cinque
minuti). Le dimensioni dei lotti vanno fissate in modo
che la manipolazione del campione possa essere
realizzata comodamente entro questo lasso di
tempo. L’uso di una pipetta multicanale agevola il
maneggiamento dei campioni e dei reagenti ed è
consigliato.
8. Con la sola eccezione dell’ultima incubazione
(soluzione di substrato), ogni periodo di incubazione inizia con il completamento dell’erogazione
del campione o del reagente. L’incubazione della
soluzione di substrato deve durare esattamente
cinque minuti per ciascun pozzetto. Tutti i campioni
e i reagenti devono essere distribuiti con la stessa
sequenza e a tasso costante.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
CONTROLLO DELLA QUALITÀ
1. Il pozzetto di controllo del bianco deve avere un
valore di assorbanza inferiore a 0,250. Valori di
assorbanza del bianco superiori a 0,250 indicano
un lavaggio inadeguato o contaminazione dei
reagenti.
2. La lettura di assorbanza del pozzetto di controllo
in bianco (fila G) viene sottratta dalle letture di assorbanza dei pozzetti di controllo della procedura
RELISA® (RPC) (fila H) e di ciascun dei pozzetti
dell’antigene (file da A ad F). I valori netti inferiori a
zero sono considerati come valori zero.
3. Il pozzetto di controllo della RELISA® (RPC) (fila H)
dovrebbe avere una assorbanza netta superiore a
0,300. Valori di assorbanza inferiori a 0,300 indicano
un viraggio inadeguato del colore ed una sequenza non valida. Il viraggio inadeguato del colore in
genere è dovuto all’uso di reagenti freddi o ad un
tempo non esatto di una o più fasi dell’analisi. Portare i reagenti a temperatura ambiente (19-23°C) e
ripetere la fase prestando particolare attenzione al
tempo di tutte le fasi.
4. Per ottenere il valore di ciascun antigene in unità
ENA, ciascun valore di assorbanza netto viene
moltiplicato per 100.
5. Il siero di controllo positivo è un pool di siero umano
contenente gli anticorpi diretti contro tutti i sei
autoantigeni di questo test. Ciascun pozzetto di
antigene dovrebbe avere un valore di 30 ENA unità
o più.
6. Il siero di controllo negativo è un pool di siero
umano che non contiene gli anticorpi diretti contro
uno dei sei autoantigeni di questa analisi. Ciascun
pozzetto di antigene dovrebbe avere un valore
inferiore a 20 unità ENA.
7. Ciascun laboratorio deve fissare la frequenza di
esecuzione dei sieri di controllo positivi e negativi in base alla frequenza dei test dei pazienti e
all’esperienza dello stesso laboratorio con questa
analisi.
Interpretazione dei risultati del paziente
1. Questa è un’analisi qualitativa. I livelli di anticorpi
rilevati non hanno alcun significato clinico noto e i
valori delle unità ottenuti in questa analisi tendono
semplicemente a dividere i pazienti nei tre ampi
gruppi che seguono. I pozzetti di campioni di
pazienti che hanno valori calcolati superiori a 30
unità ENA sono considerati positivi. I pozzetti di
campioni di pazienti che hanno valori calcolati
inferiori a 20 unità ENA sono considerati negativi.
I valori tra 20 e 30 unità sono considerati al limite
(borderline) della positività e vanno ripetuti.
Ciascun laboratorio deve fissare il propria range
di riferimento e i propri valori di cut-off sulla base
dei gruppi di pazienti oggetto del test. I valori delle
unità sono influenzati da fattori inerenti ai pazienti,
da situazioni meccaniche (come ad esempio, la
precisione e l’accuratezza della pipettatura) e
dalle condizioni di analisi (come ad esempio, la
temperatura e il tempo delle fasi).
2. I pozzetti Sm e Sm/RNP sono usati assieme per
definire la presenza di questi due autoanticorpi. Se
il pozzetto Sm/RNP è positivo e quello Sm è negativo, il paziente ha anticorpi diretti contro l’RNP. Se
entrambi i pozzetti sono positivi, con valori quasi
uguali, il paziente ha anticorpi anti-Sm. Se entrambi
i pozzetti sono positivi, e il pozzetto Sm/RNP è di 30
14
��
��
unità ENA o di un numero superiore a quello del
pozzetto Sm, ciò indica la presenza di autoanticorpi
Sm e RNP. La presenza di entrambi gli anticorpi
può essere confermata usando il sistema di analisi
ad immunodiffusione AUTO-ID® della Immuno
��
� � ��di catalogo 6030.
Concepts,
numero
� �sono
��
3. Gli altri��
pozzetti
rivestiti con antigeni monospecifici
purificati
per affinità e reagiscono solo
��
� � ��
con l’anticorpo
�� omologo.
�� Comunque, sieri dei
pazienti��
con multiple
specificità di anticorpi sono
� � ��
comunemente osservabili nell’SLE e in altre sindromi
��
autoimmuni, quindi un singolo siero può mostrare
�� positiva
� ��in��
una reazione
più di un pozzetto.
��
�
� ��
��
4. I pozzetti sono rivestiti
con antigeni
purificati per
��
affinità nell’ordine ��
che segue,
dalla parte superiore
(pozzetto A e estremità a striscetta uniforme della
striscia) alla parte inferiore (pozzetto H e estremità a
striscetta dentellata della striscia).
��
��
��
��
��
��
��
��
��
RIPORTO DEI RISULTATI
��
� riportati
� �� come positivi o negativi
I risultati devono
essere
� antigeni
� ��
per anticorpi ��
contro gli
nucleari estraibili. I
��non
� � ��
valori degli anticorpi
hanno alcun significato clinico
noto.
��
��
VALORI ATTESI
��
��
L’incidenza degli autoanticorpi contro i differenti an� ��
tigeni nucleari��
varia a�seconda
del��
gruppo di pazienti
��
��reumatiche
e dell’incidenza clinica delle patologie
cliniche in quel gruppo. L’associazione degli anticorpi a
specifiche patologie reumatiche è riassunta in
tabella 1.
��
��
RANGE DI RIFERIMENTO
��
Il range di riferimento
fu fissato
analizzando i sieri di 206
��
� � ��
donatori di sangue
sani, 105
��
� �femmine
�� e 101 maschi,
nessuno dei quali aveva alcuna storia nota di patologie
��
reumatiche. Inoltre furono ottenuti dati da 143 pazienti
��
con patologia reumatica che avevano anticorpi
� questa
� ��
��
contro uno o ��
più antigeni di
analisi
ma erano
�� Sulla base
negativi per gli anticorpi contro��
altri antigeni.
di questi dati, i normali valori di cut-off furono fissati a
meno di 20 unità ENA. La buona pratica di laboratorio
vuole che ciascuno fissi i range normali sulla base dei
� � ��
propri gruppi��
di pazienti
e di altri fattori locali.
��
��
LIMITI DEL TEST
��
1. La diagnosi
non può
essere fatta solo sulla base di
��
� � ��
anticorpi diretti contro gli antigeni nucleari estraibili.
��
Il medico deve interpretare questi risultati con��
frontandoli con l’anamnesi e i sintomi del paziente, i
� � ��
��
dati fisici ��
e altre procedure
diagnostiche.
��
2. La cura non va iniziata��
sulla sola
base di un test
positivo per gli anticorpi anti-ENA. Prima di iniziare
qualunque trattamento devono essere considerate indicazioni cliniche, altri risultati di laboratorio e
l’impressione clinica del medico.
3. Alcuni pazienti con immunopatie hanno livelli di
anticorpi contro gli antigeni nucleari estraibili non
rilevabili o insignificanti e alcuni soggetti possono
avere livelli alti di anticorpi diretti contro gli antigeni
nucleari estraibili ma poca o nessuna evidenza
di patologia clinica. Il medico deve interpretare
i risultati delle analisi degli anticorpi anti-antigeni
nucleari estraibili confrontandoli con l’anamnesi e
i sintomi del paziente, i dati fisici e altre procedure
diagnostiche.
4. I livelli di anticorpi rilevati con questo sistema di
analisi non indicano necessariamente la gravità o
la durata della patologia.
CARATTERISTICHE PRESTAZIONALI
Il test di screening RELISA® della Immuno Concepts
fu confrontato con altre analisi ELISA simili presenti sul
mercato, con test doppi ad immunodiffusione e controimmunoelettroforesi eseguiti in laboratori di riferimento
e con i risultati del metodo immunoblot (Western Blot)
ottenuti con un metodo in-house. Nel definire i risultati
previsti o “corretti” per ciascun campione analizzato
furono presi in considerazioni i risultati di tutti i metodi
Sm
Highly specific marker antibody seen in 25-30% of SLE patients
e le diagnosi cliniche dei pazienti. Sulla base di questi
Connective
Tissue
U1-RNP
confronti, furono
ottenutiMixed
i dati che
seguono tabella
2.
Disease >95%; SLE 35%; lower frequency in
discoid lupus or progressive systemic sclerosis (PSS)
Le discrepanze nella specificità sono attribuite
SSA/Ro
syndrome
60-70%; SLE 50%
all’accresciuta
sensibilitàSSjögren's
delle analisi ELISA
in confronto
ai metodi “tradizionali”
la controimmuno-elettroSjögren's
syndrome 40-50%; SLE 15%
SSB/La come
foresi e l’immunodiffusione.
Scl-70
Highly specific marker antibody seen in 15-20% of PSS patients
REATTIVITÀ CROCIATA
Highly specific marker antibody seen in 25-30% of patients with
Jo-1
dermatomyositis
Per gli studi della reattivitàpolymyositis
crociata furono or
usati
sette
campioni. Questi campioni furono ben caratterizzati dal
metodo Western Blot, CIE e ad immunodiffusione come
sieri monospecifici per ciascuno degli autoanticorpi nel
test di Anticorps
screening RELISA®.
In nessuno di questi
campioni
Associattions
cliniques:
fu
notata contre:
reattività crociata. Tabella 3.
dirigés
Sm
RIPRODUCIBILITÀ
des patients atteints de LED
Per ciascuna delle sei specificità antigene, sei campioni
U1-RNPsu tre diversi
Connectivité
mixte
> 95 %, LED 35 %, fréquence plus faible en cas de
furono elaborati
numeri di lotto
di strisce
di antigene in tre diverse occasioni. Due dei campioni
lupus discoïde ou de sclérodermie généralisée
erano negativi ma vicini al valore di cut-off di 20 unità
ENA; dueSSA/Ro
campioni erano
positivi made
vicini
al valore60-70
di
Syndrome
Sjögren
%, LED 50 %
cut-off di 20 unità ENA e due campioni erano chiaraSyndrome
Sjögren
SSB/La
mente positivi
al di sopra
del livello dide
30 unità
ENA. 40-50 %, LED 15 %
��
��
��
In
nessun
caso
un
campione
negativo
mostrò
risultati
Anticorps
marqueur
extrêmement spécifique observé chez 15 à 20 %
Scl-70
��
��
��
positivi; tutti i campioni positivi “al limite”��
(borderline)
des patients
atteints
dee sclérodermie
généralisée
diedero coerentemente risultati
tra 20 e 30
unità ENA
i
campioni chiaramente
positivi diedero
coerentemente
Jo-1
Anticorps
marqueur
extrêmement spécifique observé chez 25 à 30 %
��
��
��
risultati ��
chiaramente positivi.
��
TABELLA
1
��
Anticorpi
��
diretti
contro:
��
�� Sm
des patients atteints de polymyosite ou de dermatomyosite
��
��
��
��
��
Associazione con patologie:
��
��
��
��
��
��
��
Anticorpo marcatore
specifico
visto
��altamente
�
��
� nel 25-30% di pazienti
��
con SLE
U1-RNP
��
Patologia mista del tessuto connettivo >95%; SLE 35%; minore frequenza
��
��
��
��
nel lupus discoide o nella sclerosi
progressiva sistemica (PSS)
��
��
��
��
Sindrome
60-70%;
SLE 50% ��
SSA/Ro
��
�� di Sjögren
��
��
��
��
Sindrome di Sjögren 40-50%; SLE 15%
SSB/La
��
��
��
��
��
�� marcatore
�� altamente
��
�� nel 15-20%
��di pazienti
��
Scl-70
Anticorpo
specifico visto
��
��
�
��
��
��
��
��
��
con PSS
��
��
��
��
��
��
�
��
Jo-1
Anticorpo
marcatore
altamente
specifico
visto
nel
25-30%
con
��
��
��
��
��
��di pazienti
��
��
�
��
polimiosite
o dermatomiosite
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
�
��
��
��
��
��
��
��
��
��
TABELLA
2
Anticuerpos
Asociación
a
enfermedades:
anti:
��
��
��
��
��
Sm
Anticuerpo marcador
muy específico
que se observa en��
el 25-30% de los
��
��
��
pacientes con LES
��
��
��
��
��
��
�
��
U1-RNP
Enfermedades mixtas del tejido conjuntivo >95%; LES 35%; menor
��
��
��
��
frecuencia
en el��
lupus discoide
progresiva ��
(ESP).
��
��
��o la esclerosis
�� sistémica
��
��
��
�
��
�
��
��
��
��
��
��
SSA/Ro
Síndrome de Sjögren 60-70%; LES 50%
��
��
�
��
��
�� de Sjögren
��
��
SSB/La
Síndrome
40-50%;��
LES 15%
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Scl-70
Anticuerpo marcador muy específico que se observa en el 15-20% de los
��
��
��
��
��
��
��
��
��
pacientes
��
�� con ESP
��
��
��
��
��
��
�� marcador
�� muy específico
��
��
Jo-1
Anticuerpo
que se
observa en��
el 25-30% de��
los
TABELLA��
3
��
��
pacientes con ��
polimiositis o dermatomiositis.
��
��
��
��
��
Antikörper
��
��
gegen:
��
��
��
��
��
��
��
Assoziierte
Erkrankung:
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
Hoch-spezifischer Marker-Antikörper,
der bei
der SLE-��
Sm
��25-30
� % ��
��
��
��
��
��
��
Patienten
auftritt
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
�� >95 %;��
�� häufig
��
U1-RNP
Gemischte
Bindegewebskrankheit
SLE
bei
��
�� 35
� %; weniger
��
��
��
��oder
��
��
�� (PSS)
��
discoidem
Lupus
progressiver
systemischer
��
��
�� Sklerose
��
��
��
��
��
��
��
��
SSA/Ro
Sjögren-Syndrome 60-70 %; SLE 50 %
��
��
��
��
��
��
��
40-50 %; SLE 15��
%
SSB/La
��
��
�� Sjögren-Syndrom
Scl-70
Marker-Antikörper,
der bei 15-20 %��
der PPS��
��
�� Hoch-spezifischer
��
Patienten auftritt
��
��Jo-1
��
��
��
��
Hoch-spezifischer
Marker-Antikörper,
der
der Patienten
��
��
��
��
��
� ��
�bei 25-30 %��
auftritt
mit Polymyositis
oder
Dermatomyositis
��
��
��
��
��
��
��
��
��
15
��
��
�
��
�
��
��
��
��
PROCEDURA DEL TEST ENA RELISA®
Prima dell’uso tutti i campioni, i reagenti (compresa la soluzione tampone di
lavaggio) e i micropozzetti devono essere a temperatura ambiente.
1.
Preparazione del modulo di protocollo:
specificare nel modulo di protocollo accluso nel kit l’identificazione di ciascuna
delle otto strisce di micropozzetti.
2.
Preparazione della soluzione di lavaggio tampone (PBS-Tween): sciogliere il
contenuto di una busta di tampone PBS in
un litro di acqua deionizzata o distillata. Aggiungere l’intero contenuto di un flacone
di concentrato di tampone di lavaggio al
contenitore di PBS sciolto. Mescolare bene.
La soluzione tampone di lavaggio può essere coperta e conservata a 2-10°C fino a
quattro settimane.
3.
Diluizione dei campioni dei pazienti: diluire i
campioni del paziente a 1:40 aggiungendo
25 µl di siero a 975 µl di diluente per campioni. Mescolare bene. I controlli sono forniti
alla diluizione di lavoro e non ne richiedono
una ulteriore.
4.
Preparazione delle strisce di micropozzetti:
rimuovere i micropozzetti necessari dalle
rispettive buste e metterli nel supporto.
I micropozzetti devono essere sistemati
saldamente nel supporto. Mettere il supporto su una superficie piana con le lettere
da A a H sulla sinistra e i numeri 1-12 sul
bordo superiore del supporto. Mettere le
strisce nel supporto in modo che l’estremità
dentellata della striscia coincida col piccolo cavicchio al margine inferiore del
supporto. Premere con forza su entrambe
le estremità delle strisce in modo che si
blocchino correttamente nel supporto.
I pozzetti ben sistemati nel supporto non
cadranno quando il supporto si capovolge.
Mettere l’etichetta all’estremità congelata
della striscia per indicare l’identificazione e
la posizione nel supporto.
5.
Erogazione delle diluizioni del siero: erogare 50 µl di campione diluito del paziente in
ciascuno degli otto pozzetti di una striscia
multiparametro.
6.
Incubazione delle strisce (30 minuti a
temperatura ambiente, ovvero 19-23°C):
incubare a temperatura ambiente per 30
minuti. Durante l’incubazione, le strisce
devono essere protette da correnti d’aria
o variazioni di temperatura. Le strisce possono essere eventualmente coperte con
nastro trasparente o con carta assorbente
per proteggerle dalla polvere o da altri
corpi estranei.
7.
Lavaggio delle strisce (consultare le note
procedurali generali 5 e 6): lavare i pozzetti
da 3 a 5 volte con soluzione di lavaggio
tampone PBS-Tween. Per il lavaggio manuale, aspirare il contenuto dei pozzetti, poi
riempirne ciascuno con soluzione tampone
di lavaggio. Evitare la contaminazione
incrociata dei pozzetti, particolarmente
nel primo lavaggio dopo l’aspirazione.
Drenare tutto il tampone di lavaggio dai
pozzetti capovolgendoli, poi eliminare i
residui con un brusco movimento “secco”
del polso. Ripetere le fasi di riempimento
e di drenaggio per 3-5 lavaggi in tutto. I
pozzetti devono poi essere passati con
forza su carta assorbente o altro materiale
assorbente in modo da eliminare ogni traccia di residuo di tampone di lavaggio.
8.
Erogazione del reagente anticorpo
enzimatico: erogare 50 µl di reagente
anticorpo enzimatico in ciascun pozzetto.
16
9.
Incubazione delle strisce (30 minuti a
incubare a temperatura ambiente per 30
minuti. Durante l’incubazione, le strisce
devono essere protette da correnti d’aria
o variazioni di temperatura. Le strisce possono essere eventualmente coperte con
nastro trasparente o con carta assorbente
per proteggerle dalla polvere o da altri
corpi estranei.
10.
Lavaggio delle strisce: lavare i pozzetti
da 3 a 5 volte con soluzione di lavaggio
tampone PBS-Tween. Per il lavaggio manuale, aspirare il contenuto dei pozzetti, poi
riempirne ciascuno con soluzione tampone
di lavaggio. Evitare la contaminazione
incrociata dei pozzetti, particolarmente
nel primo lavaggio dopo l’aspirazione.
Drenare tutto il tampone di lavaggio dai
pozzetti capovolgendoli, poi eliminare i
residui con un brusco movimento “secco”
del polso. Ripetere le fasi di riempimento
e di drenaggio per 3-5 lavaggi in tutto. I
pozzetti devono poi essere passati con
forza su carta assorbente o altro materiale
assorbente in modo da eliminare ogni traccia di residuo di tampone di lavaggio.
11.
Erogazione della soluzione substrato:
usando un timer per assicurare intervalli coerenti, erogare 50 µl di soluzione substrato
in ciascun pozzetto. La soluzione substrato
deve essere aggiunta a tasso regolare in
modo che ciascun pozzetto sia incubato
esattamente per lo stesso tempo (cinque
minuti). La soluzione substrato nei pozzetti
incubati con campioni positivi virerà al
blu e la soluzione nei pozzetti incubati con
campioni negativi sarà da incolore a blu
molto chiaro.
12.
Incubazione delle strisce (5 minuti esatti a
incubare a temperatura ambiente per
cinque minuti. Durante l’incubazione, le
strisce devono essere protette da correnti
d’aria o variazioni di temperatura.
13.
Erogazione del reagente bloccante: dopo
che il primo pozzetto è stato incubato per
cinque minuti esatti, aggiungere 50 µ di reagente bloccante nello stesso ordine e allo
stesso tasso con cui era stato aggiunto ai
pozzetti la soluzione substrato. Al momento
dell’aggiunta del reagente bloccante, la
soluzione di substrato blu vira al giallo e
quella incolore resta incolore.
14.
Lettura dell’assorbanza dei pozzetti: entro
30 minuti dall’aggiunta del reagente bloccante, i pozzetti devono essere letti in uno
spettrofotometro per la lettura della piastra.
I pozzetti vengono letti a 450 nm rispetto al
pozzetto di controllo del bianco. Se è disponibile uno spettrofotometro a lunghezza
d’onda doppia, la lunghezza d’onda per il
filtro di riferimento deve essere 600-650 nm.
La lettura dei micropozzetti a 450 nm senza
filtro di riferimento avrà come risultato valori
di assorbanza più alti.
PER ASSISTENZA TECNICA:
+1 916-363-2649
oppure a mezzo e-mail:
[email protected]
ENA RELISA®
SISTEMA MULTIPARAMÉTRICO DE DETECCIÓN SELECTIVA
DE ANTICUERPOS ANTI Sm RNP SSA SSB Scl-70 Jo-1
PARA USO DIAGNÓSTICO IN VITRO
RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA
Uso previsto: Se trata de un sistema de análisis inmunoenzimático (EIA) para la detección de anticuerpos
contra los antígenos nucleares extraíbles Sm (Smith),
RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y and Jo-1 en suero humano. Los resultados de esta prueba se pueden utilizar
como complemento del diagnóstico de enfermedades
autoinmunitarias.
Los anticuerpos anti-ENA se han asociado a diversos síndromes autoinmunitarios, y parecen tener un
significado diagnóstico y/o pronóstico en la esclerosis
sistémica (1, 2), las enfermedades mixtas del tejido
conjuntivo (3-5), el síndrome de Sjögren (6, 7), la polimiositis (8), la dermatomiositis (9), el lupus eritematoso
sistémico (5) y la artritis reumatoide (10). Se ha utilizado
el análisis de anticuerpos antinucleares (ANA) para
hacer una detección selectiva de estos anticuerpos,
pero en dicho análisis no se especifica el anticuerpo, y
algunos anticuerpos contra determinados ENA no dan
positivo en el análisis de ANA (11, 12). Por eso es muy
recomendable realizar una evaluación secundaria de
confirmación de los anticuerpos anti-ENA (13).
El antígeno Sm (Smith) fue identificado en 1966 por Tan
y Kunkel como una glucoproteína no histona soluble
en suero salino, que no depende del ADN ni del ARN
para su poder antigénico (14). Se considera que los
anticuerpos contra el antígeno Sm son marcadores
serológicos específicos, debido a su elevado grado de
especificidad por el lupus eritematoso sistémico (LES).
Estos anticuerpos se observan en hasta el 30% de los
pacientes con LES, y se han asociado a nefropatías
activas y a cerebritis (15-17).
En el suero de pacientes con LES es frecuente
encontrar anticuerpos anti-Sm junto con anticuerpos
anti-U1-RNP (18, 19). Al contrario que los anticuerpos
anti-Sm, los anticuerpos anti-RNP no se consideran marcadores serológicos específicos, pues se encuentran
en pacientes con diversas enfermedades reumáticas
como LES, esclerodermia, síndrome de Sjögren y artritis
reumatoide. No obstante, los niveles elevados de anticuerpos anti-RNP presentan una elevada asociación
a un síndrome intermedio denominado enfermedad
mixta del tejido conjuntivo (EMTC). Los pacientes con
EMTC se caracterizan por una combinación de datos
clínicos que se observan en el LES, la esclerodermia y la
polimiositis. A menudo, estos pacientes demuestran una
buena respuesta al tratamiento con corticosteroides,
y presentan una incidencia menor de enfermedades
renales que los pacientes con LES (20, 21).
Originalmente, SSA y SSB fueron descritos como antígenos nucleares de proteínas del ARN en pacientes
con síndrome de Sjögren (6, 7). Ro y La fueron descritos
como antígenos citoplásmicos de proteínas del ARN
en pacientes con LES (22, 23). En la actualidad se suele
aceptar que SSA y Ro son análogos, que SSB y La también lo son, y que estos antígenos se encuentran tanto
en el núcleo como en el citoplasma. Se encuentran anticuerpos contra SSA/Ro solo o contra SSA/Ro y SSB/La
en hasta el 62% de los pacientes con lupus cutáneo
subagudo (24), y en el 85% de los pacientes con
síndrome de Sjögren que presentan vasculitis (25). Se
observan anticuerpos contra SSA/Ro solo en pacientes
con déficit homozigótico de la fracción C2 del complemento (26), en pacientes con cirrosis biliar primaria que
desarrollan síndrome de Sjögren (27) y en hasta dos
tercios de los pacientes con “LES sin ANA” (28).
Se ha descubierto que el antígeno Scl-70 es una enzima
celular, la ADN topoisomerasa I, una proteína auxiliar
de la ADN polimerasa delta (29). Se han observado
anticuerpos anti-Scl-70 en hasta el 56% de los pacientes
con esclerosis sistémica progresiva (ESP), sobre todo en
el subgrupo que presenta esclerodermia difusa (30). Se
considera que estos autoanticuerpos son marcadores
de la ESP, pues no se observan en otras enfermedades
del tejido conjuntivo.
Los anticuerpos anti-Jo-1, que es la enzima celular
histidil ARNt sintetasa, se encuentran en el 25-30% de los
pacientes con polimiositis o dermatomiositis, pero no
en otras miopatías (11, 31). También se ha demostrado
que los anticuerpos anti-Jo-1 presentan una elevada
asociación con las neumopatías intersticiales que se
observan en asociación a las miositis (31).
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
Se trata de un EIA cualitativo indirecto. La superficie de
los micropocillos ha sido recubierta con un preparado
estabilizado de antígenos nucleares extraíbles purificados en función de su afinidad, que actúa como
antígeno en este sistema. Se disponen muestras diluidas
de los pacientes en los micropocillos, y se incuban permitiendo que los anticuerpos específicos de la muestra
reaccionen con el antígeno de la fase sólida. Tras lavar
para retirar el anticuerpo no ligado y otras proteínas del
suero, se incuban los pocillos con anticuerpos humanos
de cabra, marcados con peroxidasa de rábano. El
preparado de anticuerpos conjugados con peroxidasa
de rábano que se incluye en sistema de evaluación es
específico de las cadenas ligeras y pesadas de la IgG
humana.
Tras la incubación con los conjugados de peroxidasa
de rábano, y si los resultados son positivos, se forma
un complejo estable con tres partes, a saber: Este
complejo esta compuesto por anticuerpo antihumano
conjugado con peroxidasa de rábano unido al anticuerpo anti-ENA humano, unido a su vez al antígeno
estabilizado en la superficie de plástico.
Tras otro paso de lavado, se detecta el complejo
añadiendo una solución de tetrametilbenzidina
(TMB) y H2O2 como sustrato cromógeno. El grado de
aparición del color en cada pocillo es proporcional
a la concentración de anticuerpos anti-ENA en cada
muestra de suero. Cada micropocillo es analizado en
un espectrofotómetro a 450 nm.
COMPONENTES DEL SISTEMA (MATERIALES SUMINISTRADOS)
Conservación: Todos los componentes deben conservarse en refrigerador a 2-10 ºC. No congelar.
Estabilidad: Todos los componentes son estables al
menos durante 12 meses a partir de la fecha de fabricación. No utilice los componentes pasada la fecha
de caducidad.
REACTIVOS
Tiras de micropocillos recubiertas con antígeno nuclear
extraíble: Nº de catálogo 7008-09. Tiras de ocho
pocillos recubiertos con soluciones estabilizadas de
antígenos nucleares extraíbles purificados en función
de su afinidad. Cada tira de ocho pocillos va en una
bolsa de aluminio individual sellada.
Disolvente de muestras: Número de catálogo 7015 (15
ml). Disolvente para muestras tamponado patentado,
para disolver las muestras de los pacientes.
Reactivo enzimático para anticuerpos, específico de
las cadenas ligeras y pesadas de la IgG humana:
Número de catálogo 7009-09 (6 ml). IgG antihumana
de cabra (L y P), conjugada con peroxidasa de rábano
(HRP). Listo para usar.
Solución de sustrato: Número de catálogo 7035 (6 ml).
Solución de sustrato enzimático específica de HRP, que
contiene 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina (TMB) estabilizada
y peróxido de hidrógeno (H2O2). Listo para usar.
Reactivo de parada: Número de catálogo 7033 (6 ml).
Reactivo de parada patentado para los sistemas de
análisis EIA de Immuno Concepts. Listo para usar. PRECAUCIÓN: Corrosivo. Este reactivo contiene ácido clorhídrico y ácido sulfúrico (menos del 3% de cada uno,
por volumen) y debe ser manipulado con precaución.
Manténgase fuera del alcance de los niños. En caso de
contacto con los ojos, lavar inmediatamente con agua
abundante y acudir al médico. No añadir agua a este
reactivo en ningún caso.
Control positivo para múltiples parámetros de ENA:
Número de catálogo 7021-09 (1 ml). Suero de control
positivo humano que contiene anticuerpos contra los
antígenos Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 y Jo-1. Este
suero se presenta en dilución de trabajo, listo para
usar. Este reactivo contiene azida sódica al 0,1 % como
conservante.
Control negativo para ENA: Número de catálogo 7031
(1 ml). Suero de control negativo humano que no contiene anticuerpos contra los antígenos Sm, RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 y Jo-1. Este suero se presenta en dilución
de trabajo, listo para usar. Este reactivo contiene azida
sódica al 0,1 % como conservante.
17
ELEMENTOS NO REACTIVOS
Soporte para micropocillos
Solución tampón de lavado:
Tampón PBS: Nº de catálogo 1011. Polvo salino tamponado con fosfato (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Cada bolsa
contiene polvo tampón suficiente para formar 1 litro.
(Se suministran dos bolsas de polvo tampón con cada
placa de 96 micropocillos, en kits de análisis completos).
Concentrado de tampón de lavado: Número de catálogo 1031 (10 ml). Solución de Tween 20 al 5%, para
utilizar en el tampón de lavado. (Se suministran dos
viales de concentrado de tampón con cada lámina
de 96 micropocillos, en kits de análisis completos).
Preparación: Disuelva el contenido de una bolsa de
polvo tampón en un litro de agua desionizada o destilada. Añada todo el contenido de un frasco de concentrado de tampón de lavado al PBS disuelto. Mezcle
bien y conserve en refrigerador a 2-10 ºC durante 4
semanas como máximo, o hasta que aparezcan signos
de contaminación u otras alteraciones visibles. La
solución tampón de lavado debe estar a temperatura
ambiente (19-23 ºC) antes de su empleo.
OTROS MATERIALES NECESARIOS (PERO QUE NO SE
SUMINISTRAN)
Pipetas volumétricas de precisión para dispensar
volúmenes de 25-1000 µl
Frasco flexible para añadir tampón de lavado a los
micropocillos, o un sistema de lavado automático
o semiautomático para micropocillos.
Envase de un litro para la solución tampón de
lavado PBS
Agua desionizada o destilada
Espectrofotómetro de lectura de placas capaz de
interpretar absorbancia a 450 nm
Probetas para preparar las diluciones de suero
Papel secante o toallas de papel
Pipeta multicanal capaz de dispensar a 8 pocillos
Guantes de látex desechables
Cronómetro
PRECAUCIONES
1. Todos los materiales de procedencia humana
utilizados en este producto han sido analizados en
busca de anticuerpos con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), el virus de la inmunodeficiencia humana-2 (VIH-2), el virus de la hepatitis
C (VHC) y el antígeno de superficie de la hepatitis
B (HBsAG) con métodos homologados por la FDA,
obteniendo resultados negativos (no reactivos en
varias ocasiones) en todos los casos. Pero no existe
ningún método de análisis que pueda garantizar
por completo la ausencia de VIH-1, VIH-2, hepatitis
C, hepatitis B u otros agentes infecciosos. Por eso,
todos los materiales del kit deben ser manipulados
como si fueran infecciosos.
2. Todas las muestras de paciente deben ser manipuladas según el nivel 2 de bioseguridad, según
se recomienda en el manual de los Centers for
Disease Control/National Institutes of Health para
toda muestra de suero o sangre humana potencialmente infecciosa: Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories, 1984 Edition.
3. La disolución de los componentes o su sustitución
por otros distintos de los suministrados con el
sistema puede arrojar resultados incoherentes.
4. En los sueros de control se emplea azida sódica
(0,1 %) como conservante. La azida sódica puede
reaccionar con las conducciones de plomo o
cobre y formar sales de azidas metálicas muy explosivas. Al eliminar los reactivos, lavar con grandes
volúmenes de agua del grifo para evitar que
queden residuos en las tuberías. La azida sódica es
venenosa y puede ser tóxica en caso de ingestión.
5. Este kit es para uso diagnóstico in vitro.
6. No pipetee nunca con la boca y evite el contacto
de los reactivos y las muestras con la piel y las mucosas. En caso de contacto, lávese con un jabón
germicida y agua abundante.
7. Esta prohibido fumar, comer o beber en las zonas
de manipulación de las muestras o los reactivos del
kit.
8. Evite salpicaduras y la generación de aerosoles en
todo momento.
9. Si los tiempos de incubación y las temperaturas
no son los especificados, los resultados pueden ser
erróneos.
10. La contaminación cruzada de los reactivos o
de las muestras puede dar resultados falsos. Las
18
muestras deben permanecer en los micropocillos
durante el análisis.
11. Los elementos de vidrio reutilizables deben ser
lavados y enjuagados a fondo para eliminar los detergentes antes de su uso. Todos los elementos de
vidrio deben estar limpios y secos antes de su uso.
12. Todos los reactivos, micropocillos y muestras deben
estar a temperatura ambiente (19-24 ºC) antes de
su uso.
13. Para manipular las muestras y los reactivos debe
utilizar guantes de látex desechables, y cuando
acabe deberá lavarse bien las manos.
14. La contaminación microbiana de los reactivos o
de las muestras puede dar resultados falsos.
15. El reactivo de parada es corrosivo y puede
producir quemaduras. Este reactivo contiene ácido
clorhídrico y ácido sulfúrico (menos del 3% de
cada uno, por volumen) y debe ser manipulado
con precaución. Manténgase fuera del alcance
de los niños. En caso de contacto con los ojos,
lavar inmediatamente con agua abundante y
acudir al médico. No añadir agua a este reactivo
en ningún caso.
OBTENCIÓN DE MUESTRAS
Obtención: La muestra ideal es suero. Se obtendrán
aproximadamente 5 ml de sangre por venipunción
aséptica, con un tubo de vacío estéril u otro sistema de
obtención adecuado. Deje que la sangre coagule a
temperatura ambiente (19-23 ºC). Se separará el suero
del coágulo por centrifugado cuanto antes, para que
la hemólisis sea mínima.
Sustancias que interfieren: No se utilizarán sueros que
muestren grados elevados de hemólisis, ictericia,
lipemia o crecimiento microbiano, pues en todas esas
circunstancias se pueden producir resultados aberrantes. Si la muestra presenta partículas visibles, deben ser
eliminadas por centrifugado antes de la prueba.
Conservación: Los sueros se pueden conservar a 2-10
ºC durante una semana como máximo. Si el análisis se
posterga, los sueros deben conservarse congelados a
una temperatura de –20 ºC o inferior. No se utilizarán
refrigeradores ni congeladores con sistema “auto-frost”
(eliminación automática de la escarcha).
PRECAUCIÓN: Si las muestras son sucesivamente
congeladas y descongeladas, se pueden obtener
resultados falsos positivos y negativos.
OBSERVACIONES GENERALES SOBRE EL PROCEDIMIENTO
1. Es muy importante que todos los componentes
del kit y las muestras de suero estén a temperatura
ambiente (19-23 ºC) antes de utilizarlos. Para que
un litro entero de tampón de lavado sacado del
refrigerador alcance los 20 ºC, puede ser necesario
calentar durante varias horas. Si las temperaturas
de incubación son superiores o inferiores a las
recomendadas puede que los resultados no sean
precisos. Las muestras y reactivos no utilizados
deben ser devueltos al refrigerador.
2. Mezcle bien los reactivos antes de utilizarlos, dando
la vuelta al envase con suavidad. No agite ni
remueva los reactivos. Evite que se forme espuma.
3. Para preparar las diluciones de muestras, limpie la
punta de las pipetas antes de utilizarlas para poner
suero en el disolvente. Si queda muestra adherida
al exterior de la punta de la pipeta, los resultados
pueden variar.
4. Se recomienda utilizar una pipeta multicanal
porque con ella la dispensación del reactivo y
los tiempos de incubación y reacción son más
uniformes.
5. Es extremadamente importante lavar bien los
pocillos. Si no es así, los valores de fondo serán muy
elevados, lo que se puede traducir en resultados
falsos positivos. Para el lavado manual, aspire el
contenido de los pocillos y a continuación lave
cada uno con solución tampón de lavado. Evite
la contaminación cruzada de los pocillos, sobre
todo en el lavado siguiente a la aspiración. Elimine
todo el tampón de los pocillos dándoles la vuelta;
los residuos de tampón de lavado se quitan con
un movimiento brusco de la muñeca. Repita estos
pasos hasta un total de 3 a 5 lavados. A continuación, se pasará con fuerza una toalla de papel u
otro material absorbente por los pocillos para retirar
todo vestigio de tampón de lavado. Se recomienda utilizar un sistema de lavado automático
de los micropocillos, ya que así su limpieza queda
garantizada.
NOTA: Como existen diversas técnicas de lavado
��
��
aproximadamente
�� iguales, el paciente tiene anticuerpos
anti-Sm.
Si los��
dos pocillos son positivos y
��
� � ��
el pocillo Sm/RNP presenta 30 unidades ENA o una
��
cifra superior a la del pocillo Sm, es indicativo de la
�� anti-Sm y anti-RNP.
presencia de autoanticuerpos
y de sistemas automáticos, hay que ajustar el
número de lavados para que los resultados sea
óptimos. Cada laboratorio determinará el número
de lavados más eficaz para su sistema de lavado.
6. Si no se elimina todo el tampón puede que la aparición de color no sea homogénea. Para ello, hay
que limpiar con fuerza las tiras de micropocillos,
secándolas con papel secante o toallas absorbentes.
7. El tiempo de cada paso es fundamental. Antes de
iniciar el procedimiento se disolverán las muestras
de suero, que deben ser dispuestas en los micropocillos en el menor tiempo posible (no más de cinco
minutos). Los tamaños de lote deben determinarse
de forma que se puedan manipular las muestras en
este período de tiempo con comodidad. Se recomienda utilizar pipetas multicanal, pues facilitan la
manipulación de las muestras y los reactivos.
8. A excepción de la última incubación (solución de
sustrato), cada período de incubación empieza al
finalizar la dispensación de la muestra o el reactivo.
La incubación de la solución de sustrato debe durar exactamente cinco minutos para cada pocillo.
Todas las muestras y reactivos deben dispensarse
con la misma secuencia y a velocidad constante.
La presencia de ambos anticuerpos se puede confirmar con el sistema de inmunodifusión AUTO-ID®
de Immuno Concepts, número de catálogo 6030.
3. Los demás pocillos están recubiertos con antígenos
��
monoespecíficos purificados en función de su
��
� � ��con el anticuerpo
afinidad,
y sólo reaccionan
��
��
homólogo.
Pero �
en� el
LES y otros síndromes auto��
� � ��
inmunitarios
es frecuente
ver sueros de pacientes
con múltiples
anticuerpos,
��
� � �� por lo que un suero
individual
puede�dar
una reacción positiva en más
��
� ��
de un��
pocillo. � � ��
4. Los pocillos están recubiertos con antígenos puri��
ficados en función de su afinidad, en el siguiente
��
orden, de arriba (pocillo A, y extremo de la tira
continuo) a abajo (pocillo H, y extremo de la tira
con escotaduras):
��
��
��
��
��
��
��
��
��
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
CONTROL DE CALIDAD
1. El pocillo de control vacío debe presentar un valor
de absorbancia inferior a 0,250. Si los valores de absorbancia en el pocillo vacío son superiores a 0,250,
ello indica que el lavado no ha sido adecuado o
que se han contaminado los reactivos.
2. Se resta la absorbancia del pocillo de control
vacío (fila G) de la absorbancia del pocillo de
verificación del procedimiento RELISA® (RPC) (fila
H) y de cada pocillo con antígeno (filas A a F). Los
valores netos inferiores a cero se consideran cero.
3. La absorbancia neta del pocillo de verificación del
procedimiento RELISA® (RPC) (fila H) debe ser superior a 0,300. Si es inferior, la aparición del color no
es adecuada y el ciclo no es válido. Si la aparición
del color no es adecuada suele deberse a que los
reactivos están fríos o a que la duración de uno o
más pasos de la prueba no ha sido correcta. Deje
que los reactivos alcancen la temperatura ambiente (19-23 ºC) y repita el ciclo prestando especial
atención a la duración de todos los pasos.
4. Los valores netos de la absorbancia se multiplican
por 100 para obtener el valor de cada antígeno en
unidades ENA.
5. El suero de control positivo es una mezcla de sueros
humanos que contiene anticuerpos contra los seis
autoantígenos de este análisis. Cada pocillo con
antígeno debe mostrar un valor de 30 unidades
ENA o más.
6. El suero de control negativo es una mezcla de sueros humanos que no contiene anticuerpos contra
ninguno de los seis autoantígenos de este análisis.
Cada pocillo con antígeno debe mostrar un valor
inferior a 20 unidades ENA.
7. Cada laboratorio establecerá la frecuencia con
la que debe utilizar los sueros de control positivo y
negativo, en función de la frecuencia con la que
se analicen muestras de pacientes y de la experiencia del laboratorio con esta prueba.
NOTIFICACIÓN DE RESULTADOS
Se indicará si��
el resultado �
es�positivo
o negativo para
��
los anticuerpos correspondientes a los antígenos nucle��
ares extraíbles. Los niveles de anticuerpos carecen de
��
significado clínico conocido.
��
��
VALORES ESPERADOS
��
La incidencia
de autoanticuerpos
los diversos
��
� � ��contra
��
antígenos nucleares
varían
función ��
de la población
��
� en
� ��
de pacientes y de la incidencia
de enfermedades
��
��
reumáticas clínicas en esa población. En tabla 1 se
resume la asociación de los anticuerpos a las enfermedades reumáticas concretas.
��
LÍMITES DE ��
REFERENCIA
� � ��
��
Los límites de referencia se han establecido a partir de
��
� � ��
sueros de 206
donantes
de sangre sanos, 105 mujeres
��
� � ��
y 101 varones,
ninguno
de los cuales presentaba ante� � �� reumáticas. Además, se
cedentes de��
enfermedades
obtuvieron datos
de�143
pacientes
con enfermedades
��
� ��
��
reumáticas que
presentaban
anticuerpos
contra uno
��
� � ��
��
o más de los antígenos de��
estos análisis,
�� pero no para
los demás. Basándose en estos datos, se establecieron
los valores de corte normales en <20 unidades ENA. La
buena práctica exige que cada laboratorio establezca
sus propios límites de normalidad en función de su
población de pacientes y de otros factores locales.
LIMITACIONES DE LA PRUEBA
1. No es posible hacer un diagnóstico basándose sólo
en la detección de anticuerpos contra antígenos
nucleares extraíbles. El médico debe interpretar
estos resultados en el contexto de la historia y los
síntomas del paciente, los hallazgos físicos y otros
procedimientos diagnósticos.
2. No se debe iniciar un tratamiento basándose
exclusivamente en un resultado positivo del análisis
de anticuerpos con antígenos nucleares extraíbles.
Antes de iniciar un tratamiento hay que tener en
cuenta las indicaciones clínicas, otros hallazgos de
laboratorio y la impresión clínica del médico.
3. Algunos pacientes con enfermedades autoinmunitarias pueden presentar niveles indetectables o
insignificantes de anticuerpos contra los antígenos
nucleares extraíbles, y algunos individuos pueden
presentar niveles elevados con escasos o nulos
datos de enfermedad. El médico debe interpretar
estos resultados en el contexto de la historia y los
síntomas del paciente, los hallazgos físicos y otros
procedimientos diagnósticos.
4. El nivel de anticuerpos detectado con este sistema
de análisis no indica necesariamente la intensidad
o la duración de la enfermedad.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS DEL
PACIENTE
1. Se trata de un análisis cualitativo. Los niveles de
anticuerpos detectados carecen de significado
clínico, y las cifras obtenidas en unidades sólo
sirven para separar a los pacientes en los siguientes
tres grandes grupos: Los pocillos con muestras de
pacientes que presentan valores calculados superiores a 30 unidades ENA se consideran positivos. Los
pocillos con muestras de pacientes que presentan
valores calculados inferiores a 20 unidades ENA
se consideran negativos. Los valores entre 20 y
30 unidades se consideran positivos en el límite,
y obligan a repetir la prueba. Cada laboratorio
deberá establecer sus propios límites de referencia
y valores de corte, en función de la población de
pacientes evaluada. Los valores resultan afectados
por factores de los pacientes, consideraciones
mecánicas (como la exactitud y precisión del
pipeteado) y las condiciones del análisis (como la
temperatura y la cronología de los pasos).
2. Los pocillos de Sm y Sm/RNP se utilizan juntos para
determinar la presencia de estos dos autoanticuerpos. Si el pocillo Sm/RNP es positivo y el Sm es
negativo, el paciente tiene anticuerpos anti-RNP.
Si los dos pocillos son positivos y los valores son
CARACTERÍSTICAS DEL RENDIMIENTO
Se comparó el sistema de detección selectiva RELISA®
de Immuno Concepts con otros análisis ELISA similares
comercializados, con los análisis de doble inmunodi19
��
��
��
fusión y contrainmunoelectroforesis realizados en laboen ninguna de las muestras. Tabla 3.
ratorios de
referencia, y ��
con los resultados��
obtenidos
��
� ��
por inmunotransferencia (método de Western) con un
REPRODUCIBILIDAD
��los��
��
método local. Para determinar
resultados��
previstos
o “correctos”
para cada��
muestra evaluada
se tuvieron
seis muestras de cada uno de los seis
��
��
��Se
��analizaron
��
en cuenta los resultados de todos los métodos y el diantígenos con tres números de lote diferentes de tiras
��
��
��de
��antígeno,
�� en
� tres ocasiones diferentes. Dos muestras
agnóstico��
clínico del paciente.
Según��
estas
comparaciones, se obtuvieron
los
siguientes
datos.
Tabla
2.
fueron
negativas,
pero��
próximas al
valor��
de �corte
��
��
��
��
de 20 unidades ENA; dos muestras fueron positivas,
��
��
��
��
��
��
Las discrepancias en la especificidad se atribuyen
pero próximas al valor de corte de 20 unidades ENA;
al aumento de la sensibilidad de los análisis ELISA en
y otras dos fueron claramente positivas, con valores
��
��
comparación con los métodos tradicionales, como la
superiores a 30 unidades ENA. No hubo ningún caso de
contrainmunoelectroforesis
y la��
inmunodifusión.
muestra negativa
que
diera resultados positivos; todos
��
��
��
��
��
��
��
los demás
positivos “en el límite” dieron
resultados
��
REACTIVIDAD CRUZADA
uniformes
entre 20 y 30 unidades ENA;
y las muestras
��
��
��
claramente positivas dieron resultados claramente
��
��
�� positivos.
Se��
utilizaron
siete muestras
para estudios��
de reactividad
��
cruzada.
��Dichas muestras fueron bien caracterizadas
��
��
��
por inmunotransferencia de Western, CIE e inmuno��
��
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�
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difusión como sueros monoespecíficos para cada
uno de��
los autoanticuerpos
del
sistema
de
detección
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selectiva RELISA®. No se observó reactividad cruzada
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TABLA 1
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TABLA
2
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TABLA 3
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PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
DE ENA RELISA®
Todas las muestras (incluida la solución tampón de lavado) y los micropocillos deben estar a temperatura ambiente antes de su empleo.
1.
Preparación de la hoja de trabajo: Marque
la hoja de trabajo que se adjunta con el
kit, para indicar la identificación de cada
tira de ocho micropocillos.
2.
Preparación de la solución tampón de
lavado (PBS-Tween): Disuelva el contenido
de una bolsa de tampón PBS en un litro de
agua desionizada o destilada. Añada todo
el contenido de un frasco de concentrado
de tampón de lavado al envase de un litro
de PBS disuelto. Mezcle bien. La solución
tampón de lavado se puede tapar y conservar a 2-10 ºC durante cuatro semanas
como máximo.
3.
Muestras de pacientes diluidas: Disuelva las
muestras de pacientes a 1:40 añadiendo
25 µl de suero a 975 µl de disolvente de
muestras. Mezcle bien. Los controles se
entregan a la dilución de trabajo, por lo
que no es necesario disolverlos.
4.
Preparación de las tiras de micropocillos:
Saque de sus bolsas las tiras de micropocillos necesarias y colóquelas en el soporte.
Deben quedar firmemente sujetas en él.
Coloque el soporte sobre una superficie
sólida, de forma que las letras A-H queden
a la izquierda y los números 1-12 en el
borde superior del soporte. Ponga las tiras
en el soporte de forma que el extremo
con escotaduras se acople a la pequeña
clavija del borde inferior del soporte.
Apriete suavemente ambos lados de la
tira, de forma que quede bien sujeta en el
soporte. Si las tiras están bien colocadas
en el soporte, no se caen al darle la vuelta.
Marque el borde mate de la tira para
indicar la identificación del paciente y la
posición en el soporte.
5.
Dispensación de las diluciones de suero:
Ponga 50 µl de muestra del paciente diluida en cada uno de los ocho pocillos de
cada tira multiparamétrica.
6.
Incubación de las tiras (30 minutos a
temperatura ambiente, es decir, 19-23 °C):
Incube a temperatura ambiente durante
30 minutos. Durante la incubación, la temperatura no podrá sufrir cambios bruscos.
Si se desea se pueden tapar las tiras con
cinta transparente o con toallas de papel,
para protegerlas del polvo u otros cuerpos
extraños.
7.
Lavado de las tiras (véanse las Observaciones generales sobre el procedimiento
5 y 6): Lave los pocillos de 3 a 5 veces con
solución tampón de lavado PBS-Tween.
Para el lavado manual, aspire el contenido
de los pocillos y a continuación lave cada
uno con solución tampón de lavado. Evite
la contaminación cruzada de los pocillos, sobre todo en el lavado siguiente a
la aspiración. Elimine todo el tampón de
los pocillos dándoles la vuelta; los residuos
de tampón de lavado se quitan con un
movimiento brusco de la muñeca. Repita
estos pasos hasta un total de 3 a 5 lavados.
A continuación, se pasará con fuerza una
toalla de papel u otro material absorbente
por los pocillos para retirar todo vestigio de
tampón de lavado.
8.
9.
Incubación de las tiras (30 minutos a
temperatura ambiente, es decir, 19-23 °C):
Incube a temperatura ambiente durante
30 minutos. Durante la incubación, la temperatura no podrá sufrir cambios bruscos.
Si se desea se pueden tapar las tiras con
cinta transparente o con toallas de papel,
para protegerlas del polvo u otros cuerpos
extraños.
10.
Lavado de las tiras: Lave los pocillos de 3
a 5 veces con solución tampón de lavado
PBS-Tween. Para el lavado manual, aspire
el contenido de los pocillos y a continuación lave cada uno con solución tampón
de lavado. Evite la contaminación cruzada
de los pocillos, sobre todo en el lavado
siguiente a la aspiración. Elimine todo el
tampón de los pocillos dándoles la vuelta;
los residuos de tampón de lavado se quitan
con un movimiento brusco de la muñeca.
Repita estos pasos hasta un total de 3 a 5
lavados. A continuación, se pasará con
fuerza una toalla de papel u otro material
absorbente por los pocillos para retirar todo
vestigio de tampón de lavado.
11.
Dispensación de la solución sustrato:
Utilizando un cronómetro para que los
intervalos sean homogéneos, ponga 50 µl
de solución de sustrato en cada pocillo.
La solución de sustrato se incorporará a los
pocillos a velocidad constante, de forma
que todos se sometan al mismo tiempo de
incubación (cinco minutos). La solución de
sustrato incubada en pocillos con muestras
positivas se volverá de color azul, y si son
muestras negativas, serán incoloras o de
azul muy claro.
12.
Incubación de las tiras (5 minutos exactamente a temperatura ambiente, es decir,
19-23 °C): Incube a temperatura ambiente
durante 5 minutos exactamente. Durante
la incubación, la temperatura no podrá
sufrir cambios bruscos.
13.
Dispensación del reactivo de parada: Cuando el primer pocillo haya sido incubado
durante cinco minutos exactos, añada 50
µl de reactivo de parada a cada pocillo,
en el mismo orden y a la misma velocidad
en que se añadió la solución de sustrato
a los pocillos. Tras añadir el reactivo de
parada, la solución de sustrato azul se
volverá amarilla y la incolora permanecerá
tal cual.
14.
Interpretación de la absorbancia de los
pocillos: Treinta minutos después de añadir
el reactivo de parada, los pocillos deben
ser medidos en un espectrofotómetro de
lectura de placas. Los pocillos se medirán
a 450 nm, frente al pocillo sin control. Si
se dispone de un espectrofotómetro con
doble longitud de onda, la del filtro de
referencia debe ser de 600-650 nm. Si se
leen los micropocillos sin filtro de referencia,
los valores de la absorbancia serán más
elevados.
ASISTENCIA TÉCNICA:
916-363-2649
o correo electrónico:
[email protected]
Dispensación de reactivo con anticuerpos
enzimáticos: Ponga 50 µl de reactivo con
anticuerpos enzimáticos en cada pocillo.
21
RELISA® ENA
MULTIPARAMETER ANTIKÖRPER-SCREENING-TEST
NUR ZUR IN VITRO-DIAGNOSTIK
ZUSAMMENFASSENDE ERKLÄRUNG DES TESTS
VERWENDUNGSZWECK: Dies ist ein Enzymimmuntest
(EIA) für den Nachweis von Antikörpern gegen extrahierbare nukleäre Antigene vom Typ Sm (Smith), RNP,
SSA/Ro, SSB/La, Scl-70 und Jo-1 in Humanserum. Der Test
dient als Hilfestellung bei der Diagnose von Autoimmunerkrankungen.
ENA-Antikörper (extrahierbare nukleäre Antigene)
werden mit mehreren Autoimmunsyndromen in Verbindung gebracht und haben offenbar einen diagnostischen und/oder prognostischen Wert bei systemischer
Sklerose (1, 2), gemischter Bindegewebskrankheit (3-5),
Sjögren-Syndrom (6, 7), Polymyositis (8), Dermatomyositis (9), systemischem Lupus erythematosus (5) und
rheumatoider Arthritis (10). Der antinukleäre Antikörpertest (ANA) wird als Screening-Test für diese Antikörper
verwendet, gibt jedoch keinen Hinweis auf die Spezifität
der Antikörper, und Antikörper gegen einige ENA
weisen keine positiven ANA-Testwerte auf (11, 12). Es
wird deshalb dringend ein zweiter Bestätigungstest für
Antikörper gegen ENA empfohlen (13).
Das Sm (Smith) Antigen wurde 1966 von Tan und Kunkel
als kochsalzlösliches, nicht-histonisches Glykoprotein
identifiziert, das für seine Antigenizität nicht DNA- oder
RNA-abhängig ist (14). Antikörper gegen Sm gelten
wegen ihrer ausgeprägten Spezifität für systemischen
Lupus erythematosus (SLE) als spezifischer serologischer
Marker. Diese Antikörper treten bei bis zu 30 % der SLEPatienten auf und werden mit aktiver Nierenkrankheit
und Zerebritis (15-17) in Verbindung gebracht.
muntest. Die Oberfläche der Mikrotiterplatten wurde mit
stabilisierten Präparaten affinitätsbereinigter extrahierbarer nukleärer Antigene beschichtet, die im System als
Antigen-Substrat dienen. Verdünnte Patientenproben
werden in die Vertiefungen gegeben und inkubiert, so
dass in der Probe vorhandene spezifische Antikörper mit
dem gebundenen Antigen in der Festphase reagieren
können. Nicht gebundene Antikörper und andere Serumproteine werden abgewaschen und anschließend
werden die Vertiefungen mit antihumanen Antikörpern
(Ziege) inkubiert, die mit Meerrettich-Peroxidase markiert sind. Das im Testsystem enthaltene an MeerrettichPeroxidase konjugierte Antikörper-Präparat ist spezifisch
für schwere und leichte Ketten von humanem IgG.
Nach der Inkubation mit dem Meerrettich-Peroxidase-Konjugat wird in positiven Proben ein dreiteiliger
Komplex gebildet. Dieser Komplex besteht aus einem
an Meerrettich-Peroxidase konjugierten anti-HumanAntikörper, gebunden an einen Human-Anti-ENA-Antikörper, der wiederum an das auf der Plastikoberfläche
stabilisierte Antigen gebunden ist.
Nach einem weiteren Waschvorgang wird dieser
Komplex durch Addition einer Lösung aus Tetramethylbenzidin (TMB) und H2O2 als chromogenes Substrat
nachgewiesen. Der Grad der Farbentwicklung in
den Vertiefungen ist proportional zur Konzentration
von anti-ENA-Antikörpern in den Serumproben. Jede
Vertiefung wird in einem Spektrophotometer bei 450 nm
ausgewertet.
SYSTEMKOMPONENTEN (IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Aufbewahrung: Sämtliche Komponenten sollten bei 2-10
°C im Kühlschrank aufbewahrt werden. Nicht einfrieren.
Stabilität: Alle Komponenten sind bis mindestens
12 Monate nach Herstellungsdatum stabil. Keine
Komponenten nach Überschreiten des Verfallsdatums
verwenden.
Antikörper gegen Sm werden häufig zusammen
mit U1-RNP-Antikörpern im Serum von SLE-Patienten
nachgewiesen (18, 19). Anders als Antikörper gegen
Sm sind Antikörper gegen RNP nicht als spezifische
serologische Marker anzusehen, da sie bei Patienten
mit den verschiedensten rheumatischen Erkrankungen,
einschließlich SLE, Sklerodermie, Sjögren-Syndrom und
rheumatoider Arthritis, auftreten. Hochtitrierte RNPAntikörper allein werden jedoch überwiegend mit gemischter Bindegewebskrankheit (MCTD) in Verbindung
gebracht. Bei Patienten mit MCTD tritt typischerweise
eine Kombination der klinischen Merkmale auf, wie sie
für SLE, Sklerodermie und Polymyositis charakteristisch
sind. Diese Patienten zeigen häufig auch ein gutes
Ansprechen auf die Behandlung mit Kortikosteroiden
und im Vergleich zu SLE-Patienten eine geringere Häufigkeit von Nierenerkrankungen (20, 21).
REAKTIVE REAGENZIEN
Mit extrahierbarem nukleärem Antigen beschichtete
Mikrotiterplattenstreifen: Katalognummer 7008-09. Streifen mit acht Vertiefungen, mit einer stabilisierten Lösung
aus affinitätsbereinigten extrahierbaren nukleären
Antigenen beschichtet. Jeder Streifen ist einzeln in Folie
verpackt.
Probenverdünner: Katalognummer 7015 (15 ml). Spezieller gepufferter Probenverdünner zur Verdünnung der
Patientenproben.
SSA und SSB wurden ursprünglich als nukleäre RNAProteinantigene bei Patienten mit Sjögren-Syndrom
beschrieben (6,7). Ro und La wurden als zytoplasmische
RNA-Proteinantigene bei Patienten mit SLE beschrieben
(22, 23). Inzwischen wird allgemein akzeptiert, dass
SSA und Ro analog sind, dass SSB und La analog sind,
und dass diese Antigene sowohl im Nukleus als auch
im Zytoplasma vorkommen. Antikörper gegen SSA/Ro
allein oder SSA/Ro und SSB/La treten bei bis zu 62 %
der Patienten mit subakutem kutanem Lupus auf (24)
sowie bei 85 % der Patienten mit Sjögren-Syndrom, die
eine Vaskulitis entwickeln (25). Antikörper gegen SSA/Ro
allein treten bei Patienten mit homozygotem Defekt der
C2-Komplementärfraktion auf (26) sowie bei Patienten
mit primärer biliärer Leberzirrhose, die Sjögren-Syndrom
(27) entwickeln, und bei bis zu zwei Dritteln der Patienten mit „ANA-negativem SLE“ (28).
Das Scl-70 Antigen wurde als zelluläres Enzym, DNA
Topoisomerase I, ein zusätzliches Protein von DNA Polymerase delta (29) identifiziert. Über Antikörper gegen
Scl-70 in bis zu 56 % der Patienten mit progressiver systemischer Sklerose (PSS), insbesondere in der Untergruppe
von Patienten mit diffuser Sklerodermie (30), wurde
berichtet. Diese Autoantikörper gelten als Marker für
PSS, da sie in anderen Bindegewebskrankheiten nicht
festzustellen sind.
Antikörper gegen Jo-1, bei dem es sich um das ZellularEnzym Histidyl tRNA Synthetase handelt, sind in 25-30 %
der Patienten mit Polymyositis oder Dermatomyositis zu
finden, jedoch nicht in anderen Myopathien (11, 31).
Es hat sich gezeigt, dass Anti Jo-1 Antikörper in engem
Zusammenhang mit der interstitiellen Lungenkrankheit
stehen, die zusammen mit Myositis (31) auftritt.
Enzym-Antikörper-Reagens – spezifisch für schwere
und leichte Ketten aus Human-IgG: Katalognummer
7009-09 (6 ml). Ziegen-Anti-Human-IgG (H&L), an Meerrettich-Peroxidase (HRP) konjugiert. Gebrauchsfertiges
Reagens.
Substratlösung: Katalognummer 7035 (6 ml). HRPspezifische Enzymsubstratlösung, enthält stabilisiertes
3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin (TMB) und Wasserstoffperoxid (H2O2). Gebrauchsfertiges Reagens.
Stopplösung: Katalognummer 7033 (6 ml). Spezielle
Stopplösung für EIA-Testsysteme von Immuno Concepts.
Gebrauchsfertiges Reagens. ACHTUNG: Korrosiv. Dieses
Reagens enthält Chlorwasserstoff- und Schwefelsäure
(jeweils weniger als 3 % Volumenanteil) und sollte mit
Vorsicht gehandhabt werden. Für Kinder unzugänglich aufbewahren. Bei Kontakt mit Augen, sofort und
gründlich mit Wasser ausspülen und einen Arzt konsultieren. Dieses Reagens niemals mit Wasser verdünnen.
Multiparameter-ENA-Positivkontrolle: Katalognummer
7021-09 (1 ml). Human-Positivkontrolle mit Antikörpern
gegen Antigene vom Typ Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70 und Jo-1. Das Serum ist gebrauchsfertig verdünnt.
Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel.
ENA-Negativkontrolle: Katalognummer 7031 (1 ml).
Human-Negativkontrollserum, das keine Antikörper
gegen Antigene vom Typ Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La,
Scl-70 und Jo-1 enthält. Das Serum ist gebrauchsfertig
verdünnt. Dieses Reagens enthält 0,1 % Natriumazid als
Konservierungsmittel.
NICHT-REAKTIVE KOMPONENTEN
TESTPRINZIP
Streifenhalter
Dieser Test ist ein qualitativer, indirekter Enzym-Im22
Waschpufferlösung:
PBS-Puffer: Katalognummer 1011. Phosphat-gepuffertes
Kochsalzpulver (0,01 M, pH 7,4 ± 0,2). Jeder Beutelinhalt
reicht für 1 Liter gebrauchsfertigen Puffer. Zwei Beutel
je 96er-Mikrotiterplatte sind im Lieferumfang des Testkits
enthalten.
Mikrotiterstreifen und Proben auf Zimmertemperatur
(19-23 °C) gebracht werden.
13. Beim Arbeiten mit Proben und Reagenzien sind
grundsätzlich Einmal-Latexhandschuhe zu tragen.
Danach gründlich Hände waschen.
14. Eine mikrobielle Kontamination der Reagenzien
oder Proben kann das Ergebnis verfälschen.
15. Das Stoppreagens ist korrosiv und kann Verbrennungen verursachen. Dieses Reagens enthält Chlorwasserstoff- und Schwefelsäure (jeweils weniger als 3 %
Volumenanteil) und sollte mit Vorsicht gehandhabt
werden. Für Kinder unzugänglich aufbewahren. Bei
Kontakt mit Augen, sofort und gründlich mit Wasser
ausspülen und einen Arzt konsultieren. Dieses Reagens niemals mit Wasser verdünnen.
Waschpufferkonzentrat: Katalognummer 1031 (10
ml). 5 % Tween 20-Lösung zur Verwendung mit dem
Waschpuffer. (Zwei Fläschchen Pufferkonzentrat je
96er-Mikrotiterplatte sind im Lieferumfang des Testkits
enthalten.)
Herstellung: Inhalt eines Beutels mit Pufferpulver in
einem Liter deionisiertem oder destilliertem Wasser
auflösen. Den Inhalt einer ganzen Flasche Waschpufferkonzentrat in den aufgelösten PBS-Puffer hinzugeben.
Gut durchmischen und bei 2-10 °C bis zu vier Wochen
aufbewahren, oder bis Anzeichen von Kontamination
oder andere sichtbare Veränderungen zu erkennen
sind. Waschpufferlösung muss vor Gebrauch auf Raumtemperatur (19-23 °C) gebracht werden.
ZUSÄTZLICH ERFORDERLICHE MATERIALIEN (NICHT
IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN)
Präzisionspipetten für Volumina von 25-1000 µl.
Spritzflasche für die Zugabe von Waschpufferlösung
in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten, oder
(halb)automatisches Waschsystem für Mikrotiterplatten.
1-Liter-Behälter für die PBS-Waschpufferlösung.
Deionisiertes oder destilliertes Wasser.
Spektrophotometer für Mikrotiterplatten für Absorptionsmessungen bei 450 nm.
Teströhrchen zur Herstellung von Serumverdünnungen.
Saugpapier oder Papierhandtücher.
Mehrkanal-Pipette für bis zu 8 Vertiefungen.
Einmal-Latexhandschuhe.
Laborstoppuhr.
SICHERHEITSHINWEISE
1. Sämtliche für dieses Produkt verwendeten Materialien menschlichen Ursprungs wurden nach von
der FDA anerkannten Methoden negativ (nicht wiederholt reaktiv) auf Antikörper gegen HIV-1, HIV-2,
Hepatitis-C (HCV) und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg) getestet. Keine Testmethode kann
jedoch mit absoluter Sicherheit nachweisen, dass
keine HIV-1, HIV-2, Hepatitis-C oder Hepatitis-B-Viren
oder andere infektiöse Agenten vorhanden sind.
Daher sollten alle Kitbestandteile wie potenziell
infektiöse Materialien gehandhabt werden.
2. Alle Patientenproben sollten nach den Anforderungen für Biosafety Level 2 behandelt werden, wie für
potenziell infektiöses humanes Serum und andere
Blutbestandteile empfohlen in: Centers for Disease
Control / National Institutes of Health Manual:
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, Ausgabe 1984.
3. Ein Verdünnen der Bestandteile oder eine Zugabe
von nicht zum Kit gehörenden Reagenzien kann die
Qualität der Ergebnisse beeinträchtigen.
4. Die Kontrollseren enthalten als Konservierungsmittel
Natriumazid (0,1 %). Natriumazid kann mit Blei- oder
Kupferinstallationen reagieren und hochexplosive
Metallazide bilden. Beim Entsorgen der Reagenzien
mit reichlich Leitungswasser nachspülen, damit im
Abfluss keine Rückstände verbleiben. Natriumazid
ist giftig und kann bei Verschlucken toxisch wirken.
5. Der Kit ist ausschließlich zur In vitro-Diagnostik
bestimmt.
6. Niemals mit dem Mund pipettieren und Kontakt der
Reagenzien und Proben mit Haut und Schleimhäuten vermeiden. Bei Kontakt mit viel Wasser und
desinfizierender Seife waschen.
7. In Bereichen, in denen mit Patientenproben oder
Kitreagenzien gearbeitet wird, nicht rauchen, essen
oder trinken.
8. Verspritzen von Reagenzien und Erzeugung von
Aerosolen vermeiden.
9. Die angegebenen Inkubationszeiten und Temperaturwerte genau einhalten, andernfalls könnten die
Ergebnisse verfälscht werden.
10. Eine Kreuzkontamination der Reagenzien oder
Proben kann ebenfalls zu falschen Ergebnissen führen. Während der Tests müssen die Proben in den
Vertiefungen der Mikrotiterplatten verbleiben.
11. Wiederverwendbare Glasartikel müssen vor
Gebrauch gewaschen und gründlich ausgespült
werden, um sämtliche Waschmittelrückstände zu
entfernen. Die Glasartikel müssen vor Gebrauch
sauber und trocken sein.
12. Vor der Testdurchführung müssen alle Reagenzien,
PROBENGEWINNUNG
Probenentnahme: Nach Möglichkeit sollten Serumproben hergestellt werden. Dazu durch Venenpunktion in
ein steriles Vakuumröhrchen oder durch ein anderes
geeignetes Blutentnahmesystem aseptisch ca. 5 ml
Vollblut entnehmen. Das Blut bei Zimmertemperatur (1923 °C) gerinnen lassen. Danach muss das Serum so bald
wie möglich durch Zentrifugation abgetrennt werden,
um Hämolyse zu vermeiden.
Störsubstanzen: Stark hämolytische, lipämische oder
durch Mikrobenwachstum verunreinigte Seren sowie
Seren von Ikteruspatienten dürfen nicht verwendet
werden, weil diese Zustände zu falschen Ergebnissen
führen können. Proben mit sichtbaren Verunreinigungen
müssen vor Verwendung zentrifugiert werden.
Aufbewahrung: Serumproben können bei einer Temperatur von 2-10 °C maximal eine Woche lang aufbewahrt
werden. Sollen die Proben länger aufbewahrt werden,
müssen sie bei mindestens –20 °C eingefroren werden.
Serum darf nicht in einem Kühlschrank oder Gefrierschrank mit Abtauautomatik gelagert werden.
ACHTUNG: Wiederholtes Einfrieren / Auftauen von
Patientenproben ist zu vermeiden. Andernfalls können falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse
auftreten.
ALLGEMEINE HINWEISE ZUM VERFAHREN
1. Vor Verwendung müssen unbedingt alle Serumproben und Kitbestandteile auf Zimmertemperatur
(19-23 °C) gebracht werden. Ein Liter Waschpuffer
benötigt mehrere Stunden, um nach Entnahme aus
dem Kühlschrank auf 20 °C zu kommen. Bei Inkubationstemperaturen außerhalb des hier angegebenen Bereichs können die Ergebnisse verfälscht
werden. Unverbrauchte Proben und Kitmaterialien
müssen nach Verwendung wieder gekühlt werden.
2. Reagenzien vor dem Test durch vorsichtiges Umdrehen der Flasche gut durchmischen. Auf keinen Fall
schütteln oder auf einen Mischer stellen. Schaumbildung vermeiden.
3. Beim Herstellen der Probenverdünnungen müssen
die Pipettenspitzen vor der Zugabe von Serum in
den Probenverdünner abgewischt werden. Außen
an der Pipette anhaftendes überschüssiges Probenmaterial kann die Ergebnisse beeinträchtigen.
4. Das Arbeiten mit einer Mehrkanalpipette wird empfohlen, weil dadurch die Zugabe, die Inkubationszeit und die Reaktionszeit gleichmäßiger ausfallen.
5. Sorgfältiges Waschen der Vertiefungen ist von entscheidender Bedeutung. Unzureichendes Waschen
der Vertiefungen führt zu hohen Hintergrundwerten
und unter Umständen zu falsch-positiven Ergebnissen. Beim Auswaschen von Hand den Inhalt der
Vertiefungen aspirieren, anschließend die Vertiefungen mit Waschpuffer füllen. Kreuzkontamination
zwischen den Vertiefungen vermeiden, vor allem
beim ersten Waschgang nach dem Absaugen. Die
Platten umdrehen und in der Luft kräftig ausschlagen, um alle Waschlösung aus den Vertiefungen
zu entfernen. Der Waschvorgang mit Füllen und
Entfernen muss drei bis fünf Mal wiederholt werden.
Danach die Platten auf einem Papierhandtuch
oder vergleichbarem Material ausklopfen, so dass
der Waschpuffer vollständig entfernt wird. Die
Verwendung eines automatischen Waschgeräts
für Mikrotiterplatten wird empfohlen, weil dies zu
gleichmäßigeren Waschergebnissen führt.
HINWEIS: Auf Grund der verschiedenen Waschtechniken und Automatiksysteme muss die Anzahl der
Waschgänge evtl. angepasst werden, um optimale
Ergebnisse zu erzielen. Jedes Labor muss für sein
Waschsystem die Anzahl von Waschgängen mit der
höchsten Effizienz selbst bestimmen.
6. Unzureichende Entfernung von Waschpufferrückständen kann zu inkonsistenter Farbentwicklung
23
führen. Die Mikrotiterstreifen sollten auf Papierhandtüchern oder vergleichbarem Material
ausgelegt werden, um Waschpufferrückstände zu
minimieren.
7. Die bei den Inkubationsschritten angegebene
Zeitdauer muss unbedingt eingehalten werden. Alle
Serumproben müssen vor Versuchsbeginn verdünnt
und möglichst schnell hintereinander (in maximal fünf Minuten) in die Vertiefungen dispensiert
werden. Die Testserien dürfen nur so groß sein, dass
diese Zeit bequem eingehalten werden kann. Die
Verwendung einer mehrkanaligen Pipette zur leichteren Handhabung von Proben und Reagenzien ist
zu empfehlen.
8. Mit Ausnahme des letzten Inkubationsschritts (Substratlösung) beginnt jede Inkubationsperiode nach
beendigter Proben- oder Reagenzienzugabe. Die
Inkubation mit Substratlösung muss für jede Vertiefung genau fünf Minuten dauern. Daher müssen
Proben und Reagenzien in derselben Reihenfolge
und im selben zeitlichen Abstand zugegeben
werden.
INTERPRETATION DER ERGEBNISSE
QUALITÄTSSICHERUNG
1. Die leere Kontrollvertiefung muss einen Absorptionswert von unter 0,250 haben. Höhere
Absorptionsleerwerte als 0,250 sind als Hinweis auf
unzureichendes Waschen oder Kontamination der
Reagenzien zu interpretieren.
2. Der Absorptionswert der leeren Kontrollvertiefung
(Reihe G) wird von den Absorptionswerten der
RELISA® Procedure Check (RPC) Vertiefung (Reihe
H) sowie von allen Antigen-Vertiefungen (Reihen
A bis F) subtrahiert. Nettowerte kleiner Null sind als
Nullwerte zu betrachten.
3. Die RELISA® Procedure Check (RPC) Vertiefung
(Reihe H) sollte eine Nettoabsorption größer als
0,300 aufweisen. Absorptionswerte kleiner als
0,300 lassen auf unzureichende Farbentwicklung
schließen und sollten nicht gewertet werden.
Unzureichende Farbentwicklung ist in der Regel auf
die Verwendung kalter Reagenzien oder falsches
Timing bei einem oder mehreren Schritten des
Assays zurückzuführen. Reagenzien auf Zimmertemperatur (19-23 °C) erwärmen lassen und den
Lauf wiederholen, wobei besonderes Augenmerk
auf den zeitlichen Ablauf der einzelnen Schritte zu
legen ist.
4. Nettoabsorptionswerte werden jeweils mit 100 multipliziert, um für jedes Antigen den entsprechenden
Wert in ENA-Einheiten zu erhalten.
5. Das Positivkontrollserum ist ein Pool von Humanserum mit Antikörpern gegen alle sechs Autoantigene
in diesem Test. Jede Antigen-Vertiefung sollte einen
Wert von 30 ENA-Einheiten oder mehr aufweisen.
6. Das Negativkontrollserum ist ein Pool von Humanserum, das keine Antikörper gegen eines der sechs
Autoantigene in diesem Test enthält. Jede AntigenVertiefung sollte einen Wert von 20 ENA-Einheiten
oder weniger aufweisen.
7. Jedes Labor muss für sein Assay die Anzahl von
Durchläufen für positive und negative Kontrollseren
auf Basis der Häufigkeit von Patiententests und der
Laborerfahrung selbst bestimmen.
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��
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Sm. Wenn
beide� Vertiefungen
positiv sind und die
Sm/RNP
Vertiefung
30 ENA-Einheiten oder mehr als
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die sm
Vertiefungen
hat, so
ist dies ein Indiz für das
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Vorhandensein
von
Sm und RNP
Autoantikörpern.
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��
Das Vorhandensein beider Antikörper kann mithilfe
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des AUTO-ID® Immunodiffusionsystems von Immuno
Concepts, Katalognummer 6030, bestätigt werden.
3. Die anderen Vertiefungen sind mit affinitätsbereinigten monospezifischen Antigenen beschichtet und
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� �dem
�� homologen Antikörper.
reagieren
nur mit
�� mit
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Patientenseren
multipler Antikörper-Spezifität
sind jedoch
sehr� häufig
bei SLE und anderen Au��
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toimmunsyndromen
zu beobachten, ein einzelnes
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Serum ��
kann deshalb
in mehr als einer Vertiefung
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positive Reaktionen zeigen.
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4. Die Vertiefungen sind mit affinitätsbereinigten
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Antigenen in der folgenden Reihenfolge, von oben
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(Vertiefung
A und
feste Streifenende)
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unten (Vertiefung H und
das��
gekerbte Streifenende)
beschichtet:
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AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE
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��ist�als
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Das Testergebnis
positiv oder negativ für die ent��
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sprechenden
Antikörper
gegen extrahierbare nukleäre
Antigene anzugeben.
Die Zahl der Antikörper hat keine
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bekannte klinische
�� Bedeutung.
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ZU ERWARTENDE WERTE
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Die Häufigkeit
von �
Autoantikörpern
gegenüber
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��variiert je nach
verschiedenen nukleären
Antigenen
Patientenpopulation sowie nach der Häufigkeit
klinischer Rheumaerkrankungen in dieser Population.
Der Zusammenhang zwischen dem Vorhandensein von
Antikörpern und spezifischen Rheumaerkrankungen ist
in der folgenden Tabelle 1.
REFERENZBEREICH
Der Referenzbereich wurde durch Tests an Seren von
206 gesunden Blutspendern, 105 Frauen und 101 Männer, ermittelt. Bei keinem der Spender war eine rheumatische Erkrankung bekannt. Zusätzlich wurden Daten
von 143 Rheumapatienten mit Antikörpern gegen
ein oder mehrere Antigene dieses Assays gesammelt,
die jedoch negativ für Antikörper gegen die anderen
Antigene waren. Auf Basis dieser Daten wurden die
normalen Cutoff-Werte, weniger als 20 ENA-Einheiten,
berechnet. Die gute Laborpraxis schreibt vor, dass jedes
Labor seine eigenen normalen Wertebereiche auf Basis
der Patientenpopulation und anderer lokaler Faktoren
ermitteln muss.
EINSCHRÄNKUNGEN DES TESTS
INTERPRETATION DER PATIENTENERGEBNISSE
1. Dies ist ein qualitatives Assay. Die Anzahl der
nachgewiesenen Antikörper besitzt keinerlei
bekannte klinische Relevanz und die mit diesem
Assay erzielten Einheitsgrößen dienen lediglich
der Aufteilung der Patienten in die folgenden drei
Hauptgruppen. Die Patientenprobevertiefungen,
deren errechnete Werte höher als 30 ENA-Einheiten
sind, sind als positiv zu werten. Die Patientenprobevertiefungen, deren errechnete Werte niedriger als
20 ENA-Einheiten sind, sind als negativ zu werten.
Werte zwischen 20 und 30 Einheiten liegen im positiven Grenzbereich und sollten wiederholt werden.
Jedes Labor muss seinen eigenen Referenzbereich
und eigene Cutoff-Werte auf Basis der getesteten
Patientenpopulation ermitteln. Die Einheitswerte
sind abhängig von Patientenfaktoren, mechanischen Gegebenheiten (wie Präzision der Pipetten), und
Assay-Umständen (wie Temperatur und zeitliche
Abfolge der Schritte.)
2. Die Sm und Sm/RNP Vertiefungen werden zusammen verwendet, um das Vorhandensein dieser
beiden Autoantikörper zu bestimmen. Falls die Sm/
RNP Vertiefung positiv ist und die Sm Vertiefung negativ, hat der Patient Antikörper gegen RNP. Wenn
beide Vertiefungen positiv sind, mit annähernd
gleichen Werten, hat der Patient Antikörper gegen
24
1. Es ist nicht möglich, lediglich auf der Basis des
Nachweises von Antikörpern gegen extrahierbare
nukleäre Antigene eine Diagnose zu stellen. Der
Arzt muss die Ergebnisse im Zusammenhang mit
Krankengeschichte und Symptomen des Patienten,
den Ergebnissen der körperlichen Untersuchung
und anderen diagnostischen Methoden interpretieren.
2. Lediglich auf Grund eines positiven Testergebnisses
für Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene sollte keine Behandlung initiiert werden. Für
eine Behandlung müssen auch klinische Symptome,
andere Laborergebnisse und der Gesamteindruck des Patienten auf den behandelnden Arzt
herangezogen werden.
3. Bei einigen Patienten mit Autoimmunerkrankungen
können nicht nachweisbare oder unbedeutende
Mengen Antikörper gegen extrahierbare nukleäre
Antigene vorhanden sein; bei anderen Patienten
mit großen Mengen an Antikörpern gegen extrahierbare nukleäre Antigene sind u.U. nur geringfügige
oder keine Anzeichen einer klinischen Erkrankung
festzustellen. Der Arzt muss die Ergebnisse des Tests
auf Antikörper gegen extrahierbare nukleäre Antigene im Zusammenhang mit Krankengeschichte
und Symptomen des Patienten, den Ergebnissen
der körperlichen Untersuchung und anderen diag-
��
��
��
� ��
��
� ��
��
��
��
nostischen Methoden interpretieren.
KREUZREAKTIVITÄT
��
��
��
��
��
4. Die
mit diesem Testsystem
nachgewiesenen
Antikör��
��
�
��
perwerte lassen nicht unbedingt auf die Schwere
Sieben
Proben wurden für Kreuzreaktivitätsstudien
��
��
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��
oder Dauer einer Erkrankung schließen.
verwendet. Diese Proben wurden durch Western Blot,
��
��
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��
CIE und Immunodiffusion
äußerst genau
als monospe��
��
��
��
�
LEISTUNGSFÄHIGKEIT DES TESTS
zifische Seren für jeden der Autoantikörper im RELISA®
��
��
��
��
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��
�
Screening-Test beschrieben. In keiner der Proben war
Das RELISA®
Screening
Assay von Immuno
Concepts
Kreuzreaktivität
festzustellen.
Tabelle��
3. ��
��
��
��
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��
��
��
�
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� ��
� ��
wurde mit anderen im Handel erhältlichen ELISA Assays
��
� ��REPRODUZIERBARKEIT
verglichen, außerdem mit
Doppelimmunodiffusionsund Kontraimmunoelektrophorese-Tests, durchgeführt
�� und mit Immunoblotting-(Western
in Referenzlabors,
��
��
��
Für jede
der sechs Antigen-Spezifitäten
wurden sechs
��
Blot)
Ergebnissen,
die mit einer hauseigenen Methode
��
Proben auf drei verschiedenen Chargennummern von
��
��
��
��
��
��der� für
��
�� Zur Bestimmung
ermittelt wurden.
jede getestete Antigen-Streifen bei drei verschiedenen Gelegenheiten
��
��
��
��
��
��
��
Probe
zu erwartenden oder „korrekten”
Ergebnisse
getestet. Zwei der Proben waren negativ, befanden
wurden die Resultate aus allen Methoden und die
sich
jedoch
dicht
am
Cutoff-Wert
von
20
ENA-Einheiten;
��
� ��
��
� ��
��
�
��Diagnose
�� des
��
��
��
��
��
klinische
Patienten
zwei
positiv, jedoch
dicht am Cutoff-Wert
��
�� herangezogen.
�� Auf
��Proben waren
��
��
��
��
Basis dieser
wurden die folgenden
Daten
��
�
��
� zwei Proben
von 20 ENA-Einheiten;
schließlich
waren klar
��
��Vergleiche��
��
��
��
��
ermittelt. Tabelle 2.
positiv oberhalb der Marke von 30 ENA-Einheiten. In kei��
��
��
� negative
��
��nem
��
��
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��
��
��
Fall zeigte eine
Probe
positive Ergebnisse;
Die
Spezifitäts-Diskrepanzen
sind auf ��
die ��
erhöhte
��
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��
��
��
alle
angesiedelten
Positivproben
��
��Sensi�
��
� ��
��
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��
��
�im
��“Grenzbereich”
��
��
tivität
der
ELISA-Assays im Vergleich
zu “herkömmlichen”
erbrachten
durchwegs
Ergebnisse
zwischen 20 und
30
��
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�
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��
Methoden
wie Kontraimmuno-Elektrophorese
und
ENA-Einheiten;
die�
klar positiven Proben führten durch��
��
��
��
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��
Immunodiffusion
wegs��
zu klar ��
positiven
��
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� Ergebnissen.
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�� zurückzuführen.
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��1
TABELLE
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TABELLE 2
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TABELLE
3
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25
RELISA® ENA TESTVERFAHREN
Vor der Testdurchführung müssen alle Proben, Reagenzien (auch der Waschpuffer)
und Mikrotiterstreifen auf Zimmertemperatur gebracht werden.
1.
Arbeitsblatt ausfüllen: In das mit dem Kit
gelieferte Arbeitsblatt zu Identifikationszwecken die Lage der Proben in den acht
Vertiefungen der Mikrotiterplatte eintragen.
2.
Waschpufferlösung (PBS-Tween) vorbereiten: Inhalt eines Beutels mit PBS-Pufferpulver
in einem Liter deionisiertem oder destilliertem Wasser auflösen. Den Inhalt einer ganzen Flasche Waschpufferkonzentrat in den
aufgelösten PBS-Puffer (1 Liter) hinzugeben
und gut durchmischen. Die Waschpufferlösung kann verschlossen und gekühlt (2-10
°C) bis zu vier Wochen aufbewahrt werden.
3.
Patientenproben verdünnen: Patientenproben durch Zugabe von 25 µl Serum zu 975
µl Probenverdünner 1:40 verdünnen und
gut durchmischen. Die Kontrollseren sind
gebrauchsfertig und müssen nicht weiter
verdünnt werden.
4.
Mikrotiterstreifen vorbereiten: Benötigte Streifenzahl aus den Beuteln entnehmen und
in den Halter einsetzen. Die Streifen müssen
fest im Halter sitzen. Den Halter auf eine
feste Oberfläche stellen, wobei die Buchstaben A bis H auf der linken Seite und die
Nummern 1-12 am oberen Rand des Halters
liegen sollen. Die Streifen so in den Halter
einsetzen, dass das gekerbte Streifenende
auf dem kleinen Haken am unteren Rand
des Halters sitzt. Kräftig auf beide Enden
drücken, so dass die Streifen fest im Halter
einrasten. Streifen, die korrekt im Halter
sitzen, können beim Umdrehen des Halters
nicht herausfallen. Das gefrostete obere
Ende des Streifens mit der Identifizierung
und Lage im Halter beschriften.
5.
6.
7.
8.
Serumverdünnungen auftragen: 50 µl
verdünnte Patientenprobe in jede der acht
Vertiefungen eines Multiparameter-Streifens
dispensieren.
Streifen inkubieren (30 Minuten bei Zimmertemperatur, 19-23 °C): Die Streifen 30
Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren
lassen. Während dieser Zeit müssen die
Streifen vor Luftzug oder Temperaturschwankungen geschützt sein. Gegebenenfalls die Streifen mit Klebeband oder
einem Papierhandtuch abdecken, um sie
vor Staub und anderen Fremdkörpern zu
schützen.
Streifen waschen (siehe auch Allgemeine
Hinweise zum Verfahren, Punkte 5 und 6):
Vertiefungen drei bis fünf Mal mit PBSTween-Waschpufferlösung auswaschen.
Beim Auswaschen von Hand den Inhalt
der Vertiefungen aspirieren, anschließend
die Vertiefungen mit Waschpuffer füllen. Kreuzkontamination zwischen den
Vertiefungen vermeiden, vor allem beim
ersten Waschgang nach dem Absaugen.
Die Platten umdrehen und in der Luft kräftig
ausschlagen, um alle Waschlösung aus den
Vertiefungen zu entfernen. Der Waschvorgang mit Füllen und Entfernen muss drei bis
fünf Mal wiederholt werden. Danach die
Platten auf einem Papierhandtuch oder
vergleichbarem Material ausklopfen, so
dass der Waschpuffer vollständig entfernt
wird.
Enzym-Antikörper-Reagens zugeben: 50
µl Enzym-Antikörper-Reagens in jede Vertiefung dispensieren.
26
9.
Streifen inkubieren (30 Minuten bei Zimmertemperatur, 19-23 °C): Die Streifen 30
Minuten bei Zimmertemperatur inkubieren
lassen. Während dieser Zeit müssen die
Streifen vor Luftzug oder Temperaturschwankungen geschützt sein. Gegebenenfalls die Streifen mit Klebeband oder
einem Papierhandtuch abdecken, um sie
vor Staub und anderen Fremdkörpern zu
schützen.
10.
Streifen waschen: Vertiefungen drei bis
fünf Mal mit PBS-Tween-Waschpufferlösung
auswaschen. Beim Auswaschen von Hand
den Inhalt der Vertiefungen aspirieren, anschließend die Vertiefungen mit Waschpuffer füllen. Kreuzkontamination zwischen den
Vertiefungen vermeiden, vor allem beim
ersten Waschgang nach dem Absaugen.
Die Platten umdrehen und in der Luft kräftig
ausschlagen, um alle Waschlösung aus den
Vertiefungen zu entfernen. Der Waschvorgang mit Füllen und Entfernen muss drei bis
fünf Mal wiederholt werden. Danach die
Platten auf einem Papierhandtuch oder
vergleichbarem Material ausklopfen, so
dass der Waschpuffer vollständig entfernt
wird.
11.
Substratlösung zugeben: Eine Laborstoppuhr verwenden, um sicherzustellen, dass
die Zeiten genau eingehalten werden. 50 µl
Substratlösung in jede Vertiefung pipettieren. Die Substratlösung muss in gleichmäßigen Zeitabständen zugegeben werden,
damit sichergestellt ist, dass jede Vertiefung
exakt fünf Minuten inkubiert wird. In Vertiefungen, die positive Proben enthalten,
verfärbt sich die Substratlösung blau. In den
anderen Vertiefungen bleibt die Lösung
farblos oder wird nur schwach blau.
12.
Streifen inkubieren (genau 5 Minuten bei
Zimmertemperatur, 19-23 °C): Die Streifen
genau fünf Minuten bei Zimmertemperatur
inkubieren. Während dieser Zeit müssen
die Streifen vor Luftzug oder Temperaturschwankungen geschützt sein.
13.
Stoppreagens zugeben: Nachdem die
erste Vertiefung genau 5 Minuten inkubiert
wurde, mit dieser anfangen und im selben
Rhythmus wie bei der Substratlösung in
jede Vertiefung 50 µl Stopplösung zugeben.
Bei Zugabe der Stopplösung verfärbt sich
blaue Substratlösung gelb, während farblose Lösung farblos bleibt.
14.
Absorption messen: Die Absorption der
Vertiefungen muss innerhalb von 30
Minuten nach Zugabe des Stoppreagens
mit einem Mikrotiterplatten-Spektrophotometer gemessen werden. Die Vertiefungen werden bei 450 nm um den Leerwert
bereinigt gemessen. Wenn die Möglichkeit
besteht, bei einer zweiten Wellenlänge zu
messen, auch bei 600-650 nm als Referenzwellenlänge messen. Werden die Werte
in den Vertiefungen ohne Referenzfilter
berechnet, so führt dies zu höheren Absorptionswerten.
TECHNISCHE UNTERSTÜTZUNG:
+916-363-2649
oder via E-Mail:
[email protected]
RELISA® ENA
SCREENINGTEST AV MULTIPARAMETERANTIKROPP
FÖR DIAGNOSTISK ANVÄNDNING IN VITRO
SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING AV TESTET
Avsedd användning: Detta är enzymimmunanalyssystem(EIA) för detektion av antikroppar mot de extraherbara nukleära antigenerna Sm (Smith), RNP, SSA/Ro,
SSB/La, Scl-70 och Jo-1 i humanserum. Resultaten av
denna analys kan användas som ett hjälpmedel vid
diagnostisering av autoimmuna sjukdomar.
Antikroppar mot extraherbara nukleära antigener (ENA)
har associerats med flera autoimmuna syndrom och
verkar vara av diagnostisk och/eller prognostisk betydelse vid systemisk skleros (1, 2), blandad bindvävssjukdom (3-5), Sjögrens syndrom (6, 7), polymyosit (8),
dermatomyosit (9), systemisk lupus erytematosus (5) och
reumatoid artrit (10). Det antinukleära antikropptestet
(ANA) har använts som ett filter för dessa antikroppar,
men ANA anger inte antikroppens specificitet, och
antikroppar mot vissa ENA ger inte positivt ANA-svar (11,
12). Därför rekommenderas bestämt en andra bekräftande analys av antikroppar mot ENA (13).
Sm-antigenen (Smith) identifierades 1966 av Tan och
Kunkel som ett i saltlösning lösligt icke-histonglykoprotein
som inte är beroende av DNA eller RNA för sin antigena
potential (14). Antikroppar mot Sm-antigen betraktas
som en specifik serologisk markör på grund av sin höga
specificitet för systemisk lupus erytematosus (SLE). Dessa
antikroppar har noterats hos upp till 30 procent av SLEpatienter och associerats med aktiv njursjukdom och
cerebrit (15-17).
Antikroppar mot Sm-antigen påträffas ofta tillsammans
med U1-RNP-antikroppar i sera hos patienter med SLE
(18, 19). Till skillnad från antikroppar mot Sm-antigen
betraktas antikroppar till RNP inte som en specifik
serologisk markör, eftersom de påträffas hos patienter
med olika reumatiska sjukdomar, t ex SLE, sklerodermia,
Sjögrens syndrom och reumatoid artrit. Emellertid associeras hög antikroppnivå av RNP med ett överlappande
syndrom som kallas blandad bindvävssjukdom (MCTD).
Patienter med MCTD karaktäriseras av en kombination
av sjukdomssymptom liknande de som påträffas vid SLE,
sklerodermia och polymyosit. Sådana patienter reagerar ofta väl på kortikosteroidbehandling och har färre
njursjukdomar jämfört med SLE-patienter (20, 21).
SSA och SSB beskrevs ursprungligen som nukleära
RNA-proteinantigener hos patienter med Sjögrens
syndrom (6, 7). Ro och La beskrevs som cytoplasmiska
RNA-proteinantigener hos patienter med SLE (22, 23).
Det är i dag vida accepterat att såväl SSA och Ro som
SSB och La är likartade, och att dessa antigener påträffas i både kärnan och cytoplasman. Antikroppar mot
enbart SSA/Ro eller SSA/Ro och SSB/La påträffas hos 62
procent av patienter med subakut kutan lupus (24) och
hos 85 procent av patienter med Sjögrens syndrom som
utvecklar vaskulit (25). Antikroppar mot enbart SSA/Ro
påträffas hos patienter som har homozygot brist på C2komplementfragment (26), patienter med primär biliär
cirros som utvecklar Sjögrens syndrom (27) samt hos
högst två tredjedelar av patienter med ”ANA-negativ
SLE” (28).
Scl-7o-antigenen har identifierats som ett cellformigt
enzym, DNA topoisomeras I, ett hjälpprotein till DNA
polymerasdelta (29). Antikroppar mot Scl-70 har rapporterats hos upp till 56 procent av patienter med progressiv systemisk skleros (PSS), framför allt den delmängd
av patienterna som har diffus sklerodermia (30). Dessa
autoantikroppar betraktas som en markör för PSS, eftersom de inte påträffas vid andra bindvävssjukdomar.
Antikroppar mot Jo-1, vilket är den cellformiga
enzymhistidyl-TRNA-syntestasen, påträffas hos 25-30 procent av patienter med polymyosit eller dermatomyosit,
men inte vid andra myopatier (11, 31). Anti-Jo1-antikroppar har också visat sig vara starkt associerade med
interstitiell lungsjukdom, t ex i samband med myosit (31).
TESTPRINCIP
Detta test är en kvalitativ indirekt EIA. Mikrobrunnarnas
yta har täckts med stabiliserade preparat av affinitetsrenade extraherbara nukleära antigener och fungerar
som ett antigensubstrat i detta system. Spädningar av
patientproven placeras i mikrobrunnarna och odlas så
att de specifika antikropparna i provet reagerar med
antigenen i den fasta fasen. Efter tvättning för att avlägsna obunden antikropp och annat seraprotein odlas
brunnarna med getantihumana antikroppar märkta
med pepparrotperoxidas. Det pepparrotperoxidaskonjugerade antikroppreparat som ingår i detta testsystem
är specifikt för humana IgG-tunga och -lätta kedjor.
Om resultaten är positiva efter inkubation med pepparrotperoxidaskonjugat bildas ett stabilt komplex
bestående av tre delar. Detta komplex består av antihuman antikropp konjugerad med pepparrotperoxidas
bunden till human anti-ENA-antikropp, vilken i sin tur är
bunden till den antigen som stabiliserats på plastytan.
Efter ännu ett tvättsteg detekteras detta komplex genom att tillsättande av en lösning av tetrametylbensidin
(TMB) och H2O2 som kromogent substrat. Graden av
färgutveckling i varje brunn står i relation till koncentrationen av anti-ENA-antikroppar i respektive serumprov.
Varje mikrobrunn avläses i spektrometer vid 450 nm.
SYSTEMKOMPONENTER (MATERIAL SOM MEDFÖLJER)
Förvaring: Alla komponenter skall kylförvaras i 2-10 °C.
Får ej frysas.
Stabilitet: Alla komponenter förblir stabila i minst tolv
månader från tillverkningsdatum. Använd inte komponenterna efter utgångsdatum.
REAKTIVA REAGENSER
Extraherbara nukleära antigenbelagda mikrobrunnsremsor: Katalognr 7008-09. Åtta brunnsremsor belagda
med stabiliserade lösningar av affinitetsrenade extraherbara nukleära antigener. Varje försluten foliepåse
innehåller en åttabrunnars remsa.
Provspädningsvätska: Katalognummer 7015 (15 ml).
Patentskyddad buffrad provspädningsvätska för spädning av patientprover.
Enzymantikroppreagens - human IgG tung- och
lättkedjespecifik: Katalognummer 7009-09 (6 ml).
Getantihuman IgG (H och L) konjugerad med pepparrotperoxidas (HRP). Reagensen är bruksfärdig.
Substratlösning: Katalognummer 7035 (6 ml). HRPspecifik enzymsubstratlösning innehållande stabiliserad
3,3‘,5,5‘-tetrametylbensidin (TMB) och väteperoxid
(H2O2). Reagensen är bruksfärdig.
Stoppreagens: Katalognummer 7033 (6 ml). Patentskyddad stoppreagens för Immuno Concepts EIA-testsystem. Reagensen är bruksfärdig. VARNING: Frätande.
Denna reagens innehåller hydrokloriska och svavelhaltiga syror (mindre än 3 % vardera, per volym) och
skall hanteras med varsamhet. Förvaras utom räckhåll
för barn. Om du råkar röra vid ögonen i samband med
hantering skall du omedelbart spola noggrant med vatten och kontakta läkare. Tillsätt aldrig vatten till denna
reagens.
Multiparameter ENA-positiv kontroll: Katalognummer
7021-09 (1 ml). Humant positivt kontrollserum bestående
av antikroppar mot Sm-, RNP-, SSA/Ro-, SSB/La-, Scl-70och Jo-1-antigener. Detta serum är färdigspätt och kan
användas direkt. Reagensen innehåller 0,1 % natriumazid som konserveringsmedel.
ENA-negativ kontroll: Katalognummer 7031 (1 ml).
Humant negativt kontrollserum som inte innehåller
antikroppar mot Sm-, RNP-, SSA/Ro-, SSB/La-, Scl-70- eller
Jo-1-antigener. Detta serum är färdigspätt och kan användas direkt. Reagensen innehåller 0,1 % natriumazid
som konserveringsmedel.
ICKE-REAKTIVA KOMPONENTER
Hållare för mikrobrunnar
Tvättbuffertlösning:
PBS-buffert: Katalognummer 1011: Fosfatbuffrat saltlösningspulver(0.01 M, pH 7.4 ± 0.2). Varje påse innehåller
tillräckligt med buffertpulver för att ge en liter. (Två
påsar buffertpulver medföljer varje 96-mikrobrunnsplatta i kompletta testsatser).
Tvättbuffertkoncentrat: Katalognummer 1031 (10 ml).
5 % Tween-20-lösning för användning i tvättbufferten.
(Två ampuller med buffertkoncentrat levereras för varje
96-mikrobrunnsplatta i kompletta testsatser).
Framställning: Lös upp en påse med buffertpulver i
en liter avjoniserat eller destillerat vatten. Tillsätt hela
innehållet i en flaska tvättbuffertkoncentrat i den
upplösta fosfatbuffrade saltlösningen. Blanda väl och
förvara i kylskåp i 2-10 °C i upp till fyra veckor eller tills
27
det syns tecken på kontamination eller andra synliga
förändringar. Tvättbuffertlösning måste stå i rumstemperatur (19-23 °C) före användning.
hemolys, ikterus, lipemi eller mikrobiell tillväxt skall inte
användas, eftersom dessa betingelser kan leda till avvikande resultat. Prover som innehåller synliga partiklar
bör klargöras genom centrifugering före testning.
ÖVRIGT MATERIAL SOM BEHÖVS (MEDFÖLJER EJ)
Förvaring: Sera kan förvaras i 2-10 °C under högst en
vecka. Om analysen fördröjs ytterligare, skall sera frysas
i –20 °C eller lägre. Serum bör inte förvaras i självavfrostande kylskåp eller fryslagerrum.
Volymetriska precisionspipetter för pipettering av
25-1000 µl volymer
Klämflaska för pipettering av tvättbuffertlösning till
mikrobrunnarna eller till ett automatiserat eller
halvautomatiserat tvättsystem för mikrobrunnar.
Enlitersbehållare för PBS-tvättbuffertlösning
Avjoniserat eller destillerat vatten
Plattläsningsspektrometer som kan avläsa absorption
vid 450 nm
Provrör för framställning av serumspädningar
Läskpapper eller pappershanddukar
Multikanalspipett som kan pipettera 8 brunnar.
Engångshandskar av latex
Laboratorietidur
VARNING: Upprepad frysning/upptining av patientprover kan ge falskt positiva eller negativa resultat.
ALLMÄNNA PROCEDURANVISNINGAR
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
1. Allt material av humant ursprung som använts i
denna produkt har testats med FDA-godkända
metoder och visade sig reagera negativt (inte
upprepat reaktivt) på antikroppar mot humant
immunbristvirus-1 (HIV-1), humant immunbristvirus-2 (HIV-2), hepatit C-virus (HCV) och hepatit B
ytantigen (HBsAg). Ingen testmetod kan emellertid
helt garantera att det inte förekommer HIV-1, HIV-2,
hepatit-C, hepatit-B, eller andra smittämnen. Därför
skall allt satsmaterial hanteras som potentiellt smittsamt.
2. Alla patientprover på biosäkerhetsnivå 2 skall
hanteras enligt rekommendationerna för potentiellt
smittsamt humanserum eller blodprov i Centrum för
Sjukdomskontroll/Nationella hälsoinstitutets manual:
Biosäkerhet i mikrobiologiska och biomedicinska
laboratorier, 1984 års upplaga.
3. Spädning av komponenter eller byte till andra komponenter än de som medföljer detta system kan ge
motsägande resultat.
4. Natriumazid (0,1 %) används som konserveringsmedel i kontrollserat. Natriumazid kan reagera med
ledningsrör av bly eller koppar och bilda högexplosiva metallazider. När reagenser kasseras skall man
spola med rikliga mängder kranvatten för att skölja
bort eventuella rester i avloppsledningarna. Natriumazid är ett gift och kan vara toxiskt vid förtäring.
5. Denna sats är avsedd för diagnostisk användning in
vitro.
6. Pipettera aldrig med munnen och undvik att
komma i kontakt med reagenser och prov med
hud eller slemhinnor. Tvätta med bakteriedödande
tvål och rikligt med vatten om sådan kontakt inträffat.
7. Undvik att röka, äta eller dricka i områden där prov
eller satsreagenser hanteras.
8. Undvik alltid stänk och alstring av aerosoler.
9. Andra inkubationstider och temperaturer än de
angivna kan ge felaktiga resultat.
10. Korskontamination mellan reagenser och prover
kan ge felaktiga resultat. Proverna måste hållas
instängda i mikrobrunnarna under analysen.
11. Återanvändningsbart glas måste tvättas och
noggrant sköljas från rengöringsmedel innan det
används. Allt glas måste rengöras och torkas före
användning.
12. Placera alla reagenser, mikrobrunnar och prover i
rumstemperatur (19-23 °C) före användning.
13. Använd engångshandskar av latex vid hantering
av prover och reagenser, och tvätta händerna
noggrant efteråt.
14. Mikrobisk kontamination av reagenser eller prover
kan ge felaktiga resultat.
15. Stoppreagensen är frätande och kan orsaka brännskador. Denna reagens innehåller hydrokloriska
och svavelhaltiga syror (mindre än 3 % vardera,
per volym) och skall hanteras med varsamhet.
Förvaras utom räckhåll för barn. Om du råkar röra
vid ögonen i samband med hanteringen skall du
omedelbart spola med vatten och kontakta läkare.
Tillsätt aldrig vatten till denna reagens.
PROVTAGNING
Provtagning: Serum rekommenderas som prov. Cirka 5
ml helblod skall tas aseptiskt genom venpunktion med
hjälp av ett sterilt vakuumblodtagningsrör eller annat
lämpligt blodtagningssystem. Låt blodet koagulera i
rumstemperatur (19-23° C). Serum skall så snart som
möjligt separeras från koagler genom centrifugering för
att minimera hemolys.
Störande substanser: Sera som uppvisar en hög grad av
28
1. Det är ytterst viktigt att alla satskomponenter och
serumprov står i rumstemperatur (19-23 °C) före
användning. En hel liter tvättbuffert kan ta flera
timmar att värma till 20 °C sedan den har tagits
ur kylskåpet. Inkubationstemperaturer som ligger
högre eller lägre än det angivna intervallet kan
leda till felaktiga resultat. Sätt tillbaka oanvända
prover och reagenser i kylförvaring efter användning.
2. Blanda reagenserna väl före användning genom
försiktig inversion. Snurra eller rotera inte reagenserna. Undvik skumning.
3. När provspädningarna framställs skall pipettspetsarna torkas av innan serum dispenseras i en
provspädning. Överflödigt prov som sitter fast på
utsidan av pipettspetsen påverkar resultaten.
4. Vi rekommenderar att en multikanalspipett används eftersom detta ger mer enhetliga reagensdispenseringar, inkubationstider och reaktionstider.
5. Det är ytterst viktigt att brunnarna tvättas ordentligt.
Otillräckligt tvättade brunnar leder till höga bakgrundsvärden och kan ge falskt positiva resultat.
Manuell tvätt: Aspirera brunnarnas innehåll och fyll
därefter varje brunn med tvättbuffertlösning. Undvik
korskontamination mellan brunnarna, särskilt i första
tvätten efter aspirationen. Töm all tvättlösning från
brunnarna genom att vända dem upp och ned
och skaka därefter resterande tvättbuffert från
brunnarna med en bestämd ”knyck” med handleden. Upprepa fyll- och torkstegen för totalt tre till
fem tvättar. Brunnarna skall sedan knackas bestämt
mot en pappershandduk eller annat absorberande
material för att avlägsna alla spår av kvarvarande
tvättbuffert. Om det automatiserade tvättsystemet för mikrobrunnar används blir brunnarna blir
ordentligt tvättade, varför detta rekommenderas.
OBSERVERA: Då det finns olika tvättekniktyper och
automatiserade program kan antalet tvättar behöva justeras för optimala resultat. Varje laboratorium
bör bestämma det mest effektiva antalet tvättar för
sitt tvättsystem.
6. Om den resterande tvättbufferten inte avlägsnas
ordentligt kan detta leda till ojämn färgutveckling.
Mikrobrunnsremsorna skall läskas på absorberande
papper eller handdukar för att minimera mängden
kvarvarande tvättbuffert.
7. Det är av avgörande betydelse att samtliga steg
sker i rätt tid. Samtliga serumprover skall spädas innan proceduren påbörjas och de måste
dispenseras till mikrobrunnarna på så kort tid som
möjligt (högst fem minuter). Batcharnas storlek
skall väljas så att provhanteringen går så smidigt
som möjligt under denna tidsperiod. Prov- och
reagenshanteringen underlättas med hjälp av en
multikanalspipett, varför detta rekommenderas.
8. Med undantag för den sista inkuberingen (substratlösning) börjar varje inkubationstid med att
prov eller reagenser dispenseras. Inkubationen av
substratlösningen måste vara exakt fem minuter
för varje brunn. Alla prover och reagenser skall
dispenseras i samma ordningsföljd och med en
konstant hastighet.
TOLKNING AV RESULTAT
KVALITETSKONTROLL
1. Ämneskontrollbrunnen skall ha ett absorptionsvärde
som understiger 0,250. Ämnesabsorptionsvärden
större än 0,250 tyder på otillräcklig tvättning eller
kontamination av reagenser.
2. Absorptionsavläsningen av ämneskontrollbrunnen
(rad G) dras ifrån absorptionsavläsningarna för
RELISA® procedurkontrollbrunn (RPC) (rad H) och
respektive antigenbrunn (raderna A till och med
F). Nettovärden som är lägre än noll betraktas som
nollvärden.
3. RELISA® procedurkontrollbrunn (RPC) (rad H) skall
ha en nettoabsorption större än 0,300. Absorptionsvärden som är lägre än 0,300 betyder att färgutvecklingen varit otillräcklig och serien är ogiltig.
4.
5.
6.
7.
Otillräcklig färgutveckling beror vanligtvis på att
kalla reagenser
�� har
��använts eller att tidpunkten för
ett eller flera steg i analysen varit felaktigt vald. Låt
��
reagenserna värmas till rumstemperatur (19-23 °C)
��
och upprepa serien med särskild uppmärksamhet
� � ��
på valet��
av tidpunkt
för alla steg.
��
Alla nettoabsorptionsvärden
multipliceras med 100
� �� för respektive antigen i ENAför att få��
fram�värdet
enheter.��
Det positiva
är en samling
human��kontrollserumet
� � ��
��
��
serum bestående av antikroppar mot alla sex
autoantigenerna i detta test. Varje antigenbrunn
skall uppvisa ett värde på 30 ENA-enheter eller mer.
Det negativa kontrollserumet är en samling humanserum som inte innehåller antikroppar mot någon
��
av de sex autoantigenerna i detta test. Varje
�� skall
� ��
antigenbrunn
uppvisa ett värde på mindre än
��
20 ENA-enheter.
��
Varje laboratorium
skall fastställa en frekvens för
positiva
och �negativa
��
� ��kontrollsera baserat på
förekomsten
patienttester och laboratoriets
�� av� ��
erfarenhet
��av� denna
� ��analys.
��
REFERENSINTERVALL
Referensintervallet upprättades genom att testa sera
från 206 friska blodgivare, 105 kvinnor och 101 män,
av vilka ingen veterligen hade haft någon reumatisk
sjukdom tidigare. Dessutom hade data erhållits från
143 patienter med reumatiska sjukdomar som hade
antikroppar mot en eller flera av antigenerna i denna
analys, men som reagerade negativt på antikroppar
mot andra antigener. Baserat på dessa data upprättades de normala frånslagsvärdena som mindre än
20 ENA-enheter. God laboratoriepraxis föreskriver att
varje laboratorium skall fastställa sina egna normala
spridningsområden baserat på patientpopulation och
andra lokala faktorer.
TESTETS BEGRÄNSNINGAR
1. Diagnos kan inte ställas enbart på grundval av
antikroppar mot extraherbara nukleära antigener.
Läkaren måste tolka dessa resultat med hänsyn
till patientens tidigare sjukdomar och symptom,
de fysiska upptäckterna och andra diagnostiska
metoder.
2. Behandling bör inte påbörjas enbart på grundval
av ett positivt test för antikroppar mot extraherbara
nukleära antigener. Kliniska indikationer, andra
laboratorieupptäckter och läkarens kliniska intryck
måste beaktas innan behandling påbörjas.
3. Vissa patienter med autoimmuna sjukdomar kan ha
obetydliga nivåer av antikroppar eller nivåer som är
omöjliga att upptäcka, medan andra personer kan
ha höga nivåer av antikroppar mot extraherbara
nukleära antigener, men få eller inga tecken på
klinisk sjukdom. Läkaren måste tolka testresultaten
för antikroppar mot extraherbara nukleära antigener med hänsyn till patientens tidigare sjukdomar
och symptom, de fysiska upptäckterna och andra
diagnostiska metoder.
4. De antikroppnivåer som detekteras med detta
testsystem visar inte nödvändigtvis sjukdomens
svårighetsgrad eller varaktighet.
��
TOLKNING AV PATIENTRESULTAT
��
1. Detta är en kvalitativ analys. De antikroppnivåer
som detekteras har ingen känd klinisk signifikans
och de enhetsvärden som erhållits i denna analys
har endast beräknats för att dela in patienterna i
��
följande breda grupper. Patientprovbrunnar som
��
har beräknade värden större än 30 ENA-enheter
��
� � ��
betraktas
som positiva.
Patientprovbrunnar som
��värden
� � ��
har beräknade
mindre än 20 ENA-enheter
��
� � ��
betraktas
som negativa.
Värden mellan 20 enheter
och 30��
enheter betraktas
� � �� ligga på gränsen till att
vara positiva.
Analysen
skall��
göras om. Varje labo��
� � ��
ratorium måste fastställa ett eget referensintervall
��
och egna frånslagsvärden baserat på analyserad
��
patientpopulation. Enhetsvärdena påverkas av
patientfaktorer, mekaniska överväganden (t ex pipetteringsprecision och exakthet) och analysvillkor
(t ex temperatur och val av rätt tidpunkt för ett visst
steg). ��
� � ��används tillsammans
2. Sm- och ��
SM/RNP-brunnarna
för att fastställa
��förekomsten
� � �� av dessa två autoantikroppar.
Om �
Sm/RNP-brunnen
är positiv och
��
� ��
Sm-brunnen
är negativ
har patienten antikroppar
��
� � ��
mot RNP. Om båda brunnarna är positiva och har
��
så gott som lika värden har patienten antikrop� ��
��är positiva och
par mot ��
Sm. Om �
båda
brunnarna
�� är� 30
��
��
Sm/RNP-brunnen
ENA-enheter
eller högre än
��
�� av både SmSm-brunnen tyder detta
på förekomst
och RNP-autoantikroppar. Förekomsten av båda
antikropparna kan bekräftas med hjälp av Immuno
Concepts AUTO-ID® immundiffusionssystem, katal��
� � ��
ognummer
6030.
3. De övriga
brunnarna är
��
� �belagda
��med affinitetsrenade monospecifika
och reagerar en�� antigener
� � ��
dast på den
homologa
SLE och andra
��
� antikroppen.
� ��
autoimmuna syndrom har emellertid patientsera
��
med flera antikroppspecificiteter, och därför kan ett
��
enskilt serum uppvisa en positiv reaktion i mer än en
brunn. ��
��
� ��
��
4. Brunnarna
är belagda�med
affinitetsrenade
anti��
��
gener i följande ordning: Från
toppen
(brunn A och
den solida flikänden på remsan) till botten (brunn H
och den naggade flikänden på remsan):
��
��
��
��
��
��
��
��
��
RAPPORTERING AV RESULTAT
Resultat skall rapporteras som positiva eller negativa
för respektive antikroppar mot extraherbara nukleära
antigener. Antikroppnivåerna har ingen känd klinisk
betydelse.
PRESTANDA
Immuno Concepts screeninganalys RELISA® jämfördes
med andra liknande ELISA-analyser på marknaden,
med dubbla immundiffusions- och kontraimmunelektroforestester som gjorts i referenslaboratorier och med
immunoblot (Western Blot)-resultat som erhållits med
en intern metod. Resultaten av alla metoder och den
kliniska diagnosen av patienten togs med i beräkningen
när förväntade eller ”korrekta” resultat testades för
varje prov. Följande data erhölls med utgångspunkt
från jämförelser. Tabell 2.
Skillnaderna i specificitet beror på den ökade sensitiviteten hos ELISA-analyser jämfört med ”traditionella”
metoder, exempelvis kontraimmunelektrofores och
immundiffusion.
KORSREAKTIVITET
Sju prover användes för studier av korsreaktivitet. Dessa
prover karaktäriserades väl av Western Blot, CIE och
immundiffusion som monospecifika sera för var och en
av autoantikropparna i screeningstestet RELISA®. Ingen
korsreaktivitet noterades i något av dessa prov.
Tabell 3.
REPRODUCERBARHET
För var och en av de sex antigenspecificiteterna kördes
sex prover med tre olika lotnummer av antigenremsor
vid tre olika tillfällen. Två av proverna var negativa,
men låg nära frånslagsvärdet 20 ENA. Två prover var
positiva, men låg nära frånslagsvärdet 20 ENA och
två prover låg klart positivt över nivån 30 ENA . I inget
av fallen gav ett negativt prov positiva resultat. Alla
”gränsfallspositiva” prover gav överlag resultat mellan
20 och 30 ENA-enheter och de klart positiva proven gav
klart positiva svar.
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Förekomsten av autoantikroppar mot olika nukleära
antigener varierar beroende på patientpopulation och
förekomsten av kliniska reumatiska sjukdomar i denna.
Sambandet mellan antikroppar och specifika reumatiska sjukdomar har sammanfattats i nedanstående
tabell 1.
29
Scl-70
Hoch-spezifischer Marker-Antikörper, der bei 15-20 % der PPS��
��
��
��
��
��
��
Patienten auftritt
��
��
��
��
��
��
��
��
Jo-1
Marker-Antikörper,
25-30 % der��
Patienten ��
��
��
��
�� der bei
��
�� Hoch-spezifischer
��
��
��
mit Polymyositis oder Dermatomyositis auftritt
��
��
Antikroppar
��
mot:
��
��
��
��
Sm
��
��
��
U1-RNP
��
��
��
��
��
SSA/Ro
��
SSB/La
Scl-70
��
��
��
Jo-1
��
��
��
��
Sjukdomssamband:
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��
��hos
� 25-30 ��
Mycket specifik markörantikropp
påträffade
% av SLE��
��
��
��
��
��
��
��
��
patienterna.
��
��
��
��
��
��
Blandad
>95
%, SLE 35 %,
lägre frekvens
�� bindvävssjukdom
��
��
��
��vid skivformig
��
lupus
skleros (PSS)
��eller progressiv
�� systemisk
��
��
��
��
��
��
�� syndrom
��
��
��
��
��
Sjögrens
60-70 %, SLE
50 %
��
��
��
Sjögrens syndrom 40-50 %, SLE 15 %
påträffade
PSS- �
Mycket specifik ��
markörantikropp
�
��
�� hos 15-20 % av ��
patienterna. ��
��
��
��
��
��
��
��
��
påträffade
hos
25-30
%
av
patienter
Mycket specifik markörantikropp
��
�
��
��
med
polymyosit��
eller
��
��
� dermatomyosit.
��
��
��
��
��
��
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��
��
��
��
��
��
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��
��
��
��
��
��
��
TABELL 2
��
��
��
��
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��
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��
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��
��
��
��
TABELL 3
��
��
��
��
TABELL 1
��
��
��
��
��
��
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��
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��
��
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��
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��
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��
��
��
��
��
��
��
��
��
30
RELISA® ENA TESTPROCEDUR
Alla prover, reagenser (inklusive tvättbuffertlösningen) och mikrobrunnar
måste stå i rumstemperatur före användning.
1.
Iordningställande av arbetsblad: Märk det
arbetsblad som medföljer satsen för att
ange identifieringen för varje åttabrunnarsremsa med mikrobrunnar.
2.
Framställning av tvättbuffertlösning (PBS
Tween): Lös upp innehållet i en PBS-buffertpåse i en liter avjoniserat eller destillerat
vatten. Tillsätt hela innehållet i en flaska
med tvättbuffertkoncentrat i den upplösta
fosfatbuffrade saltlösningen i en enlitersbehållare. Blanda väl. Tvättbuffertlösningen
kan täckas och förvaras i 2-10 °C i högst
fyra veckor.
3.
Spädning av prover: Späd patientproverna
till 1:40 genom att tillsätta 25 µl serum till
975 µl provspädningsvätska. Blanda väl.
Kontrollerna tillhandahålls färdigspädda
och behöver inte spädas ytterligare.
4.
Iordningställande av mikrobrunnsremsor:
Avlägsna nödvändigt antal mikrobrunnsremsor från deras påsar och placera dem
i ramhållaren. Mikrobrunnsremsorna måste
sitta ordentligt fast i ramhållaren. Placera
ramhållaren på ett stadigt underlag, med
bokstäverna A till H till vänster och siffrorna
1-12 på ramhållarens övre kant. Placera
remsorna i ramhållaren så att den naggade änden på remsan passar in över det
lilla stiftet på ramhållarens nedre kant. Tryck
ned remsans båda ändar ordentligt så att
de sitter säkert fast i ramhållaren. Remsor
som sitter ordentligt fast i ramhållaren faller
inte ut om ramhållaren vänds upp och ned.
Märk den frostade övre änden av remsan
med patientidentifikation och placering i
ramhållaren.
5.
Dispensering av serumspädningar: Dispensera 50 µl spätt patientprov i var och en
av de åtta brunnarna i en multiparameterremsa.
6.
Inkubation av remsor (30 minuter i rumstemperatur, det vill säga 19-23 °C): Odla i
rumstemperatur i 30 minuter. Remsorna skall
skyddas mot drag och temperaturväxlingar
under inkubationstiden. Remsorna kan om
så önskas täckas med genomskinlig tejp
eller pappershandduk för att skydda dem
mot damm och andra främmande ämnen.
7.
Tvättning av remsor (se „Allmänna proceduranvisningar“ 5 och 6): Tvätta brunnarna tre till fem gånger med PBS-Tween
tvättbuffertlösning. Manuell tvätt: Aspirera
brunnarnas innehåll och fyll därefter varje
brunn med tvättbuffertlösning. Undvik korskontamination mellan brunnarna, särskilt
i första tvätten efter aspirationen. Töm all
tvättlösning från brunnarna genom att vända dem upp och ned och skaka därefter
resterande tvättbuffert från brunnarna
med en bestämd ”knyck” med handleden.
Upprepa fyll- och torkstegen för totalt tre till
fem tvättar. Brunnarna skall sedan knackas
bestämt mot en pappershandduk eller annat absorberande material för att avlägsna
alla spår av kvarvarande tvättbuffert.
8.
9.
Inkubation av remsor (30 minuter i rumstemperatur, det vill säga 19-23 °C): Odla i
rumstemperatur i 30 minuter. Remsorna skall
skyddas mot drag och temperaturväxlingar
under inkubationstiden. Remsorna kan om
så önskas täckas med genomskinlig tejp
eller pappershandduk för att skydda dem
mot damm och andra främmande ämnen.
10.
Tvättning av remsor: Tvätta brunnarna tre
till fem gånger med PBS-Tween tvättbuffertlösning. Manuell tvätt: Aspirera brunnarnas
innehåll och fyll därefter varje brunn med
tvättbuffertlösning. Undvik korskontamination mellan brunnarna, särskilt i första
tvätten efter aspirationen. Töm all tvättlösning från brunnarna genom att vända
dem upp och ned och skaka därefter
resterande tvättbuffert från brunnarna
med en bestämd ”knyck” med handleden.
Upprepa fyll- och torkstegen för totalt tre till
fem tvättar. Brunnarna skall sedan knackas
bestämt mot en pappershandduk eller annat absorberande material för att avlägsna
alla spår av kvarvarande tvättbuffert.
11.
Dispensering av substratlösning: Förvissa
dig om jämna tidsintervall med hjälp av ett
tidur och dispensera 50 µl substratlösning
i varje brunn. Substratlösningen måste
tillsättas i brunnarna i en jämn hastighet så
att varje brunn inkuberas exakt lika länge
(fem minuter). Substratlösningen i brunnar
som inkuberas med positiva prover blir blå,
medan lösningen i brunnar som inkuberas
med negativa prover blir färglösa eller
mycket svagt blå.
12.
Inkubation av remsor (exakt fem minuter i
rumstemperatur, dvs 19-23 °C): Odla i rumstemperatur i exakt fem minuter. Remsorna
skall skyddas mot drag och temperaturväxlingar under inkubationstiden.
13.
Dispensering av stoppreagens: När den
första brunnen har inkuberats i exakt fem
minuter skall 50 µl stoppreagens tillsättas
i varje brunn, i samma ordningsföljd och
med samma hastighet som substratlösningen tillsattes i brunnarna. När stoppreagens
tillsätts skiftar den blå substratlösningen till
gult, medan den färglösa lösningen förblir
färglös.
14.
Läsning av brunnarnas absorption: Brunnarna måste avläsas i plattläsande spektrofotometer inom 30 minuter efter tillsättning
av stoppreagensen. Brunnarna avläses vid
450 nm mot ämneskontrollbrunnen. Om
spektrofotometer med dubbla våglängder
används skall referensfiltrets våglängd
ställas in på 600-650 nm. Avläsning av mikrobrunnarna utan referensfilter ger högre
absorptionsvärden.
TEKNISK HJÄLP:
+1-916- 363-2649
eller e-mail:
[email protected]
Dispensering av enzymantikroppreagens:
Dispensera 50 µl enzymantikroppreagens i
varje brunn.
31
BIBLIOGRAPHY
1. Douvas, A.S., Achten, M., and Tan, E.M. Identification of a Nuclear Protein (Scl-70) as a Unique Target of Human
Antinuclear Antibodies in Scleroderma. J. Biol. Chem. 254:10514-10522, 1979.
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Manufacturer
Constructeur
Fornitore
Fabricante
Hersteller
Fabrikant
Authorized Representative in the European Community
Représentant autorisé dans le Communauté européen
Rappresentante autorizzato nella Comunità Europea
Representante autorizado en la Comunidad Europea
Autorisierter Repräsentant in der Europäischen Gemeinschaft
Auktoriserad Representant europeiska unionen
Temperature Limitation
Limitation de la Température
Limitazione Di Temperatura
Limitación De la Temperatura
Temperatur-Beschränkung
Temperatur begränsning
Contains Sufficient for <n> tests
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