Préparation de lames porte-objets pour l`examen cytologique de

Méthode Hettich
Préparation de lames porte-objets pour
l’examen cytologique de liquide pleural
ou d’ascite
Préparation de lames porte-objets pour l’examen cytologique de liquide pleural ou d’ascite
Le liquide pleural et le liquide d’ascite contiennent, outre
des cellules mésothéliales, des lymphocytes ainsi que
des granulocytes éosinophiles et neutrophiles. La teneur
en protéines s‘élève généralement à environ 30 g/l. Le
contenu cellulaire varie souvent très fortement. On peut
trouver du sang dans les deux liquides mais aussi de la
graisse dans le cas de l’ascite.
Avantages de la méthode Hettich
1.Des chambres de cytologie adaptées
à différents contenus cellulaires et volumes
2. Haut rendement cellulaire
3. Bonne représentation des cellules
4. Répartition optimale des cellules
Préparation
1.Préparation d’échantillons contenant
une part importante d’érythrocytes
Les érythrocytes en trop grand nombre ont une
influence négative sur la qualité de la préparation, il est
donc recommandé de les éliminer à l‘aide d‘un tampon
de lyse avant de réaliser la préparation cytologique.
a) Préparation du tampon de lyse
8,29 g de chlorure d’ammonium (NH4Cl)
1,0 g de bicarbonate de potassium (KHCO3) et
0,037 gd’acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA)
sont mélangés à de l’eau distillée pour obtenir
1 litre de tampon.
Pour une meilleure conservation, il est recommandé
d‘autoclaver le tampon de lyse.
b) Lyse des érythrocytes
·C
entrifuger l’échantillon pendant 10 minutes à
350 x g (ce qui correspond à 1.700 min-1 avec le rotor
6 places, et à 1.900 min-1 avec le rotor 4 places).
· Prélever le surnageant à l‘aide d‘une pipette et le
mettre de côté.
· Plonger le sédiment dans le tampon de lyse
(10 volumes de tampon pour 1 volume de sédiment).
· Bien mélanger et laisser agir pendant 10 minutes
à température ambiante. L’hémoglobine se libérant
entraîne une coloration rouge transparente.
· Arrêter la réaction en ajoutant 10 fois la quantité de
solution saline physiologique (NaCl à 0,9 %) ou de
solution saline tamponnée au phosphate.
· Centrifuger à 350 x g pendant 10 minutes
· Déverser et jeter le surnageant et les érythrocytes
lysés.
· Plonger le sédiment dans 10 ml de NaCl à 0,9 %
(ou PBS), bien mélanger et centrifuger une nouvelle
fois à 350 x g pendant 10 minutes.
· Jeter le surnageant, ajouter le sédiment au surnageant
de l‘échantillon d‘origine mis de côté plus tôt, et bien
mélanger. Une préparation cytologique peut à présent
être obtenue à partir de cet échantillon.
Important : ne pas laisser les cellules trop longtemps
dans le tampon de lyse car celles-ci seraient alors
également dissoutes.
2.Choix des accessoires adaptés
Pour la centrifugation de liquide pleural et d’ascite,
il est recommandé d’utiliser des chambres de 2 ml
(réf. 1664) d’une surface de sédimentation de 60 mm2
et des chambres de 4 ml (réf. 1665) d’une surface
de sédimentation de 120 mm2. Les chambres de 2 ml
sont appropriées pour les échantillons contenant
jusqu‘à 100.000 cellules max. et les chambres de
4 ml pour les échantillons contenant jusqu’à 200.000
cellules max.
3.Assemblage du système de cytologie
Pour l’assemblage du système de cytologie, veuillez
vous reporter à notre schéma « Des préparations parfaites en un tour de main – le système de cytologie
HETTICH ». La préparation de lames porte-objets à
partir de liquide pleural et d’ascite nécessite en règle
générale une fixation sèche. Il faut donc utiliser une
carte-filtre dans le système cytologique (cf. schéma,
point B1). Pour la centrifugation d’échantillons infectieux, il est recommandé d’utiliser le couvercle
réf. 1661 (cf. schéma, point B2).
2
Préparation de lames porte-objets pour l’examen cytologique de liquide pleural ou d’ascite
4.Centrifugation
a) Sédimentation
Verser l’échantillon et centrifuger pendant 10 minute à
490 x g (ce qui correspond à 2.000 min-1 avec le rotor
6 places, et à 2.200 min-1 avec le rotor 4 places).
b) Retrait du surnageant acellulaire
Après la centrifugation, le surnageant acellulaire se
trouve encore dans la chambre et doit être retiré
prudemment par aspiration.
Il est important de ne pas remuer le sédiment au cours
de l’aspiration, car cela pourrait influencer sa qualité et
entraîner une perte de cellules. Il est donc recommandé
de retirer le surnageant de haut en bas en suivant la
surface du liquide à l’aide d’une pipette Pasteur. Le bout
de la pipette ne doit pas toucher la lame mais laisser
une petite goutte de liquide résiduel sur le sédiment !
c) Séchage du sédiment
Le sédiment doit ensuite être séché pour pouvoir utiliser
les très répandus colorants GIEMSA. Le séchage a lieu
au cours d’une seconde centrifugation. Après avoir retiré
le surnageant, détacher la bague de serrage et la retirer
en même temps que la chambre (cf. schéma, point B4).
Replacer la nacelle avec la plaque de fixation, la lame
porte-objets et le filtre dans la centrifugeuse et centrifuger pendant 1 minute à 1 100 x g (ce qui correspond à
3 000 min-1 avec le rotor 6 places, et à 3 400 min-1 avec
le rotor 4 places). Le liquide résiduel est extrait sous
l’effet de la force centrifuge et absorbé par la carte-filtre.
Les cellules restent sur la lame sous forme de sédiment. Elles sont parfaitement conservées et réparties de
manière idéale. Le séchage par centrifugation permet
d’éviter les effets entraînés par l’évaporation, tels que le
rétrécissement des leucocytes et la cristallisation.
d) Fixation et coloration
La préparation sèche peut ensuite immédiatement être
fixée puis colorée.
Bon à savoir
Après coloration au Giemsa ou au May-GrünwaldGiemsa, les lames porte-objets sont rincées à l’aide
d’un tampon (Weise, Sörensen). Elles doivent ensuite
être séchées.
Le système de maintien Labora pour 6 lames
porte-objets (réf. 1285) permet de réaliser ces
étapes de manière simple et rapide :
·P
lacer les lames porte-objets rincées avec le tampon
Weise dans les supports puis les mettre dans la
centrifugeuse.
· Centrifuger pendant 1 minute à 275 x g (ce qui
correspond à 1.500 min-1 avec le rotor 6 places,
et à 1.700 min-1 avec le rotor 4 places).
· Sortir les supports contenant les lames porte-objets
sèches de la centrifugeuse.
· Les préparations peuvent maintenant être observées
au microscope et/ou recouvertes.
· Essuyer les nacelles.
Le rotor 6 places permet de sécher jusqu’à
36 lames porte-objets simultanément.
Références pour la commande
Centrifugeuse
Réf.
1206
ROTOFIX 32 A
UNIVERSAL 320 / UNIVERSAL 320 R
Accessoires sélectionnés
1401 / 1406
1)
Réf.
Rotor 4 places
1624
Rotor 6 places
1626
Nacelle de cytologie
1660
Couvercle pour réf. 1660
1661
Plaque de fixation avec bague de serrage
1662
Chambre de cytologie 1 x 2 ml (60 mm²)
1664
Chambre de cytologie 1 x 4 ml (120 mm²)
1665
Système de maintien Labora pour 6 lames porte-objets
1285
1)Vous
trouverez notre gamme complète d’accessoires pour la cytologie dans
notre catalogue de cytologie que vous pouvez obtenir gratuitement sur demande.
Andreas Hettich GmbH & Co. KG
Föhrenstr. 12
D -78532 Tuttlingen
Allemagne
www.hettichlab.com
[email protected]
[email protected]
Tél.
Fax
+49 (0)7461 / 7 05 - 0
+49 (0)7461 / 7 05 - 1 22
Ventes nationales :
- 200
Ventes internationales :
- 201
Service clients pour l‘Allemagne : - 202
Service clients pour l‘étranger : - 203