Diagnostic des mycoses profondes

Diagnostic des mycoses profondes
Boualem SENDID
ParasitologieParasitologie-Mycologie, Inserm U995U995-2
Institut de Microbiologie, CHRU de Lille
Colloque National des Biologistes des Hôpitaux
Lille, 44-8 octobre 2010
Agents fongiques responsables d’infections invasives chez le
patient hospitalisé (USA)*
Type d’infection
Proportion %
Candidose
59
Aspergillose
14
Cryptococcose
9
Histoplasmose
4
Coccidioidomycose
3
Blastomycose
3
Fusariose
1
Scedosporiose
1
Zygomycose
1
Autres
5
*Fothergill AW, Focus on Fungal infections 18, 2008
Distribution des espèces de levures isolées
d’hémoculture (AP-HP, 2002-2007, 1824)*
1%
5%
3%
2%
0%
10%
49%
13%
C. albicans
C. glabrata
C. parapsilosis
C. tropicalis
Cr. neoformans
C. krusei
C. kefyr
C. guilliermondii
Autres
17%
Données de l’Observatoire des levures,CNRMA
Distribution des espèces Candida isolées d’hémoculture
au CHRU Lille (430 isolats, 1993-2003)
100%
other species
C. krusei
C. parapsilosis
C. tropicalis
C. glabrata
C. albicans
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
O
s
gy
lo
gy
lo
o
at
em
ha
d
ar
w
er
th
onc
s
or
m
ro
te
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tu
o
tr
as
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s
ric
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di
Pe
O
G
So
y
er
rg
U
Su
IC
Sendid B et al. BMC Infect Dis. 2006
Aspergillose invasive, pathologies sous-jacentes
(Surveillance nationale 2005-2006, 331 cas)*
Hémopathies malignes
81%
Pathologies resp. chron. 11%
Cancer
5%
Transplantation d’organes 3%
Hémopathies malignes
45%
40%
35%
30%
28%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
LAM
LAL
Lymphomes
LLC
Autres
Réseau SAIF, CNRMA
Aspergillose invasive et transplantation
Allogeneic – Unrelated
Allogeneic – Related
Lung Transplant
10.3%
6.7%
8.4%
Heart Transplant
6.2%
Autologous BMT
2.6%
Liver Transplant
Pancreas Transplant
1.7%
1.3%
Kidney Transplant
0.7%
Infections fongiques invasives,
un problème de santé publique persistant
Morbidité1
Durée de séjour à l’hôpital étendue : 3 -30 days.
Surcoût par patient : 6.214- 92.266 $
Mortalité1,3
Associée à la candidémie : 10-40 %;
Traitement retardé (>12 h): 23-46%.
Associée à l’aspergillose : 50-90%
Traitement antifongique2 : 10.5% des charges totales
Exemple (2005)4: 2.8 M€ par an pour un hôpital de 3000 lits (France)
Origine : difficultés du diagnostic clinique et biologique
Ex. Hémoculture, sensibilité < 50%; LBA <30%
Diagnostic précoce (pronostic favorable)?
1Pfaller
M. CMR, 2007: 2Rentz AM. CID, 1998
3Morgan JM, Infect. Control. Hosp Epidemiol. 2005
4 Sendid B, BMC Infect Dis 2006
Stratégies diagnostiques des
infections fongiques invasives
(IFI)
HISTOLOGIE
Diagnostic de certitude, mais biopsies rarement réalisées (gestes
invasifs)
IMAGERIE
• Candidose profonde : diagnostic tardif, en particulier
suspicion de candidose hépato-splénique (images de microabcès), atteinte médullaire…
IMAGERIE
IMAGERIE
: Aspergillose
invasive
Aspergillose
Invasive
Halo
Condensation
J0 - J5
J5 - J10
Valeur majeure
non
spécifique
Neutropénie
Croissant
J10 - J20
retardé
PNN >> 500
Caillot D, 2001
Mycologie: méthodes conventionnelles
Milieu chromogène identification présomptive :
C. krusei
C. albicans
L
e
v
u
r
e
s
C. glabrata.
C.tropicalis
Tests d’agglutination :
Galerie d’identification
Résultats disponibles en 24-72h
Mycologie: méthodes conventionnelles
Milieux d’isolement :
F
I
L
A
M
E
N
T
E
U
X
Sabouraud + antibiotiques
Gélose au sang
Milieu d’identification
milieu Czapec
Extrait de Malt
Incubation :
25-30°C
Atmosphère aérobie
Durée 48h- plusieurs jours
Amplification et séquençage des régions ITS (gène 18RNAr)
« Internal Transcribed Spacer »
ITS1
ITS2
pITS1
18S ADNr
5,8 S
26S ADNr
pITS2
Taille: 400-600 pb
Intérêts :
Diagnostic de mycoses invasives (examen direct positif, culture négative)
Diagnostic d’espèce pour les mycoses rares
Levures émergentes (ex. C. haemulonii, candidémies)
Champignons filamenteux rares (Fusarium sp.)
Identification des champignons par MALDI-TOF
Spores de Aspergillus
Spectre
Matrix
DHB
MALDI-TOF-MS
ME. Bougnoux/A. Alanio, ICAAC 2009
MALDI-TOF MS: Une révolution en microbiologie clinique
Plus de 500 références dans PubMed..
Aspergillus sp. Pics de référence des 28 espèces
Fumigati
Flavi
Terrei
Nigri
Nidulantes
Usti
Aspergilli : Taxonomie
Genre
Section
Complexe d’espèces
35 espèces
Fumigati
N. pseudofischeri
Flavi
Aspergillus
A. viridinutans
Nigri
N. udagawae
Terrei
A. fumigatiaffinis
A. lentulus
Nidulantes
A. fumigatus
Hong et al., 2008
Identification des levures en routine hospitalière
(700 souches, 17 espèces différentes, 50 souches de référence*
Nombre de souches
C dubliniensis
P cactophila
Résultats d’identification par SM
Première identification
Deuxième identification
Discordance
Résultats d’identification par méthodes conventionnelles
99% de corrélation avec la galerie API32C
* Sendid B. 2010, J Mycol Med, sous presse
Stratégies diagnostiques des mycoses
profondes
Examen mycologique
•
Sites normalement stériles (LCR, liquide pleural, liquide articulaire, bile…)
: valeur diagnostique très élevée, mais prélèvements peu réalisés
 Hémocultures : 50 % pour Candida ; inutilisables pour Aspergillus
•
Sites "ouverts", susceptibles d’être colonisés ou contaminés (trachée,
LBA) : interprétation difficile
- Importance de la densité fongique et la fréquence d’isolement (LBA,
Urines…)
La colonisation fongique
• La colonisation est un préalable à toute invasion
- Facteur de risque majeur d’infection
• Colonisation de plusieurs sites périphériques:
Facteur de risque indépendant de candidose invasive
Le % de patients colonisés augmente au cours de
L’hospitalisation
Eggimann, 2004
Eggiman P. Lancet Infect Dis. 2003
La colonisation fongique, en pratique…
*Pittet D, Annals of Surgery 1994
Pittet D, Am J Med 1991
Index de colonisation (IC, ICC)*:
 mieux cibler les patients justifiant
d’un traitement antifongique
650 patients suivis en USI; 29 patients
colonisés :11 ont développé des CI
Seuil 0.5 atteint 5-6 jours avant l’infection
Se
Sp
>ou= 2 sites colonisés
100
22
Index de colonisation
100 (>0,5)
69
Index de colonisation
100 corrigé
100
VPP
44
66
100
VPN
100
100
100
• Valeur prédictive, pas testée en prospectif,
• Stratégie non validée en réanimation médicale
• Difficultés de mise en œuvre ++
(Hamidfar R et al, SRLF 2004)
‘‘Candida Score’’ pour identifier les patients justifiant
d’un traitement antifongique
A "Candida score » >2.5 accurately selected
patients who would benefit from
early antifungal treatment.
Leon C. Crit Care Med 2006; 34: 730-737
Justification des tests alternatifs à la culture
• Faible sensibilité des méthodes conventionnelles (hémoculture: 50%,
LBA < 30%)
• Patients à haut risque d’IFI, souvent traités de manière empirique, faible
rendement des cultures, nécessité de documenter l’épisode infectieux*
• Amélioration de la précocité du diagnostic biologique
• Suivi l’efficacité thérapeutique
Répartition de la consommation antifongique en
hématologie adulte et pédiatrique en 2005
Probabiliste
72%
Prophylactique
3,3%
Documenté
24,7%
Total : 1 731 300 €
Thèse, Bérénice Bro , 2007
Tests sérologiques : détection du mannane et des
anticorps anti-mannane
100
100°
°C
Platelia® Candida
antigène
Sendid et al. J Clin Microbiol 1999
Yera et al. EJCMID 2001
Sendid et al. J Med Microbiol 2002
Sendid et al. J Clin Microbiol 2004
Platelia® Candida
anticorps
Nouvelle génération de Tests PlateliaTM Candida
Nom*
Platelia™Candida Ag Plus
Interprétation des résultats
C<62.5pg/ml : Négative pour la présence d’antigène mannane
62.5pg/ml=<C<125pg/ml : Intermédiaire pour la présence d’antigène mannane
C>=125pg/ml : Positif pour la présence d’antigène mannane
Nom**
Platelia™Candida Ab Plus
Interprétation des résultats C<5AU/ml : Négatif pour la présence d’anticorps anti-mannane
5=<C<10AU/ml : Intermédiaire pour la présence d’anticorps anti-mannane
C>=10AU/ml : Positif pour la présence d’anticorps anti-mannane
* Test plus sensible; ** Faible dilution de sérum (1:400)
Exemple : Valeurs cinétiques des tests Platelia Ag et Ac
au cours d’une candidose systémique chez un patient
de réanimation
10
100
Ac
8
80
6
60
40
4
20
2
0
0
-20
-10
0
10
20
30
Sensibilité (%)
100
Mannanémie (ng/ml)
Titres d’anticorps anti
anti-mannane (A.U)
En pratique : Détection conjointe Mnn/Ac Mnn
80
60
40
20
0
1
(19)
2
3
4
5
6
(17) (13) (9)
(5) (3)
n samples/patient
(n patients/category)
Herent et al. JCM 1992
Jours
Isolement de Candida
d’une hémoculture (J0)
Un prélèvement dès l’admission et un suivi
bi-hebdomadaire pour les patients à haut risque
Early diagnosis of invasive candidiasis with mannan
antigenemia and antimannan antibodies
Prella M, Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2004
Contribution des tests Platelia® au diagnostic des
candidoses systémiques
EN RÉSUMÉ…
• Diagnostic de 80 % des candidoses déterminées par les
espèces les plus pathogènes du genre, C. albicans, C.
glabrata et C. tropicalis
• Sensibilité plus faible (40-50%) pour les autres espèces
• Précocité : 4 jours en moyenne avant positivité de
l’hémoculture
•Tests automatisés, adaptés à la surveillance d’un grand
nombre de patients à risque.
Galactomannane
2 M1
a
2 M1
PLATELIA ASPERGILLUS
a
2 M1
a
6 M1
6
Galf
5
1
b
Galf
PATAG
n>4
Présent sur de nombreuses
Glycoprotéines avec
MMr > 40 kDa
JP Latgé, IP Paris.
GOLD
TEM
GOLD
SEM
Détection du galactomannane sérique (ELISA)
Patients avec cancers
Etude prospective de 797 patients
3294 échantillons sériques
153 épisodes d’AI; 31 confirmés, 67 probables, 55 possibles
Sp
94.8
98.2
98,2 adultes 47.6 (enfants)
Se
29.4
65
16
26
confirmés
probables
possibles
VPP
58
92% chez non-allogréffé
43% chez allogreffé
VPN
85
Valeur diagnostique, 2 sérums consécutifs + > un résultat isolé
Herbrecht, R, J Clin Oncol, 2002
Dépistage de patients à haut risque
d’aspergillose invasive (AI)
 La détection d’antigène GM est plus sensible et plus spécifique que la TDM et
la culture
 La positivité de l’antigène GM précède les signes radiologiques (TDM) et la
culture d’une semaine (moyenne)
 L’antigène GM était positif 6 à 10 jours avant l’apparition des symptomes
cliniques
 L’antiggène GM était plus sensible (comparé à la RT-PCR aux b-glucanes)
pour la prédiction d’un diagnostic positif d’AI chez le patient d’oncohématologie.
Faux positifs
• Réactivité croisée avec d’autres champignons (Cryptococcus,
Histoplasma) ou bactéries (bifidobacterium)
• Apport exogène de galactomannane, alimentaire, antibiotiques
(Pipéraciline/Tazobactam, interférence variable selon les lots)
• Solutés de nutrition parentérale (Ribaud, ICAAC 2007)
Détection d’anticorps anti-Aspergillus par ELISA
ELISA indirect 2h30
Utilisation d’un antigène recombinant
Détection d’anticorps anti-Aspergillus par ELISA
Groupes :
1A : chronic pulmonary aspergillosis
1b : ABPA
2 : Mutiple colonization (culture ++)
3: 1 seul prélèvement BP +
4: Culture - et IPD négative
5: Témoins sains
Thorez S, Sendid B, Hennequin C, ICAAC 2010
Limulus assay
Fungitell ® assay: Associates of Cape Cod, Agrément FDA 2004
Test enzymatique (durée 40 min)
Le fungitell est préparé à partir d’un lysat d’amebocytes (GR du crap)
traités (dépourvus de facteur C, activable par le LPS).
1,3-glucanes, un marqueur panfongique
Spécificité large:
- Miyazaki T et al. J Clin Microbiol 1995
- Obayashi T et al. J Med Vet Mycol 1992
- Obayashi T et al. Lancet 1995
- Mitsutake KT et al. J Clin Microbiol 1996
- Pazos C et al. J Clin Microbiol 2005
Candida,
Aspergillus,
Pneumocystis,
Fusarium,
Scedosporium
Exception:
Cryptococcus (très faible quantité)
Zygomycoses
170 Healthy subjects
B-D-Glucanes et infections déterminées par Candida sp.
Valeurs de référence :
+
120
80
-
Détection d’ADN fongique par PCR
Beaucoup de questions : certaines sont résolues d’autres pas…
•
•
•
•
•
Echantillon biologique : Sang total, Plasma, Sérum ?
Cible amplification ? ADNr, autres ?
Type de PCR, conventionnelle, temps réel
Extraction: Manuelle, automatique
Volume d’échantillon: 5 ml, 1ml, 200 L…?
SeptiFast permet l’identification de
25 agents pathogènes couvrants 90% des infections, en moins de 6 heures.
MRSA (mecA)
SeptiFast
Technique RT-PCR sur LightCycler 2.0 CE/IVD
directement sur sang prélevé sur EDTA
Sang total EDTA
(3 ml)
MagNA Lyser
Instrument
Prélèvement
Lyse
LightCycler 2.0
Instrument
Extraction
SeptiFast
approx. 5 heures
Coût : 150 € /analyse
Rendu
Etude prospective interventionnelle temps-réel SeptiFast en
réanimation médicale, CHRU de Lille (Evaluation en cours en hématologie)
SF pos
HC
pos
SF neg
5
2
SF=S. aureus/HC=C. glabrata
SF=S.marcescens/HC =S. marcescens SF
Inhib*/ HC = E. coli
SF Neg/ HC = Leuconostoc
= C. tropicalis/HC= C. albicans
SF= S.aureus/HC = S.aureus
SF=S.marcescens/HC =S. marcescens
HC 7
neg 2 E. coli/ HC neg
(pas dans le panel SeptiFast)
74 dont 2 SF = INH*
2 S. aureus / HC neg
2 Klebsiella/HC neg
1 P. aeruginosa
* Leucocytose > 30.000/mm3
Wallet F, Clin Microbiol Infecttion, soumis
QUELS PATIENTS ?
Patients
à risque
Admissions
A quel moment ?
Surveillance
Mycologique
Sérologique
Réanimation
Chirurgie
Leucémies
Tumeurs solides
Transplantation
Greffés
Prématurés
Brûlés….
Facteurs de risque associés
Chimiothérapie (mucite)
Antibiotiques
Corticothérapie
Cathéter veineux central
Score de gravité élevé
Colonisation fongique
Aide à la décision thérapeutique
Mycose profonde
Syndrome infectieux résistant
aux antibiotiques
Stratégie diagnostique des mycoses profondes en hématologie
Patients
à risque
Admissions
Leucémies
Tumeurs solides
Transplantation
Greffés
Prématurés
Brûlés….
Facteurs de risque associés
Chimiothérapie (mucite)
Neutropénie
T. empirique
Antibiotiques
Corticothérapie
Cathéter veineux central
Score de gravité élevé
Colonisation fongique
Décision
thérapeutique
Mycose profonde
A l’admission :
Bilan mycologique
Bouche, nez, urines, selle, crachats
Aspiration bronchique
Bilan sérologique
- Mnn; GM; BDG (VPN:
- Anticorps Candida, Aspergillus
Début de chimiothérapie :
Surveillance bi- hebdomadaire
GM, BDG, Mnn
Recherche active des foyers infectieux si :
*2x GM+ avec ou sans BDG (Aspergillose)
**2x Mnn+ avec ou seul BDG (candidose)
***2x BDG (autres mycoses)
*Foyers aspergillaires
**Foyers candidosiques
Imagerie (TDM, Echographie)
Aspirations bronchiques (X)
LBA, Biopsies, LCR
PCR sérum ++
Hémocultures
Imagerie (Echographie)
Lésions cutanées
Biopsies
***Autres mycoses profondes
Imagerie (TDM, IRM)
Biopsies
Stratégie de prise en charge diagnostique de l’aspergillose invasive
Clin Infect Dis 2005;41:1242-50
Stratégie diagnostique des candidoses profondes en réanimation
Admission
Bilan mycologique « de référence »
Bouche, nez, urines, selle, crachats
Aspiration bronchique
Bilan sérologique « de référence »
BDG, Mnn/Ac Mnn
Décision thérapeutique
Dialogue
Bio-clinique
Surveillance 2x /semaine
-
Recherche de foyers infectieux:
- Hémocultures
- Imagerie (Echographie)
- Biopsies
Surveillance
Evaluation des facteurs de
risque associés
Antibiotiques
Cathéter veineux central
Score de gravité élevé
Chirurgie
+
-
+
Bilan mycologique
Bouche, nez, urines, selle, crachats
Aspiration bronchique
Bilan sérologique
BDG, Mnn, Ac
+
-
Surveillance
Conclusions
Diagnostic mycologique conventionnel est :
- Perfectible (répéter les prélèvements)
- Indispensable
identification du genre, d’espèce
Tests de sensibilité aux antifongiques
- Biomarqueurs alternatifs à la culture:
- Outils de screening, identification des patients justifiant
d’une recherche active du foyer infectieux (Hémocultures, TDM)
- Contributifs si réalisés de manière régulière (2X/semaine)