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CHAPITRE III : MISE AU POINT DES TECHNIQUES D’ETUDES I. CARACTERISATION DU SYSTEME D'AEROBIOCONTAMINATION A. PARAMETRES PHYSIQUES 1. TAILLE DES BIOAEROSOLS 2. STABILITE DE LA PRODUCTION DE L'AEROSOL 3. EFFET DE LA VITESSE D’AIR DE SOUFFLAGE 4. CONTAMINATION DES SURFACES B. PARAMETRES BIOLOGIQUES 1. EFFET DE L’AGE DE LA CULTURE SUR LA DISPERSION 2. IMPACT DE L’AEROSOLISATION SUR LA GERMINATION 3. EFFET DE L’ETAT D’HYDRATATION DE LA CULTURE II. SUIVI DE LA CROISSANCE FONGIQUE A. DETERMINATION DE LA CROISSANCE EN MILIEU AQUEUX B. ESTIMATION DU TEMPS D’ADAPTATION DES MOISISSURES AUX SUBSTRATS C. MESURE DE LA BIOMASSE AU SEIN DES MATERIAUX : DOSAGE DE L’ERGOSTEROL 1. MISE AU POINT ET VALIDATION DE LA TECHNIQUE ANALYTIQUE 2. MISE AU POINT DE L'ETAPE D'EXTRACTION 3. QUANTITE D'ERGOSTEROL PAR SPORE D. MESURE DU PH DES PRODUITS DE CONSTRUCTION - 67 - 67 - 67 - 69 - 70 - 71 - 72 - 72 - 73 - 74 - 75 - 75 - 76 - 77 - 77 - 78 - 80 - 80 - TABLE DES ILLUSTRATIONS CHAPITRE III FIGURES Figure 1 : Profil granulométrique de l’aérosol d’Aspergillus niger et photographie de ses conidies impactées sur gélose (microscope optique x400) .................................................................................................- 67 Figure 2 : Photographie d'une spore d'Aspergillus niger (MEB)...........................................................................- 68 Figure 3 : Photographie d'une zone d'impaction réalisée sur lame graissée sans (A) et avec (B) le système de désagrégation d'amas .....................................................................................................................- 68 Figure 4 : Concentration conidienne d'Aspergillus niger obtenue lors d'une génération continue d'aérosol pour un débit d'air de soufflage de 2,9 l/min...............................................................................................- 69 Figure 5 : Dispersion des spores d’Aspergillus niger, Penicillium brevicompactum et Cladosporium sphaerospermum selon la vitesse d’air de soufflage (n = 7)..........................................................- 70 Figure 6 : Concentration de spores d'Aspergillus niger impactées sur lame graissée en fonction de la concentration particulaire aérosolisée ..................................................................................................................- 71 Figure 7 : Décroissance conidienne d'Aspergillus niger........................................................................................- 72 Figure 8 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’âge de la culture (débit d'air de soufflage= 2,9 l/min) .......................................................................................................................................- 73 Figure 9 : Photographie d’une zone d’impaction 15 heures après la collecte de conidies d’Aspergillus niger sur lame gélosée. Observation au microscope à fond clair (X1000) ...................................................- 74 Figure 10 : Proportion de spores capables de germer selon l'âge de la culture fongique.......................................- 74 Figure 11 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’état d’hydratation de la culture (débit de soufflage=2,9 l/min) ......................................................................................................................- 75 Figure 12 : Photographies de cultures d’Aspergillus niger réalisées en suspension liquide..................................- 76 Figure 13 : Photographies de spores d'Aspergillus niger en phase de germination réalisée au microscope optique (x1000) et au microscope électronique à balayage (x10000) (spores impactées sur gélose) .........- 76 Figure 14 : Corrélation entre l’aire des pics et la concentration d’ergostérol (n=3) ..............................................- 77 Figure 15 : Influence de la température (de 4 à 53 °C) sur le dosage de l’ergostérol............................................- 78 Figure 16 : Effet du temps d’ultrasonication sur l’extraction de l’ergostérol à partir de spores d’Aspergillus niger ...79 Figure 17 : Effet de la concentration de matériau sur la mesure du pH.................................................................- 81 Figure 18 : Influence du broyage et du temps de contact sur la mesure du pH .....................................................- 82 - TABLEAUX Tableau I : Moyenne géométrique du diamètre aérodynamique et écart type géométrique des spores fongiques aérosolisées....................................................................................................................................- 69 Tableau II : Statistique descriptive (unités arbitraires) ..........................................................................................- 78 Tableau III : Efficacité de la procédure d'extraction de l'ergostérol ......................................................................- 80 Tableau IV: Evaluation de la quantité d’ergostérol par conidie d’Aspergillus niger.............................................- 80 Tableau V : Données statistiques relatives aux essais réalisés pour évaluer la répétabilité de la mesure du pH...- 82 - - 66 - CHAPITRE III MISE AU POINT DES TECHNIQUES D’ETUDES Nos travaux de recherche nécessitent la mise au point d'outils, tant pour simuler la contamination des surfaces par un aérosol fongique, que pour évaluer la croissance de ces microorganismes sur les supports ou encore caractériser les propriétés des produits de construction contaminés. Dans ce chapitre, nous étudions les caractéristiques du bioaérosol produit et en particulier, l'influence des paramètres physiques et biologiques du système. Nous présentons également les différentes techniques d'évaluation du développement fongique ainsi que le protocole mis au point pour déterminer le pH des produits de construction. I. CARACTERISATION DU SYSTEME D'AEROBIOCONTAMINATION A. PARAMETRES PHYSIQUES 1. Taille des bioaérosols Dans la mesure où le comportement des particules aéroportées dépend de leur taille, il nous faut connaître les dimensions de l'aérosol produit. Une culture pure (7 Concentration particulaire (conidies/cm3) jours) d’Aspergillus niger est utilisée pour cette expérimentation. 1,50 1,25 1,00 0,75 0,50 0,25 0,00 .5 .7 1 2 3 5 7 10 20 Diamètre aérodynamique Figure 1 : Profil granulométrique de l’aérosol d’Aspergillus niger et photographie de ses conidies impactées sur gélose (microscope optique x400) - 67 - La distribution granulométrique du bioaérosol est évaluée à l’aide d'un compteur aérodynamique (APS) (Figure 1). Nous constatons que la taille des particules biologiques se situe entre 3 et 5 µm avec un diamètre aérodynamique moyen égal à 3,4 ±0,2 µm. Nous avons complété ces mesures par une observation au microscope électronique à balayage qui permet d’apprécier le diamètre réel de ces bioaérosols. Cette taille est d'environ 5 µm si on estime la forme échinulée spécifique de cette moisissure (Figure 2). Figure 2 : Photographie d'une spore d'Aspergillus niger (MEB) Lors des premiers essais, nous avions constaté la production d'amas ou de chaînes de spores, désagrégés par la mise en place, en sortie du générateur, d'un réducteur de section de 0,4 mm de diamètre (Figure 3). A A B Figure 3 : Photographie d'une zone d'impaction réalisée sur lame graissée sans (A) et avec (B) le système de désagrégation d'amas Nous effectuons les mêmes essais avec des cultures pures de Cladosporium sphaerospermum et de Penicillium brevicompactum (Tableau I). - 68 - Espèces fongiques dae (µm) σg Aspergillus niger 3,2-3,6 1,35 Cladosporium sphaerospermum 2,4-2,8 1,30 Penicillium brevicompactum 2,3-2,7 1,25 Tableau I : Moyenne géométrique du diamètre aérodynamique et écart type géométrique des spores fongiques aérosolisées La distribution de l'aérosol est proche de la mono dispersion pour les trois souches (valeur des σg légèrement supérieure à 1,2). Par ailleurs, nous constatons que, ni la durée d'incubation, de 5 à 28 jours, ni le degré d'humidité dans le montage, de 26 à 85 % (27°C), n'affecte la taille du bioaérosol produit. 2. Stabilité de la production de l'aérosol L'une des volontés concernant le système d'aérobiocontamination était de pouvoir contaminer de manière reproductible et contrôlable plusieurs échantillons. Nous avons donc estimé la stabilité de l’aérosol produit sur une durée de 15 minutes. Une souche d’Aspergillus niger cultivée pendant 7 jours en ambiance humide est soumise à un flux d’air sec stérile pendant 15 minutes. La cinétique de dispersion est présentée dans la Figure 4. spores/cm 3 10 1 0,1 0,01 0,001 0 5 10 Temps en min 15 Figure 4 : Concentration conidienne d'Aspergillus niger obtenue lors d'une génération continue d'aérosol pour un débit d'air de soufflage de 2,9 l/min - 69 - Nous constatons que la concentration de l’aérosol produit se stabilise après 3 minutes à une valeur moyenne de 2 ± 0,3 conidies/cm3 et qu’elle reste stable durant les 12 minutes suivantes. 3. Effet de la vitesse d’air de soufflage Pour nous permettre d’évaluer l’influence de la vitesse de soufflage sur la libération des spores, nous utilisons trois espèces fongiques : Aspergillus niger, Penicillium brevicompactum et Cladosporium sphaerospermum. Des cultures sèches âgées de 7 jours et incubées dans les mêmes conditions sont dispersées successivement à l’aide de différents débits d’air de soufflage : 0,5; 1; 1,5; 2; 3; 4, et 5 l/min (de 4,1 à 41,5 m/s en sortie de buse). La dispersion des spores selon la vitesse d'air est représentée sur la Figure 5. Aspergillus niger 10000 Penicillium brevicompactum 1000 Cladosporium sphaerospermum Spores/cm 3 100 10 1 0,1 0,01 0 10 20 30 40 50 Vitesse d'air de soufflage (m/s) Figure 5 : Dispersion des spores d’Aspergillus niger, Penicillium brevicompactum et Cladosporium sphaerospermum selon la vitesse d’air de soufflage (n = 7). Comme attendu, la concentration de spores aéroportées augmente avec la vitesse de l’air de soufflage. La dispersion observée dépend également de la souche fongique considérée, la culture d’Aspergillus niger nécessitant une vitesse d’air moindre par rapport à Cladosporium sphaerospermum ou Penicillium brevicompactum. En effet, pour aérosoliser une concentration de 1 spore/cm3, la vitesse de soufflage nécessaire est égale à 4; 17 et 21 m/s pour, respectivement, Aspergillus niger, Cladosporium sphaerospermum et Penicillium brevicompactum. Dans un environnement intérieur, à niveau de contamination équivalent (hors sources extérieures), nous pouvons supposer, - 70 - que des prélèvements atmosphériques révèleront une concentration plus importante en Aspergillus qu'en Penicillium ou Cladosporium. Aussi, pour caractériser au mieux la contamination d'un local, les techniques de prélèvement d'air devraient s'accompagner d'un examen des surfaces contaminées avec identification des espèces présentes. 4. Contamination des surfaces Nous réalisons cette contamination à l'aide d'un impacteur placé à la base de la chambre d'homogénéisation. Nous avons modifié les caractéristiques de ce collecteur de manière à pouvoir contaminer simultanément 5 échantillons. La dispersion entre les zones d’impaction d’un même échantillon a été évaluée par observation microscopique du support contaminé. Le dénombrement des spores est réalisé, à l’aide d’un système d’analyse d’images, sur 10 zones choisies aléatoirement sur la surface. La dispersion observée entre les spots est d'environ 15%. De manière à contrôler l’aérobiocontamination des surfaces, nous relions également la concentration du bioaérosol produit avec le degré de contamination des surfaces. Nous employons comme surface de référence une lame de verre graissée. Ce support permet de limiter les phénomènes de rebond et de bioadhésion spécifique. Nos résultats sont présentés Figure 6. Dans l’intervalle de concentration testé, on note une relation linéaire Concentration de spores sur la surface 4 2 (10 part/mm ) entre les mesures aériennes et surfaciques (r² égale 0,97). 3 [conidies/mm2]prélevées =[1,9. [conidies/cm3]aérosolisées + 0,14].104 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Concentration de spores aéroportées (part/cm3) Figure 6 : Concentration de spores d'Aspergillus niger impactées sur lame graissée en fonction de la concentration particulaire aérosolisée Selon le degré d’aérobiocontamination des surfaces désiré, nous utilisons deux procédures : la génération continue ou interrompue. - 71 - Nous l’avons vu (Figure 4), la technique de génération en continu permet d’atteindre une concentration stable d’aérosol sur une période de 12 minutes. Toutefois, la concentration élevée obtenue en permanence ne convient pas pour l’ensemble de nos expérimentations et l’utilisation d’une dilution importante ou d’un temps de collecte réduit, de manière à la limiter, augmentent considérablement l’incertitude. La deuxième procédure adoptée utilise la décroissance de la concentration particulaire au cours du temps. Après avoir atteint une concentration comprise entre 10 et 15 part/cm3, la génération est stoppée et remplacée par un air filtré de débit identique. Sur la Figure 7 est représentée la cinétique de décroissance moyenne utilisée. Le calcul de l’intégrale de cette décroissance exponentielle permet d’atteindre simplement et précisément le niveau de contamination souhaité. Figure 7 : Décroissance conidienne d'Aspergillus niger Cette procédure permet ainsi de réaliser une large gamme de concentrations selon le moment auquel nous procédons au prélèvement et sa durée. Par exemple, une impaction de 1 minute réalisée entre 400 et 460 secondes permet de collecter en moyenne 76 particules biologiques. B. PARAMETRES BIOLOGIQUES 1. Effet de l’âge de la culture sur la dispersion Nous évaluons l’impact de la durée d’incubation des moisissures sur leur propension à être aérosolisées, en utilisant une même culture hydratée d'Aspergillus niger après 5, 7, 14, 21 et 28 jours d’incubation. La concentration du bioaérosol produit est mesurée pour - 72 - chaque essai. Nous représentons dans la Figure 8 les différents profils de dispersion obtenus. Entre 5 et 15 minutes de génération, deux niveaux de concentration sont ainsi mis en évidence : la concentration moyenne de l’aérosol produit à partir des cultures âgées (14, 21 et 28 jours) est 10 fois plus importante que pour les cultures jeunes (5 et 7 jours). Les structures mycéliennes âgées seraient plus aisément dispersées. Cette différence est probablement liée à la dégénérescence des structures fongiques au cours du temps, phénomène vraisemblablement rencontré dans les environnements intérieurs sur les surfaces contaminées. Figure 8 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’âge de la culture (débit d'air de soufflage= 2,9 l/min) 2. Impact de l’aérosolisation sur la germination Outre la concentration produite, nous étudions l'effet de la durée d'incubation sur la capacité des spores aérosolisées à se développer. Ainsi, nous contaminons des lames de verre gélosées avec la même culture d'Aspergillus niger après 7; 14; 21 et 28 jours d'incubation (Figure 9 et Figure 10). - 73 - Mycélium en croissance Conidies en phase de germination Conidie inactive Figure 9 : Photographie d’une zone d’impaction 15 heures après la collecte de conidies d’Aspergillus niger sur lame gélosée. Observation au microscope à fond clair (X1000) 100 Conidies germant (%) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 7 jours 14 jours 21 jours 28 jours Age de la culture Figure 10 : Proportion de spores capables de germer selon l'âge de la culture fongique Une baisse de la capacité à se développer pour les cultures les plus âgées est clairement mise en évidence (Figure 10) : après 7 jours d'incubation, la biomasse active est proche de 85% et n’est plus que de 60% après 28 jours. De manière à standardiser et optimiser la procédure d’aérobiocontamination, nous utiliserons une culture âgée de 7 jours. Au vu de nos résultats, on peut supposer que la proportion de spores aérosolisées susceptibles de croître est probablement sur estimée dans les études utilisant la culture comme technique de dénombrement (Verhoeff et al, 1992; Madelin, 1995). 3. Effet de l’état d’hydratation de la culture Pour évaluer l’influence de l’état d’hydratation des cultures sur la libération des spores, nous utilisons deux cultures d’Aspergillus niger de 7 jours, l’une étant maintenue - 74 - pendant 24 heures à proximité d’un gel de silice (assèchement de la culture), l’autre bénéficiant d’une ambiance saturée en eau. Nos résultats sont présentés Figure 11. Des concentrations moyennes de 2 et 450 spores/cm3 sont mesurées respectivement pour les cultures humide et sèche. L’état d’hydratation de la culture aurait un effet sur la libération des spores. L’eau est nécessaire à la croissance des moisissures et la déshydratation semble favoriser leur libération. Dans les environnements intérieurs, ce phénomène favoriserait la prolifération et la dissémination des spores vers des substrats riches en eau plus propices à leur croissance. Nous choisissons de standardiser notre technique de production de l'aérosol en séchant les cultures fongiques pendant les 24 heures précédant l'aérosolisation. Figure 11 : Cinétique de dispersion des spores d’Aspergillus niger selon l’état d’hydratation de la culture (débit de soufflage=2,9 l/min) II. SUIVI DE LA CROISSANCE FONGIQUE Comme nous l’avions évoqué dans la synthèse bibliographique, le développement fongique est le fruit de différentes étapes spécifiques : la germination, la croissance des hyphes, et enfin la sporulation. Pour appréhender le comportement des moisissures sur les matériaux, nous avons été amenée à mettre en œuvre et valider différents protocoles d’évaluation : de l’observation macroscopique qualitative à l’approche moléculaire. A. DETERMINATION DE LA CROISSANCE EN MILIEU AQUEUX La première approche consiste à évaluer qualitativement l'effet des nutriments (rapport carbone sur azote) et du pH sur le développement fongique. Pour ce faire, une même quantité de spores d'Aspergillus niger est ajoutée à un volume constant de solution - 75 - nutritive et la croissance est évaluée macroscopiquement après une semaine d’incubation. 0 1 2 Figure 12 : Photographies de cultures d’Aspergillus niger réalisées en suspension liquide Les résultats de croissance observés (Figure 12), nous permettent d’ordonner le développement selon 3 catégories : pas de croissance (0); colonisation visible (1) et développement important (2). Cette première méthode de tests rapides pourra être employée pour orienter le choix des variables (nutriments et pH). B. ESTIMATION DU TEMPS D’ADAPTATION DES MOISISSURES AUX SUBSTRATS Une fois en contact avec un matériau (propice à son développement), la spore va utiliser plus ou moins rapidement les nutriments constitutifs de ce substrat. Elle devra ainsi s’adapter à ce nouvel environnement. Le temps spécifique nécessaire à cette accoutumance correspond à l’étape de germination. Nous avons assimilé cette durée au moment où le premier hyphe émerge de la cellule (Figure 13). Conidies en cours de germination Figure 13 : Photographies de spores d'Aspergillus niger en phase de germination réalisée au microscope optique (x1000) et au microscope électronique à balayage (x10000) (spores impactées sur gélose) - 76 - Cette période d’adaptation est comprise entre 8 et 59 heures pour respectivement le substrat le plus favorable (milieu de culture) et le milieu le plus défavorable (support basique ayant un rapport carbone sur azote faible) au développement du microorganisme. Nous constatons que, malgré des conditions de culture bien maîtrisées, la germination des spores est asynchrone, phénomène déjà constaté par Bosch en 1995. Des observations microscopiques horaires permettent de déterminer que le laps de temps nécessaire à la germination de toutes les spores capables de se développer est de 4 heures. C. MESURE DE LA BIOMASSE AU SEIN DES MATERIAUX : DOSAGE DE L’ERGOSTEROL 1. Mise au point et validation de la technique analytique Nous réalisons une gamme étalon de solutions d'ergostérol de concentrations croissantes comprises entre 0 et 10 mg/l. La relation entre l’aire des pics et la concentration en ergostérol injectée est représentée sur la Figure 14. 25 Aire des pics (Unités arbitraires) 20 15 10 5 0 0 2 4 6 8 10 Concentration d'ergostérol (mg/l) Figure 14 : Corrélation entre l’aire des pics et la concentration d’ergostérol (n=3) La relation entre ces deux paramètres est linéaire : [Aire] = 23382[Ergostérol ] + 485 avec un coefficient de corrélation r² de 0,99. La dispersion de la mesure est calculée à partir de 31 manipulations réalisées de façon identique. La concentration de la solution étalon d'ergostérol utilisée est égale à 6 mg/l (Tableau II). - 77 - Moyenne 144265,5 Ecart-type 1108,5 Minimum 141236 Maximum 146662 Nombre d'échantillons 31 Tableau II : Statistique descriptive (unités arbitraires) Il est admis qu’une méthode est répétable lorsque le rapport de l’écart type à la moyenne est faible. Le coefficient de variation calculé, inférieur à 1 %, apparaît satisfaisant. Par ailleurs, en utilisant des solutions d'ergostérol de concentration décroissante à partir de 1 mg/l, nous pouvons évaluer la limite de quantification. Elle est égale à 40 ± 5 ng/l (n=35, coefficient de variation de 13%). 2. Mise au point de l'étape d'extraction L'extraction de la molécule d'ergostérol des parois cellulaires fongiques implique de soumettre l'éprouvette à doser à une phase de sonication en présence de méthanol, durant laquelle la température du bain peut atteindre 53°C. a) Effet de la température Des filtres, sur lesquels 2 µg d’ergostérol commercial sont déposés, sont conservés pendant 45 minutes à différentes températures comprises entre 4 et 53°C. Les quantités d’ergostérol dosées pour chaque filtre sont reportées sur la Figure 15. Figure 15 : Influence de la température (de 4 à 53 °C) sur le dosage de l’ergostérol - 78 - Les valeurs obtenues varient de 1,8 à 2,05 µg. La quantité d'ergostérol dosée est quasi identique à celle initialement déposée sur chaque filtre : la température, entre 4 et 53 °C, n'a donc pas d'effet sur le dosage de la molécule. b) Effet du temps de sonication Plusieurs filtres sont contaminés simultanément avec une quantité identique de spores d'Aspergillus niger. Ces supports sont ensuite immergés dans du méthanol et soumis à l'ultrasonication pendant une durée variant de 0 à 75 minutes. Les quantités d'ergostérol dosées sont reportées dans la Figure 16. Nous constatons que l’étape de trempage dans le méthanol est déterminante. Elle permet d’extraire, à elle seule, 60% de l’ergostérol accessible par cette technique. L’effet du temps de sonication diffère très peu entre 15 et 75 minutes. Pour la suite de nos expériences, nous choisissons une durée de sonication égale à 45 minutes. Figure 16 : Effet du temps d’ultrasonication sur l’extraction de l’ergostérol à partir de spores d’Aspergillus niger c) Rendement de la technique Plusieurs filtres, préalablement conditionnés en nutriments et en pH, sont simultanément contaminés via un aérosol d’Aspergillus niger. Les éprouvettes sont mises à incuber dans une enceinte d'humidité relative proche de 100%, à 25°C, dans l’obscurité. Une fois la sporulation observée, les filtres sont traités simultanément. Chaque filtre subit 3 cycles extraction - dosage. Les concentrations d'ergostérol obtenues après chaque cycle sont reportées dans le Tableau III. - 79 - Concentration d’ergostérol (µg/ filtre) Filtre 1 1ère extraction 2,285 2ème extraction 0,463 3ème extraction 0,093 4ème extraction 0 Filtre 2 2,609 0,520 0,17 0 Filtre 3 2,122 0,391 0,096 0 Tableau III : Efficacité de la procédure d'extraction de l'ergostérol Nos résultats montrent que 3 sonications sont nécessaires pour doser la quasi totalité de l’ergostérol accessible. Toutefois, la première extraction permet déjà de récupérer de 79 à 81% de l’ergostérol total dosé. Nous avons donc choisi de procéder à une seule extraction lors du traitement des prochains échantillons. 3. Quantité d'ergostérol par spore Nous avons préparé une suspension de spores d’Aspergillus niger de concentration connue et ensemencé un filtre avec un volume connu de cette solution puis réalisé l’ensemble du protocole de dosage. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau IV. Nombre de conidies Quantité d’ergostérol par conidie (pg) 3,450.106 0,04 3,800.106 0,042 6,275.106 0,034 10,375.106 0,036 Tableau IV: Evaluation de la quantité d’ergostérol par conidie d’Aspergillus niger La quantité d’ergostérol contenue dans une spore d’Aspergillus est de 0,038 pg (σ = 0,004 pg), Ce résultat est conforme aux résultats de la littérature. En effet, Miller en 1997 trouve, avec le même champignon, une valeur de 1,71 ± 20 pg d'ergostérol par conidie. D. MESURE DU PH DES PRODUITS DE CONSTRUCTION Les méthodes préconisées par les différentes normes relatives à la mesure du pH de l'extrait aqueux de divers produits (NF EN ISO 1264, 1997; NF EN ISO 4045, 1998; NF EN 1245, 1999…) ont pour inconvénient d'être spécifiques aux matériaux considérés. - 80 - Toutefois trois étapes sont récurrentes : mise en solution du produit, broyage de la matière et mesure du pH après un temps de contact défini. Nous avons optimisé le protocole en l'appliquant à différents produits. L'influence de la concentration de matière sur la mesure du pH est étudiée sur des échantillons de dalle de plafond acoustique. Nos résultats sont reportés sur la Figure 17. 8 7 pH 6 5 4 3 2 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 Concentration en matériau (g/l) Figure 17 : Effet de la concentration de matériau sur la mesure du pH Nous constatons que le pH augmente avec la quantité de matériau broyé. Toutefois à partir d'une concentration en matériau égale à 7 g/l, le pH est quasiment constant. Compte tenu du faible niveau de désagrégation de certains produits, nous choisissons, par commodité, de travailler avec une concentration massique de 10 g/l. Nous évaluons également les effets du broyage et du temps de contact sur la mesure du pH. Cette dernière est réalisée dans deux solutions de dalle de plafond acoustique à la concentration massique prédéfinie. Dans un cas la matière est broyée pendant 30 secondes. Le pH des deux solutions, avec et sans broyage, est mesuré après 1; 3; 10; 20; 30; 60 et 120 minutes. Une mesure de contrôle est réalisée après 24 heures de contact (Figure 18). Les deux milieux sont soumis à une agitation permanente durant toute l'expérimentation. - 81 - 6,6 6,4 Sans broyage Avec broyage 6,2 pH 6,0 5,8 5,6 5,4 5,2 0 50 100 1200 120 Temps de contact (min) 1400 Figure 18 : Influence du broyage et du temps de contact sur la mesure du pH La mesure réalisée après 2 heures de contact révèle une différence de l'ordre de 1 unité pH en faveur de la solution dont le matériau a été broyé. Cet écart est probablement dû au fait que le broyage a libéré les composants acido-basiques du matériau. Nous constatons qu’entre 2 et 24 heures de contact, le pH n’évolue quasiment pas, que le matériau soit broyé ou non, aussi avons-nous finalement retenu un temps de contact de 2 heures avec des matériaux préalablement broyés pour l’ensemble des essais. Nous évaluons la répétabilité de notre méthode à partir de 15 essais réalisés de façon identique sur une plaque de plâtre. Les données statistiques relatives à nos essais sont reportées dans le Tableau V. Moyenne 7,3 Écart-type 0,0655 Minimum 7,2 Maximum 7,4 Coefficient de variation (%) 0,9 n 15 Tableau V : Données statistiques relatives aux essais réalisés pour évaluer la répétabilité de la mesure du pH Compte tenu de la valeur du coefficient de variation, proche de 1 %, notre méthode peut donc bien être considérée comme répétable. - 82 - Nous éprouvons notre technique en l’appliquant à un matériau test conditionné avec une solution nutritive tamponnée (cf. Chapitre II). Le pH mesuré correspond effectivement à celui attendu, à savoir le pH du tampon. - 83 -