Présentation PowerPoint

2.3
TRL 2
L’ARNi, outil de génétique inverse pour l’Homme
CARACTÉRISTIQUES GÉNÉRALES DES SIRNA
L’ARN interférence (ARNi) est un processus naturel, conservé au cours de l’évolution, de suppression de
l’expression d’un gène. L’ARNi a été décrite en 1998 par A.Z. Fire and C.C Mello chez le nématode
Caenorhabditis elegans. L’introduction d’ARN simple ou double brins dans une cellule, provoque la
dégradation spécifique des séquences homologues d’ARNm. De même, les microARNs (ARNmi) sont des
petits ARN non-codant endogènes, présents dans le génome, qui régulent spécifiquement l’expression de
quelques gènes cibles. In fine, si un inhibiteur classique peut bloquer spécifiquement l’activité d’une protéine
tout en lui laissant la possibilité d’interagir avec d’autres effecteurs, l’ARNi endogène (miRNA) ou exogène
(siRNA) supprime l’expression d’une protéine.
Pour trouver la fonction d’un gène ou d’un réseau génétique complexe, les cribles de génétique inverse sont
particulièrement efficaces. La génétique inverse cherche à comprendre la fonction d’un gène donné par
l'observation des mutants correspondants. Cette approche « s'oppose » (inverse), à la démarche de
génétique classique, qui, pour un mutant donné, cherche à identifier le gène responsable. Par exemple, les
cribles de génétique inverse chez la levure ont permis l’identification des régulateurs clés du cycle cellulaire.
Comparaison des potentialités des siRNA & des petites
molécules chimiques pour la découverte de médicaments
siRNA
Petites molécules chimiques
Spécificité
Elevée (fondée sur la séquence mais nécessite
de disposer de plusieurs siRNA)
Faible à moyenne, basée sur la
conformation
Concentration efficace sur
cellules
pM
Variable (souvent du nM au mM)
Nombre de cibles
accessibles
>10 000
500 à 1 000
Mode d'action/ Spécificité
Arrêt de la biosynthèse de cible protéique et
disparition de toutes ses fonctions.
La cible protéique reste présente.
Son activité enzymatique peut être
inhibée par exemple, mais elle
conserve d’autres sites potentiels
d’interaction.
Réversibilité
Non
Oui (Fréquente)
Nombre de molécules
« lead » potentielles et
d’alternatives
>100 dépend de la longueur de la cible
< 2 ou 3
Accès aux molécules
« lead »
4 à 8 semaines
2 à 4 ans
Toxicité
Faible. Approche fondée sur un processus
naturel et spécifique
Parfois élevée. Approche fondée sur
des molécules exogènes et peu
spécifiques
Efficacité thérapeutique
avérée
Faible
Bonne
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2.3
L’ARNi, outil de génétique inverse pour l’homme
Le cycle classique d’un criblage démarre par un crible « primaire » au cours duquel l’intégralité d’une banque
interférente ARN (petits ARN interférents – siARNs - synthétiques, inhibiteurs ou mimiques des micros ARNs
- miRNAs) est systématiquement testée par transfection dans des cellules humaines cultivées en
microplaques (format 96, 384 ou 1 536 puits). La mesure de la fonction biologique est fondée sur un système
rapporteur mono-paramétrique (colorimétrique, fluorescent ou luminescent), ou sur une méthode de dosage
immuno-enzymatique. Cette mesure est ensuite quantifiée sur un lecteur de plaques multimode. Pour une
fonction biologique plus complexe à mesurer (ex : cycle cellulaire) et/ou nécessitant une mesure directe, le
crible utilise les capacités de multiplexage de l’imagerie à haut débit (criblage à haut contenu) pour la
quantification simultanée de multiples paramètres cellulaires (« phenotypage »). Les gènes retenus à l’issue
du crible primaire sont ensuite individuellement testés à nouveau dans un criblage de confirmation (crible
secondaire) qui exclut les faux positifs. La liste des cibles fonctionnellement actives dans les deux cribles
constitue les touches (« hits ») du criblage, à partir desquelles un travail de caractérisation approfondi peutêtre envisagé.
PROCÉDÉ DE CRIBLAGE PHÉNOTYPIQUE
• Identifier la meilleure stratégie de criblage : quel
modèle cellulaire (disponible ou à identifier)
choisir ? Quels tests phénotypiques ?
Quelle banque de SiRNA ?
• Développement du test :
optimisation de la culture cellulaire,
optimisation des tests phénotypiques, optimisation
de la parallélisation de la transfection
• Réalisation du criblage
• Analyse du criblage : traitement statistique des
données
• Résultats : identification des gènes pertinents au
regard de la question biologique posée,
répondeurs en fonction de spécificités biologiques
©G. Saint Auret
Ressources
Privé
Public
-
-
Genel genel.fr (Grenoble)
-
Plateforme Ibisa ARN interférence
(PARi, CEA Saclay)
Equipe Biomics (CEA Grenoble)
Références
• Weiss. WA et al (2007) Recognizing and exploiting differences between RNAi and small-molecule inhibitors.
Nat. Chem. Biol., 3: 739-744
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