isolation et amplification

Transcription

8. Amplification et séquençage des
acides nucléiques
ADN chromosomique, plasmides (ADN
bactérienne), ARN messager
Rupture cellulaire
Isolation et purification
des acides nucléiques
Concentration et amplification
de l’ADN ou de l’ARN isolé
290
8.1 Extraction et isolation de l’ADN
Échantillon de cellules ou de tissus
Traitement avec une solution hypotonique
ou avec des détergents (Triton X-100 et SDS)
Rupture cellulaire et
dissociation des
complexes ADN-protéine
Incubation séquentiel avec un enzyme
protéolytique (protéinase K) et la ribonucléase
Élimination de protéines
et d’ARN
Extraction de l’ADN dans de l’éthanol
Seules les longues chaînes
d’ADN précipitent dans l’EtOH;
les nucléotides simples et les
produits de la digestion de l’ARN
291
restent dans la phase aqueuse.
Centrifugation par gradient de densité:
Une méthode alternative pour l’isolation de
l’ADN est la séparation de protéines, ARN
et ADN selon des différences dans leurs
densités flottantes ou poussées.
Une telle séparation est effectuée en
centrifugeant à haute vitesse l’échantillon
brut dans une éprouvette contenant un
gradient de densité formé (ex. 1.6 à 1.8
mg/mL) par une solution de CsCl.
Lors de la centrifugation, les
macromolécules (protéines, ADN, ARN)
présentent dans la solution de CsCl forment
des bandes distinctes selon leurs densités
flottantes.
(D’après D. Holme et H. Peck,
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
292
L’ADN chromosomique peut être séparé des plasmides par centrifugation par
gradient de densité en présence du bromure d’éthidium (EtBr).
(D’après D. Holme et H. Peck,
Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
L’EtBr est un fluorophore qui se lie entre deux brins d’ADN. En se liant à
l’ADN, l’EtBr diminue la densité flottante de celle-ci, dû à un déroulement
partiel de la double hélice.
Il y a plus d’EtBr qui se lie à l’ADN chromosomique (ADN linéaire) qu’aux
plasmides (ADN circulaire).
La densité de l’ADN chromosomique est diminuée par 0.125 g/mL, tandis que
que celle des plasmides est diminuée par 0.085 g/mL.
293
8.2 Isolation de l’ARN

L’isolation de l’ARN n’est pas aussi simple que celle de l’ADN:

Les échantillons sont facilement contaminés par de la
ribonucléase (omniprésente) qui cause la fragmentation de l’ARN.
Des d’inhibiteurs sont ajoutés pour empêcher l’activité endogène
de la ribonucléase et l’activité exogène est minimisée par
l’utilisation de verrerie stérile et de produits chimiques de haute
pureté.

L’ARN est fortement associé à des protéines (polysomes). Des
traitements durs sont nécessaires pour libérer l’ARN.
Deux méthodes communément employées pour l’isolation de
l’ARN sont la méthode de la protéinase K (enzyme
protéolytique qui cause la dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines) et le traitement avec du
thiocyanate de guanidine.
294
Méthode de la protéinase K
Échantillon de cellules
Rupture cellulaire; le nucléus
demeure intacte
Traitement avec une solution hypotonique
Centrifugation
Élimination du débris et nucléus
cellulaire; l’ARN cytoplasmique
demeure dans le surnageant
Traitement du surnageant
avec la protéinase K
Extraction avec du phénol/chloroforme
Extraction avec de l’éthanol
Dissociation des complexes ARNprotéine et la digestion des protéines
Élimination des produits de
la digestion enzymatique
Précipitation de l’ARN dans
295
la phase aqueuse avec de l’EtOH
Traitement avec du thiocyanate de guanidine
Échantillon de cellules
Traitement avec du thiocyanate de guanidine
et du 2-mercaptoéthanol
Centrifugation du surnageant sur du CsCl
(5.7 mol/L) à 100 000 g pendant 18 h
Rupture cellulaire et
dénaturation de la
ribonucléase
Isolation de l’ARN au
fond du tube
La pelote d’ARN est dissout dans du tampon
L’ARN est concentré par précipitation dans de l’éthanol froide.
Séparation et purification de l’ARNm par chromatographie par affinité
(oligo-dT-cellulose ou poly(U)-sépharose)
296
8.3 L’amplification des acides nucléiques par
réaction de polymérisation en chaîne
La quantité d’ADN dans un échantillon est souvent insuffisant pour
le séquençage et l’analyse.
L’amplification en chaîne par polymérase (ACP) est un procédé
d'amplification enzymatique in vitro d'une séquence définie d'ADN
(Kary Mullis, Prix Nobel 1993).
Une seule molécule d’ADN suffit pour l’ACP. Avec l’ACP, plusieurs
tâches qui avant étaient impossible sont maintenant devenues de
routine (ex. identification d’un coupable avec un seul cheveu ou
spermatozoïde et l’identification rapide de maladies infectieuses).
Principes de l’ACP
ACP en temps réel (mesure semi-quantitative des produits de l’ACP
durant la réaction)
Transcription inverse de l’ARN en ADN complémentaire
297
8.3.1 Principes de l’ACP
La réaction d’amplification est effectuée dans un seule éprouvette
qui est placé dans un thermocycleur.
L’éprouvette contient:
(1) l’échantillon d’ADN à amplifier
(2) un excès de 2 amorces, i.e. des oligonucléotides, constitués de
10 à 30 bases, ayant des séquences complémentaires aux bouts
de l’ADN cible
(3) un excès des 4 acides désoxyribonucléiques (dATP, dCTP,
dGTP et dTTP)
(4) l’ADN polymérase, une enzyme qui synthétise, à partir des
amorces, le brin complémentaire de celui ayant servi de matrice
(5) un tampon qui maintient le pH et fournit les ions Mg2+ qui sont
nécessaires à la réaction.
298
La réaction d’amplification est constitué de 3 étapes principales:
Étape 1- dénaturation de l'ADN
(séparation des deux brins de la
double hélice) à température
élevée (94-95°C).
Étape 2- positionnement des amorces
en face de leurs séquences
complémentaires, sur les brins
d'ADN, et fixation sur ces cibles
(hybridation).
5’
Étape 3- phase d'extension dans
laquelle l'ADN polymérase
synthétise, à partir des amorces,
le brin complémentaire de celui
ayant servi de matrice.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
299
Les 3 étapes, dénaturation de l’ADN, hybridation des amorces et extension
des amorces, constituent un cycle. L’ACP comporte généralement 20 à 35
cycles successifs d'amplification.
Le chauffage et refroidissement répétitif du mélange réactionnel est
communément appelé cycle thermique.
Chaque étape dure 30 à 120 s. Seule la 1ère étape de dénaturation dure
5 min. Une ACP de 30 cycles peut être donc complétée dans 1 à 2 hres.
300
En théorie, le nombre de copies d’ADN est doublé dans chaque cycle.
Le nombre théorique de molécules d’ADN (double brins), Nm, à la fin de la
réaction dépend du nombre initial de molécules d’ADN (double brins), No,
dans le mélange réactionnel et du nombre de cycles, n:
N m = No ⋅ 2 n
Ce nombre théorique n’est jamais atteint dus à des facteurs limitants tels
que l’épuisement des réactifs et l’amplification de chaînes plus longues
durant les premiers cycles.
En pratique, le nombre de molécules d’ADN peut être estimé selon
l’équation:
Nm = No ⋅ (1 + x )n
où x est l’efficacité de la réaction (valeur de 0 à 1).
301
Par exemple, pour une réaction d’amplification de 20 cycles (n=20)
avec une seule molécule d’ADN à double brins (No=1), le nombre
théorique de copies à la fin de la réaction est > 106 (=220).
Si on suppose une efficacité de la réaction de 0.7 (x), la réaction est
estimée à produire une amplification d’environ 40 000 (=1.720).
L’efficacité et le rendement ne sont pas les seuls indicateurs de la
réaction d’amplification. La spécificité (génération de la séquence
cible uniquement) et fidélité (un nombre négligeable d’erreurs dans
la séquence des chaînes synthétisées) de la réaction sont aussi des
caractéristiques importantes.
302
8.3.2 Vitesse d’amplification
séquence cible
(à amplifier)
303
La réaction d’amplification atteint éventuellement un plateau, le nombre
de copies n’augmente plus. Ceci est dû à l’épuisement de réactifs (amorces
et nucléotides), à l’inhibition enzymatique par des phosphates libérées
durant la réaction, à la détérioration thermique de l’ADN polymérase et à
l’hybridation des brins plus long d’ADN à des températures élevées au
dépit de l’hybridation de l’ADN à simple brin avec des amorces.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 304