Production d`un réactif monoclonal anti-B humain pour la

Immuno-analyse et biologie spécialisée 22 (2007) 68–71
a v a i l a b l e a t w w w. s c i e n c e d i r e c t . c o m
j o u r n a l h o m e p a g e : h t t p : / / f r a n c e . e l s e v i e r. c o m / d i r e c t / I M M B I O /
TECHNIQUES AU QUOTIDIEN
Production d’un réactif monoclonal anti-B humain
pour la détection des groupes sanguins ABO
Production of anti-B human monoclonal reagent
for the detection of the blood groups ABO
A. Tissenta,b,*, N. Habtia, F. Sadiqa,b, N. El Amranib, N. Benchemsia
a
b
Laboratoire de génie génétique et cellulaire, faculté de médecine et de pharmacie, Casablanca, Maroc
Laboratoire de biologie et de physiologie cellulaire, faculté des sciences-II Ben-M’Sik, Casablanca, Maroc
Reçu le 3 août 2006 ; accepté le 3 novembre 2006
Disponible sur internet le 26 janvier 2007
MOTS CLÉS
Réactif monoclonal
anti-B humain ;
Groupes sanguins ABO ;
Transformation par
l’EBV
Résumé La majeure partie des anticorps monoclonaux sont d’origine murine. Ils sont obtenus
par la technique des hybridomes. Cependant, en l’absence d’une animalerie, la technique de
la transformation des lymphocytes humains par le virus d’Epstein-Barr (EBV) est une alternative. Le but de ce travail est de produire des anticorps monoclonaux humains permettant la
détermination des groupes sanguins ABO par cette technique. Un prélèvement sanguin est réalisé chez une femme de groupe O rhésus négatif. Les lymphocytes obtenus à partir de ce prélèvement par séparation sur gradient de densité, sont transformés par l’EBV. Les lymphoblastoïdes sont stabilisés par fusion avec des cellules myélomateuses de souris P3X63Ag-8 selon la
technique des hybridomes puis clonés par dilution limite. Un anticorps H04 monoclonal anti-B
humain est ainsi sélectionné. Il reconnaît les groupes B, AB, B3 et Bx. La comparaison de sa
réactivité à d’autres anticorps monoclonaux anti-B de référence ne montre aucune discordance. L’anticorps H04 peut être utilisé comme réactif pour la détermination des groupes sanguins ABO et l’étude des épitopes de l’antigène B.
© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
KEYWORDS
Anti-B human
monoclonal reagent;
ABO blood grouping;
Transformation by EBV
Abstract The major part of monoclonal antibodies has a murine origin. They are obtained by
the murine hybridoma technology. However, in the absence of an animalery, the transformation technology of human B-lymphocytes by Epstein-Barr virus (EBV) can be an alternative.
The aim of this study is to produce a human monoclonal antibodies use in the determination
of ABO blood grouping. A sampling of blood was deducted from a woman whose her blood
type was O rhesus negative. EBV transformed lymphocytes obtained by density-gradient
separation. Lymphoblastoïde cells were consolidated by fusion with P3X63Ag-8 murine myeloma cells according to the hybridoma technology, then cloned by limiting dilutions. A
H04 human monoclonal antibody anti-B was selected. It recognizes the B, AB, B3 and Bx ery-
* Auteur
correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (A. Tissent).
0923-2532/$ - see front matter © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
doi:10.1016/j.immbio.2006.11.006
Production d’un réactif monoclonal anti-B humain pour la détection des groupes sanguins ABO
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throcytes. The comparison of its reactivity with other anti-B commercial antibodies didn’t
show any discordance. The H04 human monoclonal antibody can be used like a reagent for
the determination of ABO blood types and the study of antigen B epitopes.
© 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Introduction
Depuis 1975, la technique des hybridomes a permis la production d’anticorps monoclonaux murins utilisés dans différents secteurs de recherche et de diagnostique. Un des obstacles à l’application de cette technique dans les pays en
voie de développement est l’absence d’une animalerie.
L’alternative est l’immortalisation par le virus d’EpsteinBarr (EBV) des lymphocytes B humains sécréteurs d’anticorps. Les cellules lymphoblastoïdes issues de cette transformation perdent rapidement leur sécrétion en anticorps
[10]. La fusion des cellules lymphoblastoïdes avec les
cellules myélomateuses donne naissance à des hétérohybridomes relativement stables, capables de produire de
façon continue des anticorps monoclonaux humains.
Le but de ce travail est de produire un réactif pour la
détermination des antigènes des groupes sanguins du système ABO.
Matériel et méthode
Technique de la transformation par l’EBV
Vingt millilitres du sang périphérique sont prélevés chez
une femme de groupe O rhésus négatif. Le prélèvement
est réalisé dans des tubes contenant de l’EDTA.
Les lymphocytes sont obtenus par centrifugation à 400 g
pendant 30 minutes sur gradient de densité utilisant le
ficoll/hypaque (Eurobio, France). Le culot de 30.106 de
lymphocytes obtenu est lavé trois fois avec le tampon de
Hanks (HBSS, BIO-Whittaker Europe, Belgique) et suspendu
dans 5 ml de surnageant de culture de la lignée B95 contenant l’EBV. Après une heure d’incubation à 37 °C,
l’ensemble est repris dans un milieu de culture RPMI 1640,
contenant du sérum de veau fœtal (SVF) à 25 % (Eurobio,
France), de la pénicilline à 100 UI/ml et de la streptomycine à 100 μg/ml. Les cellules sont mises dans des plaques
de 96 puits et incubées à 37 °C et à 5 % de CO2.
Identification des clones sécréteurs d’anticorps
Les surnageants de culture sont testés en microplaques en
utilisant des hématies A, B et O traitées par la broméline
pour identifier les clones sécréteurs d’anticorps. La spécificité des anticorps est précisée en utilisant deux hématies O
d’un panel (Sanofi Diagnostic Pasteur, France) présentant la
majorité des antigènes des autres systèmes de groupes sanguins et trois hématies de phénotype A, B et AB.
Hétérofusion
Les cellules lymphoblastoïdes du puits présentant une forte
sécrétion en anticorps sont fusionnées avec des cellules
myélomateuses de souris P3X63Ag-8 selon le protocole
décrit précédemment [3]. L’agent fusionnant est le polyéthylène glycol 4000 à 45 % (Laboratoire BDH, GrandeBretagne) en milieu RPMI 1640, pH à 7,2 et contenant
2,5 % de diméthylsulfoxide (DMSO, laboratoire BDH,
Grande-Bretagne). Les cellules fusionnées sont cultivées, à
37 °C et à 5 % de CO2, dans des plaques de 96 puits (Costar,
États-Unis) dans un milieu sélectif RPMI 1640, contenant
du SVF à 25 % (Eurobio, France), de l’hypoxanthine à
13,6 μg/ml, de l’azasérine à 1,7 μg/ml, de la ouabaïne à
3 × 10−10 M, de la pénicilline à 100 UI/ml et de la streptomycine à 100 μg/ml.
Sélection et évaluation d’un clone anti-B
Les clones sécréteurs sont identifiés en testant les surnageants de cultures en microplaques. Chaque hétérohybride
sécréteur est cloné par dilution limite avant d’être cryopréservé dans l’azote liquide.
L’hétérohybridome H04 est cloné et amplifié pour produire l’anticorps monoclonal sous forme de surnageant de
culture. La stabilité du clone est contrôlée durant six mois
par le titrage du surnageant. La spécificité est étudiée en
technique saline et enzymatique en utilisant les hématies O
de dix panels d’identification des anticorps antiérythrocytaires (Sanofi Diagnostics, Pasteur, France) et un panel
constitué de 50 hématies B et 50 hématies AB. La réactivité
de l’anticorps est étudiée vis-à-vis d’hématies B3 et Bx sur
plaque d’opaline, en tube et en test enzymatique en microplaque. L’anticorps est comparé aux réactifs commerciaux
anti-B (Sanofi Diagnostics, Pasteur, France). La comparaison
a concerné 20 000 donneurs de sang et 5000 malades présentant différentes pathologies. Cette comparaison est
effectuée sur un automate de groupages sanguins PK7200
(Olympus, Japon).
Isotypage de l’anticorps H04
Des tests d’immunofluorescence sont utilisés pour déterminer la classe de l’anticorps produit.
Les érythrocytes de groupe A, B et O sont préparés à
partir du sang périphérique de donneurs volontaires sains.
Le surnageant de culture est incubé avec 5 μl de la suspension érythrocytaire à 3 % pendant 1 heure. Après 2 lavages
avec du tampon phosphate pH = 7,2 (PBS), Les érythrocytes
sont incubés pendant une heure avec une dilution de 1/100
des anticorps de lapin anti-IgM humain, anti-IgG humain,
anti-IgA humain, anti-κ humain ou anti-λ humain (DAKO,
Danemark) et sont marqués à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Les réactions sont effectuées à température
ambiante. Après un lavage supplémentaire et une fixation
avec le paraformaldehyde à 0,25 % en PBS, les cellules sont
analysées en cytométrie de flux (Becton Dickinson).
70
A. Tissent et al.
Résultats
Sélection du clone HATRA lymphoblastoïde
Après quatre à six semaines de culture en présence de
l’EBV, 30 % des puits présentent une prolifération de cellules lymphoblastoïdes. L’anticorps issu du clone nommé
HATRA présente la meilleure agglutination avec les hématies B et AB.
Hétérofusion HATRA
Quinze jours après l’hétérofusion entre les cellules lymphoblastoïdes HATRA et les cellules myélomateuses de souris, il
apparaît une prolifération des hétérohybridomes dans 90 %
des puits. Les hétérohybridomes sécréteurs d’anticorps sont
présents dans 32 puits (35,55 %). Ces derniers sont clonés
par dilution limite et retestés après 20 jours de culture.
Une perte de sécrétion chez 22 clones et une faible sécrétion chez six clones sont enregistrées. Seuls l’hétérohybridome H04 et trois autres clones présentant une forte sécrétion d’anticorps sont retenus. Les anticorps produits ne
reconnaissent pas les hématies A et O, mais agglutinent
les hématies B et AB traduisant une spécificité anti-B.
Évaluation du clone H04 sélectionné
Le clonage de l’hétérohybridome H04 a donné 100 % de clones sécréteurs. Cette stabilité est confirmée par la stabilité
de la production de l’anticorps. La sécrétion en anticorps
du clone H04 est comparée à celle de la cellule parentale.
Une augmentation du titre de l’anticorps est enregistrée
(Tableau 1).
La stabilité de l’anticorps est étudiée dans le temps et à
différentes températures par titrage du surnageant. Après
six mois, l’anticorps est stable à + 4 °C et à + 25 °C avec un
titre de 256 et un score de 79 avec les hématies B et AB. À
37 °C, la réactivité de l’anticorps au-delà d’un mois a faiblement diminué (Tableau 2).
Tableau 1 Comparaison de la sécrétion en anticorps entre
l’hétérohybridome et la ligné parentale HATRA
GR
A
B
AB
O
Sérum du donneur
I/T
-/++++/128
++++/128
-/-
HATRA
I/T
-/++/64
–/32
-/-
H04
I/T
-/++++/256
++++/256
-/-
GR : globules rouges ; I : intensité en microplaque ; T : titre en anticorps.
Tableau 3 Réactivité de l’anticorps H04 avec les hématies B
par immunofluorescence
IgG humain (γ)
IgM humain (μ)
IgA humain (α)
κ
λ
D’après les tests d’immunofluorescence, l’anticorps H04
est marqué avec les anticorps de lapin anti-IgM et anti-κ
humain et ne présente aucun marquage avec les autres
anticorps (Tableau 3).
La spécificité anti-B de l’anticorps est confirmée par les
panels d’hématies. L’étude comparative avec les réactifs
de référence n’a montré aucune discordance. L’anticorps
H04 reconnaît les groupes faibles B3 et Bx.
Discussion
L’absence d’une animalerie impose de rechercher d’autres
alternatives pour produire des anticorps monoclonaux. La
transformation par le virus d’EBV suivie d’une hybridation
cellulaire est réalisée dans ce sens pour résoudre le problème. D’autres équipes font appel à d’autres techniques
telles que le génie génétique pour produire des anticorps
recombinants [4]. Dans ce travail, les cellules myélomateuses utilisées comme partenaires à la fusion sont d’origine
murine P3X63Ag-8. Malgré cette fusion et à quelques exceptions [2,5], les hétérohybridomes ont tendance à cesser la
production d’anticorps humains après quelques jours, voire
quelques semaines de la fusion. La cause peut être une
perte sélective des chromosomes humains [6,8]. L’utilisation d’un myélome humain [1] ou d’un hétéromyélome
(homme/souris) [7,9] comme partenaire de la fusion avec
les cellules lymphoblastoïdes, augmente considérablement
la stabilité de l’hybridome.
L’anticorps produit en continu par H04 est resté stable
pendant plus de huit mois de culture avec un titre de 256
nettement supérieur à la norme internationale exigée qui
est de 64. Les performances et la spécificité de l’anticorps
H04 sont comparables à celles des réactifs commerciaux. Il
reconnaît spécifiquement tous les groupes B et AB ainsi que
les groupes faibles B3 et Bx, ce qui permet de l’utiliser
comme réactif pour la détermination des groupes sanguins
ABO.
Références
[1]
Tableau 2 Réactivité de H04 à + 37 °C ; titres et scores en
fonction du temps
GR
B
AB
J0
T/S
256/79
256/79
J15
T/S
256/79
256/79
J30
T/S
256/74
128/64
GR : globules rouges ; T/S : titre/score ; J : jour.
J45
T/S
128/66
128/62
% de cellules marquées au FITC
H04
0
91
0
96
0
[2]
[3]
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