isolement des mitochondries de levure

PREPARATION MITOS LEVURES
Récolte LEVURES en
phase exponentielle
Lavage des cellules
Culotter : 7 000 g, 7 min
2 à 3 lavages des culots
avec H2O : 7 000 g 7 min
dernier lav. dans 1 seul pot
Préincubation
10 min dans Tampon SH ( 20 m l/ g PS )
à 28°C sous agitation
Lavage du SH
3 lavages des culots avec KCl-Tris pH 7
7 000 g, 7 min :
Jeter le surnageant du 1er lavage dans poubelle SH
dernier lav. dans 1 seul pot
Digestion
Lavage des PROTOPLASTES
Incubation dans tp digestion (10 ml / g PS)
+cytohélicase* ou zymolyase* ss agitation
à 28°C (suivre lyse des cellules au spectro)
3 lavages des culots au tp Protos ;
culotter à 12 000 g, 10 min (tubes SS34)
homogénéiser au potter entre chaque centri
Faire la dernière centri dans un minimum de tubes
* 0,17 g / g PS de cytohélicase, incubation <=1 h
* ou 10 mg / g PS de Zymoliase, incubation 20 à 45 min
Ces valeurs sont fonction du lot d'enzyme et de la souche
à partir de cette étape travailler à 4°C
Eclatement des protos
Reprendre le culot précédent avec un peu de tp HOMO
soit pottériser ( 4 g de cellules./potter de 30 ml )
soit Waring Blender : 3 X 5 s. (en abs d'air)
Diluer l'homogénat dans Tp Homo
10 min à 800 g
éliminé
S1 mitos
C1 débris soit
repris ds tp homo
Pottériser
10 min à 12 000 g
10 min à 800
g
S2 mitos
C2 éliminé
10 min à 12 000 g
S3 éliminé
C3
+
C3
repris dans tp récupération
10 min à 800 g
S4
C4 éliminé
10 min 12 000 g
S5 éliminé
CULOT MITOCHONDRIAL
S3 éliminé
SOLUTIONS-MERES POUR Tp DE PREP. DE MITOS
PHOSPHATE DISODIOUE 0,2 M (PM 142 ) Na2HPO4, anhydre
7,1 g pour 250 ml 5,7 g pour 200 ml dans H2O chaude
ACIDE CITRIOUE 0.l M (PM 192,1)
4,8 g pour 250 ml
1,92 g pour 100 ml
PHOSPHATE MONOSODIOUE 0,2 M (PM 156.03) NaH2PO4
7,8 g pour 250 ml
3,12 g pour 100ml
TAMPON DI-MONO PHOSPHATE pH 7.6
pour 500 ml: 202,5 ml phosphate disodique 0,2 M
100 ml : 40,5 ml
47,5 ml phosphate monosodique 0,2 M
9,5 ml
Vérifier le pH
TRIS-MALEATE 0,5 M (PM TRIS 121.14 PM Ac.MALEIQUE 116 )
pour 500 ml : 30,2 g TRIS
pour 200 ml: 12,9 g
pH 6,8 avec Ac.MALEIQUE.
EGTA 0,l M (PM 380.4)
pour 250 ml : 9,51 g
pH 7 avec TRIS (poudre au départ)
SORBITOL DESIONISE 2 M
364 g pour 1L (fermenteur 10 L)
728 g pour 21 (fermenteur 20L)
Solubiliser le sorbitol avec la moitié du volume d'eau nécessaire en faisant chauffer à
environ 60°C au micro-onde . Refroidir . Passer sur résine (par volumes de 500ml) en
laissant agiter 3 min (rincer la résine 2 ou 3 fois à l'eau distillée avant de commencer) .
Verser dans l'éprouvette en filtrant sur coton de verre . Laver la résine avec la quantité
d'eau nécessaire au volume final.
Rincer plusieurs fois la résine à l'eau distillée et stocker a 4°C .
MANNITOL DESIONISE 0.8 M
508 g pour 3,5 L (fermenteur 10 L)
873 g pour 6 L (fermenteur 20 L)
Opérer comme pour le Sorbitol.
REGENERATION DE LA RESlNE (Dowex AG50W8 20/50µm ) BIORAD, résine à
groupes sulfoniques ( 100 g) Référence :142-1421
Laver avec 500 ml HCl 2 N
Rincer avec H2O plusieurs fois jusqu'a pH 5 - 6
Laver avec 500 ml NaOH 2 N
Rincer avec H2O jusqu’à neutralité de l'eau de rinçage
Refaire une seconde fois ce cycle: HCI-H2O-NaOH-H2O
PREPARATION DES TAMPONS
FERMENTEUR
10L
20L
H20 ou H20 galactosée .1%
5L
10 L
Tp Préincubation SH à manipuler ss sorbonne
Tris 0.1M (PM 121J1)
b-Mercaptoéthanol 0.5 M (PM 78,13 )
pH 9,3 avec NaOH
500 ml
6g
17,48 ml
1L
12 g
34,96 ml
Tp lavage au KCI
KCI 0,5 M (PM 74,5)
Tris 10 mM (PM 121,1)
pH 7 avec HCI
4L
149,1g
4,8 g
Tp Digestion (Cytohélicase)
Sorbitol 1,35 M (passé sur résine)
EGTA 1 mM
Citrate-phosphate 10 mM : ac citrique
Phosphate di monosodique (ou disodique)
pH 5.8
250ml
169 ml (2 M)
2,5 ml (0,1 M)
25 ml (0,1 M)
37,5 ml (0,2 M)
Tp Digestion (zymolyase)
Sorbitol 1,35M (passe sur resine)
EGTA 1mM
Tp di mono sodique 0,2 M (ou disodique)
pH 7,4
250 ml
169 ml (2 M)
2,5 ml (0,1 M)
70 ml
5L
186,4g
6g
500ml
338 ml (2 M)
5 ml (0,1 M)
50 ml (0,1 M)
75 ml (0,2 M)
500 ml
338 ml (2 M)
5 ml (0,1M)
140 ml
Tp lavage des Protoplastes
1, 5L
2L
Sorbitol 0.75M désionisé
565 ml (2 M) 755 ml (2 M)
Mannitol 0.4 M désionisé
750 ml (0,8 M) 1 L (0,8 M)
Tris-maléate 10 mM
30 ml (0,5 M) 40 ml (0,5 M)
BSA 0.1%
1,5 g
2g
pH 6.8
Rq: ne pas mettre la BSA si on veut congeler le tampon.
Tp d'Homogènéisat!on
1L
Mannitol 0.6 M désionisé
755 ml (0,8 M)
ou 0,5M
625 ml
EGTA 2 mM
20 ml (0,1 M)
Tris-maléate 10mM
20 ml (0,5 M)
BSA 0.2 %
2g
pH 6.8
Rq: ne pas mettre la BSA si on veut congeler le tampon
Tp de Récupération
Mannitol 0,6 M désionisé
EGTA 2 mM
Tris-maléate 10 mM
pH 6.8
6L
223,6 g
7,26 g
3L
1130 ml (2 M)
1,5 L (0,8 M)
60 ml (0,5 M)
3g
2L
1510 ml (0,8 M)
1258 ml
40 ml (0,1 M)
40 ml (0,5 M)
4g
1.5 L
1130 ml (0,8 M)
30 ml (0,1 M)
30 ml (0,5 M)
3L
2260 ml (0,8 M)
60 ml (0,1M)
60 ml (0,5 M)