Génie de la biocatalyse et génie des procédés « Production d

Transcription

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université Virtuelle de Tunis
Génie de la biocatalyse et génie des
procédés
« Production d’enzymes
industrielles »
Concepteur du cours:
Prof. Dr. Mohamed GARGOURI
Attention !
Ce produit pédagogique numérisé est la propriété exclusive de l'UVT. Il est
strictement interdit de le reproduire à des fins commerciales. Seul le
téléchargement ou impression pour un usage personnel
(1 copie par utilisateur) est permis.
Génie de la biocatalyse et génie des procédés
Production d’enzymes industrielles
1. Exemple de production d’enzyme à échelle industrielle : BASF
☺
 BASF est un groupe d’industries chimiques.
 Il s’intéresse de plus en plus aux activités de production
d’enzymes pour sa propre utilisation ou pour la vente à
d’autres secteurs.
 BASF produit des enzymes utilisées comme des additifs dans
l’alimentation pour animaux : volaille et porc. Une enzyme au
nom commercial « Natuphos® » correspond à une phytase.
Cette enzyme est devenue la propriété industrielle exclusive
de BASF depuis l’achat de tous les brevets, procédés et droits
d’une autre compagnie qui a participé au lancement du
produit.
 L’enzyme est produite dans des fermenteurs de très grands
volumes (plusieurs m3) à partir d’organisme génétiquement
modifié du champignon Aspergillus niger avec un procédé
économique en ressources. Le produit est vendu après
extraction, et séchage sans purification : sous forme de
préparation enzymatique.
2
Source : BASF Interim Report 2nd Quarter 2006.
 Natuphos ® est mélangée à l’alimentation de porc et de volaille.
Une fois consommée par l’animal, elle aide à mieux assimiler le
phosphate contenu dans l’aliment d’origine végétale. Ceci
diminue significativement la quantité de phosphate inorganique
ajouté à l’aliment. Les excréments de l’animal contiennent ainsi
moins de phosphates et la contamination du sol et de l’eau est
réduite de 1/3.
 Le même procédé permet à l’entreprise de produire d’autres
enzymes qui facilitent la digestion de certains polysaccharides
comme Natugrain ® : xylanase.
3
2. Découverte et screening d’activités enzymatiques
☺
 Des activités enzymatiques diverses sont découvertes dans
des organismes vivants. Les enzymes industrielles
proviennent de plantes, d’animaux et essentiellement de
microorganismes.
2.1. Screening d’isolat naturel
 Des milliers d’échantillons du sol, de matériel végétal et
d’autres peuvent faire l’objet d’une recherche automatisée
d’une activité ou d’une voie enzymatique d’intérêt.
 Le screening utilise un milieu spécifique qui ne laisse pousser
que les microorganismes exprimant un système enzymatique
donné. Exemple : un milieu contenant le xylan comme unique
source de carbone et d’énergie, ne laisse pousser que les
microorganismes produisant des xylanases.
4

Le screening peut se baser sur des données écologiques. Par
exemple : un environnement salin comme dans les sebkhas,
est uniquement habité par des organismes halophiles. On
cherche alors dans ces organismes l’activité enzymatique
résistante au sel qui doit être de préférence stable et
extracellulaire.

Des méthodes physiques ou basées sur la composition du
milieu de culture sont employées pour favoriser le
développement d’une catégorie de microorganismes ou bien
défavoriser le développement d’autres.

Critères de sélection : pour distinguer l’organisme ayant
l’activité recherchée, on utilise un critère avec lequel il se
distingue. Exemple : l’utilisation d’une couche opaque de
caséine comme seule source de carbone sur agar, peut révéler
les microorganismes sécrétant des protéases en formant un
halo clair dû à l’hydrolyse de la caséine autour des colonies
développées. D’autres méthodes utilisent des indicateurs
colorés ou des substrats chromogènes.

Le problème souvent rencontré avec le screening classique
est la faible concentration de l’enzyme d’intérêt dans les
isolats microbiens naturels ou bien parfois des propriétés
insuffisantes
pour
l’utilisation
en
industrie.
Des
manipulations génétiques permettent parfois d’améliorer les
propriétés du microorganisme ou de l’enzyme.
2.2. Screening moléculaire

Dans le cas où une enzyme aux propriétés intéressantes a
été identifiée chez une espèce particulière, une recherche
peut être effectuée pour des enzymes homologues chez des
espèces proches (reverse genetics).

La séquence d’acides aminés de la protéine enzymatique
peut nous donner une idée sur la séquence probable des
5
bases nucléotidiques dans le gène correspondant. En se
basant sur cette information une sonde peut être construite
de 15 à 20 nucléotides.

En utilisant la technique PCR sur l’ADN chromosomique
d’espèce proche, un gène homologue peut être amplifié et
transféré à un organisme hôte pour expression de l’enzyme
homologue.
2.3. Screening génomique

Des milliers de gènes sont actuellement séquencés et
disponibles dans des banques de données.

Les génomes de plus de 800 organismes sont accessibles au
public. Exemple :
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Genome

Des méthodes informatiques peuvent alors faciliter la
recherche d’enzymes aux propriétés bien déterminées.
2.4. Screening protéomique

Dans le cas d’expression et de purification efficaces des
protéines, des analyses directes de la structure et de la
fonction sont possibles grâces à des moyens informatiques et
à l’automatisme.

Cette nouvelle technologie permet également l’analyse
fonctionnelle de grands nombres de protéines recombinantes.
6
3. Génie protéique
☺

Le génie des protéines utilise un ensemble de techniques
pour remplacer un acide aminé par au autre ou une séquence
par une autre dans le but de modifier les propriétés de la
protéine.

Le génie protéique se base sur les progrès :
o au niveau des connaissances des structures 3D
déterminées par cristallographie aux rayons X ou par
spectroscopie RMN,
o au niveau de la modélisation informatique,
o au niveau des technologies de l’ADN recombinant.

Les techniques de mutagenèse permettent maintenant
d’effectuer un très grand nombre de substitutions séparées
d’acides aminés dans la même protéine pour tester les
nouvelles propriétés qui en découlent.

Certaines méthodes réalisées au laboratoire miment le
processus d’évolution naturelle ; on parle alors d’« évolution
dirigée ».

Exemple d’application industrielle :
o l’-amylase utilisée pour l’hydrolyse de l’amidon en
industrie doit résister à une opération de chauffage à
7
105 °C utilisée pour faire exploser les granules
d’amidon, et doit fonctionner 1 à 2 h à 90 °C.
o La structure de l’-amylase de Bacillus licheniformis a
été déterminée et comparée à d’autres -amylases
d’autres sources. Cette enzyme possède plusieurs
propriétés intéressantes, mais elle manque de stabilité
comparée à d’autres sources. Les études structurales
ont montré que ceci est dû à des différences à certaines
localités de la séquence d’acides aminés. Le
remplacement de chacun des résidus localisés a permis
d’améliorer la stabilité aux températures du procédé de
quelques dizaines de fois.
4. Méthodes de production d’enzymes
☺
 On distingue les enzymes d’extraction (à partir d’organismes
végétaux ou animaux) ou les enzymes de fermentation
(microorganismes).
 Le procédé industriel typique pour la production d’enzymes est
la culture en profondeur en milieu aérobie utilisant un
microorganisme produisant en grande quantité une enzyme
extracellulaire. Les principaux avantages des enzymes de
fermentation par rapport aux enzymes d’extraction :
o Production en grande quantité en fermenteur,
o Production indépendante des contraintes géographiques
et saisonnières,
o Matière première bon marché,
8
o Manipulation
génétique
hyperproducteurs,
facile
o Purification
plus
extracellulaires.
en
facile
–
cas
mutants
d’enzymes
 Les microorganismes utilisés pour la production d’enzymes
peuvent être des eucaryotes tels que les levures et les
champignons, ou des procaryotes tels que les gram-positifs ou
les gram-négatifs.
 Les caractéristiques recherchées dans une souche produisant
une enzyme industrielle sont : taux de croissance important,
productivité en enzyme importante, activité spécifique de
l’enzyme élevée, régulation réduite, résistance à la répression
catabolique, peu de produits secondaires, sporulation limitée,
nutrition réduite, enzyme extracellulaire, morphologie adaptée
à la culture en réacteur. Comme il est difficile de trouver toutes
ces caractéristiques chez le même organisme, la majorité des
souches servant à la production d’enzymes industrielles ont été
améliorées par :
o mutagenèse (agents chimiques ou irradiation UV)
permettant d’atteindre rapidement des caractéristiques
utiles ou,
o génie génétique permettant à des microorganismes de
produire des enzymes d’organismes supérieurs par
insertion
du
gène
correspondant
dans
le
microorganisme. La chymosine (E.C. 3.4.23.4) a été
clonée par différents groupes dans plusieurs
microorganismes faciles à cultiver comme la levure pour
produire de manière industrielle des préparations
enzymatiques coagulant le lait.
 La fermentation en vue de produire une enzyme se fait à très
grande échelle. Quand l’enzyme est extracellulaire, on peut
utiliser un fermenteur jusqu’à 450 m3. Dans le cas d’enzymes
9
intracellulaires, la nécessite de traitements pour l’extraction
impose une limite du volume jusqu’à 30 m3.
 Dans un fermenteur la production d’enzyme est optimisée grâce
à un contrôle rigoureux d’un maximum de paramètres :
UVT | Cours | ENT | Médiathèque | Bourse virtuelle |C2i |Sites de l'UVT
10

Génie de la biocatalyse et génie des procédés « Production d

Transcription

Documents pareils

Institut Supérieur Aquitain du Bâtiment et des Travaux Publics

Génie de la biocatalyse et génie des procédés

Le fondement scientifique de Digestive Enzyme

dut génie biologie - iut lyon 1

Le top 50 des programmes d`études professionnelles et techniques

d`info

INFORMATIQUE CYCLE PROBATOIRE GÉNIE LOGICIEL

dates de rentrée dut

de l`IUT de Vélizy - Université de V

BD JEUNESSE