Par mélange du sang avec les réactifs (Türk, Dacie Lewis ou Plaxan

Méthode
Par mélange du sang avec les réactifs (Türk, Dacie Lewis ou Plaxan) et en le laissant reposer quelques instants, les cellules sanguines à identifier vont être
colorées et conservées, les autres lysées.
Avantages et Désavantages
Avantages
Désavantages
Maniement
- facile, rapide, réalisable au laboratoire du cabinet
- seul le microscope est nécessaire
- sources nombreuses d’erreur (méthode manuelle)
- comptage de < 500 cellules (analyseur > 5000 cellules)
- microscopie: la répartition des cellules est subjective
Usage
- vérification rapide semi-quantitative du nombre des cellules
- inadapté pour le comptage dans la zone pathologique (p. e. leucémie, chimiotherapie)
Les résultats peuvent varier de 10% en fonction des techniques de comptage – le patient doit être suivi par la même technique. Le prélèvement de sang capillaire doit être
effectué uniquement dans des cas exceptionnels (source additionnelle d’erreurs). Il est recommandé d'utiliser du sang anticoagulé (EDTA).
Matériel
Matériel d’ usage
Tube de réaction à 2,2 ml
Papier filtre rond Æ 60mm
Micro pipettes (capillaires verre), 10 μl + 50 μl*
Micro pipettes (capillaires verre), 20 μl*
*incl. aide au pipetage
n° article
sac
M246
M247
M244
M245
à 200
à 100
à 250
à 250
Solution
Leucocytes (lc): Solution Türk
Érythrocytes (ec): Solution Dacie & Lewis
Plaquettes (tc): Solution Plaxan
n° article
flacon
n° test
M241
M242
M243
30 ml
30 ml
30 ml
75 (30)*
15
75 (30)*
*dépend du mode de dilution lors du comptage (voir schéma de pipetage et comptage)
Les clients de labor team w ag peuvent commander directement les articles au laboratoire ->voir la carte de commande labor team w ag.
autre
Pipette automatique à volume réglable 100-1000μl
Pipette automatique à volume réglable 10-100 μl ou micro pipettes (capillaires verre) 20 μl/ 50 μl/ 10 μl
Chambre de comptage Neubauer improved et lame couvre-objet
Entonnoir et filtre à papier pour filtrer la solution
Mode opératoire
EDTA
1
Filtrer la solution colorante une fois
par semaine ou avant usage.
2
Verser la solution dans le tube de
réaction.
mic.pip
3
Pipeter le sang EDTA ou prélever
directement au bout du doigt.
EDTA
mic.pip
4
A l'aide d'un papier filtre, éliminer le
surplus sur la pointe ou la micro
pipette. Mélanger le sang avec la
solution. *
*Pour vider ou nettoyer la micro pipette,
utilisez la poire. Aspirez et éjectez la
mélange. Pour aspirer veuillez boucher
le trou avec l'index
EDTA
5
Recapuchoner le tube et laisser 5
minutes sur le mélangeur. (Plaquettes : attendez 5 minutes et le
placer après sur le mélangeur)
6
Homogénéiser. Prélever env. 20 μl
et remplir la chambre.
7
Temps de sédimentation dans la chambre:
- leucocytes/ érythrocytes 2 min.
- plaquettes 15 min.*
*chambre humide
M098-F
Schéma de pipetage et comptage
Paramètre
Réactif
Dilution
Type
Sang
μl
Leucocytes
Türk
1:20
Érythrocytes
Dacie +
Lewis
1:200
Plaquettes
Plaxan
1:20
Türk
„
Solution
μl
a)
20
380
b)
50
950
10
1990
a)
20
380
b)
50
950
1:100
20
1980
Normes
Facteur
Comptage
normal
x 0.05
= G/l
x 50
lc/μl
4 carrés
normal
x 0.01
= T/l
x 10'000
ec/μl
4 lignes (centre)
normal
x1
= G/l
x 1’000
tc/μl
4 carrés
lc > 50.0 G/L
x 0.25
= G/l
x 250
lc/μl
4 carrés
autres volumes
Leucocytes
„
1:10
20
180
lc < 4.0 G/L
x 0.025
= G/l
x 25
lc/μl
4 carrés
Érythrocytes
Dacie &
Lewis
1:100
20
1980
ec < 3.0 T/L
x 0.005
= T/l
x 5'000
ec/μl
4 lignes (centre)
Plaquettes
Plaxan
1:100
20
1980
tc > 450 G/L
x5
= G/l
x 5’000
tc/μl
4 lignes (centre)
„
1:10
20
180
tc < 100 G/L
x 0.5
= G/l
x 500
tc/μl
4 lignes (centre)
„
Comptage
Perturbations liées aux patients
Comme?
Où?
Comptage des leucocytes
Les formes nucléées immatures des érythrocytes
(érythroblastes basofiles) sont facilement
confondues avec des leucocytes. Ceci induit des
valeurs trop hautes.
Comptage des érythrocytes
Agglutinine froide: des anticorps provoquent
l’agglutination des érythrocytes. Celle-ci induit
des valeurs trop basses.
comptés
leucocytes - 4 grands carrés (dans les 4 coins)
Comptage des thrombocytes
Agrégation des plaquettes: erreurs lors du prélèvement de sang; le tube EDTA n'est pas
suffisamment bien mélangé, ou, plus rarement, il
peut s'agir d'une intolérance à l’EDTA. Ceci
induit des valeurs trop basses..
non comptés
érythrocytes/plaquettes 4 lignes, (80 petits carrés)
Assurer la qualité
- Une double lecture est recommandée, les résultats ne doivent pas différer de plus de 10% -> voir graphique 1.
- Participer régulièrement aux contrôles de qualité de laboratoires externes (comparaison directe avec d’autres laboratoires qui utilisent la même technique)
- Respecter le nombre minimum de cellules à décompter (afin de maintenir le coefficient de variation le plus bas possible) -> voir graphique 2..
( SA - SB ) x 100
= distance en %
SA
SH = Somme la plus haute / SB = Somme la plus basse
- ec au moins 400 cell. (variation de coefficient 5%)
- lc au moins 100 cell. (variation de coefficient 10%)
- tc au moins 100 cell. (variation de coefficient 10%)
grap. 1
grap. 2
Sources d’erreurs
Résultats
incorrects
causes
tendance á / â
á
L'embout de la pointe ou du capillaire n'a pas été essuyé. (trop de sang,
dilution incorrecte)
á
L'aspiration de matériel excédentaire de la chambre par du papier fausse
la dilution.
á
La chambre de comptage n’est pas correctement nettoyée. La poussière
mime les petites cellules comme par exemple les thrombocytes.
á
La lame couvre-objet n’est pas posée correctement (pas d’anneaux de
Newton)
á
Échantillon commence à sécher dans la chambre à comptage. Les bords
se rétractent.
á ouâ
Problème de pipetage, bulle d'air.
á ou â
á ou â
á ou â
Mauvaise dilution.
La chambre est trop remplie (le matériel s’écoule dans la deuxième).
Facteur de calcul incorrect.
correction
Bien essuyer l'embout avec du papier filtre.
Remplir vite et proprement avec la quantité adéquate.
Nettoyer soigneusement la chambre. Avec de l'alcool à 70% et sécher avec
un Kleenex sans peluche.
Profondeur de la chambre incorrecte = volume d’échantillon incorrecte.
Dès que vous observez une rétraction, nettoyez et remplissez à nouveau la
chambre.
Après le pipetage, contrôler que l'embout/capillaire soit correctement
rempli.
Bien homogénéiser.
Volume incorrect = mauvaise dilution
Comparer avec le schéma « schéma de pipetage et comptage » ci-dessus.