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Biopathologie et Cancer: identification de marqueurs et cibles thérapeutiques moléculaires Puces à ADN et Analyse du Transcriptome Pr François Bertucci Oncologie Médicale - Oncologie Moléculaire Institut Paoli-Calmettes Définitions • Biopathologie = Étude des altérations moléculaires au sein d’un échantillon (solide ou liquide) En pleine évolution depuis plus de 30 ans (avancées scientifiques, technologiques) Années 95: début analyses à haut débit; actuellement en plein essor +++ • Marqueur moléculaire = Molécule dont la présence (ou l’absence) est associée au risque d’apparition d’un cancer (m. de prédisposition), à sa présence (m. diagnostique), à son évolution clinique (m. pronostique et/ou prédictif de réponse thérapeutique), à sa rechute (m. de surveillance) Spécifique, sensible, dosable, reproductible… • Cible thérapeutique moléculaire = Molécule cible des « thérapies moléculaires ciblées » Molécule identifiée, rôle prouvé dans la maladie, avec corrélation à l’évolution clinique, molécule mesurable (test diagnostique), « droguable » (enzyme, surface cellulaire par ex.) Pourquoi typer les cancers ? • Fréquence et gravité: • ~240.000 cas/an en France (~1 cas toutes les 2 mn) • ~150.000 décès/an (~1 décès toutes les 4 mn) • Problèmes cliniques majeurs A RESOUDRE: • dépistage, traitement préventif insuffisants m. de prédisposition • diagnostic tardif m. diagnostique • traitements inefficaces et/ou toxiques • hétérogénéité évolutive des tumeurs m. pronostique m. prédictif de réponse anticancéreux non spécifiques thérapeutique cible ● Typage des tumeurs Pourquoi au niveau moléculaire ? (1) Car le typage histo-clinique est insuffisant face à l’hétérogénéité des tumeurs • Exemple des facteurs pronostiques et/ou prédictifs de réponse: • cliniques: âge, sexe, stade d’extension… • histologiques: ganglions, taille, grade, récepteurs hormonaux… • Classification des tumeurs • Progrès, mais insuffisants: • bon pronostic: % d’échecs • mauvais pronostic: % d’échecs Sous-classes non identifiées Pourquoi au niveau moléculaire ? (2) Pour mieux comprendre la complexité des tumeurs … Cancer = accumulation progressive d’un grand nombre d’altérations moléculaires dont les effets se combinent pour aboutir à l’apparition de la tumeur et son évolution vers un phénotype de plus en plus agressif et résistant aux traitements Indépendance vis-à-vis des facteurs de croissance Echappement à l’apoptose Insensibilité aux signaux anti-prolifératifs + instabilité génétique Angiogenèse Phénotype invasif et métastasiant Potentiel réplicatif illimité (Hanahan D. et Weinberg R.A., Cell, 2000) … et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques spécifiques Le typage moléculaire classique (1) Tissus, cellules (sains ou pathologiques) Broyage et lyse cellulaire Extraction ADN, ARN, protéines Étalement Analyse morphologique microscope ET moléculaire - ADN: séquençage, caryotype, FISH, Southern blot… - ADN: FISH - ARN: Northern blot, RT-PCR… - ARN: ISH - Protéines: Western blot… - Protéines: IHC Recherche de marqueurs: corrélation avec le paramètre clinique d’intérêt (survie, réponse TRT…) d’abord dans des études rétrospectives, puis prospectives avant éventuelle application clinique Le typage moléculaire classique (2) • ADN: anomalies de structure ou de nombre des chromosomes ou des gènes Génomique Structurelle • ARN et Protéines: anomalies d’expression Génomique Fonctionnelle • Approches classiques, « gène-à-gène », « protéine-à-protéine », « tissu-à-tissu » analysant UN SEUL paramètre moléculaire sélectionné par échantillon et par expérience • Développement des outils d’analyse: très nombreuses études • Progrès compréhension oncogenèse • Retombées cliniques majeures Quelques retombées cliniques • ADN •Amplification du gène HER2 dans les cancers du sein (pronostic, TRT) • Séquençage du gène BRCA1 dans les cancers du sein héréditaires (dépistage, TRT préventif) •ARN •Recherche de transcrits de fusion dans les leucémies aiguës (surveillance) •Protéines •Expression des récepteurs hormonaux RE/RP et de la protéine HER2 dans les cancers du sein (pronostic, TRT) Biologie du Cancer du Sein et Applications Cliniques approches moléculaires CLASSIQUES, 1 seul paramètre (ADN, ARN, protéine) par expérience Ludwig, Nat Rev Cancer, 2005 Retombées Thérapeutiques Majeures …MAIS relativement limitées compréhension incomplète peu applications cliniques Complexité moléculaire des tumeurs, hétérogénéité, aspect combinatoire Biais méthodologiques Typage moléculaire à haut débit Une nouvelle dimension: le typage moléculaire à grande échelle 100aines à 10.000ers paramètres simultanément « OMIQUE » ADN CGH-array ARN Puce à ADN Génomique fonctionnelle Protéines 2D, SM chromato., SM Portrait moléculaire Génomique structurelle (diversité - cibles) Tissus Tissuemicroarray Protéomique …grâce aux retombées de • Projet Génome: – clones ADNc (clones IMAGE, …) – séquençage de banques de clones d’ADNc (EST 5’ et EST 3’), Insert ADNc dans un clone ADNc 5’ EST 3’ EST – bases de données (dbEST, UNIGENE, …) • Progrès technologiques: – robotique (traitement des clones, spottage, …) – bio-informatique (alignement des séquences, sélection des clones, analyse des données…) – analyse d’images (acquisition, quantification, …) Intérêts potentiels - Analyse très grand nombre de paramètres moléculaires et sans a priori - Plus adapté à la complexité moléculaire des tumeurs une combinaison de molécules fait mieux que chaque molécule prise isolément……. - Analyse d’un très grand nombre de tumeurs (tissue microarray) • Fondamental: – Oncogenèse, résistance, invasion…. – réseaux géniques, régulation expression génique… • Pharmaceutique: – nouvelles cibles thérapeutiques – mécanisme d’action des traitements… • Clinique: – dépistage – diagnostic – pronostic et prédiction de la réponse au traitement: TRT à la carte – surveillance L’ère post-Génome GENOME inventaire pièces détachées: anatomie élémt. répétés chromosomes gènes Transcriptome POST-GENOME annotation fonctionnelle, relationnelle: physiologie Génomique Fonctionnelle Protéome Interactome Métabolome… Niveaux multiples de régulation de l’expression génique 60.1012 cellules Eucaryotes +++ ADN ~25.000 gènes Transcription Transcrit primaire: ARNm précurseur Maturation (cap en 5’, queue polyA en 3’, épissage….. avec nbreux transcrits alternatifs) noyau cytoplasme ARNm mature ~120.000 ARNm différents gènes Transport ARNm Traduction Dégradation du messager ARNm inactif Protéines Activité (modifications post-traductionnelles…) Fonction ~150.000 protéines différentes (+ de 500.000 protéines…) 1. Transcriptome: puces à ADN kb 9,49 7,46 4,40 – Etalement: HIS 2,37 1,35 0,24 – Nouvelles méthodes: milliers de gènes / expérience, voire tous les gènes d’un organisme Testicules 8 sem. – Broyage et lyse cellulaire: Northern, RT-PCR..: 1 gène / expérience Thymus 8 sem. = ensemble des transcrits d’un échantillon Diverses méthodes à grande échelle Même but : niveau d’expression (ARN) de milliers de gènes simultanément 1/ Basées sur la PCR RT-PCR d’ARNm de différents tissus avec des amorces arbitraires et comparaison des ADNc sur gel ex: Differential Display 2/ Basées sur le séquençage Séquençage ADNc de différents tissus, identification (comparaison bases de données) et quantification ex: Séquençage de banques ADNc, SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) 3/ Basées sur l’hybridation: PUCES A ADN Hybridation d’un jeu d’ADNc ordonnés sur un support solide (cDNA microarray) avec une sonde complexe préparée à partir de l’ARN d’intérêt (Liang and Pardee, Nat Rev Cancer, 2003) Puces à ADN = DNA microarray 50 à 40.000 Gènes cibles (clones ADNc ou oligos (3’ ARNm)) Tumeur (cellules, tissus) dépôt ou synthèse extraction ARN RT (oligodT) et marquage Puce: support solide (cm2) cibles ordonnées Sonde complexe en solution ADNc HYBRIDATION acquisition quantification, Signal = f (Conc. Sde, Qté cible, marquage, lavage, expo…) normalisation PROFIL D’EXPRESSION GENIQUE bio-informatique Analyse et visualisation Niveau d’expression = k x Signal Caractéristiques de l’hybridation sonde complexe -Sonde complexe : tous les mRNAs exprimés dans l’échantillon, rétrotranscrits; 3’ de la séquence (oligo dT priming) - Cibles : 3’ de la séquence des cDNAs (ARN de référence des gènes) - Hybridation en excès de cible : signal d’un gène proportionnel à : - la concentration de la séquence correspondante dans la sonde ++ - la durée de l’hybridation - la quantité de cible - Remarques : -Faible couverture de la cible (1%) : signaux faibles, ⇒ besoin d’un système de détection sensible et de l’absence de signal non spécifique (contrôles) -Northern, Southern : hybridation en excès de sonde et durée telle que toute la cible soit saturée ⇒ le signal ne dépend que de la quantité de cible Il existe plusieurs approches Clones d’ADNc Cibles et production Oligonucléotides Synthèse in situ ou dépôt Dépôt GMS Arrayer PCR, (bactéries) Support Marquage Membrane Nylon colorimétrie PCR Lame de verre radioactivité Lame de verre fluorescence Acquisition Scanner à plat Radio-imageur Microscope confocal Puces avec clones d’ADNc dbEST dbEST banques ADNc: clones banque d’EST : séquences acgatgctagcta gctgatcgatcga tcgtagc clusters d’EST : ‘gènes’ 1. sélection de gènes ou non selon question posée 1 clone ADNc = 1 gène 2. sélection des clones 3. PCR et spottage UniGene clustering Fabrication des puces I.M.A.G.E. séquençage En amont des puces: consortium IMAGE Images d’hybridation Microarray Nylon radioactivité P33 Macroarray Nylon radioactivité P33 8 x 12 cm2 - 1.200 cibles simple marquage - µg ARN total Coût moindre, ré-utilisable++ 7.2 x 1.8 cm2 - 9.300 cibles simple marquage - < µg ARN total Coût moindre, ré-utilisable Microarray Nylon colorimétrie 1,8 x 2,7 cm2 - 9.600 cibles double marquage - µg ARNm Coût moindre, densité+++ Microarray Verre fluorescence 1,8 x 1,8 cm2 - 6.400 cibles double marquage - µg ARNm Coût +++, densité+++ Oligonucléotides GenBank GenBank dbEST dbEST banque de séquences gènes acgatgctagcta gctgatcgatcga tcgtagc synthèse puis dépôts •robots spotteurs •imprimantes ‘jet d’encre’ 11 à 1 Oligo / gène sélection de 20 à 60mer spécifiques synthèse in situ 11 20mer / 1 gène (Affymetrix) 1 60mer/1 gene (Agilent) •photolithographie (Affymetrix) + •imprimantes ‘jet d’encre’ (Agilent) + µg ARN messager fluorochrome Sonde A Sonde B TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT TTTTT Oligonucléotides Lame de silicium 12.8 x 12.8 mm Densité 64.000 oligos, soit 1.600 gènes (1 gène = 20+20 oligos) NB: double marquage possible Puces à oligos – Fluorescence Coût +++, densité (Wodicka et al, Nat Biotechnol, 1996, 15, 1359-67) 39.000 gènes 1,3 cm Oligochips (20 mer) Verre fluorescence 1,3 x 1,3 cm2 - 40.000 gènes Coût+++, densité+++ Analyse des résultats: deux approches 200 gènes candidats – cDNA macroarrays nylon – radioactivité 34 cancers du sein localisés et 1 SN Deux types d’analyse: approche différentielle et approche profils d’expression « Approche différentielle » (« screening ») Tumeur RE+ Tumeur RE- Différentiels Reproductibilité 100 Tumeur RE- Hybridation Hybridation22 100 10 1 0.1 0.01 10 1 Liste de gènes différentiels 0.1 0.01 0.001 0.001 0.1 10 Hybridation 1 1000 0.001 0.001 0.01 0.1 1 Tumeur RE+ 10 100 Approche différentielle Cancer du sein Clone ID 207378 129757 235947 154343 120649 153275 109677 172152 Gene / Protein identity Gene symbol MYB Related Protein B GATA-binding protein 3 Stromelysin 3 Granzyme H T-Lymphocyte surface CD2 antigen Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 CREB Binding Protein EGFR-binding protein GRB2 MYBL2 GATA3 STMY3 GZMH CD2 CRABP2 CREBBP GRB2 *** T / NB (a ) 17.8 15.9 9.5 7.5 7.2 5.1 5.0 Avantages: Clone ID 147016 179197 231424 111461 195022 220451 125413 290007 Gene / Protein identity Gene symbol * ERBB2 Receptor Protein-Tyrosine Kinase ERBB2 Protein Phosphatase PP2A, 55 kD Subunit PP2A BR gamma Glutathione S Transferase Pi GSTP1 SOX4 Protein SOX4 Interleukin 2 Receptor Beta chain IL2RB Zinc Finger protein 144 ZNF144 Mucin 1 MUC1 CD44 antigen, epithelial form CD44 10N+ / N5.0 5.0 2.7 2.7 2.4 1.9 1.8 1.7 -nombre d’échantillons -analyse « simple » (replicates, Bonferroni) Inconvénient: information limitée Clone ID 129757 356763 248613 211999 235947 229839 153275 301950 Gene / Protein identity Gene symbol GATA-binding protein 3 Granzyme A MYB proto-oncogene KIAA1075 protein Stromelysin 3 Macrophage Stimulating 1 Cellular Retinoic Acid Binding Protein 2 X-box Binding Protein 1 GATA3 GZMA MYB KIAA1075 STMY3 MST1 CRABP2 XBP1 * * * ER+ / ER28.6 5.7 3.4 3.3 3.1 2.8 2.7 2.7 NT45 ER+ NT44 ER- AT20 ER- NT43 ER- AT19 ER+ NT41 ER+ NT40 ER+ AT18 ER- b 10 NB a AT17 ER- L’expression de GATA3 est corrélée à celle de RE 1 4.0 kb GATA3 1.8 kb β ACTIN 0.1 NB 0.01 0.001 ER- ER+ Macroarray - p = 0.001 (Mann-Witney test) Northern blot , 79 tumeurs - p < 0.0001 (Mann-Witney test) « Approche Profils d’Expression »: Signatures Moléculaires définissant des Classes de Tumeurs Masse de données produites ++++ Dissymétrie +++++ Bioinformatique (Analyse et Visualisation) Supervisées Non supervisées « Découverte de classes » non connues « Prédiction de classes » phénotypiques connues Validation ? % classification correcte Recherche de corrélations: - classes de T et facteurs histo-cliniques ? - classes de gènes et fonction, chromosome…? % classification correcte ? Sensibilité, spécificité ? Hybridations Exemple d’Analyse Non Supervisée: Clustering hiérarchique Quantification Echantillons E01 E02 E03 E04 E05 E06 E07 E08 G01 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00 G02 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22 Mesure des corrélations entre gènes et entre échantillons G03 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41 Gènes G04 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85 Cluster I G05 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00 G06 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22 G07 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41 G08 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85 G09 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41 G10 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85 G11 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00 G12 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22 G13 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41 Colorisation G14 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85 G15 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41 G16 4,76 0,33 0,01 0,96 1,22 5,87 0,00 3,85 G17 1,03 5,42 0,03 8,25 0,14 3,34 5,78 0,00 G18 6,18 1,45 6,89 0,25 5,06 7,25 0,00 8,22 G19 6,13 4,50 6,99 0,48 3,56 1,54 2,66 0,41 Cluster II Classification des gènes et des échantillons selon leur similarité Classification Recherche de corrélations: - classes de T et facteurs histo-cliniques ? - classes de gènes et fonction, chromosome…? Profils d’expression Patterns: -type cellulaire (microdissection virtuelle) -fonction Avantages « Débrouillage »: qualité données Information supplémentaire:gènes, échantillons Inconvénients: -nombre d’échantillons -analyse statistique (Ross et al, Nat Genet, 2000, 24, 227-35) CH sur 88 échantillons et 11.000 gènes, soit ~970.000 mesures Lymphomes B Diffus à Grandes Cellules Cliniquement relevantes Probabilité de Survie Globale CB activées sang et CB CG CB repos Analyse non supervisée Deux classes Biologiquement 19 patients, 6 décès 21 patients, 16 décès Années après le diagnostic LBDGC de type CB CG LBDGC de type CB activées (Alizadeh et al, Nature, 2000, 403, 503-11) Hybridations Analyse Supervisée: « Prédiction de classes » Quantification Population divisée en 2 sets indépendants -training, learning - validation set % classification correcte Validation ? Performances: % classification correcte, sensibilité, spécificité,…. Applications en Cancérologie • ARN • Fondamental lignées cellulaires, cellules, tissus; sain ou tumoral; avant, pendant, après TRT; modèles expérimentaux (transfection, RNAi)… – – • Clinique – – • Oncogenèse (gènes impliqués dans la progression, la résistance…) Caractérisation des gènes co-exprimés: annotation fonctionnelle, étude de la régulation (promoteurs…), réseaux géniques (cinétiques d’activation ou d’inhibition…) Nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques Nouvelles classes diagnostiques et pronostiques Pharmaceutique – – – – – Identification de nouvelles cibles thérapeutiques Effets du gène cible sur le transcriptome Mécanisme d’action des drogues (validation, cibles secondaires) Effets secondaires des drogues Identification de populations homogènes (essais thérapeutiques) Classifications pronostiques basées sur les profils d’expression Ça marche: lignées cellulaires 13 lignées 1.200 gènes (Khan et al, Cancer Res, 1998, 58, 5009-13) Etudes Pronostiques Cancer du Sein 1. Approches non supervisées sur tumeurs Classification moléculaire du cancer du sein 2. Approches supervisées sur tumeurs Signatures moléculaires 3. Approches supervisées basées sur une hypothèse biologique Signatures moléculaires avec un sens biologique ensuite appliquées aux tumeurs 1. Non supervisée: Classification Moléculaire Nature 2000 Hétérogénéité transcriptionnelle+++++ 5 sous-types homogènes - biologiquement relevants - Luminal: RH+, CK8/18+ - lum.A: RE++, prolif- lum.B: RE+, prolif+, survie- / lum.A cibles TRT: RE - autres? - Her2+: RH-/+, Her2+ - cliniquement relevants TP53 mutations, grade+, survie < lum.A cibles TRT: Her2 - autres? - Basal: RH-, Her2-, CK5/6/17+ TP53 mutations, grade+, survie < lum.A cibles TRT: EGFR? autres? Robustesse des sous-types moléculaires Sorlie: 115 T, 5 classes Data dispo web: van’t Veer: 97 T, 5 classes Hétérogénéité IBC avec - existence de sous-types moléculaires - associés à différences de survie - et différences de taux RCH Her2 et basal > luminal 22.000 gènes Puces Affymetrix - 82 T1-T4 avec CT néo-adjuvante séquentielle (Taxol x 12 / FAC x 4) Sous-types moléculaires et Réponse Histologique à la CT (21 RCH et 61 non-RCH) Sous-types moléculaires Corrélation avec RCH Corrélations histo-cliniques Age (jeune et basal) Type histologique (médullaire et basal; lobulaire et luminal A ou normal-like) Grade (faible et luminal; élevé et basal; luminal A vs B) Expression RH (luminal A/B) Expression HER2 (Her2 sous-type) Mutations TP53 (basal) Amplifications TOP2A (Her2 sous-type) Corrélations+++ Avec paramètres pronostiques majeurs: RH, HER2, prolifération Intérêt pronostique / paramètres classiques: pas certain Evolutions attendues (nombre de tumeurs analysées) Kit diagnostique: Breast BioClassifier (ARUP aux USA) 50 gènes en QRT-PCR Sous-type BASAL KRT5,6,7,17,23 EGFR KIT CRYAB MKI67 MET Aurora B LYN FOXM1C CDH3… 10-20% - le plus homogène Corrélation pT / pN non significative Grade élevé Souvent RH-, Her2-, CK5/6/14+ mutations TP53, mutations BRCA1 Métastases viscérales (foie, poumon, cerveau) Survie défavorable, mais Réponse CT Basal aussi (voire plus) différent de luminal … que de K colon…. Basal Colon 14.500 gènes Luminal ….des maladies très différentes au sein du cancer du sein…. Intérêt clinique = définition d’entités plus homogènes - pour rechercher des facteurs pronostiques/prédictifs dans un environnement moléculaire homogène - pour définir et tester des thérapies ciblées spécifiques des sous-types (basal+++) 2a. Analyses supervisées sur tumeurs: Signatures Moléculaires et Pronostic Cancer du sein localisé ou localement avancé Signatures moléculaires associées à la survie ? - Sans CT adjuvante: - van’t Veer et al, Nature, 2002; van de Vijver et al, NEJM, 2002 70-gene signature (Amsterdam) - Wang et al, Lancet, 2005; Foekens et al, JCO, 2006 (Rotterdam) Essai prospectif MINDACT - Avec HT adjuvante: - Ma et al, Cancer Cell, 2004 - Paik et al, NEJM, 2004 (21-gene signature: Oncotype) - Avec CT adjuvante: Bertucci et al, Hum Mol Genet, 2000, 2002, en cours - Avec et Sans CT adjuvante: Pawitan et al, Breast Cancer Res, 2005 Essai prospectif TAILORx Essais prospectifs Sans CT adjuvante Signature d’Amsterdam dans le cancer du sein localisé N- CT adjuvante ? Traitement inutile Succès du traitement Succès du traitement mais toxicité majeure à long terme (IC, LA…) Rechute malgré le traitement Déjà guéris par la chirurgie Mieux identifier les patientes qui n’ont pas besoin de CT Supervisée Learning set: 78 25.000 gènes 97 T localisées, âge < 55 ans, N-, pT1-T2, sans CT ou HT adjuvante 70 gènes discriminants Signature d’Amsterdam 2 groupes MFS différente Evite « sur-traitement » Validation set: 19 Validation du « prédicteur » à 70 gènes en analyses multivariées 1/ 25.000 gènes - 295 T localisées consécutives, unicentriques pT1-2, âge < 53 ans, de bon et de mauvais pronostic 2/ Puces Mammaprint (Agendia) - 307 T localisées, localisées 5 centres pT1-2, N-, âge < 60 ans Kit Mammaprint CE, puis FDA (Février puis Juin 2007) 1er test Puce à ADN commercialisé (Europe, puis USA) 70 gènes x 3 + contrôles RH pos et neg Réponse dans les 10 jours ~3.200 dollars, remboursement ? Pronostic: ni diagnostic, ni prédiction réponse TRT Orienter ou non vers une CT adjuvante chez NIntérêt clinique? Essai MINDACT (TransBIG EORTC) Essai prospectif randomisé testant la supériorité d’un pronostic défini par la signature génique (genomic arm) par rapport au pronostic défini sur les critères histo-cliniques (clinical arm Adjuvant OnLine !) dans le cancer du sein pN0 (et récemment 1 à 3 N+) N = 6000 Europe Objectif principal: démontrer une survie meilleure ou équivalente dans le bras Génomique MALGRE ~15% de CT en moins Début: Août 2007…Inclusion+… Faisabilité clinique en temps réel ? Etude RASTER (Lancet Oncol, 2007) Pays-Bas, 16 centres RNA later et envoi au NCI Amsterdam Si N-, envoi à Agendia Amsterdam Extraction ARN, Puce Mammaprint « Bon » ou « mauvais » groupe Retour centre et TRT adjuvant Faisable Echecs génomique = 23% Avec HT adjuvante Objectif: signature d’expression, par RQ-PCR sur échantillons en paraffine, associée à la rechute à distance dans le K sein, RH+, N- après Tam adjuvant Objectif: éviter le rajout de la CT 1/ Identification du modèle multigénique 250 genes sélectionnés - RQ-PCR - 447 N- avec Tam +/- CT adjuvante – corrélation avec la rechute 21 gènes (16 gènes et 5 contrôles), calcul Recurrence Score (RS) RS (0 à 100), 3 classes: faible, intermédiaire, haut risque de rechute 2/ Validation du modèle Calcul du score RS sur 668 N- avec Tam adjuvant (NSABP B-14): 3 classes associées à rechute OK en multivariée Etudes complémentaires sur le Recurrence Score Validation N- : 770 patientes sans CT (Habel et al, Breast Cancer Res 2006) avec effet plus fort avec HT que sans HT Validation N+ : 78 patientes (Cobleigh et al, Clin Cancer Res 2005) Bénéfice chimiothérapie selon le risque ? OUI si Risque Elevé - adjuvant: 660 NSABP B-20 HT +/- CT (Paik et al, J Clin Oncol 2006) pas bénéfice CT si risque faible ou intermédiaire bénéfice CT si risque élevé - néo-adjuvant: Chang et al, Breast Cancer Res 2008 - Gianni et al, J Clin Oncol 2005) Oncotype and Economic Studies Economic analysis of targeting chemotherapy using a 21-gene RT-PCR assay in lymph-node-negative, estrogen-receptor-positive, earlyHornberger et.al. Am J Manag Care. 2005 Impact of a 21-gene RT-PCR assay on treatment decisions in early-stage breast cancer: An economic analysis based on prognostic and p Lyman et al. Cancer 2007 Oncotype DX and Adjuvant Treatment Decisions Prospective multi-center study of the impact of the 21-gene recurrence score assay on patient satisfaction, anxiety and decisional conflict conflic Mumby et al. 2007 SABCS San Antonio, Texas. Abstract #1092 A retrospective analysis of the impact of oncotype DX low recurrence score results on treatment decisions in a single academic breast cancer center. Liang et al. 2007 SABCS San Antonio, Texas. Abstract #2061 Evaluation of practice patterns in the treatment of node-negative, hormone-receptor positive breast cancer patients with the use of the oncotype DX assay at the University of Pennsylvania. Erb et al. 2007 SABCS San Antonio, Texas. Abstract #3082 Prospective multi-center study of the impact of the 21-gene Recurrence Score (RS) assay on medical oncologist (MO) and patient (pt) ad Lo et al. J Clin Oncol 2007 Impact of a Commercial Reference Laboratory Test Recurrence Score on Decision Making in Early-Stage Breast Cancer. Oratz et al. J Oncol Pract. 2007 Kit Oncotype DX USA, pas agrément FDA ASCO2007 – NCNN2008 ~3.500 dollars remboursement OK Pronostic et prédiction réponse TRT Utilisation+++ (>40.000 tests entre 2004 et 2008) New guidelines Oncotype DX® is included in both the ASCO 2007 Update of Recommendations for the Use of Tumor Markers in Breast Cancer and the NCCN 2008 Clinical Practice Guidelines in Oncology Breast Cancer to identify certain subgroups of patients with N-, HR+ breast cancer who may be successfully treated with HT alone and may not need CT. ASCO: The Oncotype DX assay is recommended to identify: Patients with low recurrence risk who may not benefit from adjuvant CT (specifically CMF/MF) Patients with high recurrence risk who may derive significant benefit from adjuvant CT (specifically CMF/MF) NCCN: The NCCN expert panel recommended in their 2008 Clinical Practice Guidelines consideration of the use of the Oncotype DX test for HR+ patients with the following clinical features: Tumor size 0.6-1.0cm, moderate/poorly differentiated or unfavorable features*; or Tumor size >1cm Orienter ou non vers une CT adjuvante chez N- RH+ Intérêt clinique? Essai TAILORx (US NCI) Essai prospectif randomisé testant la non-infériorité en terme de DFS de HT seule par rapport à HT+CT chez les patientes de risque intermédiaire selon Oncotype dans le cancer du sein pN0 RH+ Her2-, ≥1cm N >10.000 1.000 centres américains Protocoles libres HT et CT Début: Mai 2006…Inclusion+++… Avec CT adjuvante 1ère étude: 200 gènes (ADNc) - 34 T localisées Signature pronostique à 23 gènes pour les T de mauvais pronostic avec CT adjuvante à base d’A 2ème étude: 1000 gènes (ADNc) - 55 T localisées de mauvais pronostic avec CT adjuvante à base d’A 1. Validation de la signature 2. Amélioration 40 gènes discriminants (2 métagènes) - 3 classes de T équilibrées 3ème étude: multicentrique 468 T localisées traitées par CT adjuvante à base d’anthracycline IPC (213) - CLB (110) - Bergonie (17) - FNCLCC: PACS 01 (FEC100: 128) MFS à 5 ans 75% Puces à ADN Ipsogen (~9.000 gènes) → Modèle à 3 métagènes Learning set n=323 5y-MFS 79% vs 52% p<0.0001 HR: 2.35 (1.50-3.5) Validation set n=145 5y-MFS 86% vs 61% p=0.001 HR: 3.49 (1.6-7.5) Multivariate analysis The model is the strongest prognostic factor Deux groupes de patientes de survie différente après CT adjuvante à base d’Anthracycline: – « Bon pronostic: ~80% 5y-MFS – « Mauvais pronostic: ~60% 5y-MFS : Anthracycline-résistance ? Application potentielle: Sélection du protocole optimal de CT adjuvante: « Ne pas donner tout et la même chose à tout le monde » – Groupe de bon pronostic : • Donner CT à base d’A sans taxane (« ne pas donner tout ») = SA02 Transfert clinique = Essai SA02 Cohorte Prospective Utilisation d’une Signature Génomique comme Facteur Décisionnel de la Chimiothérapie Adjuvante des Cancers du Sein Promoteur: Institut Paoli-Calmettes Multicentrique (IPC Marseille, CAL Nice, CHG Toulon, CLB Lyon) • • Cancer du sein non métastatique N+ sélectionné sur le profil génomique «bon pronostic» de leur tumeur Traité par CT avec anthracyclines (6 FEC 100) • Objectif principal: confirmer la MFS à 5 ans observée dans les séries rétrospectives après FEC100 sans taxane dans ce groupe sélectionné par la signature multigénique • Objectifs secondaires: – 5y-OS – Faisabilité en temps réel de la génomique – Recherche de transfert génomique et protéomique – Evaluation socio-économique • Inclusion: 200 patientes nécessaires, soit 375 à inclure sur 2 ans en cours depuis 2008 2b. Analyses supervisées: Signatures Moléculaires et Prédiction de la Réponse à la CT Cancer du sein localisé ou localement avancé dont inflammatoire Signature moléculaire associée à la réponse? Chang et al, Lancet, 2003; Chang et al, JCO, 2005 (Baylor; docetaxel) Ayers et al, JCO, 2004 (MD Anderson, paclitaxel, then FAC) Bertucci et al, Cancer Res, 2004-2005: IBC Rouzier et al, Clin Cancer Res, 2005 (MD Anderson, same CT, molecular sub-types) Gianni et al, JCO, 2005 (Milan - MD Anderson, AT, then paclitaxel, RQ-PCR paraffine 384 gènes et validation signature 21 gènes) - Hannemann et al, JCO, 2005 (Amsterdam, AC ou AT: pas de signature RCH) - Hess et al, JCO, 2006 (MD Anderson, paclitaxel, FAC) - 12.000 gènes Puces Affymetrix - 24 T local. avancées avec CT néo-adjuvante (Taxotère x 4) Supervisée sur Réponse Clinique à la chimiothérapie (12 répondeurs et 12 non-répondeurs) p<0.001 Validation sur 6 nouveaux cas (tous répondeurs) 30.721 cDNA Puces MD Anderson - 42 T2-T4 avec CT néo-adjuvante (Taxol x 12 / FAC x 4) Supervisée sur Réponse Histologique à la chimiothérapie (13 RCH et 11 non-RCH) N=24 N=18 Validation 74 cDNA ~8.000 gènes - 81 Tumeurs 44 NIBC 37 Inflammatory BC 5 10 15 20 25 Réponse Histologique à la CT néo-adjuvante (anthracyclines) N=26 : 9 RCH+ et 17 RCH- 85 gènes Supervisée sur Type IBC vs NIBC et sur RCH 1 85 gènes discriminants 0 -1 2 groupes IBC RCH 70% RCH 0% 3. Approches supervisées basées sur une hypothèse biologique: Signatures moléculaires avec sens biologique Identification d’une signature multigénique associée à un processus biologique pertinent en cancérologie Paramètre biologique agressivité Facteur pronostique - Cicatrisation: signature fibroblastes stimulés par du sérum (Chang et al, PLoS Biol, 2004; Chang et al, PNAS, 2005) - Hypoxie: signature épithélium en hypoxie (Chi et al, PLoS Med, 2006) - Cellules souches cancéreuses (Glinsky et al, J Clin Invest, 2005; Liu et al, NEJM, 2007) - Grade histologique (Sotiriou et al, JNCI, 2006) - Mutation P53 (Miller et al, PNAS, 2005) PUIS application sur données d’expression publiques de tumeurs avec annotations cliniques pour évaluer l’impact pronostique de la signature 9 échantillons: 6 « cellules souches cancer » vs 3 épithélium mammaire Nl sur Affymetrix U133A/B Signature 186 gènes (IGS) Application IGS à données publiques 295 T sein Application IGS à données publiques de 3 autres cancers Grade histologique… et grade génomique Grade histologique: 3 critères: degré de différenciation, pléïomorphisme nucléaire, activité mitotique Reflet direct de certaines caractéristiques biologiques de la tumeur GH1 GH2 GH3 25% 50% 25% Facteur pronostique et facteur prédictif de réponse à la CT Mais imparfait - reproductibilité faible pour les grades II - valeur pronostique du grade II intermédiaire donc pas claire - difficile à évaluer sur biopsie Définir une mesure plus objective, reproductible et fiable GG1 GG3 Analyse de 661 tumeurs Training set (N = 64): comparaison grade I vs II signature score = GGI Validation set (N = 597): application du GGI: grade I vs III ? Grade II ? Pronostic ? Training set 64 tumeurs dont 33 GH1 et 31 GH3 – Puces Affymetrix UI33A GH1 GH3 Comparaison GH1 vs GH3 128 probe sets 97 gènes (cycle cellulaire++) Score = GGI Validation set 597 tumeurs (4 datasets) dont GH1, GH2 et GH3 – puces différentes Validation signature GH1 vs GH3 Deux types de GH2 selon GGI (GH1-like et GH3-like) de survie différente (GH2/GG1 mieux que GH2/GG3) GH2 GG1 GG1 GG1 GG1 GG3 GG3 GH2 GG3 GG3 GG1 GG1 GG1 GG1 GG3 GG3 GG3 GG3 N = 570 - GH et GG - Survie sans rechute Même différence Mêmes différences entre les 5 sites Grading à 3 classes (histologique) remplacé par Grading à 2 classes (génomique) plus performant au niveau pronostique pour les grades 2 histologiques Commercialisé Juin 2008 Marquage CE diagnostic Bilan Puces à ADN et Pronostic du Cancer du Sein Hétérogénéité moléculaire du cancer du sein +++ Amélioration de l’information pronostique par l’identification, à partir de signatures moléculaires de dizaines de gènes, de nouvelles sous-classes dans des classes histo-cliniques a priori homogènes, mais d’évolution différente Modification des essais cliniques Incorporation systématique de la collecte et congélation des tissus signatures prédictives, signatures d’activité Mise en place d’essais basés sur la génomique - Validation signatures (MINDACT, TailorX, SA02) - Définition de groupes plus homogènes (même profil génomique): interprétation des résultats, effectif plus réduit, essai plus rapide Questions Validité scientifique ? - Sous-types moléculaires: OK - Signatures supervisées « directes »: critiquées, MAIS validation indépendante ET concordance en terme de prédiction - Signatures supervisées « indirectes » biologiques: OK Amélioration information pronostique, mais jusqu’à quel degré ? mais possibilité d’incorporer sur la même puce plusieurs signatures (pronostic, prédiction réponse TRT, grade génomique, ER, HER2…) Réelle utilité clinique ? réponse dans plusieurs années Ratio coût/bénéfice Echantillons disponibles congélation ou solution conservation qualité ARN (RNA later): doit suivre Application des 5 signatures aux données publiques de van de Vijver et al 295 tumeurs Bonne concordance en terme de prédiction des 5 signatures Challenges avant transfert clinique • Echantillons tumoraux : – – Tumorothèque (annotations, base de données, consentements) ARN: qualité (tissus congelés: paraffine?) et quantité (amplification?) • Technologie : – – – Variabilité des mesures: expérimentale (contrôles qualité) et biologique (hétérogénéité des cellules cancéreuses et des tissus cancéreux) Comparaison et reproductibilité inter plate-formes++++; standardisation (ARN référence?) Traitement des données: normalisation, signification statistique des corrélations (robustesse et validation +++++), interprétation • Autres challenges : – – – – – Confrontation autres analyses moléculaires à grande échelle (CGH array, protéome; tissue array TMA,…) Validation sur grandes séries (TMA, RQ-PCR) Etudes cognitives sur cibles moléculaires potentielles de thérapie ciblée ++ Futur au lit du patient (puce spécialisée ? RQ-PCR ? IHC ?) Essais cliniques 6 plates-formes ≠ avec 3 laboratoires ≠ / plate-forme 4 échantillons ≠ avec 5 replicates / échantillon intra-labs inter-labs Affx vs TaqMan Ratio d’expression éch. A sur B 3 laboratoires n=nbre de gènes testés Résultats reproductibles et robustes 2. Autre analyse moléculaire à haut débit CGH array Hybridation Génomique Comparative sur Puces à ADN CGH classique Recherche de régions chromosomiques amplifiées (oncogènes) ou délétées (gènes suppresseurs) Mais faible résolution de la cible d’hybridation (5 –10 Mb), identification difficile des gènes cibles. CGH array Cibles = clones ADN = gènes ordonnés selon leur localisation chromosomique Identification à haute résolution de gènes amplifiés ou délétés (Forozan F, Trends Genet, 13, 405-9) 3. Un nouvel outil de Pathologie Moléculaire Tissue microarray Permet analyse des altérations moléculaires d’une population cellulaire sélectionnée dans le contexte de son microenvironnement tissulaire dans un très grand nombre d’échantillons simultanément Tissue microarray Analyses de 1.000 tumeurs simultanément section Lame de verre: ~1.000 tumeurs taille des spots: 0.6 mm écart inter-spot: 0.7 mm (Kononen K, Nat Med, 4, 844-7) Tissue microarray HES: morphologie ARN (ISH), protéines (IHC) ADN (FISH) Gain de temps, réactifs, argent ET reproductibilité • Complementarity : validation of discriminator genes or proteins on larger series of samples DNA microarray Tissue microarray Prognostic value of NM23 expression in colon cancer DNA microarrays 22 K colon – 9.000 genes « Metastase signature »: 244 genes Tissue microarrays 191 K colon – Ab NM23 Negative correlation between NM23 status and metastatic relapse Meta - / NM23 + NM23 pos NM23 neg NM23 overexpressed in samples without metastatic relapse p=0.03 Meta + / NM23 - 2. Identification of molecular signatures 26 proteins IHC - 552 T (stage I-III) on TMA Supervised analysis: metastatic relapse Identification Learning set: 368 T 26-protein signature Validation Validation set: 184 T 552 T Potentiel énorme Médecine moléculaire « à la carte » à suivre….