Pistacia vera L. - Université des Sciences et de la Technologie d`Oran

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
SCIENTIFIQUE
Université des Sciences et de la Technologie d’Oran
« MOHAMED BOUDIAF »
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOTECHNOLOGIES
THESE
Présentée
pour l'obtention du grade de Docteur Es-Sciences
Option : Biotechnologie Végétale
Par
Benamar BENMAHIOUL
Amélioration de la micropropagation in
vitro du pistachier (Pistacia vera L.) en
vue de l’extension des vergers en Algérie
Soutenue le 10 décembre 2009 devant le jury composé de:
FORTAS Zohra
KAID-HARCHE Meriem
DAGUIN Florence
YAKOUB-BOUGDAL Saliha
BOUAZZA Mohamed
TCHOUAR Noureddine
SAADI Abdelkader
Professeur Université d’Oran
Professeur USTOMB-Oran
HDR INHP-Angers
Professeur Université de Tizi-Ouzou
Professeur Université de Tlemcen
Maître de conférences USTOMB-Oran
Professeur Université de Chlef
Présidente
Rapporteur
Co-rapporteur
Examinatrice
Examinateur
Examinateur
Invité
DEDICACES
Je dédie ce modeste travail à :
Mes très chers parents…
Qui furent mes premiers enseignements, à qui je dois tout ; Pour leur
affection et leur soutien moral pendant toute la période de mes études primaires,
secondaires et universitaires.
Ma femme et mes enfants, les plus chers à mon coeur Amina et Mohammed El Hadi …
« Rabbi ikhallikoum lia inchallah ».
Mes frères et soeurs pour m’avoir garanti ce super cadre familial qui m’a permis d’en
arriver là.
Mon beau frère et ma belle sœur ainsi qu’à leurs enfants
Mes collègues les plus chers (Département de Biotechnologies (USTO), Foresterie,
Biologie et Agronomie (Université de Tlemcen) et Agrocampus-Ouest (Centre d’Angers).
Tous les instituteurs, professeurs et encadreurs qui m’ont formé, que de chemin
parcouru depuis mes premiers pas à l’école …
REMERCIEMENTS
Une thèse, tant nominative soit elle, est avant tout un travail de réflexion collective, donc
au terme de ce travail, il m’est à la fois un plaisir et un devoir de remercier sincèrement toutes les
personnes, qui de près ou de loin, m’ont accompagné, soutenu et participé à la réalisation de cette
thèse.
Mes remerciements sont d’abord destinés à Madame Noëlle DORION, Professeur à
l'Institut National d’Horticulture et du Paysage d’Angers et directrice du laboratoire de m’avoir
accueilli au Département de Sciences et Techniques des Productions Horticoles.. J’ai beaucoup
apprécié votre accueil, vos conseils et vos encouragements que vous n’avez jamais cessé de me
donner. Soyez assurée de ma profonde gratitude.
Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Madame Mariem KAID-HARCHE,
Professeur au département de Biotechnologie végétale, USTO et directrice de thèse, pour
m’avoir accordé sa confiance et m’avoir guidée dans mes réflexions scientifiques tout au long de
ce travail. Que cette thèse soit le témoignage de toute ma gratitude pour ses précieux conseils et
pour son soutien.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Madame Florence DAGUIN, Docteur, chargée de
recherches à AGROCAMPUS OUEST, Centre d’Angers et co-directrice de ma thèse, pour ses
nombreux conseils judicieux et sa grande disponibilité lors de la réalisation des expériences, de
la confiance qu’elle m’a accordée tout au long de ma thèse. Mon travail a bénéficié de sa rigueur
scientifique et son esprit critique. Nous avons eu ensemble de nombreuses discussions très
enrichantes quant aux choix des stratégies et des protocoles à mettre en œuvre pour répondre au
mieux à la problématique qui m’était posée. Soyez assurée de ma profonde gratitude.
Je veux aussi adresser ma profonde reconnaissance aux membres du jury pour avoir accepté
de consacrer leur temps à l’examen de ce travail :
-
À Madame Zohra FORTAS, Professeur à l’université d’Oran, pour l’intérêt qu’elle a
porté à mon travail et pour avoir accepté de présider ce jury.
-
À Madame Saliha YAKOUB-BOUGDAL, Professeur à l’université de Tizi-Ouzou
pour avoir accepté d’évaluer mon travail et pour m’avoir fait l’honneur d’être membre
du jury.
-
À Messieurs Mohamed BOUAZZA, Professeur à l’université de Tlemcen,
Noureddine TCHOUAR, Maître de Conférences à l’université des sciences et de la
technologie d’Oran et Abdelkader SAADI, Professeur à l’université de Chlef qui
m’ont honoré en acceptant de faire partie du jury de ma thèse ainsi que pour leur
lecture attentive de ce manuscrit.
Mes remerciements s'adressent également à notre Ministère de l’Enseignement Supérieur et
de la Recherche Scientifique et l’Ambassade de France à Alger qui m'ont accordé gracieusement
cette bourse de Recherche.
Il me reste à adresser de chaleureux remerciements aux très nombreuses personnes qui
m’ont aidé avec toujours une extrême gentillesse :
•
INHP-Angers : Anita SANGUINE, Agnès GRAPIN, Eric MORTREAU, Linda VOISINE,
Denis CESBRON, Jacky GRANGER, Valérie LE CLERC, Jérémy CLOTAULT, Vanessa
FRESLON, Sabrina MARQUEZ, Sébastien HUET, Wahiba BOUTEBTOUB, Amani
NAOUAR, Marie THELIER, Mathilde BRIARD, Laurent CRESPEL, Saied DAGHIGHI,
Michel LAFFAIRE, Daniel RELION, Jean-Claude MAUGET, Emmanuel GEOFFRIAU.
•
INRA-Dijon : Sergio OCHATT, Richard, Catherine, Louis JACAS et tous les membres du
laboratoire de physiologie cellulaire, morphogenèse et validation.
Merci pour leur efficacité et leur motivation à réaliser un travail de qualité. Merci pour
leurs qualités humaines, leur bonne humeur et leur soutien tout au long de la thèse.
Je voudrais remercier également toute ma famille : mes parents, mes frères et sœurs, ma
femme et mes enfants qui ont accepté et enduré les longues séparations pendant mes séjours à
l’INHP-Angers.
Enfin, merci à mes collègues de m’avoir toujours soutenu et encouragé pendant les
moments de doute.
Résumé
Le pistachier d’Alep est une espèce fruitière de grande importance économique et
écologique. Il peut valoriser les zones arides et semi-arides méditerranéennes. En Algérie,
malgré l’abondance de terrains propices à sa culture, le pistachier est presque délaissé à cause de
sa rentabilité à long terme et surtout d’une insuffisance de plants de qualité destinés aux
plantations.
L'extension de la culture du pistachier est tributaire de la mise au point de techniques fiables
de multiplication. Le développement de la culture in vitro du pistachier vrai (Pistacia vera L.)
représente un défi non seulement pour l’Algérie mais aussi à l'échelle internationale. Toutefois,
la production industrielle in vitro de plants de cette espèce fruitière à fin commerciale ne pouvait
être envisagée compte tenu des résultats aléatoires obtenus, notamment ceux relatifs à
l’enracinement et à l’acclimatation. Nous avons essayé d’établir un système adéquat de
micropropagation qui permet d’obtenir de plants de qualité.
Les essais portant sur la culture in vitro d’embryons isolés de Pistacia vera L. ont montré
que le milieu de base de Murashige et Skoog (1962) solidifié à 4 g l-1 agar-agar, enrichi de 20 à
40 g l-1 saccharose et de 2 g l-1 charbon actif est le plus favorable à la croissance des vitrosemis.
De plus, une lumière modérée paraît suffire pour la croissance des organes photosynthétiques
durant cette première étape de la culture in vitro des embryons isolés du pistachier. Nos essais
ont montré également qu’au stade juvénile, le pistachier fruitier se comporte comme une plante
tolérante aux stress abiotiques. Outre leur capacité germinative élevée, les embryons isolés ont
montré une grande résistance vis-à-vis du sel et du PEG. Cette espèce réduit rapidement son
expansion foliaire et sa croissance aérienne pour surmonter l’effet du stress salin et hydrique.
Ces études ont permis de repérer rapidement les sujets résistants et de sélectionner précocement
des génotypes tolérants.
Des essais de micropropagation par culture de segments nodaux issus d’arbres adultes et de
jeunes plantules élevées en serre ont été abordés sur un milieu de base de Murashige et Skoog
(1962). Les pertes enregistrées dues aux infections microbiologiques sont variables avec le type
d’explant mis en culture, la période de prélèvement et la technique de désinfection adoptée. Les
explants prélevés en printemps d’arbres adultes désinfectés par le bichlorure de mercure donnent
le meilleur résultat comparativement à ceux provenant d’un matériel végétal dormant. De plus,
les repiquages successifs fréquents ont permis l’élimination des composés phénoliques et
l’amélioration de la réactivité des bourgeons. Toutefois, l’utilisation des plantules juvéniles
préparées et élevées en serre a permis de limiter considérablement les contaminations
microbiologiques et d’obtenir des taux de débourrement des bourgeons élevés comparativement
à ceux enregistrés avec le matériel adulte. La BAP à la concentration de 1 mg l-1 a permis
d’obtenir les meilleurs débourrements et développement des pousses feuillées.
Les expériences visant l’amélioration du taux de multiplication et l’aspect qualitatif des
microplants obtenus a permis de constater que le milieu de Murashige et Skoog (1962)
additionné de méta-topoline (2 mg l-1) donne les meilleurs résultats aussi bien au niveau de la
qualité des pousses qu’au niveau du taux de multiplication.
La réussite de la production industrielle de vitroplants dépend largement du pourcentage
d’enracinement et de la qualité du système racinaire obtenu. Plusieurs essais d’enracinement in
vitro ont été effectués et nous ont permis d’obtenir seulement des taux rhizogènes faibles ne
dépassant pas les 35% en présence de 1 mg l-1 d’ANA qui s’est distingué des autres auxines
testées. Les racines adventives formées in vitro sont en général de mauvaise qualité ce qui a
entraîné des taux de mortalités élevés (40-60%) lors de l’acclimatation.
Utilisé pour la première fois chez le pistachier, l’enracinement ex vitro a amélioré non
seulement le pourcentage de plants enracinés mais aussi la qualité du système racinaire. Les
meilleurs résultats ont été obtenus avec la poudre auxinique commerciale (Rhizopon® 2% AIB).
Nos essais ont montré également que l’enracinement ex vitro chez le pistachier n’est pas
influencé par le milieu de prolifération de pousses feuillées. Cependant, les microplantules issues
de la méta-topoline donnent le maximum d’enracinement (82,5%) comparativement à celles
provenant de la BAP (75%). Les taux de reprise ont été élevés (81,5%) lors de passage des
microplants en serre.
L’identification du sexe chez le pistachier fruitier est abordée ici par la caractérisation de
marqueurs moléculaires ADN. L’utilisation des amorces PVF1 et PVF2 a permis d’obtenir une
bande située à environ 300 pb chez les plantes femelles. Cette bande est absente chez les sujets
mâles.
Nous avons finalement montré qu’une conservation plus prolongée de graines a un effet plus
marqué sur la viabilité des axes embryonnaires de P. vera L. La germination in vitro est passée
de 100% avec les embryons isolés de graines fraîchement récoltées à 87,3 et 30,9% avec ceux
provenant de graines conservées respectivement entre 12-18 mois et plus de 24 mois. La
cryoconservation des axes embryonnaires est la méthode de choix pour assurer la préservation à
long terme des espèces à graines récalcitrantes. Les essais effectués dans ce sens ont montré une
interaction entre la teneur en eau, la congélation à -196 °C et la survie des embryons isolés. En
effet, l’optimal de la cryoconservation (100%) avec un développement normal de plantules a été
enregistré avec les axes embryonnaires déshydratés à une teneur en eau d’environ 0,1 g g-1.
Cependant, une quantité d’eau supérieure ou égale à 0,2 g g-1 a affecté, après congélation, la
croissance de l’appareil végétatif ainsi que l’aspect qualitatif des vitroplants régénérés.
Mots clés : Algérie, Pistacia vera L., vergers, micropropagation, embryons isolés,
bourgeonnement axillaire, enracinement in vitro et ex vitro, acclimatation, marqueurs
moléculaires, cryoconservation.
Abstract
The pistachio tree is a fruit-bearing species of great economic and ecological importance. It
can contribute to develop the arid and semi-arid regions Mediterranean. In Algeria, despite the
abundance of areas suitable for its culture, the pistachio tree is almost forsaken because of its
profitability in the long term and especially also due to an insufficiency of valuable plant
material needed to settle the plantations.
The extension of the pistachio tree culture is dependent on the development of reliable
techniques of multiplication. The development of the in vitro culture of Pistacia vera L.
constitute a challenge, not only for Algeria but also on an international scale. However, the
industrial production in vitro of vitroplants of this fruit-bearing species at commercial purpose
could not be considered taking into account the random results obtained, in particular those
relating to the rooting and the acclimatization. We tried to establish an adequate system of
micropropagation making possible to obtain plantlets of quality.
Our experiments related to the in vitro culture of embryos isolated from Pistacia vera L.
showed that the basic medium of Murashige and Skoog (1962) solidified to 4 g l -1 agar-agar,
enriched with 20 to 40 g l -1 sucrose and 2 g l -1 activated charcoal is most favourable to the
growth of the seedlings. Moreover, moderate light does not appear to be enough for the growth
to the photosynthetic bodies during this first stage to the in vitro culture to the embryos isolated
from the pistachio tree. Our tests also showed that at the youthful stage, the fruit-bearing
pistachio tree behaves like a tolerant plant with the abiotic stresses. In addition to their raised
germinative capacity, the embryos showed a great resistance with respect to salt and PEG. This
species quickly reduces its foliar expansion and its air growth to overcome the effect of the
saline and hydrous stress. These studies allowed to quickly detect the resistant genotypes and
select tolerant genotypes precociously.
Tests of micropropagation by culture of nodal segments resulting from adult trees and young
seedlings raised in greenhouse were approached on a basic medium of Murashige and Skoog
(1962). The recorded losses due to the microbiological infections are variable with the type of
explants put in culture, the period of taking away and disinfection method adopted. The explants
taken in adult springs of trees treated by mercuric chloride gave the best results as compared to
those coming from a dormant plant material. Moreover, frequent successive subcultures allowed
the elimination of the phenolic compounds leakage and the improvement of the buds response.
However, the use of the prepared and raised youthful seedlings tightens some made it possible to
limit the microbiological contaminations considerably and improved the stem growth to obtain
rates of buds higher than those recorded with the adult material. The BAP with the concentration
of 1 mg l-1 made it possible to obtain the best the shoot growth.
Further experiments aiming to improve the rate of multiplication and the qualitative aspect
of the microplants made allowed to notice that the Murashige and Skoog medium (1962)
supplemented with meta - topoline (2 mg l -1) gave the best results as regards to the growth
quality and the level of rate multiplication.
The success of the industrial production of vitroplants depends largely on the percentage of
rooting and the quality of the rooting. Several tests of in vitro rooting were carried out and
allowed us to obtain only rates weak rhizogenesis, not exceeding the 35% using 1 mg l- 1 ANA,
which was more efficient than the other auxins tested. The adventitious roots formed in vitro
proved to be generally of poor quality, which led to high death rates (40-60%) during subsequent
acclimatization.
Used for the first time with the pistachio tree, ex vitro rooting improved not only the
percentage of rooted plantlets but also the quality of the root system. The best results were
obtained with the commercial auxinic powder (2% AIB Rhizopon®). Our tests also showed that
the rooting ex vitro of the pistachio vitroplants was not influenced by the culture medium used of
shoots proliferation. However, microplantlets obtained on the meta-topoline containing medium
led to the maximum of rooting (82.5%) as compared to those issued from the BAP (75%)
containing medium. The rates of survival were high (81.5%) by the end of acclimatization in
greenhouse.
The identification of sex for the fruit-bearing pistachio tree is approached here by the
characterization through molecular markers DNA using SCAR method and different primers.
First attempts made it possible to obtain as PCR product a fragment of approximately 300 pb
present for the female plants samples. This band was absent for the male subjects.
We finally showed that more prolonged seed conservation has an effect more marked on the
viability of the embryonic axes of P. vera L. in vitro germination decreased from 100% for the
embryos isolated from seeds freshly collected to 87.3 and 30.9% for those issued from seeds
preserved respectively between 12-18 month and more than 24 months. The cryoconservation
of the embryonic axes is the method of choice to ensure the long-term safeguarding of the
species recalcitrant seeds. The tests carried out in this direction showed an interaction between
the water content, freezing at -196 °C and then, the survival of the embryos. Indeed, the optimal
achievement of cryoconservation (100% survival) with a normal development of seedlings was
recorded for the embryonic axes dehydrated with a water content of approximately 0.1 g.g-1
However, a quantity of higher water or equalizes to 0.2 g.g -1 affected, the growth of the
vegetative parts as well as the qualitative aspect of the regenerated vitroplants.
Key words: Algeria, Pistacia vera L, orchards, micropropagation, isolated zygotic embryo,
axillary budding, in vitro and ex vitro rooting, molecular markers, acclimatization,
cryopreservation.
Abréviations
ABA
AcJas
ADN
AgNO3
AIA
AIB
ANA
BAP
BEt
BSAA
°C
CaCl2
cm
CTAB
DMSO
DKW
EDTA
g
g.g-1
GA3 ou AG3
h
h/j.
ha
HgCl2
j
KIN
KN
l
mg
m
ml
µl
mM
MS
MS0
mT
NaClO
P.
pb
PBZ
PCR
PEG
pH
PPM®
PVP
rpm
Aacide abscissique
Acide jasmonique
Acide désoxyribonucléique
Nitrates d’argent
Acide indole acétique
Acide indole butyrique
Acide naphtalène acétique
6-benzylaminopurine
Bromure d’éthidium
Acide 3-benzo[b]selenyl acétique
Degré Celsius
bichlorure de calcium
Centimètre
Cétyl triméthyl ammonium bromide
Diméhyle sulfoxyde
Milieu de Driver et Kuniyuki (1984)
Acide éthylène diamine tetraacétique
Gramme
Gramme d’eau par gramme de matière sèche
Acide gibbérellique
Heure
Heure par jour
Hectare
bichlorure de mercure
Jour
6-furful-aminopurine (Kinétine)
Milieu de Knop (1884)
Litre
Milligramme
Mètre
Millilitre
Microlitre
Millimole
Milieu de Murashige et Skoog (1962)
Milieu de Murashige et Skoog sans régulateurs de croissance
méta-Topoline
Hypochlorite de sodium
Pistacia
Paire(s) de bases
Paclobutrazol
Polymerase chaine reaction
Polyéthylène glycol
Potentiel hydrogène
Plant Preservative Mixture (Biocide)
Polyvinylpyrrolindone
Tours par minute (rounds per minute)
SCAR
Taq
TBE
TDZ
TE
Tris
µM
UV
Vit.B5
v/v
WPM
WT
w/v
Z
2iP
2,4D
%
Sequence characterized amplified region (caractérisation de produit
d’amplification)
Thermus aquaticus polymerase
Tampon Tris Borate EDTA
Thidiazuron
Teneur en eau
Tris (hydroxyméthyl) aminométhane
Micromole
Lumière ultraviolette
Vitamines de Gamborg et al., (1968)
Volume par unité de volume
Woody plant medium
Milieu de White (1936)
Poids par unité de volume
Zéatine
6(2-isopentenylaminopurine)
Acide 2,4 dichlorophénoxyacétique
Pourcent
Liste des tableaux
page
Tableau 1.
Position systématique du pistachier (Pistacia vera L.) ……………………………..
4
Tableau 2.
Evolution de la production de pistaches par pays en tonne …………………………..
6
Tableau 3.
Evolution de la surface cultivée par pays de pistachier en hectare …………………..
7
Tableau 4.
Caractéristiques de principales variétés de pistachier (Pistacia vera L.) …………….
16
Tableau 5.
Récapitulatif de quelques travaux de recherches en culture in vitro du pistachier
(Pistacia vera L.) utilisant la micropropagation ……………………………………..
22
Principales recherches réalisées sur l’organogenèse directe et l'embryogenèse
somatique du pistachier (Pistacia vera L.) …………………………………………..
24
Tableau 7.
Composition des milieux de culture testés (en mg/l) …………………………………
30
Tableau 8.
Solvants, conditions de stockage et modes de stérilisations des principaux
régulateurs de croissances testés………………………………………………………
30
. Effet du milieu de culture et sa concentration en agar-agar sur la longueur moyenne
de la partie aérienne et racinaire ainsi que le nombre de feuilles néoformées par
embryon développé après 30 jours de culture…………………………………………
37
Effet de la concentration en saccharose sur la longueur moyenne de la partie
aérienne et racinaire ainsi que le nombre de feuilles néoformées par embryon
développé après 30 jours de culture sur le milieu de base de MS0 (sans hormone),
solidifié à 4 g l-1 agar-agar ……………………………………………………………
38
Effet de l’agent désinfectant et de l’intensité lumineuse sur le taux de contamination
et de développement in vitro des embryons isolés de Pistacia vera L. après 30 jours
de culture sur le milieu de base MS0………………………………………………….
42
Pourcentage d’amélioration de la croissance aérienne et racinaire des vitrosemis de
Pistacia vera L. cultivés sur différentes concentrations de charbon actif (CA)………
45
Effet de la concentration en NaCl sur les paramètres de croissance, le nombre moyen
de feuilles par vitrosemis et le rapport MS racines/MS organes aériens……………..
50
Pourcentages de germination in vitro, de survie et d’hyperhydrie de pistachier (P.
vera L.) en fonction de la concentration de polyéthylène glycol (PEG 6000)………..
56
Effet de la concentration en polyéthylène glycol (PEG 6000) sur les paramètres de
croissance, le nombre moyen de feuilles par vitrosemis et le rapport MS racines/MS
organes aériens……………………………………………………………………….
57
Pourcentages de réduction (par rapport aux témoins) en longueur de la partie
aérienne et racinaire ainsi que le nombre moyen de feuilles des vitrosemis soumis à
différentes concentrations de PEG (6000) après un mois de culture.. ………………..
57
Les pertes par les infections microbiologiques observées selon le type d’explants mis
en culture, la période de prélèvement et la technique de désinfection appliquée…….
63
Effet de l’agent désinfectant sur les taux de contamination, de débourrement des
bourgeons et leur transformation en rosettes feuillées après 30 jours de culture…….
66
Tableau 6.
Tableau 9.
Tableau 10.
Tableau 11.
Tableau 12.
Tableau 13.
Tableau 14.
Tableau 15.
Tableau 16.
Tableau 17.
Tableau 18.
Effet de 4 cytokinines de différentes concentrations sur le débourrement des
bourgeons et leur développement in vitro en pousses feuillées (longueur moyenne et
nombre moyen de feuilles) après 30 jours de culture sur le milieu de base de MS….
67
Effet de 1 mg l-1 de BAP associée ou non au charbon actif (CA) à 0,2 % et 1 mg l-1
de GA3 sur le débourrement des bourgeons et leur développement en pousses
feuillées après 30 jours de culture sur le milieu de base de MS……………………..
68
Effet de différentes concentrations de trois cytokinines (BAP, KIN, mT) sur la
production de pousses feuillées à partir de segments nodaux après 30 jours de
culture ………………………………………………………………………………...
76
Evaluation du potentiel morphogénétique des pousses feuillées obtenues sur BAP et
mT (2 et 4 mg l-1) après deux passages successifs sur le même milieu ………………
76
Effet de différents traitements rhizogènes sur l’induction et l’allongement des
racines de vitroplants de Pistacia vera L. après 30 jours de transfert sur le milieu
d’expression racinaire (MS/2)…………………………………………………………
83
Effet de l’acide jasmonique (AcJas) et de paclobutrazol (PBZ) sur la formation des
racines et de cals chez Pistacia vera L. après 30 jours de culture sur le milieu
d’expression racinaire (Knop)..……………………………………………………….
84
Effets comparés de l’AIB et de l’ANA sur l’enracinement des microboutures ;
induction de 1 h en solution aqueuse………………………………………………….
84
Effet de la poudre auxinique sur l’enracinement ex vitro des microplants de Pistacia
vera L. après 6 semaines de culture…………………………………………………...
88
Effet du milieu de multiplication sur l’enracinement ex vitro des microboutures de
Pistacia vera L. traitées par Rhizopon® 2% AIB……………………………………..
88
Tableau 28.
Composition du mix réactionnel utilisé pour l’amplification d’ADN de P. vera L…..
96
Tableau 29.
Amorces SCAR utilisées pour identifier le sexe chez le pistachier (Pistacia vera L.)..
96
Tableau 30.
Viabilité et germination in vitro d’embryons isolés de P. vera L. après
déshydratation et cryoconservation …………………………………………………..
105
Tableau 19.
Tableau 20.
Tableau 21.
Tableau 22.
Tableau 23.
Tableau 24.
Tableau 25.
Tableau 26.
Tableau 27.
Liste des Figures
page
Figure 1.
Aire actuelle de distribution du pistachier ………………………………………………...
5
Figure 2.
Pistachier fruitier (Pistacia vera L.) ………………………………………………………
8
Figure 3.
Fruits de Pistacia vera L…………………………………………………………..............
9
Figure 4.
Quelques insectes ravageurs du pistachier vrai (Pistacia vera L.) et leurs dégâts.............
12
Figure 5.
Plantation mixte de pistachier …………………………………………………………….
13
Figure 6.
Dispositif de répartition des arbres mâles dans un verger de pistachier …………………..
14
Figure 7.
Zones potentielles du pistachier fruitier en Algérie ………………………………………
17
Figure 8.
Distinction entre deux variétés syriennes de Pistacia vera L. introduites en Algérie ……
17
Figure 9.
Greffe en écusson …………………………………………………………………………
19
Figure 10.
Jeunes plants de pistachier greffés avec succès dans la région de Sidi el Djilali…………
19
Figure 11.
Matériel végétal utilisé…………………………………………………………………….
35
Figure 12.
Effet du milieu de culture et sa concentration en agar-agar sur le pourcentage de
germination in vitro des embryons isolés après 30 jours de culture……………………….
36
Effet du milieu de culture et sa concentration en agar-agar ainsi que la dose en
saccharose sur le poids frais de la partie aérienne et racinaire des vitrosemis ……………
38
Développement in vitro d’embryons isolés de Pistacia vera L après 30 jours de culture
sur les milieux nutritifs solidifiés à 4 g l-1 d’agar-agar ....…………………………………
39
Effet de la concentration en saccharose sur le développement in vitro des embryons
isolés de Pistacia vera L après 30 jours de culture ………………... …………………….
39
Figure 16.
Influence de l’agent désinfectant sur l’aspect qualitatif des graines………………………
43
Figure 17.
Effet de l’agent désinfectant et de l’intensité lumineuse sur les différents paramètres de
croissance de vitrosemis de Pistacia vera L. …………………………………………….
43
Figure 18.
Variation de la taille de vitrosemis élevés sous deux intensités lumineuses ……………..
44
Figure 19.
Effet du charbon actif sur les différents paramètres de croissance de vitrosemis de
Pistacia vera L. après 30 jours de culture sur le milieu de base MS0. ……………………
46
Morphologies comparées de vitrosemis âgés de 30 jours obtenus après culture sur MS0
contenant différentes concentrations de charbon actif ……………………………………
47
Pourcentages de germination in vitro et de survie des embryons isolés de Pistacia vera
L. en fonction de la concentration en sel. ……………………………………...................
49
Variation de la croissance des vitrosemis de Pistacia vera L. sous l’effet de différentes
concentrations salines ……………………………………………………………………..
51
Effet de la concentration en NaCl sur la biomasse aérienne des vitrosemis de Pistacia
vera L. après un mois de culture sur MS0………………………………............................
52
Figure 13.
Figure 14.
Figure 15.
Figure 20.
Figure 21.
Figure 22.
Figure 23.
Effet de la concentration en NaCl sur la biomasse du système racinaire des vitrosemis de
Pistacia vera L. après un mois de culture sur MS0………………… ……………………
52
Effet de la contrainte hydrique simulée par le PEG 6000 sur la croissance des vitrosemis
de pistachier (P. vera L.)……………………………………………….............................
58
Figure 26.
Effet de la concentration en PEG sur la biomasse aérienne des vitrosemis ........................
59
Figure 27.
Effet de la concentration en PEG sur la biomasse des racines des vitrosemis ………….
59
Figure 28.
Établissement des cultures in vitro à partir des segments nodaux d’arbres adultes ..……..
65
Figure 29.
Taux d’oxydation des milieux nutritifs après 7 et 30 jours de culture…………………….
64
Figure 30.
Initiation de la micropropagation du pistachier (Pistacia vera L.) par culture in vitro de
segments nodaux provenant de jeunes plantules élevées en serre………............................
68
Effet de la benzylaminopurine (BAP) seule ou combinée à 0,1 mg l-1 AIB et/ou 1 mg l-1
GA3 sur la prolifération des bourgeons et la production de pousses feuillées du
pistachier (P. vera L.) après 4 semaines de culture sur le milieu MS …………………….
74
Figure 32.
Prolifération in vitro des pousses axillaires sur le milieu de base de MS ………………..
75
Figure 33.
Prolifération in vitro des pousses axillaires de Pistacia vera L. après 30 jours de culture
sur le milieu de base de Murashige et Skoog (1962)……………………………………..
77
Effet du traitement auxinique sur la formation de racines adventives après 30 jours de
culture sur les milieux d’expression racinaire……………………………………………
85
Figure 35.
Enracinement ex vitro et acclimatation des microplants de Pistacia vera L………………
89
Figure 36.
Vitrosemis obtenus après 30 jours de culture sur MS0 enrichi de 0,2% charbon actif……
93
Figure 37.
Photos représentatives du nombre chromosomique (2n = 30) chez Pistacia vera L……...
95
Figure 38.
Révélation de l’ADN de Pistacia vera L. extrait par la technique Doyle et Doyle
(1990)……………………………………………………………………………………..
97
Profil SCAR sur gel d’agarose 1,5% obtenu après amplification d’ADN de jeunes semis
et de vitroplants de pistachier fruitier avec les amorces SCO-08For et SCO-08Rev……..
98
Profil SCAR sur gel d’agarose 1,5% obtenu par amplification d’ADN de jeunes semis et
de vitroplants du pistachier fruitier avec les amorces PVF1 et PVF2…………………….
98
Figure 41.
Trichomes de Pistacia vera L. après 18 h de digestion dans la solution enzymatique. …..
100
Figure 42.
Cryoconservation d’embryons isolés de Pistacia vera L………………………………….
106
Figure 43.
Effet de la conservation des graines sur la germination in vitro d’embryons isolés ...........
104
Figure 44.
Effet de la déshydratation et de la congélation dans l’azote liquide des axes
embryonnaires de Pistacia vera L. sur la croissance de la partie aérienne et des racines
ainsi que le nombre moyen de feuilles et de nœuds par vitrosemis....…………………….
107
Effet de la déshydratation et de la congélation dans l’azote liquide des axes
embryonnaires de Pistacia vera L. sur la production des biomasses aérienne et racinaire
des vitrosemis ……………………………………………………………………………..
108
Schéma du procédé de cryoconservation des axes embryonnaires de pistachier fruitier
(Pistacia vera L.) ……………………………………………………………………….....
109
Figure 24.
Figure 25.
Figure 31.
Figure 34.
Figure 39.
Figure 40.
Figure 45.
Figure 46.
TABLE DES MATIERES
DEDICACES _____________________________________________________________
REMERCIEMENTS ________________________________________________________
RESUME ________________________________________________________________
ABSTRACT ______________________________________________________________
RESUME (en arabe) ______________________________________________________
LISTE DES ABREVIATIONS __________________________________________________
LISTE DES TABLEAUX _____________________________________________________
LISTE DES FIGURES _______________________________________________________
TABLE DES MATIERES _____________________________________________________
i
ii
iv
vi
viii
x
xii
xiv
xvi
________________________________________________
1
CHAPITRE I- REVUE BIBLIOGRAPHIQUE ET PRESENTATION DES OBJECTIFS __________
3
1− GENERALITES SUR LE PISTACHIER _________________________________________
1.1− Position Taxonomique _____________________________________________
1.2− Origine et répartition géographique __________________________________
1.3− Importance de la culture ___________________________________________
1.4− Caractéristiques du pistachier fruitier _________________________________
1.4.1- Caractéristiques botaniques __________________________________
1.4.2- Caractéristiques biologiques __________________________________
1.5− Exigences pédoclimatiques du pistachier ______________________________
1.5.1- Exigences climatiques ______________________________________
1.5.2- Exigences édaphiques ______________________________________
1.6– Maladies et ravageurs du pistachier fruitier _____________________________
1.6.1- Maladies fongiques _________________________________________
1.6.2- Insectes ravageurs __________________________________________
1.7– Techniques de culture du pistachier __________________________________
1.8− Principales variétés du pistachier cultivé ______________________________
2– MODES DE PROPAGATION DE PISTACIA VERA L. _______________________________
2.1− Multiplication sexuée _____________________________________________
2.2− Multiplication végétative __________________________________________
3- CULTURE IN VITRO DU PISTACHIER _________________________________________
3.1- Modalités de propagation in vitro ____________________________________
3.1.1- Micropropagation __________________________________________
3.1.2- Organogenèse directe et embryogenèse somatique ________________
3.2- Problèmes posés par la culture in vitro du pistachier fruitier ________________
4- PRESENTATION DES OBJECTIFS DE LA THESE __________________________________
4
4
4
5
8
8
9
10
10
10
10
10
11
13
14
18
18
18
20
20
20
23
25
25
CHAPITRE II- MATERIELS ET METHODES
____________________________________
27
1- MATERIEL VEGETAL ____________________________________________________
1.1− Provenance du matériel biologique ___________________________________
1.2- Types d’explants utilisés ___________________________________________
28
28
28
INTRODUCTION GENERALE
2- DESINFECTION DU MATERIEL VEGETAL ______________________________________
2.1- Technique à base de bichlorure de mercure _____________________________
2.2- Technique à base d’hypochlorite de sodium _____________________________
3- MILIEUX DE CULTURE UTILISES ___________________________________________
3.1- Composition des milieux testés _______________________________________
3.2- Régulateurs de croissance étudiés _____________________________________
3.3- Autres additifs ____________________________________________________
3.4- pH des milieux nutritifs et les récipients de culture utilisés _________________
3.5- Stérilisation des milieux de culture ____________________________________
4- CONDITIONS DE CULTURE ________________________________________________
5- ACCLIMATATION DES VITROPLANTS _______________________________________
5.1- Vitroplants enracinés in vitro _______________________________________
5.2- Enracinement ex-vitro _____________________________________________
6- ETUDE CHROMOSOMIQUE ET MOLECULAIRE __________________________________
6.1- Dénombrement chromosomique _____________________________________
6.2- Étude moléculaire _________________________________________________
7- CRYOCONSERVATION DES AXES EMBRYONNAIRES _____________________________
8- ANALYSES STATISTIQUES _______________________________________________
28
28
28
29
29
29
31
31
31
31
32
32
32
32
32
32
33
33
CHAPITRE III - CULTURE IN VITRO D’EMBRYONS ISOLES DE PISTACIA VERA L. _______
34
1- INTRODUCTION ________________________________________________________
2- TECHNIQUE DE PRELEVEMENT ET MISE EN CULTURE DES AXES EMBRYONNAIRES _____
3- EFFET DU MILIEU DE CULTURE, DE LA CONCENTRATION EN AGAR-AGAR ET DE LA DOSE
EN SACCHAROSE _________________________________________________________
3.1- Milieux et conditions de culture ______________________________________
3.2- Paramètres d’appréciation ___________________________________________
3.3- Résultats ________________________________________________________
3.3.1- Germination in vitro des embryons isolés _______________________
3.3.2- Croissance et développement des vitrosemis _____________________
3.3.2.1- Effet du milieu de culture et de sa concentration en agar-agar __
3.3.2.2- Effet de la concentration en saccharose ___________________
3.4- Discussion et conclusion ____________________________________________
4- EFFET DE L’AGENT DESINFECTANT ET DE L’INTENSITE LUMINEUSE ________________
4.1- Introduction _____________________________________________________
4.2- Techniques de désinfection _________________________________________
4.3- Milieu nutritif et conditions de culture _________________________________
4.4- Résultats ________________________________________________________
4.4.1- Effet sur le développement in vitro des embryons _________________
4.4.2- Effet sur la croissance des vitrosemis ___________________________
4.5- Discussion et conclusion ___________________________________________
5- EFFET DU CHARBON ACTIF SUR LA CROISSANCE DES VITROSEMIS__________________
5.1- Introduction _____________________________________________________
5.2- Technique expérimentale ___________________________________________
5.3- Résultats ________________________________________________________
5.4- Discussion et conclusion ___________________________________________
6- EFFET D’UNE CONTRAINTE SALINE SUR LE COMPORTEMENT DES EMBRYONS ISOLES ___
6.1- Introduction _____________________________________________________
35
35
36
36
36
36
36
37
37
37
40
41
41
41
41
42
42
42
44
45
45
45
45
46
48
48
6.2- Milieux nutritifs et conditions de culture ______________________________
6.3- Évaluation de la tolérance au stress salin in vitro ________________________
6.4- Résultats ________________________________________________________
6.4.1- Effet de NaCl sur la germination in vitro et la survie des embryons ____
6.4.2. Effet de NaCl sur la croissance des vitrosemis _____________________
6.5- Discussion ______________________________________________________
6.6- Conclusion ______________________________________________________
ETUDE DE LA TOLERANCE AU STRESS HYDRIQUE DE PISTACHIER (PISTACIA VERA L.) :
EFFET SUR LE DEVELOPPEMENT IN VITRO DES EMBRYONS ISOLES ET LA CROISSANCE DES
VITROSEMIS ____________________________________________________________
48
49
49
49
50
52
54
7-
7.1- Introduction _____________________________________________________
7.2- Matériel et Méthodes ______________________________________________
7.3- Résultats ________________________________________________________
7.3.1. Effet de la concentration en PEG sur la germination in vitro et la survie
des embryons ___________________________________________________________
7.3.2. Effet de la concentration en PEG sur les paramètres de croissance _____
7.4- Discussion ______________________________________________________
7.5- Conclusion ______________________________________________________
55
55
55
56
56
56
60
60
CHAPITRE IV - CULTURE IN VITRO DES SEGMENTS NODAUX _____________________
61
1- INTRODUCTION ________________________________________________________
2- MATERIEL ET METHODES ________________________________________________
2.1 Matériel végétal utilisé et méthodes de désinfection ______________________
2.2- Optimisation des conditions de culture ________________________________
3- RESULTATS __________________________________________________________
3.1- Effet de la technique de désinfection __________________________________
3.2- Réactivité des explants primaires _____________________________________
3.2.1- Explants nodaux provenant d’arbres adultes _______________________
3.2.2- Explants nodaux provenant de jeunes plantules ____________________
4- DISCUSSION ET CONCLUSION _____________________________________________
4.1- Désinfection _____________________________________________________
4.2- Réactivité du matériel végétal du départ _______________________________
62
62
62
62
63
63
64
64
66
69
69
69
CHAPITRE V - PROLIFERATION IN VITRO DE POUSSES FEUILLEES __________________
72
1- INTRODUCTION ________________________________________________________
2- MATERIEL VEGETAL UTILISE ______________________________________________
3- MILIEUX DE CULTURE TESTES _____________________________________________
4- FACTEURS ETUDIES ____________________________________________________
5- RESULTATS __________________________________________________________
5.1- Effet de la BAP combinée ou non à l’AIB et/ou à la GA3 __________________
5.2- Effet des cytokinines ______________________________________________
5.3- Effet d’une seconde subculture ______________________________________
6- DISCUSSION ET CONCLUSION _____________________________________________
6.1- Effet combiné de BAP/AIB/GA3 ____________________________________
6.2- Effet de la nature et la concentration en cytokinine _______________________
73
73
73
73
74
74
75
76
78
78
78
6.3- Conclusion ______________________________________________________
79
Chapitre VI - Rhizogenèse et Acclimatation des Vitroplants ___________________
1- INTRODUCTION ________________________________________________________
2- ETUDE DE L’ENRACINEMENT IN VITRO _______________________________________
2.1- Matériel et Méthodes ______________________________________________
2.1.1- Matériel végétal _____________________________________________
2.1.2- Milieu de rhizogenèse _______________________________________
2.1.3- Induction racinaire prolongée __________________________________
2.1.4- Induction racinaire rapide _____________________________________
2.1.5- Paramètres étudiés ___________________________________________
2.2- Résultats ________________________________________________________
2.2.1- Induction rhizogène prolongée _________________________________
2.2.2- Induction rhizogène rapide ____________________________________
2.3- Discussion ______________________________________________________
3- ETUDE DE L’ENRACINEMENT EX VITRO ______________________________________
3.1- Matériel végétal et technique expérimentale ____________________________
3.2- Facteurs étudiés et critères d’évaluation _______________________________
3.3- Résultats ________________________________________________________
3.3.1- Effet de la poudre auxinique ___________________________________
3.3.2- Effet du milieu de multiplication ________________________________
3.4- Discussion ______________________________________________________
4- ACCLIMATATION DES VITROPLANTS ________________________________________
5- CONCLUSION _________________________________________________________
80
81
81
81
81
81
82
82
82
83
83
84
86
87
87
87
87
87
88
90
90
91
CHAPITRE VII- ÉTUDE DE L’IDENTIFICATION DU SEXE CHEZ LE PISTACHIER (PISTACIA
VERA L.) PAR L’UTILISATION DE DIFFERENTES APPROCHES ______________________
92
1- INTRODUCTION ________________________________________________________
2- ETUDE CHROMOSOMIQUE ________________________________________________
2.1- Matériel et Méthodes ______________________________________________
2.1.1- Matériel végétal utilisé ________________________________________
2.1.2- Préparation des racines ________________________________________
2.1.3- Traitement des racines ________________________________________
2.1.4- Préparation d’étalements des chromosomes ________________________
2.2- Résultats obtenus _________________________________________________
3- ETUDE MOLECULAIRE ___________________________________________________
3.1- Matériel végétal __________________________________________________
3.2- Extraction de l’ADN génomique _____________________________________
3.3- Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction, PCR) ____
3.4- Électrophorèse sur gel d’agarose _____________________________________
3.5- Résultats et discussion _____________________________________________
3.5.1- Vérification et évaluation de la qualité d’ADN extrait ________________
3.5.2- Analyse des profils SCAR ______________________________________
4- UTILISATION DES TRICHOMES POUR IDENTIFIER LE SEXE CHEZ LE PISTACHIER VRAI ____
4.1- Matériel végétal et méthode expérimentale _____________________________
4.2- Résultats ________________________________________________________
93
93
93
93
94
94
94
94
95
95
95
96
96
97
97
97
99
99
99
4.3- Conclusion ______________________________________________________
100
CHAPITRE VIII – CRYOCONSERVATION D’EMBRYONS ISOLES DE PISTACIA VERA L. ___
101
1- INTRODUCTION ________________________________________________________
2- MATERIEL ET METHODES _________________________________________________
2.1- Matériel végétal __________________________________________________
2.2- Techniques de cryoconservation _____________________________________
2.3- Milieux nutritifs et conditions de culture _______________________________
3- RESULTATS ET DISCUSSION _______________________________________________
3.1- Effet de la conservation des graines sur la viabilité des embryons isolés ______
3.2- Cryoconservation d’embryons isolés __________________________________
3.2.1- Effet sur la survie et la germination in vitro ________________________
3.2.2- Effet sur la croissance des vitrosemis _____________________________
4- CONCLUSION _________________________________________________________
102
102
102
103
103
103
103
104
104
107
108
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES ___________________________________
1- CULTURE IN VITRO D’EMBRYONS ISOLES _____________________________________
2- CULTURE IN VITRO DES SEGMENTS NODAUX __________________________________
3- PROLIFERATION IN VITRO DES POUSSES FEUILLEES _____________________________
4- RHIZOGENESE ET ACCLIMATATION DES VITROPLANTS __________________________
5- IDENTIFICATION DU SEXE CHEZ LE PISTACHIER FRUITIER ________________________
6- CRYOCONSERVATION D’EMBRYONS ISOLES DE PISTACIA VERA L. __________________
Perspectives ____________________________________________________________
110
111
111
112
112
112
112
113
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES __________________________________________
114
ANNEXES ______________________________________________________________
PUBLICATIONS __________________________________________________________
130
136
Introduction Générale
INTRODUCTION GENERALE
Le pistachier vrai est une espèce fruitière appartenant à la famille des Anacardiacées. Il est
cultivé dans les régions arides et semi-arides d’Asie (Moyen-Orient) et d’Afrique (Maghreb)
mais aussi en Australie, dans quelques pays d’Amérique (Etats-Unis et Mexique), et dans les
régions d’Europe méditerranéenne.
Grâce à ses fruits et sa haute valeur fourragère, Pistacia vera L. constitue une source de
revenu vital pour les riverains. Cependant, la culture de cette espèce et son extension se heurtent
à des obstacles de plusieurs ordres. Le vieillissement des vergers, les maladies parasitaires ainsi
que les insectes ravageurs sont les principaux facteurs influençant la productivité et la résilience
de l’espèce.
Le pistachier est très peu répandu en Algérie, malgré les conditions pédoclimatiques
favorables et les intéressants aspects agronomiques et commerciaux que présente cette culture.
On le trouve principalement à l’ouest dans la région de Tlemcen, Saida, sidi Bel Abbés et à l’est
dans la région de Batna, Khenchela, Sétif et Tébessa. Le développement de la culture du
pistachier nécessite la sélection et la diffusion de cultivars performants. La mise au point d’une
stratégie efficace de multiplication de génotypes élites s’avère nécessaire pour améliorer la
productivité des vergers. La propagation du pistachier se fait exclusivement par les techniques
traditionnelles, notamment le bouturage et le greffage. Cependant, ces méthodes classiques se
heurtent le plus souvent à des obstacles physiologiques dus principalement aux secrétions de
résines et de composés polyphénoliques. En outre, l’entrée en production du pistachier fruitier
est extrêmement tardive et n’a lieu que vers la huitième année de la plantation. Ce facteur
décourage beaucoup d’agriculteurs à investir dans la culture de cette espèce.
Pour faire face à ces différentes contraintes d’ordre cultural et sanitaire, la mise au point
d’une technique moderne de production de plants de quantité et qualité s’avère une nécessité
inéluctable pour le développement et l’extension de la culture du pistachier. Les stratégies de sa
propagation se sont donc orientées vers les techniques de culture in vitro.
Depuis le début des années 80, de nombreux travaux ont été effectués pour essayer de
maîtriser la multiplication in vitro du pistachier (Barghachi, 1982 ; Colinas et al., 1982;
Barghachi et Alderson, 1983 et 1985 ; Zaheer et al, 1989 ; Abousalim et al, 1991). Malgré les
progrès réalisés en matière de sa micropropagation (Barghchi et Alderson, 1989), bien que
modestes comparativement à d’autres essences fruitières, la production industrielle in vitro de
plants de pistachier à des fins commerciales ne pouvait être envisagée compte tenu des résultats
aléatoires obtenus au cours des différentes phases de la production. La culture in vitro se heurte à
plusieurs problèmes liés principalement à l’établissement des cultures aseptiques et réactives :
contaminations microbiologiques, oxydation des tissus végétaux, nécrose de bourgeons
(Abousalim et Mantell, 1994) et surtout à la rhizogenèse et à l'acclimatation des microplants
(Gonzalès-Garcia, 1990 ; Abousalim et Mantell, 1994 ; Chatibi et al., 1995 ; Chatibi, 1999) : les
faibles taux d’enracinement in vitro ainsi que l’aspect qualitatif des racines adventives produites
souvent non fonctionnelles rendent difficile l’acclimatation et la reprise des microplants lors du
passage en serre.
Compte tenu des problèmes et difficultés sus évoquées, nous avons abordé ce travail avec
pour objectif principal l’établissement d’un protocole de micropropagation approprié pour une
production industrielle de plants de qualité.
Cette thèse est constituée de huit chapitres. En premier lieu, une revue bibliographique de la
culture du pistachier fruitier est présentée et se termine par des hypothèses et des objectifs de
recherche. Le second chapitre est consacré à la présentation du matériel biologique utilisé et les
techniques expérimentales adoptées. Le chapitre suivant traite la culture in vitro d’embryons
isolés de Pistacia vera L. et leur comportement vis-à-vis des stress abiotiques (salin et hydrique).
Le quatrième chapitre étudie la culture in vitro des segments nodaux provenant d’arbres adultes
et de jeunes plantules élevées en serre. Le cinquième et le sixième chapitre sont consacrés
respectivement à la prolifération in vitro des bourgeons axillaires et à l’enracinement et
l’acclimatation des vitroplants. Le septième chapitre traite l’identification du sexe chez les plants
micropropagés. Le dernier chapitre étudie la cryoconservation des axes embryonnaires en vue de
la préservation de cette ressource phytogénétique. L'étude se termine par une conclusion générale
qui tente de répondre aux hypothèses de recherche proposées.
Chapitre I – Revue bibliographique et
présentation des objectifs
1− GENERALITES SUR LE PISTACHIER
1.1− Position Taxonomique
Le pistachier est une Angiosperme dicotylédone appartenant à la famille des Anacardiacées
(Tableau 1). Cette famille comprend environ quatre cent trente espèces d’arbres et d’arbustes
donnant un suc résineux ou laiteux. Parmi les espèces les plus connues de cette famille :
-
Anacardium occidentale L., anacardier ;
Spondias dulcis FORST, ou S. cytherea SONNER, pommier de cythère ;
Spondias purpurea L. Prunier d’Espagne ;
Pistacia vera L. pistachier d’Alep ou pistachier vrai
L’étude monographique du genre Pistacia faite par Zohary (1952) montre que ce genre
comprend 4 sections et 11 espèces dont certaines comme Pistacia atlantica DESF (Betoum),
Pistacia terebinthus L. (Térébinthe) sont utilisées comme porte-greffe de l’espèce Pistacia vera
qui est la seule produisant des fruits comestibles (Joley, 1979).
Tableau 1. Position systématique du pistachier (Pistacia vera L.) (Quezel et Santa, 1962)
Règne : Planta (Végétal)
Sous-règne : Plantes vasculaires
Embranchement: Spermaphytes
Sous-embranchement : Angiospermes
Classe: Dicotylédones.
Sous- Classe : Archichlamydées
Ordre : Sapindales
Famille: Anacardiaceae
Genre: Pistacia
Espèce: Pistacia vera L.
1.2− Origine et répartition géographique
La culture du pistachier est très ancienne. Les perses connaissaient déjà cette culture environ
1000 ans avant l’ère chrétienne (Evreinoff, 1948). Ibn-Al-Awam (1864) a exposé dans son livre
« Kitab el Filahah » les techniques culturales du pistachier utilisées à son époque. En raison de
l’ancienneté de cette culture, la détermination de l’aire d’origine du pistachier est difficile.
Cependant, Vavilov en 1951, cité par Ayfer (1967), a émis l’hypothèse de l’existence de deux
centres d’origine du pistachier fruitier :
-
Le premier centre regroupe le Proche-Orient et le Moyen-Orient, y compris l’intérieur de
l’Asie Mineure, la région du Caucase, l’Iran et Turkménistan.
Le second centre couvre l’Asie centrale, le Nord-Ouest Indien, l’Afghanistan, le
Tadjikistan et l’Ouzbékistan.
Le pistachier d’Alep constitue naturellement des peuplements importants en Afghanistan et
au Turkestan. Il est cultivé principalement au Moyen-Orient notamment en Syrie, en
Afghanistan, en Iran et en Turquie (Figure 1).
Le pistachier a été introduit en Europe, notamment en Italie pour la première fois par
Vitellus, alors gouverneur de Syrie sous le règne de l’Empereur Tibère (14-37 après J.C.). De là
il est parvenu en Espagne (Vargas et al, 1995). Le pistachier est également répandu en Afrique
du Nord (Algérie, Maroc, Tunisie, Libye) et aux Etats-Unis (notamment en Californie) où le
pistachier a été introduit pour la première fois vers 1835 (Evreinoff, 1948). D’autres
introductions ont été faites en provenance de Sicile en 1900 et d’Iran et Turkestan en 1929
(Joley, 1969).
Figure 1. Aire actuelle de distribution du pistachier (D’après Yi et al, 2008).
L’ombrage gris indique les principales zones de 11 espèces de pistachier ainsi qu’un hybride (a = P. atlantica, b = P.
chinensis, c = P. integerrima , d = P. khinjuk , e = P. lentiscus , f = P. mexicana , g = P. palaestina , h = P.
terebinthus , i = P. texana , j = P. vera , k = P. weinmannifolia , l = P. saportae ).
1.3− Importance de la culture
Le pistachier vrai constitue une espèce ligneuse méditerranéenne précieuse. Il offre de
nombreux débouchés dont principalement la production fruitière.
La production de pistache occupe une grande place dans l’économie agricole de nombreux
pays tels que l’Iran, les Etats-Unis, la Turquie et la Syrie. L’Asie est la principale région de
production de pistaches, notamment l’Iran (région de Kerman), la Syrie (région d’Alep) et la
Turquie.
Aujourd’hui la production américaine, en particulier en Californie, connaît un essor
important, encore prouvé par la récolte de 2007 qui a donné 110000 tonnes de graines grâce à
des cultures modernes récentes, à l’irrigation à base la variété « Kerman » à gros fruits et chair
jaunâtre originaire d’Iran. De ce fait, les USA deviendront rapidement le deuxième pays
producteur de pistaches dans le monde (Tableau 2). Il existe aussi des petites productions en
Algérie, Australie, Espagne, Maroc, Sicile et Mexique.
La culture du pistachier fruitier a beaucoup évolué au cours des dernières années,
notamment dans les pays méditerranéens. Citons à titre d’exemple, le cas de la Tunisie où les
vergers se sont agrandis, modernisés et la surface de la culture a passé de 4400 ha en 1980 à
23000 ha en 2007 (Tableau 3).
Tableau 2. Evolution de la production de pistaches par pays en tonne (Source FAO, 2008)
Pays
1980
1985
1990
1995
2000
2005
2007
Iran
Etats-Unis
Turquie
Chine
Syrie
Grèce
Italie
Afghanistan
Tunisie
Pakistan
Madagascar
Ouzbékistan
Côte d’ivoire
Kirghizistan
Maroc
Jordanie
Chypre
Mexique
Maurice
23000
12247
7500
18000
7814
2514
1560
3200
50
90
51
3
-
104657
12290
35000
19000
12028
4067
2000
2200
120
222
30
10
13
-
162831
54430
14000
22000
13000
3439
200
2000
600
250
250
50
20
10
238778
67130
36000
25000
14538
5591
2200
2400
900
200
260
150
50
30
15
15
112000
110220
75000
22000
39923
9536
2768
2800
1600
209
230
200
100
100
50
15
31
5
229657
128367
60000
34000
25000
9365
2719
2457
1000
597
210
300
100
100
50
15
26
5
230000
110000
78409
38000
29000
9000
2000
3000
800
600
210
240
100
50
20
5
5
Monde
76029
191637
273080
393257
376787
493979
501451
FAOSTAT | © OAA Division de la Statistique 2008|
Tableau 3. Evolution de la surface cultivée par pays de pistachier en hectares (Source FAO, 2008)
Pays
1980
1985
1990
1995
2000
2005
2007
Iran
Etats-Unis
Turquie
Chine
Syrie
Grèce
Italie
Afghanistan
Tunisie
Pakistan
Madagascar
Ouzbékistan
Kirghizistan
Jordanie
Chypre
Mexique
112000
10930
23071
18721
4500
4400
64
33
55
-
107371
13070
25857
16000
7400
3650
3300
3700
11000
79
15
80
27
154276
21730
29121
16400
14900
3840
3672
2700
27703
81
500
145
-
218000
24400
34071
16600
15000
4900
3500
2700
35000
95
500
1200
200
80
274728
30200
36349
12000
28482
5500
3602
2700
21670
135
510
1000
100
140
85
440025
42492
40000
16000
35000
5035
3635
2211
18000
171
510
2000
100
440000
45000
41420
17500
14000
5000
3500
3000
23000
200
510
1600
100
153
39
150
26
Monde
173774
191549
275068
356246
417201
605375
595009
FAOSTAT | © OAA Division de la Statistique 2008 |
Avec 22% de protéines et 60% d’huile, les pistaches possèdent une valeur nutritionnelle
considérable. Ce fruit est utilisé en industrie alimentaire particulièrement en pâtisserie et en
confiserie. Le pistachier offre d’autres avantages, notamment son bois qui est très recherché et
apprécié pour sa dureté et ses caractéristiques techniques et esthétiques.
1.4− Caractéristiques du pistachier fruitier
1.4.1- Caractéristiques botaniques
Le pistachier vrai est un petit arbre d’environ 3 à 5 mètres de hauteur. Ses feuilles pennées,
alternes, composées de 3 à 5 folioles pointues avec un court pétiole rougeâtre peuvent dépasser 4
cm de largeur et sont parcourues par des nervures ramifiées saillantes en dessous. Les feuilles
sont d’abord cotonneuses et prennent ensuite une consistance coriace, qui leur permet de mieux
résister à la déshydratation dans les milieux arides.
Le pistachier est une espèce dioïque, les organes sexuels sont séparés sur des pieds différents
(pied mâle et pied femelle). Pour cette raison, il faut une organisation spécifique pour la
réalisation d’un verger (Voir ci-dessous en 1.7).
L’inflorescence mâle est une grappe composée, compacte, atteignant 5 à 8 cm de long et
constituée de 450 à 500 fleurs (Figure 2A,B) (Seigue, 1985). La fleur apétale est composée d’un
calice de 3 à 5 bractées membraneuses et d’un androcée ayant le plus souvent 5 étamines
opposées ; le nombre des étamines peut varier de 4 à 8. Le centre de la fleur est occupé par une
ébauche de gynécée.
L’étamine a un filet mince et court, une anthère introrse à deux loges séparées par un
connectif. Le grain de pollen de 30 μm de diamètre est rond et lisse de couleur jaune et présente
quatre pores germinatifs. (Pesson et Louveaux, 1984).
L’inflorescence femelle est constituée de 190 à 260 fleurs groupées en grappe composée
(Figure 2C), plus lâche, généralement plus longue et plus large (Seigue, 1985).
Un calice de 3 à 5 bractées membraneuses et inégales entoure un gynécée formé d’un ovaire
à 3 carpelles soudés, sans cloison intercalaire renfermant un seul ovule anatrope porté par un
long funicule. L’ovaire est surmonté d’un style court et d’un volumineux stigmate trifide à
divisions inégales (Figure 2D,E) (Pesson et Louveaux, 1984).
A
B
D
E
C
Figure 2. Pistachier fruitier (Pistacia vera L.)
A− Inflorescence mâle et détail d’un groupe de fleurs mâles (B). C− Rameau avec inflorescence femelle. D, E− Détail de
la structure de la fleur femelle (d’après Baillon, 1877 In Histoire des plantes)
Le fruit ou pistache est une drupe, sèche, ovoïde ou sphérique. Il s’ouvre en deux valves à la
maturité pour découvrir une graine oléagineuse. Cette graine est couverte d’une pellicule brun
rosé et dont les cotylédons sont généralement vert clair parfois jaunâtres ou roses (Figure 3A, B,
C).
La grappe principale rassemble de petites grappes généralement au nombre de 3 à 10.
Chacune des petites grappes porte 10 à 25 fruits de couleur verte. L’écorce généralement,
sombre, crevassée en petits carreaux à la base du tronc.
Figure 3. Fruits de Pistacia vera L.
A : Fructification ; B : Graines fraîchement récoltées ; C : Graines libérées de leur épicarpe.
1.4.2- Caractéristiques biologiques
Le pistachier vrai est un feuillu réputé comme étant de longue longévité, environ 200 à 300
ans (Maggs, 1977). Ses feuilles caduques apparaissent avec les fleurs au début de floraison en
avril-mai. La fructification a lieu en septembre.
La pollinisation naturelle chez le pistachier est généralement assurée par le vent. Cependant
cette pollinisation anémophile peut être dans certaines conditions climatiques insuffisante (temps
humides ou très calme ou exagérément venté (mistral)). Des rangées d’arbres mâles sont
indispensables pour assurer une bonne pollinisation chez cette essence (Maggs, 1977).
Le pistachier a besoin des variétés pollinisatrices. On cherche toujours à installer dans les
vergers des arbres mâles dont la période de floraison coïncide avec celle des variétés femelles.
Le pourcentage des pistachiers mâles, évidemment impératifs, est limité dans les plantations
modernes. En Tunisie, Jacquy (1972a) préconise la proportion de 1 pour 8 (11 %) répartis dans
la plantation.
La pollinisation artificielle effectuée avec du pollen bien conservé au réfrigérateur à 4°C
(tampon de coton, souffleuse manuelle, etc.) peut avoir une action très bénéfique sur la
production surtout en culture non irriguée où les arbres sont trop éloignés pour que la
pollinisation naturelle soit suffisante (Pesson et Louveaux, 1984).
L’enracinement du pistachier est pivotant. Il peut atteindre des dizaines de centimètres dès
les premières années.
1.5− Exigences pédoclimatiques du pistachier
Le pistachier se contente d'une gamme assez large de sols, pourvu qu’ils soient bien
drainant. Cet arbre supporte des sols légèrement calcaires. Il possède également une tolérance à
la salinité du sol, ainsi qu'à la sécheresse. Il a besoin cependant d'une irrigation correcte pour
produire convenablement.
1.5.1- Exigences climatiques
Le pistachier (Pistacia vera L.) se rencontre à l’état spontané dans une vaste aire
géographique s’étendant sous climat tempéré chaud et subtropical.
Comme pour plusieurs espèces fruitières, le pistachier a besoin d’une période de basses
températures pour la reprise de sa croissance active. Cette exigence est particulièrement
importante pour cet arbre, puisque les bourgeons qui produiront les fruits l’année n +1 sont
initiés durant l’été de l’année n. Après que leur besoin en froid a été satisfait, ils continuent à se
développer au printemps suivant. La quantité de froid nécessaire varie selon les cultivars et les
régions. En général, elle est comprise entre 200 et 1 000 heures de froid inférieur à 7°C (Crane
et Iwakiri, 1981). Le pistachier est un arbre résistant au froid, puisqu'il pourra supporter des
températures de l'ordre de - 17 à - 30°C (Woodroof, 1979 ; Spina et Pennisi, 1957). Cependant,
la floraison printanière peut être abîmée avec des gels beaucoup plus modérés.
Le pistachier supporte sans défaillance les sécheresses les plus prolongées comme les plus
fortes chaleurs qui sont mêmes nécessaires pour la bonne maturation de ses fruits. Il
s’accommode d’une pluviométrie extrêmement réduite (200 mm en générale par an) ; l’excès
d’eau fait pourrir les racines (Rebour, 1968).
I.5.2- Exigences édaphiques
Le pistachier fruitier est un arbre des régions semi-arides et arides. Bien qu’adapté à des
nombreux types de sol, cette essence est réputée être gypso-calcicole préférant des sols
relativement profonds et bien drainés (Woodroof, 1979). En général, tous les sols où prospèrent
l'olivier, l'amandier et la vigne conviennent parfaitement à la culture du pistachier (Jacquy,
1972a). Cet auteur signale qu’en terrain lourd, avec pluviométrie abondante ou en culture
irriguée, il est préférable de choisir comme porte-greffe le pistachier d’Atlas (Pistacia atlantica)
ou le pistachier térébinthe (Pistacia terebinthus) qui résistent mieux à l’humidité.
Le pistachier est peu connu en Algérie où de vastes espaces en cultures sèches ou irriguées
pourraient lui être avantageusement consacrés. Grâce à sa résistance au stress salin (Benmahioul
et al, 2009), le pistachier peut valoriser de nombreuses zones touchées par le problème de la
salinité.
1.6 – Maladies et ravageurs du pistachier fruitier
1.6.1- Maladies fongiques
Le pistachier est soumis à l’attaque de maladies diverses dues principalement à des
champignons. Ces pathogènes, en infectant le feuillage, les pousses et les racines, provoquent
des graves dégâts et entraînent l’affaiblissement de l’arbre. De plus, diverses maladies peuvent se
développer sur les fleurs et les fruits, entraînant ainsi une perte importante. Plusieurs espèces
fongiques ont été identifiées chez le pistachier dont les principales sont : Verticillium dahliae,
Botrytis cinerea, Alternaria alternata, Botryosphaeria dothidea, Armillaria mellea, Sclerotinia
sclerotiorum, Nematospora coryli, Aspergillus niger (Michailides et al, 1995).
1.6.2- Insectes ravageurs
Les insectes constituent certainement le groupe de prédateurs le plus nuisible pour la culture
du pistachier qu’ils peuvent attaquer à différents stades de leur vie (larvaire ou adultes).
Parmi les insectes qui attaquent le pistachier, les pucerons tiennent une place prééminente, non
seulement du fait des dégâts directs qu’ils occasionnent en prélevant une quantité importante de
sève mais ils transmettent certains agents pathogènes tels que les bactéries et les virus. L’une des
espèces les plus dangereuses à ce titre est le puceron vert du pêcher (Myzus persicae) que nous
avons observé même chez les jeunes semis de Pistacia vera L. (Figue 4A).
Il existe d’autres ravageurs qui peuvent engendrer des graves dégâts au niveau des feuilles et
des fruits tels que : Acrosternum hilare (punaise du pistachier, Figure 4B), Calocoris (Figure 4C
et D), Agonoscena pistaciae (psylle commun du pistachier), Kermania pistaciella (kermès des
rameaux du pistachier) (Mehrnejad, 2001). Cet auteur observe d’autres insectes ravageurs et
acariens phytophages dans les vergers de pistachier fruitier, nous citons à titre d’exemple :
Recurvaria pistaciicola (teigne du fruit du pistachier), Idiocerus stali (sauterelle des feuilles du
pistachier), Pistaciaspis pistaciae (cochenille des rameaux et fruits), Melanaspis inopinata
(cochenille du tronc et des branches), Hylesinus vestitus (scarabée de l’écorce), Ocneria
terebinthina (tordeuse des feuilles) et Polydrosus davatchii (charançon du pistachier). Ces
dernières années un ravageur a été signalé aux Etats-Unis qui cause des graves dégâts en
s’attaquant aux feuilles, bourgeons et fruits : il s’agit de Ferrisia gilli (Figure 4E,F,G).
Cependant, certains prédateurs utilisés en lutte biologique (Fig. 4H,I) peuvent limiter la
population de ce ravageur.
Figure 4. Quelques insectes ravageurs du pistachier vrai (Pistacia vera L.) et leur dégâts
A)- Pucerons verts (Myzus persicae), B)- Acrosternum hilare, C-D)- Calocoris (Hémiptère) : adulte
(C) et nymphe (D), E-G)- Ferrisia gilli : femelles adultes de corps roses et sont couverts en cire
blanche (E), mâle adulte (centre) caractérisé par une paire d'ailes et deux longues queues (F),
Dégâts causés sur le fruits (G), Larve de Chrysoperla s’attaque aux ravageur Ferrisia gilli (H),
Coccinelle prédateur (droit) à côté de deux femelles de Ferrisia gilli (I). (Photos B à I : source,
Haviland, 2005 et Haviland et al., 2006)
1.7– Techniques de culture du pistachier
Comme pour la plupart des essences fruitières, la production du pistachier est extrêmement
variable puisqu’elle dépend de nombreux facteurs, communs aux autres espèces (le climat, le sol,
l’eau, le porte-greffe, la variété, la fumure, les parasites, l’entretien). Par ailleurs d’autres
facteurs sont particuliers à cet arbre fruitier tels que la pollinisation par exemple (naturelle ou
artificielle).
Le pistachier est réputé pour être le plus rustique des arbres fruitiers : il peut végéter presque
partout (grâce à différents porte-greffes). Cependant, sa production reste relativement liée à la
qualité du sol, la quantité d’eau mise à sa disposition ainsi qu’aux soins effectués.
La plantation en motte de plants greffés, est le mode de plantation qui permet la meilleure
reprise ; la réussite est totale en une seule plantation (Jacquy, 1972a). Les plants mâles seront
marqués avec une peinture pour les distinguer des plants femelles et les repiquer aux
emplacements réservés. D’autres techniques de plantations sont utilisées à savoir les plantations
avec plants non greffés, plantations à racines nues de plants greffés ou non, semis en place,
plantation mixte (Figure 5).
L’époque de plantation du pistachier est un facteur clé pour la reprise. Les meilleurs taux de
réussite proviennent des plantations précoces : dès le début de l’hiver, en décembre. La densité
de plantation dans un hectare varie selon la pluviométrie de la région, de la nature du sol et de
l’irrigation. Dans les lieux irrigués en cultures intensives en Iran par exemple, les espacements
sont de 5 x 5 et même 5 x 3 m. Aux Etats-Unis les distances de plantations de 8 à 9 m sont
recommandées car les arbres deviennent rapidement volumineux. En climat sec, les espacements
varient avec la pluviométrie, pouvant atteindre 14 m et plus dans les régions arides, cas de Sfax
en Tunisie (Jacquy, 1972a).
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
O
X
X
O
X
X
O
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
O
X
X
O X
X
O
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
Δ
X : Pistachier greffé femelle
O : Pistachier greffé mâle
Δ : Porte-greffe à greffer
Figure 5. Plantation mixte de pistachier (D’après Jacquy, 1972a)
Du fait de la spécificité de cette espèce dioïque, on doit planter en respectant la proportion
de 8 pieds femelles dispersés autour d’un seul pied mâle ou un pied mâle pour 5 ou 6 pieds
femelles. Par ailleurs, certains auteurs préconisent de planter une rangée de pieds mâles du côté
du vent dominant pour augmenter la pollinisation (Figure 6).
X : Arbre femelle
O : Arbre mâle
X
X
X
X
O
X
X
X
X
Côté du vent
dominant
O
X
X
X
X
O
X
X
X
X
O
X
X
X
X
O
X
X
X
X
Figure 6. Dispositif de répartition des arbres mâles dans un verger de pistachier (D’après Oukabli, 2005)
Dans une plantation avec des plants non greffés au départ ou d’un semis direct, le greffage
est indispensable. En effet, un semis donne plus de plants mâles (improductifs) que de plants
femelles, alors que la proportion de 1 pour 8 est suffisante. De plus, les plants femelles issus
d’un semis donnent généralement des fruits de petite taille par rapport à ceux du pied mère. Le
greffage sera effectué la 2ème ou 3ème années de plantation. Le porte-greffe qui a été rabattu en
décembre, présente plusieurs pousses. Au début mai, 2 ou 3 pousses sont sélectionnées, les
autres supprimées. Les pousses sélectionnées possèdent vers mi-juin un calibre suffisant pour
être greffées à œil poussant. Il existe une seconde greffe, début septembre : à œil dormant.
La sélection des variétés est indispensable à la rentabilité de la culture. Chaque année, on
enregistre un pourcentage important de déchets (fruits vides ou parasités), sur lequel le
propriétaire a sa part de responsabilité, notamment en ce qui concerne la répartition des arbres
mâles, la pollinisation artificielle et les traitements phytosanitaires). Une fois les variétés
femelles sélectionnées, il est nécessaire de choisir une ou plusieurs variétés mâles. Ce choix se
fait sur plusieurs critères, notamment l’époque de floraison de la variété mâle : il faut qu’elle
fleurisse à la même époque que la variété femelle. En outre, la vigueur et la productivité sont
deux critères importants de la sélection. En effet, la variétés mâle doit être vigoureuse, florifère
et donnant en quantité un pollen de qualité (pollen fertile).
1.8- Principales variétés du pistachier cultivé
Il existe de nombreuses variétés de pistachier dans le monde. Chaque pays producteur
possède ses propres variétés, bien adaptées donnant satisfaction au producteur mais aussi au
consommateur.
La variété de pistaches doit présenter à un certain nombre de qualités tels que la grosseur, la
déhiscence, la productivité, la qualité gustative et la couleur (Tableau 4). Ce dernier facteur est
moins important que les précédents pour les fruits « apéritifs », c’est le cas des variétés
iraniennes qui sont de couleur jaune, mais très déhiscentes (faciles à ouvrir).
Les principales variétés de pistachiers dans les principaux pays producteurs de pistaches
dans le monde sont citées ci-dessous (Jacquy, 1972b ; Acsad, 1998 ; Parfitt et al, 2005)
Variétés Turques et Syriennes :
En Turquie, "Uzum, Kirmizi et Halebi (Alep)" sont les variétés les plus cultivées. En Syrie, les
variétés qui dominent largement sont "Achoury" et "Bataury". D’autres cultivars, tels que
"Alemi", "Obiad", et "Ajmi" » sont également cultivés en Syrie.
Variétés Iraniennes :
En Iran, premier pays producteur de pistaches dans le monde, les variétés "Momtaz",
"Ohadi" et "Kaleh-Ghouchi" ont été adaptée pour leurs qualités et leurs productions abondantes.
Il existe d’autres cultivars intéressants tels que : "Bademi", "Dameghan", "Famtog", "Ghafuri",
"Kazouini", " Safideh-Montaz", "Razvine", "Shasti" et "Vahedi".
Variétés Européennes :
L’Italie et la Grèce sont les principaux pays européen producteurs de pistaches. Bronte en
Sicile est la zone productrice la plus importante en Italie. "Napoletana (Bianca)" est la variété
dominante dans ce pays. Il existe d’autres cultivars, mais moins plantés, comme "Agostana»,
"Bronte", "Cappuccia", "Girasola-Rusata", "Insolia", ''Notaloro" "Santangilizi", "Silvana" et
"Traponella". En Grèce, les variétés "Aegina", "Kinezaki", "Foundoukato" et "Nachato" sont les
plus dominantes. Les mâles ''Alpha'', ''Bêta'' et ''Gamma'' ont été sélectionnés pour la
pollinisation.
Variétés Californiennes
''Kerman'' est la principale variété femelle cultivée dans toutes les régions en Californie. Ce
cultivar donne des rendements très élevés avec une qualité supérieure de pistaches. Dans les
vergers californiens les variétés mâles ''Peters'' et ''Chico23'' assurent la pollinisation.
Variétés Tunisiennes
Les variétés ''Mateur'', ''El Guettar'', ''Sfax'' et ''Meknassi'' sont les plus cultivées. D’autres
variétés ont été introduites dans ce pays telles que ''Ohadi'', ''Achouri'' et ''Kerman''.
Tableau 4. Caractéristiques de principales variétés de pistachier (Pistacia vera L.) *
Syrie
Zone de
culture
Variétés
Achouri
Fruit moyen, rouge déhiscent, très productif, excellente qualité.
Batouri
Gros fruit blanchâtre, peu déhiscent, peu vigoureux, bonne qualité.
Alemi
Lazouardi
Turquie
Uzun
Iran
Italie
Etats-Unis
(*)
Fruit petit, rose garance déhiscent.
Fruits long, moyen, très productif, mais avec alternance forte.
Fruit moyen, rouge, très productif, mais alternant.
Halebi
Gros fruit, amande vert très clair à jaunâtre, a moins besoin de froid que les
autres variétés.
Abiad miwahi
= pistachier blanc
Feuilles et fruits non pigmentés, moyen à noyau blanc, déhiscent, excellent.
El Jalale
Fruit petit, allongé, brou épais indéhiscent, amande de bonne qualité, assez
vigoureux, fertile.
Aintaby
Fruit petit, comprimé, un côté blanc, l’autre rougeâtre indéhiscent.
Fruit moyen, charnu, rouge foncé, très dur, indéhiscent, cultivar très employé
comme porte-greffe franc de semis.
Wahedi et Ohadi
Gros fruit rond déhiscent, amande vert clair à jaunâtre.
Sefideh-Montaz et
Dameghan
Gros fruit allongé déhiscent, amande jaunâtre, très appréciée.
Razvine
Fruit petit, allongé, peu déhiscent, amande d’un beau vert, mieux adapté aux
zones froides.
Aegina
Répondu dans toute la zone de production.
Napoletana
Tunisie
Fruit assez gros, déhiscent.
Kirmizi
Ajmi
Grèce
Caractéristiques
Fruit moyen, allongé, rouge vineux à crème, souvent déhiscent, mi-précoce
(août-septembre), vigoureux.
Agostana
Fruit moyen, ovale, rouge vineux à crème, souvent déhiscent, précoce (août).
Notaloro
Fruit petit, rouge vineux à jaune crème, productif mais avec beaucoup de fruits
vides, vigoureux.
Allepo
Gros fruit, arrondi, rouge foncé, déhiscent, grosse amande de qualité, assez
vigoureux, très fertile.
Bronte
Fruit moyen, allongé, d’un côté crème de l’autre rougeâtre, bonne qualité,
vigoureux.
Kerman
Gros fruits, déhiscents, mais avec une proportion non négligeable de coques
vides (jusqu’à 25%). Il est très cultivé.
Joley
Plus récent (1979), à fruits plus petits, mais plus vigoureux et productif.
Peters
Employé comme sujet mâle pollinisateur dans les vergers.
Sfax
Petit fruit de qualité, arbre petit, mise à fruit précoce (3-4ans), très peu exigeant
en froid hivernal.
D’après les données bibliographiques de Zuang et al, 1988.
Le Pistachier pourrait couvrir de vastes étendues en Algérie (Figure 7). Il existe actuellement
une population locale adaptée, composé dans sa majorité de variétés syriennes ''Achouri'' et
''Batouri'' (Figure 8). D’autres variétés étrangères comme ''Mateur'', ''Ohadi'' et ''Kerman'' peuvent
être essayées surtout en cultures irriguées. Il est possible d’admettre que la plupart d’entres elles
trouveront en Algérie un climat identique ou meilleur à celui de leur pays d’origine.
N
Figure 7. Zones potentielles du pistachier fruitier en Algérie (Khellil et Kellal, 1980)
Port retombant : Batouri
Port érigé : Ashouri
Dépression de la coque, prononcée
Apex de la coque, aplati
Relief de la cicatrice du pédicelle est :
1- Aplatie : Batouri
2- Proéminente: Ashouri
Relief de la suture :
Elevé = Batouri
Ouverture de la suture :
Modérée = Ashouriy
= Batouri
Figure 8. Distinction entre deux variétés syriennes de Pistacia vera L. introduites en Algérie
(IPGRI, 1997)
2– MODES DE PROPAGATION DE PISTACIA VERA L.
2.1− Multiplication sexuée
La méthode la plus utilisée pour la production de porte-greffes est la voie sexuée. Bien que
plusieurs espèces du pistachier puissent être employées comme porte-greffe, l'espèce cultivée
Pistacia vera L. est la plus utilisée. Elle se prête la mieux à la multiplication par semis par
rapport aux autres espèces comme Pistacia atlantica ou Pistacia terebinthus.
Les graines doivent être de l’année en cours, car elles alors ont le meilleur pouvoir
germinatif. Celui-ci peut chuter de 50 % à la deuxième année (Jacquy, 1972b). Ces graines
doivent être saines et sélectionnées ou éventuellement traitées avec des insecticides et des
fongicides.
Le semis peut s’effectuer (de décembre à mars), suivant plusieurs techniques, telles que le
semis à plat (en planche), directement ou après un trempage de 24 heures dans l’eau ou, après
une stratification. Aletà et al, 1998 signalent qu’une stratification des semences au froid humide
(2-4°C) pendant 30 jours, avant leur mise en germination à 20°C améliore nettement le taux de
germination chez Pistacia vera L.
Avant de repiquer la graine germée, la pointe de la radicule est sectionnée (½ cm environ) à
l’aide d’un greffoir. Ce pincement de la coiffe a pour but de favoriser un bon développement du
système racinaire.
Etant donné que le pistachier est une essence dioïque, le semis donne autant de pieds
femelles que des mâles. Or ceux-ci, mis à part un très faible pourcentage, sont inutiles et doivent
être transformés en sujets femelles : le semis ne permet pas la transmission avec certitude de
toutes les caractéristiques de la variété dont sont issues les graines.
2.2- Multiplication végétative
Deux techniques de propagation se présentent à l’arboriculteur pour lui permettre de
préserver les mêmes caractéristiques de son arbre sélectionné, à savoir le bouturage et le
greffage.
™ Le bouturage
Le bouturage ligneux est une méthode de production techniquement difficile, et qui donne
des résultats assez faibles (Djerah, 1991 In : Aoudjit et Mouissa, 1997). La plupart des travaux
concernant ce type de multiplication n’ont pas donné des résultats positifs, en raison de son
enracinement difficile et de la difficulté de sa mise en œuvre. A cet effet, les pieds mères ont été
étiolés avant prélèvement des boutures ; les boutures semi-ligneuses sont trempées dans une
solution d’acide indole butyrique (AIB) (2000 et 4000 ppm) et enracinées sous brouillard (Aletà
et al, 1998).
™ Le greffage
Le greffage est le mode de multiplication végétative le plus répandu. C’est une technique
qui consiste à insérer le greffon, représentant la partie végétative ou variété sur le sujet ou le
porte-greffe, représentant la partie racinaire.
La production de plants de pistachier par greffage est difficile. Tous les stades du processus
de production, que ce soit la germination des semences, la préparation des plants avant le
greffage, le greffage et la transplantation sont considérés comme particulièrement compliqués
(Jacquy, 1972b ; Ayfer, 1976).
Il existe plusieurs porte-greffes qui peuvent être utilisés. Au Moyen-Orient, le pistachier
vrai ou franc, obtenu par le semis de pistaches est habituellement adopté comme porte-greffe.
Cette espèce est à exclure en terre lourde et humide, car elle est sensible au pourridié (Zuang et
al, 1988). Les mêmes auteurs signalent que le pistachier térébinthe (Pistacia terebinthus) est le
porte-greffe le plus employé en Europe, notamment en Sicile ; mais les graines de cette essence
germent difficilement. Le pistachier d’Atlas (Pistacia atlantica) est utilisé aux Etats-Unis. Vu sa
rusticité et ses faibles exigences édapho-climatiques, ce porte-greffe est également le plus utilisé
en Afrique du nord, notamment en Algérie. Appelé « Betoum » en Arabe et « Iggh » en Berbère,
le pistachier d’Atlas est considéré le plus vigoureux de tous les porte-greffes. Pistacia lentiscus,
arbre buissonnant spontané en Algérie, est à éliminer comme porte-greffe en raison de son
comportement: les nombreuses repousses de cette essence éliminent rapidement le greffon
(Jacquy, 1972b).
Le greffage est pratiqué lorsque la section du porte-greffe atteint au minimum 5 mm de
diamètre, soit environ la première année de plantation. Le mode de greffage le plus utilisé pour
le pistachier fruitier est le greffage en écusson (Figure 9). Mais la méthode de la greffe
« anglaise » peut donner également de bons résultats (Figure 10).
Figure 9. Greffe en écusson
(Délimitation de l’écusson ; écusson prêt à l’emploi ; écusson inséré, ligature de la greffe)
Figure 10. Jeunes plants de pistachier greffés avec succès dans la région de Sidi el Djilali (Tlemcen)
(A) - Greffage d’un écusson : Malheureusement le manque d’entretien a conduit à une croissance importante du porte greffe (P.
atlantica) au détriment du greffon (P. vera L) ; (B) - ‘greffe anglaise’ réalisée sur Pistacia vera L ; (C) - Après une année de
greffage, on note le bon développement du greffon qui dépasse les 70 cm de hauteur.
Pour que le greffage soit possible, les greffons doivent être à maturité (à partir du début
juin), la date de leur prélèvement varie selon le mode de greffage :
-
Début du mois de juin jusqu’à la fin du mois de juillet pour le greffage en écusson à œil
poussant.
Tout le long du mois d’août et parfois au début du mois de septembre pour le greffage en
écusson à œil dormant.
Les taux de réussite sont très faibles, atteignant rarement les 15 % en moyenne chez le
pistachier (Aletà et al, 1998). Les mêmes chercheurs signalent que la reprise au greffage, quelle
que soit la technique pratiquée, dépend directement du diamètre du porte greffe et de sa vigueur.
De plus, l’influence de l’espèce sur cette reprise est très importante. En outre, le greffage se
heurte chez le pistachier à un problème d’incompatibilité de l’association porte greffe/ greffon
dû à la sécrétion de substances phénoliques et de résine (Al-Barazi et Schwabe, 1982).
3- CULTURE IN VITRO DU PISTACHIER
La culture in vitro de tissus peut apporter plusieurs avantages par rapport aux techniques
conventionnelles de propagation du pistachier (semis, bouturage et greffage). Cette voie moderne
de la multiplication végétative a trouvé un large champ d’application dans le cas des espèces
forestières, fruitières et ornementales. Chez le pistachier, les premières tentatives de
vitropropagation ont été entamées par Colinas et al., 1982 puis Barghachi et Alderson en 1983.
3.1- Modalités de propagation in vitro
La multiplication par les techniques in vitro est particulièrement intéressante pour la
propagation du pistachier, espèce fortement hétérozygote. La multiplication végétative rapide de
cette essence peut s’effectuer par la culture in vitro des tissus à travers les techniques citées cidessous.
3.1.1- Micropropagation
a)- Culture d’embryons zygotiques
Généralement, les embryons prélevés de semences sont une source privilégiée d’explants
car leur caractère juvénile leur confère une bonne réactivité. La technique de culture d’embryons
isolés a été utilisé pour la micropropagation de nombreuses espèces végétales, notamment les
essences ligneuses récalcitrantes, c’est le cas du chêne liège (Bellarosa, 1981 ; Deidda et al,
1988), du noyer commun (Jay-Allemand et Cornu, 1986 ; Sanchez-Zamora et al, 2006), de
l’olivier (Abousalim et al, 2005).
Chez le pistachier (Tableau 5), Abousalim et al, 1992 ont obtenu des bourgeons par culture
d’embryons sur un milieu solidifié avec de l’agar-agar. Ces auteurs signalent que le
développement des pousses et des bourgeons est favorisé par des milieux pauvres en sels
minéraux et dépourvus de GA3 ; cependant, la croissance racinaire est stimulée par un milieu
riche contenant de l’acide gibbérellique.
Ozden-Tokatli et al, 2005 ont également utilisé la culture d’embryons matures. Ils signalent
un taux de contamination d’environ 10% après une désinfection des graines dans une solution de
peroxyde d’hydrogène 10 % (v/v). Les axes embryonnaires cultivés sur MS additionné de 30g l-1
de saccharose et 7 g l-1 d’agar ont donné 70 – 75 % de germination après 6 – 7 jours.
Chatibi et al, 1998 ont initié leurs cultures organogènes à partir des feuilles d’embryons
zygotiques. Les graines ont été désinfectées par trempage de 15 minutes dans une solution
d'hypochlorite de sodium (12° chlore actif) additionnée de quelques gouttes de Tween 20. Le
milieu de Quoirin et Lepoivre (1977) contenant 15 g l-1 de saccharose a été utilisé pour la culture
d’embryons isolés.
b)- Culture de bourgeons et noeuds
La micropropagation in vitro à partir de bourgeons apicaux et axillaires est plus utilisée
pour la production commerciale de plantules d'arbres forestiers. La propagation in vitro par
bourgeonnement axillaire a été obtenue à partir de matériel végétal jeune ou adulte chez
quelques espèces de pistachiers : Pistacia terebinthus et P. vera (Pontikis, 1984 ; Gannoun et al,
1995) et P. mutica (Ghoraishi, 2006).
L’établissement de cultures indemnes de contaminants est parfois difficile à réussir. Les
contaminants de surface peuvent être éliminés par des agents désinfectants tels que
l’hypochlorite de calcium ou de sodium, le peroxyde d’hydrogène ou le chlorure de mercure,
cependant les microorganismes endogènes, notamment les bactéries, sont en général difficiles à
éliminer. La prolifération de ces contaminants n’apparaissent parfois qu’après plusieurs
subcultures et entraînent ainsi des pertes considérables.
Chez le pistachier vrai (Pistacia vera L.), les premiers travaux remontent à Barghachi
(1982) et Barghachi et Alderson (1985) qui ont utilisé des bourgeons apicaux et axillaires excisés
de plantules d’environ 2 ans (Tableau 5). Ces bourgeons ont été mis en culture sur le milieu de
Murashige et Skoog (MS) en présence de BAP. Cette cytokinine à la concentration de 4 mg l-1
assure une meilleure prolifération des bourgeons.
Abousalim et al, 1991 ont utilisé des microboutures de 15 – 20 mm de longueur excisées de
jeunes plantules âgées de 20 jours, issues de graines germées in vitro. Ces explants ont été
cultivés sur le milieu de MS additionné de 30 g l-1 de saccharose et solidifié par 7 g l-1 d’agar.
Les auteurs ont constaté que la BAP augmente significativement la prolifération des bourgeons.
Le nombre maximal de pousses feuillées a été obtenu avec 2,5 mg l-1. Les pousses issues de la
phase de multiplication ont été repiquées sur le milieu MS solidifié par de l'agar en présence
d’acide gibbérellique pour être allongés. L’addition de GA3 a réduit l’accroissement à la dose de
1 mg l-1. L’induction racinaire dépend de la concentration d’AIB qui doit être supérieure à 0,1
mg l-1. Le taux maximum de rhizogenèse in vitro (75 %) a été enregistré en présence de 2,5 mg l1
.
Ozden-Tokatli et al, 2005 ont initié leurs cultures à partir d’un matériel juvénile : nœuds
prélevés de vitrosemis âgés d’environ 1 semaine. Le milieu de MS enrichi de 9 µM BAP et 0,2
µM GA3 induit la formation de plusieurs bourgeons par nœud. De plus, l’addition de 12 µM
AgNO3 a permis d’améliorer l’aspect qualitatif des pousses et de réduire significativement la
production de cal à leurs bases. La culture des microboutures sur le milieu MS/2 associé de 12
µM AIB et leur transfert sur le même milieu sans hormones ont permis d’obtenir un taux
d’enracinement maximal de 58 %.
D’autres chercheurs ont essayé de propager le pistachier à partir de matériel adulte (Tableau
5). Plusieurs problèmes sont apparus : contaminations, brunissement du milieu et manque de la
réactivité du matériel végétal. Onay (2000a) a initié ses cultures à partir de bourgeons apicaux et
axillaires développés sur des petits rameaux prélevés d’arbres adultes. Après leur désinfection,
les segments nodaux ont été cultivés sur MS additionné de la benzylaminopurine. La production
maximale de pousses a été obtenue en présence de 8,8 μM de BAP. L'enracinement des
microplants a été réalisé sur un milieu enrichi d'acide indole butyrique (AIB).
Tableau 5. Récapitulatif de quelques travaux de recherches en culture in vitro du pistachier (Pistacia vera L.) utilisant la micropropagation
l-1)
Type d’explants
Milieux nutritifs
Bourgeons prélevés sur de
jeunes plantules
MS
- Induction de pousses : BAP (4) ou KIN (2 à 4)
- Enracinement : AIB (2,5)
- Prolifération de pousses
- Régénération de plants
Barghachi (1982)
Segments nodaux de jeunes
plants (1-2 ans)
MS
- Induction de pousses : BAP (4)
- Enracinement : AIB (2,5)
- Régénération de plants
Barghachi et
Alderson (1985)
Segments nodaux provenant
d’arbres adultes (30 ans)
MS
- Induction de pousses : BAP (0,5-8)
- Enracinement : AIB (1-4)
- Prolifération de pousses
- Régénération de plants
Onay (2000a)
- Induction de pousses : BAP (2) + GA3 (0,1)
- Induction racinaire : AIB (2,5)
- Effet AgNO3 à 12 µM
- Enracinement : 58 %
- Acclimatation : 75 %
Ozden-Tokatli et
al, (2005)
- Prolifération des pousses : BAP (2,5 - 4)
- Enracinement : AIB (2,5)
Régénération de plants à
partir d’explants initiaux
juvéniles
Abousalim et al,
1991
- Embryons matures
- Nœuds de vitrosemis
Explants prélevés sur des
plantules âgées de 20 jours,
développées à partir graines
germées in vitro.
MS
+
AgNO3
MS
Phytohormones (mg
Résultats, observations,
Références
Graines complètes
(embryons+cotylédons)
MS, KN,
Eau distillée,
- Développement des pousses et des bourgeons :
Milieux pauvres
- Croissance racinaire : milieux riches + GA3
Production des vitrosemis
Abousalim et al,
1992
Segments de tige, méristèmes
prélevés sur arbres adultes
MS ou WPM
- BAP (0,3) + AIB (0,05)
Nécrose
de
formation de cal
Barghachi (1986)
pousses,
3.1.2- Organogenèse directe et embryogenèse somatique
En raison des difficultés rencontrées avec les tissus adultes, les cultures embryogènes du
pistachier sont habituellement initiées à partir de tissus juvéniles et plus fréquemment de tissus
embryonnaires. L’initiation des cultures embryogènes et des embryons somatiques chez le
pistachier fruitier a été testée sur divers types d’explants. Nous présentons ci-dessous les
expériences de la littérature (Tableau 6).
a)- Culture d’embryons zygotiques immatures
Zaheer et al, 1989 ont initié des cals embryogènes à partir d’embryons immatures de
Pistacia vera L. Les embryons prélevés par dissection aseptique ont été cultivés sur le milieu MS
additionné de 2,4-D et de KIN aux doses respectives de 4 et 2 mg l-1.
Onay et al, 1995 ont eux aussi établi leurs cultures embryogènes à partir d’embryons
zygotiques immatures. Les graines ont été récoltées durant le développement de l’embryon.
Après la désinfection des graines, les embryons prélevés ont été cultivés sur le milieu MS
associé aux vitamines de Gamborg (B5) et additionné de BAP (1 – 8 mg l-1). Les cultures sont
placées en chambre climatisée avec une lumière continue et une température d’environ 25 ± 2°C.
Onay et al, 2000 ont réussi la régénération de plantules à partir de cultures embryogènes.
Ces dernières initiées à partir de graines immatures, ont été cultivées sur le milieu de MS
additionné de vitamine B5 et des phytohormones BAP et ABA.
B
b)- Culture de fragments de Cotylédons
Hafdi et Abousalim (2000) ont utilisé des fragments de cotylédons, excisés à partir de
graines germées in vitro. Ils ont constaté que l’utilisation de la BAP ou le 2iP combinées au 2,4D a favorisé l’induction d’un cal proliférant mais d’une structure granulaire. Malgré les
subcultures successives sur des milieux semi solides et même liquides, aucune amélioration n’a
été enregistrée. Ces auteurs préconisent le 2,4-D seul pour l’initiation de l’embryogenèse
somatique à partir de fragments cotylédonaires chez le pistachier.
c)- Culture de feuilles
Chatibi et al, 1998 ont obtenu une organogenèse directe par régénération de bourgeons
adventifs à partir de feuilles de vitrosemis âgés de 15 jours. Après élimination de toute présence
de méristèmes ou de bourgeons préexistants, les explants foliaires ont été cultivés sur le milieu
de base de MS additionné de différents régulateurs de croissance (BAP, AIB et ANA). Les
cultures sont maintenues à l’obscurité pendant 3 semaines puis placées à la lumière sous une
photopériode de 12 h par cycle de 24 h à une température de 25 ± 2°C. En raison de la quantité et
la qualité des pousses obtenues, ces auteurs ont retenu deux combinaisons hormonales
composées de BAP/AIB/ANA à des concentrations respectives de 0,5/1,0/0,5 mg l-1 et
1,5/2,0/0,5 mg l-1.
Onay et Jeffree (2000) ont réalisé l'embryogenèse somatique à partir de feuilles prélevées
sur des plantules d’environ 1 an. Elles ont été désinfectées et cultivées sur le milieu MS
(liquide). Les cals et les embryons somatiques ont été initiés en présence de TDZ ou BAP (0,5 –
4 mg l-1) sous une photopériode de 24 h de lumière et une température de 25 ± 2°C.
Tableau 6. Principales recherches réalisées sur l’organogenèse directe et l'embryogenèse somatique du pistachier (Pistacia vera L.)
Explants initiaux
Fruits immatures
Milieux nutritifs
Phytohormones (mg l-1)
MS
2,4 D (4) ; KIN (2)
MS avec vitamines
B5
BAP (1 - 2)
MS
BAP (1 - 4)
MS avec
vitamines B5
MS
Cotylédons immatures
Explants de feuilles prélevés
de jeunes plantules issues de
l’in vitro.
Fragments de cotylédons
Feuilles prélevées de plantules
d’environ 1 an.
MS
Résultats, observations,
- Formation du cal
- Embryons somatiques
- Régénération de plants
-Embryogenèse somatique
- Régénération des plants
Références
Zaheer et al, 1989
Onay et al, 1995
Onay, 2000b
BAP (1 - 16)
ABA (0,5 - 4)
- Embryogenèse somatique
- Germination des embryons
somatiques et régénération des
plantules complètes
ANA (1 – 5)
Régénération de plants à partir
des embryons somatiques
Taskin et al, 1996
Embryogenèse somatique
Chatibi et al, 1997
Organogenèse
directe :
néoformation de bourgeons
adventifs
Chatibi et al, 1998
Initiation d’un cal de structure
granulaire
Hafdi et Abousalim, 2000
2,4 D (1-5) + KIN (0,5-2) + ANA (0,1)
MS
BAP (0,5 – 1,5) + AIB (1 – 2) + ANA (0,5)
MS
BAP ou 2iP (0,5 - 1) + 2,4 D (10)
MS
(milieu liquide)
TDZ ou BAP (0,5 – 4)
- Embryons somatiques
Onay et al, 2000
Onay et Jeffree, 2000
3.2- Problèmes posés par la culture in vitro du pistachier fruitier
Chez le pistachier, et malgré les progrès accomplis dans le domaine, la culture in vitro se
heurte à plusieurs problèmes liés au choix de l'explant, à l'initiation aseptique, à la nécrose des
bourgeons apicaux, à la régression des potentialités en subculture, et surtout à l'enracinement et à
l'acclimatation des vitroplants (Chatibi, 1999).
Les premières recherches sur la culture in vitro du pistachier se sont surtout intéressées aux
espèces sauvages, car la culture in vitro de Pistacia vera L., s’avère difficile à ce jour.
La réactivité du matériel végétal du départ est très importante pour la réussite de la
micropropagation des essences forestières et fruitières. Cornu (1985) signale que certaines
techniques de rajeunissement telles que la taille et le recepage, permettent l’amélioration de cette
réactivité in vitro qui est également liée aux conditions de culture, notamment la composition
minérale des milieux nutritifs
Selon certains chercheurs, notamment Martinelli, 1988 ; Gonzales-Garcia, 1990, Abousalim
et Montell, 1994 ; Chatibi et al, 1995 la technique in vitro chez le pistachier se heurte à plusieurs
problèmes liés principalement à :
¾ l’initiation aseptique ;
¾ le choix de l’explant de départ ;
¾ l’oxydation des tissus par l’émission rapide de composés phénoliques dans le milieu de
culture en inhibant la croissance des tissus ;
¾ la nécrose des bourgeons apicaux ;
¾ la régression des potentialités en subcultures ;
¾ l’enracinement et l’acclimatation des vitroplants.
La rhizogenèse in vitro des microboutures obtenues durant la phase de multiplication a
longtemps été, et est toujours, l’un des problèmes majeurs de la micropropagation industrielle du
pistachier fruitier. Bien que certains auteurs ont mentionné réussir à enraciner cette essence
fruitière, les taux d’enracinement dépassent rarement les 50 % et dans la plupart des rapports
sont même considérablement moindres. Le système racinaire produit in vitro est généralement de
mauvaise qualité ce qui explique les difficultés rencontrés lors de l’acclimatation des vitroplants
de P. vera L. (Chatibi, 1999).
4- PRESENTATION DES OBJECTIFS DE LA THESE
L’étude bibliographique montre l’importance écologique et économique du pistachier fruitier
mais également les difficultés rencontrées lors de sa multiplication classique. Malgré, les
quelques travaux réalisés sur l’introduction in vitro de Pistacia vera L. à partir de différents
explants (nœuds, bourgeons, méristèmes, feuilles, embryons), les résultats obtenus restent
aléatoires. De plus, la réussite de la technique in vitro est liée étroitement à l’enracinement et
l’acclimatation des vitroplants obtenus. Ces deux dernières étapes sont très délicates pour le
pistachier, espèce récalcitrante, dont les taux de rhizogenèse in vitro et de reprise après
acclimatation sont faibles voir nuls dans certains cas.
Compte tenu des contraintes décrites ci-dessus, nous avons entrepris ce travail avec pour
objectif principal d’améliorer les résultats de la micropropagation in vitro chez le pistachier vrai
(Pistacia vera L.). Nous avons conduit des expérimentations à partir de différents explants, âgés
et/ou juvéniles, dans lesquels nous avons fait varier les compositions minérales, organiques et
hormonales des milieux nutritifs. Certaines substances ont été testées pour la première fois chez
le pistachier fruitier, c’est le cas de la méta-topoline et le paclobutrazol. De plus, l’enracinement
ex-vitro n’avait jamais été étudié chez Pistacia vera L.
Au cours de ce travail nous avons essayé d’améliorer les différentes étapes de la
micropropagation. Pour cela, six thèmes ont été abordés, présentés dans les paragraphes suivants.
-
Dans un premier temps, nous avons étudié en détail la culture in vitro d’embryons
isolés de Pistacia vera L. L’effet du milieu de culture, sa concentration en agar-agar, la
dose en saccharose et en charbon actif ainsi que l’influence de l’intensité lumineuse sur la
germination et le développement in vitro des axes embryonnaires ont été étudié. Le
comportement des embryons isolés soumis à des contraintes abiotiques : stress salin
(NaCl) et hydrique (PEG 6000) a été suivi.
-
Dans un second temps nous avons essayé de résoudre certains problèmes
d’établissement des cultures in vitro à partir des bourgeons axillaires (arbres âgés,
plantules élevées en serre). Différents traitements ont été testés liés particulièrement à la
désinfection des explants, l’oxydation du milieu de culture ainsi que la réactivité du
matériel végétal du départ.
-
Le troisième thème a été consacré à l’étude de la prolifération in vitro des bourgeons
axillaires. Durant cette phase de multiplication, nous avons précisé le rôle de la nature de
cytokinine et sa concentration sur le bourgeonnement axillaire et l’aspect qualitatif des
pousses feuillées obtenues.
-
L’enracinement et l’acclimatation ont constitué le quatrième thème. Nous avons essayé
de déterminer les conditions optimales de l’enracinement (in vitro et ex vitro) et de
l’acclimatation. Pour cela, l’étude a porté sur l’incidence du milieu d’induction racinaire,
la nature et la concentration auxinique, le mode du traitement rhizogène, le milieu
d’expression racinaire (gélosé, liquide+vermiculite) sur les taux d’enracinement et de
reprise au cours de l’acclimatation. Nous avons précisé également l’effet du milieu de
multiplication sur la formation des racines adventives.
-
Le cinquième thème a été consacré à l’identification du sexe de jeunes plants : pieds
mâles et femelles chez le pistachier fruitier (Pistacia vera L) par l’utilisation des
marqueurs moléculaires SCAR. Une nouvelle approche utilisant les trichomes a été
proposée.
-
Et en dernier lieu, le sixième thème est relatif à la cryoconservation. Des essais de
conservation des axes embryonnaires de P. vera dans l’azote liquide (-196°C) ont
également effectué. Enfin la thèse se conclura en dégageant les perspectives de ce travail.
Chapitre II – Matériels & Méthodes
Nous présentons dans ce chapitre de façon générale, les matériels et techniques relatifs aux
différentes expérimentations effectuées dans les conditions in vitro ou en serre ; ensuite, une
description détaillée du matériel biologique et les méthodes spécifiques utilisées sont données
dans chaque chapitre.
1- MATERIEL VEGETAL
1.1- Provenance du matériel biologique
Tout le matériel végétal utilisé dans ce travail appartient à l’espèce Pistacia vera L. Il a été
récolté du verger d’El Fehoul (Wilaya de Tlemcen). Ce matériel a été transporté à l’Agrocampus
- Ouest, centre d’Angers - France) ; il est composé de :
-
Graines libérées de leur épicarpe et séchées naturellement, ont été récoltées à maturité
(au mois de septembre) sur des pieds élites puis conservées à la température du
laboratoire.
Boutures de nœuds d’environ 20 cm sont prélevés sur des rameaux de l’année récoltés
sur des sujets âgés d’environ 30 ans. Elles sont débarrassées de leurs feuilles et nettoyées
à l’eau savonnée.
1.2- Types d’explants utilisés
Le matériel végétal destiné à l’établissement des cultures in vitro est constitué :
- D’embryons zygotiques prélevés de graines matures.
- De pousses herbacées prélevées de jeunes semis élevées en pots, sous serre.
- De boutures de nœud lignifiées ou herbacées prélevées sur des sujets adultes.
2- DESINFECTION DU MATERIEL VEGETAL
La stérilisation du matériel végétal destiné à l’introduction des cultures in vitro est effectuée
sous hotte à flux laminaire suivant deux protocoles de désinfection :
2.1- Technique à base de bichlorure de mercure
Après rinçage rapide (environ 60 secondes) dans l’éthanol 70 % (v/v), les explants sont
trempés pendant 10 à 15 min (selon le type des explants), dans une solution désinfectante de
bichlorure de mercure (HgCl2) à 0,1% (w/v) additionnée de quelques gouttes d’un agent
mouillant (détergeant) .
Afin de limiter la toxicité due au mercure, les explants sont rincés deux fois (10 min) dans une
solution stérile de bichlorure de calcium (CaCl2) à 0,3% (w/v). Ils sont ensuite rincés 3 fois dans
l’eau distillée stérile.
2.2- Technique à base d’hypochlorite de sodium
Les explants sont tout d’abord rincés (60 secondes) dans l’éthanol 70 % (v/v), puis trempés
pendant 10 à 15 min (selon le type des explants), dans une solution d’hypochlorite de sodium
(NaClO à 2,6 % de chlore actif) additionnée de quelques gouttes d’un agent mouillant
(détergeant). Les explants sont ensuite rincés trois fois à l’eau distillée stérile.
* Remarques
-
Avant de procéder la désinfection, les extrémités des fragments de tige contenant 2 à 4
bourgeons ont été trempées dans la paraffine.
Les segments de tiges provenant d’arbres adultes sont traités également par le PPM® à
0,2% (v/v).
Après le dernier rinçage, les graines désinfectées sont maintenues dans l’eau distillée
stérile pendant une nuit pour augmenter l’imbibition des cotylédons et faciliter le
prélèvement des axes embryonnaires.
3- MILIEUX DE CULTURE UTILISES
3.1- Composition des milieux testés
Plusieurs milieux de culture, variant par les apports en macroéléments (Tableau 7) et les
phytohormones, ont été testés. Ces milieux sont complétés selon le but de l’expérience par des
additifs qui seront décrites dans les chapitres concernés.
Les solutions macrominérales étudiées sont :
- Le milieu de Murashige et Skoog (1962) complet ou dilué nommé respectivement MS et
MS/2.
- Le milieu de Driver et Kuniyuki (1984), nommé DKW.
- Le milieu de Knop (1884), nommé KN.
- Le milieu de White (1936), nommé WT.
Tous les milieux de culture testés contiennent les micro-éléments et la solution ferrique de
Murashige et Skoog (1962), les vitamines B5 de Gamborg et al. (1968), myo-inositol (100 mg l1
), hydrolysat de caséine (500 mg l-1) et nitrates d’argent AgNO3 (1 mg l-1). Ces milieux sont
complétés selon le but de l’expérience par des additifs qui seront mentionnés dans les chapitres
appropriés.
3.2- Régulateurs de croissance étudiés
Différents régulateurs de croissance, appartenant à trois groupes différents de
phytohormones (Cytokinines, Gibbérellines et Auxines), ont été testés :
•
Culture de nœud : 6-benzylaminopurine (BAP), Kinétine (KIN), Zéatine (Z) et
Thidiazuron (TDZ) associés ou non à l’acide indole- butyrique (AIB) et/ou à l’acide
gibbérellique (GA3).
•
Prolifération des bourgeons axillaires : 6-benzylaminopurine (BAP), Kinétine (KIN),
Acide indole- butyrique (AIB), Acide gibbérellique (GA3) et méta-Topoline (mT) qui est
une cytokinine aromatique.
•
Enracinement in vitro : Acide indole- butyrique (AIB), Acide naphtalène acétique
(ANA), Acide 3-(Benzo(b)selenyl) acétique (BSAA), Paclobutrazol (PBZ) et l’acide
jasmonique (AcJas).
La GA3, les auxines et les cytokinines sont dissoutes préalablement dans quelques gouttes
d’éthanol, de NaOH (1N) ou de KOH (1N), respectivement avant leur dilution dans de l’eau
distillée (Tableau 8).
Tableau 7. Composition des milieux de culture testés (en mg/l)
Milieux
MS
DKW
KN
WT
Macroéléments
NH4NO3 …………………………..
KNO3 ……………………………..
Ca (NO3)2. 4H2O ………………….
CaCl2.2H2O ……………………….
K2SO4 ……………………………..
MgSO4.7H2O ……………………...
KH2PO4 …………………………...
KCl ………………………………..
Na2 SO4 …………………………...
Na H2 PO4. H2O …………………..
1650
1900
440
370
170
-
1416
1968
149
1559
740
265
-
250
1000
250
250
-
80
288
737
65
460
19
Micro-éléments
MnSO4.4H2O ……………………...
H3BO3 ……………………………..
KI ...……………………………….
CuSO4 .5H2O ..……………………
Na2M0O4.2H2O ...………………….
ZnSO4 .7H2O ...……………………
CoCl2 6H2O ...……………………..
22,3
6,2
0,83
0,025
0,25
8,6
0,025
22,3
6,2
0,83
0,025
0,25
8,6
0,025
22,3
6,2
0,83
0,025
0,25
8,6
0,025
22,3
6,2
0,83
0,025
0,25
8,6
0,025
Fer
FeSO4. 7H2O ……………………...
Na2EDTA.2H2O …………………..
27,8
37,3
27,8
37,3
27,8
37,3
27,8
37,3
Vitamines B5
Thiamine Hydrochloride (vit.B1)
Acide Nicotinique
Chlorhydrate de Pyridoxal (Vit.B6)
Myo-inositol
1
0,1
0,1
100
1
0,1
0,1
100
1
0,1
0,1
100
1
0,1
0,1
100
Tableau 8. Solvants, conditions de stockage et modes de stérilisations des principaux régulateurs de croissances
testés
Régulateurs de
croissance
BAP
Kinétine
Zéatine
mT
TDZ
GA3
AIB
ANA
BSAA
Acide Jasmonique
PBZ
Conditions de stockage
Poudre
Solution
solvant
Diluent
1N NaOH
1N NaOH
1N NaOH
KOH 1 N
DMSO
Ethanol
Ethanol ou 1N NaOH
1N NaOH
KOH 1 N
Ethanol
Eau
Eau
Eau
Eau
Eau
Eau
Eau
Eau
Eau
Eau
TA
- 0°C
- 0°C
0-5°C
TA
TA
0-5°C
TA
0-5°C
0-5°C
0-5°C
- 0°C
- 0°C
0-5°C
0-5°C
0-5°C
- 0°C
0-5°C
0-5°C
0-5°C
A/F
A/F
A/F
A/F
A/F
A/F
A/F
A
A/F
F
Ethanol 80° (ne pas
dépasser 20mg/l)
Eau
TA
- 0°C
F
A/F : autoclavage/Filtration ; TA : température ambiante ;
Stérilisation
3.3- Autres additifs
D’autres additifs ont été additionnés aux milieux nutritifs testés selon l’expérimentation et
l’étape de la culture. Il s’agit des additifs suivants :
-
Source carbonée : saccharose.
Polyvinylpyrolidone (PVP 10).
Sel : NaCl.
Charbon actif (CA).
Polyéthylène Glycol (PEG 6000).
Agar-agar.
Vermiculite.
Les concentrations étudiées seront citées dans les chapitres appropriés.
3.4- pH des milieux nutritifs et les récipients de culture utilisés
Tous les milieux de culture testés ont été ajustés à un pH de 5,7 à l’aide de la solution de
KOH 0,1N ou HCl 0,1N.
Les cultures ont été effectuées dans différents récipients et ça selon les explants utilisés et
l’étape de la culture :
-
Pour la culture d’embryons isolés et des segments nodaux, les cultures ont été effectuées
dans des tubes à essai en verre pyrex de 22 mm de diamètre et de 150 mm de longueur
contenant 15 ml de milieu nutritif.
Pour la phase de prolifération des bourgeons axillaires (phase de multiplication) et
d’enracinement in vitro, les explants ont été repiqués dans des bocaux en verre d’une
capacité de 500 ml renfermant 100 ml de milieu nutritif.
Certains essais d’induction racinaire ont été effectués dans des tubes en verre de 30 mm
de diamètre et de 200 mm de longueur contenant la vermiculite humidifiée par le milieu
liquide de KN ou MS.
3.5- Stérilisation des milieux de culture
Tous les milieux de culture testés ont été autoclavés à une température de 113°C pendant 20
min. Certaines substances thermolabiles, telles que le paclobutrazol (PBZ) et l’acide jasmonique
(AcJas) ont été stérilisés à froid par des filtres millipores stériles de 0,22μm, puis ajoutés sous
hotte à flux laminaire au milieu déjà stérilisé.
4- CONDITIONS DE CULTURE
-
La température dans les chambres de culture est maintenue à 22°C avec une photopériode
de 16 heures par cycle de 24 heures.
La lumineuse dans les étagères est assurée par des tubes fluorescents type «Cool White».
Pour les essais de la culture d’embryons isolés, deux intensités lumineuses ont été testées.
Elles seront exposées dans le chapitre concerné.
La phase d’induction racinaire in vitro a été effectuée dans une chambre obscure à une
température de 22°C.
5- ACCLIMATATION DES VITROPLANTS
5.1- Vitroplants enracinés in vitro
Une fois débarrassées de leur milieu de culture agarisé, les vitroplants enracinés ont été
transférés, à raison d’une microplante par pot, dans un mélange horticole composé de tourbeperlite-vermiculite (1 :1 :1 v/v/v). Ces vitroplants ont été placés dans des mini-serres munies
d’une protection transparente destinée à maintenir une humidité relative élevée dans leur
environnement d’acclimatation et placées dans une chambre climatisée avec les mêmes
conditions ambiants que celle de l’in vitro. Après environ 10 jours, les couvercles sont ouverts
légèrement puis complètement après 15 jours environ.
5.2- Enracinement ex vitro
La technique d’enracinement ex vitro des microplants sera donnée plus en détails dans le
chapitre concerné. Cette méthode regroupe la phase d’enracinement et d’acclimatation en une
seule étape. Les micropousses issues de la phase de prolifération ont été lavées à l’eau courante
pour éliminer le reste du milieu de culture. La base des vitroplants est passée dans la poudre
auxinique testée. Les microplantules ainsi traitées sont insérées dans des mottes Fertiss®
contenues dans des mini serres. Les vitroplants enracinés sont transplantés dans des pots en
plastique contenant de tourbe-perlite-vermiculite (1 :1 :1 v/v/v) puis transférés en serre.
6- ETUDE CHROMOSOMIQUE ET MOLECULAIRE
Les techniques de dénombrement chromosomique et d’identification du sexe chez le
pistachier vrai (P. vera L.) sont décrites en détaille dans le chapitre VII. Néanmoins, nous
présentons ici brièvement les principales étapes expérimentales effectuées.
6.1- Dénombrement chromosomique
Le nombre chromosomique chez le pistachier fruitier a été déterminé à partir des extrémités
de racines prélevées sur des vitrosemis en phase de croissance active. Ces apex racinaires ont
subi différents traitements : colchicine, fixateur, enzyme. Les échantillons sont ensuite déposés
sur une lame puis écraser et étaler rapidement en présence de 10µl du fixateur.
Les observations ont été effectuées au microscope (Leica) muni d’une caméra et la prise des
photos est réalisée grâce à un logiciel MetaVue (Cyto Génétique Fluo).
6.2- Étude moléculaire
Une étude d’identification du sexe a été effectuée sur des feuilles de jeunes plantules élevées
en serre et de vitroplants. Après avoir été lyophilisées, les feuilles ont été moulues
mécaniquement. Les principales étapes de cette étude sont les suivantes :
-
Extraction de l’ADN génomique : nous avons opté pour le protocole décrit par Doyle et
Doyle, 1990.
Réactions en chaîne de la polymérase (PCR) : Quatre amorces ont été utilisées : SCO08For, SCO-08Rev, PVF1 et PVF2.
Les réactions d’amplifications ont été effectuées par volume de 25µl dans un
thermocycler modèle C1000TM Thermal Cycler.
-
Electrophorèse des fragments d’ADN amplifiés : les produits d’amplification ont été
séparés sur un gel d’agarose à 1,5%. Ces gels sont ensuite colorés dans un bain de
bromure d’éthidium (BEt) et photographiés sous lumière UV. La taille des bandes
obtenues a été estimée grâce au marqueur de poids moléculaire 1kb DNA Ladder.
7- CRYOCONSERVATION DES AXES EMBRYONNAIRES
Des essais de cryoconservation des axes embryonnaires isolés de graines matures de P. vera
L. ont été effectués. Afin de déterminer la teneur en eau idéale pour la congélation d’embryons
zygotiques dans l’azote liquide (-196°C), différentes durées de déshydratation sur silica gel ont
été étudiées. Les principales étapes de l’expérimentation effectuée sont les suivantes :
-
Prélèvement des axes embryonnaires (voir chapitre III).
Déshydratation sur silica gel (0, 30, 60, 90 et 120 min) : pour chaque traitement, un lot
des axes embryonnaires est cultivé directement sur MS0 additionné de 0,2% charbon actif
(CA).
Congélation : l’autre lot d’embryons de chaque traitement de déshydratation est transféré
à sec dans des tubes cryobilogiques puis congelés dans l’azote liquide par immersion
directe.
Réchauffement : Après environ 2h de congélation, les axes embryonnaires ont été
réchauffés pendant 1 min dans un bain marie réglé à 40°C puis cultivé eux aussi sur le
milieu nutritif (MS0 + 0,2% CA).
Les cultures sont placées durant les 3 premiers jours à l’obscurité ensuite transférés à la
lumière 40µmol m-2 s-1. Les taux de survie, de contamination, de germination et de
développement in vitro des plantules ont été relevé après 30 jours.
8- ANALYSES STATISTIQUES
Les études statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel « STATGRAPHICS Plus ».
Les résultats obtenus ont été traités par analyse de la variance (ANOVA) et les moyennes
significativement différentes ont été séparées par le test de Duncan au seuil de probabilité de 5%.
Les résultats sont représentés par les moyennes ± les écart types (SE).
Chapitre III - Culture in vitro
d’embryons isolés de Pistacia vera L.
1- INTRODUCTION
La production de jeunes pousses par la technique de la culture in vitro d’embryons
zygotiques doit améliorer le taux de succès et réduire considérablement les risques de
contamination et d’oxydation phénoliques in vitro qui souvent observées en micropropagation
des espèces ligneuses.
La composition minérale appropriée des milieux de culture (Tombolato et Monet, 1984 ;
Sanchez-Zamora et al, 2006) et des apports de saccharose adaptés (Jay-Allemand et Cornu,
1986 ; Garcia et al, 2002) sont indispensables pour le développement équilibré et complet des
embryons cultivés in vitro. Ce développement n’est assuré que par une bonne absorption de l’eau
et des métabolites du milieu nutritif. La dose en agar-agar, agent solidifiant le plus fréquemment
utilisé, semble avoir un effet direct sur l’alimentation des explants en culture in vitro (Gürel et
Gülsen, 1998 ; Casanova et al, 2008).
Le but de nos essais est de déterminer les meilleurs conditions de développement in vitro des
axes embryonnaires de Pistacia vera L. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés également
à l’effet de la contrainte saline et du stress hydrique sur le comportement de vitrosemis de
pistachier fruitier en condition in vitro.
2- TECHNIQUE DE PRELEVEMENT ET MISE EN CULTURE DES AXES EMBRYONNAIRES
Après une désinfection de 10 min dans l’hypochlorite de sodium (voir chap. II), les graines
(Figure 11A) sont maintenues dans l’eau distillée stérile du dernier rinçage pendant une nuit pour
augmenter l’imbibition des cotylédons et faciliter le prélèvement des axes embryonnaires.
Le prélèvement des embryons se fait en ouvrant les graines à l’aide de pinces chirurgicales
et en détachant l’axe embryonnaire du cotylédon auquel il adhère encore (Figure 11B), à l’aide
d’un scalpel en faisant attention à ne pas endommager les embryons (Figure 11C). Les axes
embryonnaires sont mis en culture sur les différents milieux testés.
Figure 11. Matériel végétal utilisé.
A)- Graines matures désinfectées ; B)- Axe embryonnaire encore attaché au
cotylédon ; C)- embryon isolé du cotylédon (Barre = 1 cm (A) et 4 mm (C))
3- EFFET
DU MILIEU DE CULTURE, DE LA CONCENTRATION EN AGAR-AGAR ET LA DOSE EN
SACCHAROSE
3.1- Milieux et conditions de culture
Les milieux de culture étudiés diffèrent par leur composition en macroéléments. Ces milieux
contiennent tous les micro-éléments et la solution ferrique de Murashige et Skoog (1962), les
vitamines B5 de Gamborg et al. (1968), myo-inositol (100 mg l-1), hydrolysat de caséine (500 mg
l-1). Sans aucun régulateur de croissance, ces solutions nutritives ont été comparées, soit en
milieu semi solide à 4 g l-1 ou en milieu solide à 8 g l-1 par Bacto-agar Difco. La concentration de
saccharose est modifiée selon l’expérimentation (30 g l-1est la dose témoin). Le pH des milieux
de culture a été ajusté à 5,7 avec KOH 0,1 N avant passage en autoclave à 113°C pendant 20
min.
Les embryons ensemencés en tubes (22 x 150 mm) contenant 15 ml de milieu nutritif, sont
placés en chambre de culture à 22°C, avec une photopériode de 16 heures et une intensité
lumineuse de 90µmol m-2 s-1.
3.2- Paramètres d’appréciation
Après 30 jours de culture, les paramètres suivants sont mesurés : la germination, la longueur
de la tige et de la racine principale, le poids frais de la partie aérienne et du système racinaire, le
nombre moyen de feuilles par embryon développé.
3.3- Résultats
3.3.1- Germination in vitro des embryons isolés
Les différents milieux étudiés n’ont pas entraîné de différences significatives du nombre
d’embryons développés. Au cours de l’expérimentation menée, les taux de germination in vitro
des axes embryonnaires ont varié entre 85,4 et 95,8 % obtenus respectivement sur WT et DKW
(Figure 12).
0.4%
Germination in vitro (%)
100
0.8%
80
60
40
20
0
MS
DKW
KN
WT
Milieux
Figure 12. Effet du milieu de culture et sa concentration
en agar-agar sur le pourcentage de germination in vitro
des embryons isolés après 30 jours de culture.
3.3.2- Croissance et développement des vitrosemis
3.3.2.1- Effet du milieu de culture et de sa concentration en agar-agar
L’effet quantitatif et qualitatif des solutions minérales étudiées a été constaté à la fin de
l’expérimentation. En effet, le poids frais moyen des embryons cultivés sur les milieux gélosés à
4 g l-1 d’agar est supérieur à celui des embryons développés dans des milieux solidifiés à 8 g l-1
d’agar. La réduction de la concentration en agar est favorable pour toutes les solutions nutritives
testées (Figure13 A,B).
Le choix d’une solution minérale ne peut se faire seulement sur la synthèse de la matière
fraîche qu’elle permet d’obtenir par unité de temps. En effet, les résultats résumés dans le tableau
9 nous permettent également de distinguer l’efficacité comparable des solutions nutritives
étudiées sur le développement équilibré des embryons isolés de Pistacia vera L.
Tableau 9. Effet du milieu de culture et sa concentration en agar-agar sur la longueur moyenne de la partie aérienne
et racinaire ainsi que le nombre de feuilles néoformées par embryon développé après 30 jours de culture.
Milieu gélosé
à 8 g l-1
MS
DKW
KN
WT
Milieu gélosé
à 4 g l-1
MS
DKW
KN
WT
Longueur (cm)
Racine
Partie aérienne
Nombre moyen des feuilles par
embryon développé
3,4 ± 1,8bc
2.7 ± 1.3c
3,7 ± 1,9ab
4,3 ± 1,6a
1,8 ± 0,5a
1.8 ± 0.6a
1,4 ± 0,5b
1,1 ± 0,4b
7,6 ± 2,8a
7.5 ± 2.3a
6,1 ± 2,6b
5,0 ± 2,1b
4,0 ± 1,9a
4,0 ± 1.8a
4,8 ± 2,1a
4,6 ± 1,9a
2,5 ± 0,8a
2.6 ± 0.7a
1,7 ± 0,5b
1,3 ± 0,4c
9,3 ± 1,8a
8.4 ± 1.6ab
7,5 ± 2,4bc
7,0 ± 1,6c
Les valeurs représentent la moyenne de 30 explants par traitement. Ces valeurs ayant les mêmes lettres pour une même colonne
de la même dose d’agar ne présentent pas de différence significative à 5%.
Les milieux riches (MS et DKW) solidifiés à 4 g l-1 d’agar assurent le meilleur
développement de la partie aérienne avec une bonne organogenèse foliaire. Cependant, les
milieux pauvres (KN et WT) semblent plus favorables au développement racinaire chez le
pistachier (Figure 14).
3.3.2.2- Effet de la concentration en saccharose
L’effet de différentes concentrations en saccharose sur la longueur de la partie aérienne et
racinaire ainsi que l’organogenèse foliaire des embryons isolés est rapporté dans le tableau 10.
Tableau 10. Effet de la concentration en saccharose sur la longueur moyenne de la partie aérienne et racinaire ainsi
que le nombre de feuilles néoformées par embryon développé après 30 jours de culture sur le milieu de base de MS0
(sans hormone), solidifié à 4 g l-1 agar-agar.
Longueur (cm)
Concentration
en saccharose (g l-1)
Nombre moyen des feuilles par
embryon développé
Racine
Partie aérienne
10
20
3,2 ± 2,0c
3,5 ± 2,0c
1,8 ± 0,6c
2,6 ± 0,9a
6,0 ± 2,3c
7,2 ± 1,9b
30
4,0 ± 2,1bc
2,5 ± 0,8ab
9,4 ± 2,0a
40
5,9 ± 2,7a
2,1 ± 0,8bc
5,7 ± 2,1c
60
5,3 ± 2,5ab
1,4 ± 0,3d
5,4 ± 1,6c
120
4,8 ± 3,4ab
1,0 ± 0,2e
1,9 ± 1,8d
Les valeurs représentent la moyenne de 25 explants par traitement. Ces valeurs ayant les mêmes lettres pour une même colonne
ne présentent pas de différence significative à 5%.
Les doses de 20 à 40 g l-1 de saccharose sont plus favorables au développement in vitro des
axes embryonnaires. Elles assurent une bonne croissance et une meilleure organogenèse. A plus
fortes concentrations (60 et 120 g l-1) l’allongement de la tige et la production de feuilles par
embryon diminuent. Une faible teneur en saccharose (10 g l-1) ralentit la croissance des
embryons (Figure 15). L’inhibition de la croissance de la partie aérienne est liée à la production
de la matière fraîche racinaire. En effet, le poids frais racinaire est significativement élevé avec
les fortes concentrations en saccharose (Figure 13C).
Partie aérienne
200
180
Racine
a
200
(A)
A
120
b
c
100
80
A
AB
c
B
60
Poids frais (mg)
Poids frais (mg)
b
160
140
120
100
80
B
cd
40
20
0
0
B
de
C
10
(B)
B
BC
e
60
20
a
A
bc
140
40
120
(C)
a
180
160
20
30
40
60
Saccharose (g/l)
120
Poids frais (mg)
100
a
80
60
b
A
AB
40
b
B
B
KN
WT
20
0
MS
DKW
Milieux
Figure 13. Effet du milieu de culture et sa
concentration en agar-agar (A: 4 g l-1; B: 8 g l-1)
ainsi que la dose en saccharose (C) sur le poids frais
de la partie aérienne et racinaire des vitrosemis de
Pistacia vera L après 1 mois de culture. Les valeurs
ayant les mêmes lettres ne présentent pas de
différence significative à 5%.)
Figure 14. Développement in vitro d’embryons isolés de Pistacia vera L
après 30 jours de culture sur les milieux nutritifs solidifiés à 4 g l-1 d’agaragar de WT (A), KN (B), DKW (C) et MS (D) (Barre = 1 cm).
Figure 15. Effet de la concentration en saccharose sur le développement in vitro des
embryons isolés de Pistacia vera L après 30 jours de culture sur le milieu de base MS0
solidifié par 4 g l-1 agar-agar et additionné de saccharose à la dose de 10 g l-1 (A), 20 g l-1
(B), 30 g l-1 (C), 40 g l-1 (D), 60 g l-1 (E), 120 g l-1 (F) (Barre = 1 cm).
3.4- Discussion et Conclusion
Les milieux nutritifs utilisés en culture in vitro d’embryons matures de nombreuses espèces
végétales sont très variés. On distingue les milieux à faible concentration ionique et les milieux
fortement concentrés. Nos essais réalisés sur les axes embryonnaires de P. vera L. ont montré
que les milieux « riches » sont plus favorables à leur développement in vitro. En effet, le milieu
de Murashige et Skoog a permis d’induire un développement homogène des embryons.
Cependant, les milieux « pauvres » de Knop et White apparaissent favorables au développement
du système racinaire. Ces résultats sont similaires avec ceux obtenus par Tombolato et Monet,
1984. Ces auteurs signalent que les milieux riches sont bénéfiques à la synthèse de la matière
fraîche chez les embryons de pêcher. Cependant, Abousalim et al, 1992 ont montré que les
milieux de culture à faible concentration ionique sont plus favorables à la croissance de plantules
de Pistacia vera L. issues de la germination in vitro de graines (embryons avec leur cotylédons).
Dans nos expérimentations, nous avons utilisé uniquement les axes embryonnaires (embryons
privés de leur cotylédons) pour apprécier l’effet du milieu de culture. Ces embryons associant
radicule et gemmule vont extérioriser les effets du milieu nutritif sur ces deux parties essentielles
d’une plantule.
L’état physique du milieu peut avoir son importance dans le comportement des explants en
milieu artificiel. L’analyse des résultats met en valeur l’intérêt de la réduction de la concentration
en agar-agar. En effet, le poids frais total des embryons est toujours supérieur sur les milieux
dont la dose en agar est réduite de moitié. Casanova et al. (2008) soulignent l’importance de la
concentration en agar-agar dans l’organogenèse in vitro de Dianthus caryophyllus L. Les
meilleurs résultats ont été observés avec les faibles doses. L’enrichissement du milieu en agar
empêche l’extraction et l’absorption des substances nutritives du milieu de culture (Tombolato et
Monet, 1984).
Utilisé à différentes doses, le saccharose oriente significativement le développement des
axes embryonnaires chez Pistacia vera L. Les concentrations de 20 à 40 g l-1 sont les plus
favorables à l’organogenèse des embryons isolés de cette essence. En outre, elles assurent un bon
aspect morphologique. En revanche, les fortes doses (60 et 120 g l-1) ralentissent nettement la
croissance des vitrosemis. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus par Thomas (1980) chez
Pinus sylvestris et Jay-Allemand et Cornu (1986) chez Juglans regia L. Ces chercheurs
signalent que le saccharose intervient sur les équilibres de croissance et sur la localisation des
mitoses. Ils précisent que les fortes concentrations de saccharose, établissant de hautes pressions
osmotiques, peuvent réduire le transport de l’eau et des nutriments de la racine vers la partie
aérienne.
4- EFFET DE LA L’AGENT DESINFECTANT ET L’INTENSITE LUMINEUSE
4.1- Introduction
La réussite de l’établissement des cultures in vitro dépend de plusieurs facteurs, notamment
l’asepsie et la reprise de la croissance. L’élimination des contaminants microbiologiques
nécessite généralement une désinfection des explants primaires. Plusieurs produits chimiques
sont utilisés pour se débarrasser des contaminants. Cependant, le choix de l’agent désinfectant
est indispensable. Sa nature, sa concentration ainsi que la durée de trempage sont des facteurs
clés de la réussite de la technique. Des traitements désinfectants peuvent éliminer complètement
les contaminants mais dans beaucoup de cas, ils affectent la reprise de croissance ultérieure des
explants.
La réponse morphogénétique en conditions in vitro dépend de nombreux facteurs. En plus
des conditions nutritionnelles (trophiques), les facteurs ambiants, notamment la lumière peuvent
affecter le développement et la croissance. Les exigences des cultures in vitro en lumière sont
complètement différentes de celles de la plante entière autotrophes puisque la source carbonée
est fournie (généralement le saccharose). L’intensité lumineuse parait cependant jouer un rôle
capital dans l’orientation morphogénétique.
L’objectif de cette expérimentation est d’étudier l’influence de l’agent désinfectant et de
l’intensité lumineuse sur le développement in vitro des embryons isolés et la croissance des
vitrosemis chez Pistacia vera L.
4.2- Techniques de désinfection
Après élimination des téguments, la désinfection des graines est effectuée par un trempage
d’une minute dans l’éthanol 70 % (v/v) puis de 10 min dans la solution désinfectante additionnée
de 2 à 3 gouttes de détergeant domestique. Deux technique de désinfection (à base de HgCl2 ou
NaClO) ont été étudiées (voir chapitre II). Les graines sont ensuite rincées trois fois à l’eau
distillée stérile puis maintenue dans l’eau du dernier rinçage pendant une nuit pour augmenter
l’imbibition des cotylédons et faciliter le prélèvement des axes embryonnaires.
4.3- Milieu nutritif et conditions de culture
Le milieu de culture utilisé est celui de MS0 précédemment retenu. Il contient les microéléments et la solution ferrique de Murashige et Skoog (1962), les vitamines B5 de Gamborg et
al. (1968), myo-inositol (100 mg l-1), hydrolysat de caséine (500 mg l-1) et saccharose (30 g l-1).
Sans aucun régulateur de croissance, ce milieu est solidifié à 4 g l-1 par Bacto-agar Difco.
Les embryons ensemencés en tubes (22 x 150 mm) contenant 15 ml de milieu nutritif sont
placés dans des chambres de cultures où la température est maintenue à 22°C avec une
photopériode de 16 heures par cycle de 24 heures, sous deux intensités lumineuses : 90 et
40µmol m-2 s-1.
Les paramètres suivants sont utilisés pour évaluer l’effet des facteurs étudiés : la
germination, la longueur de la tige et de la racine principale, le poids frais de la partie aérienne et
du système racinaire, le nombre moyen de feuilles par embryon développé.
4.4- Résultats
4.4.1- Effet sur le développement in vitro des embryons
Les résultats obtenus après 30 jours de culture ne montrent aucun effet significatif de l’agent
désinfectant sur le taux d’infection et de germination in vitro des embryons isolés de Pistacia
vera L. Une moyenne de 08,3% de contamination a été enregistrée chez les axes embryonnaires
désinfectés par le bichlorure de mercure (HgCl2) contre seulement 02,9% chez les embryons
désinfectés par l’hypochlorite de sodium (NaClO). Des taux moyens de développement in vitro
de 98,3 et 100% ont été obtenus chez les embryons désinfectés respectivement par HgCl2 et
NaClO (Tableau 11). Il est à signaler l’aspect qualitatif des graines des deux lots
expérimentaux testés : une décoloration des semences traitées au HgCl2 par opposition à celles
désinfectées au NaClO (Figure 16).
Les résultats montrent également que l’intensité lumineuse n’a pas influencée la germination
in vitro des axes embryonnaires. Les pourcentages fluctuent autour d’une moyenne de 98,5 et
100% obtenus chez les embryons cultivés respectivement sous une intensité lumineuse de 90 et
40µmol m-2 s-1 (Tableau 11).
Tableau 11. Effet de l’agent désinfectant et de l’intensité lumineuse sur le taux de contamination et de
développement in vitro des embryons isolés de Pistacia vera L. après 30 jours de culture sur le milieu de base MS0.
90µmol m-2 s-1
Nombre d’embryons mis en culture
% Contamination
% Germination in vitro
40µmol m-2 s-1
Moyennes :
HgCl2
NaClO
HgCl2
NaClO
HgCl2
NaClO
30
10,0
96,7
35
02,9
100
30
06,7
100
35
02,9
100
60
08,3
98,3a
70
02,9
100a
Moyennes :
% Contamination
% Germination in vitro
06,2
98,5a
04,6
100a
05,4
99,2
Les valeurs ayant les mêmes lettres pour une même ligne ne présentent pas de différence significative à 5%.
4.4.2- Effet sur la croissance des vitrosemis
Les résultats de croissance des vitrosemis montrent que l’agent désinfectant n’a pas affecté
les principaux paramètres de croissance testés (Figure 17A-D). Cependant, une intensité
lumineuse de 40µmol m-2 s-1 a amélioré significativement la croissance des vitrosemis dont la
longueur moyenne des tiges passe de 1,7 cm à 3,2 cm pour les vitrosemis cultivés
respectivement sous 90 et 40µmol m-2 s-1 (Figures 17A et 18 ). Il est à noter que malgré leur
taille réduite, les vitrosemis ayant séjournés sous la forte intensité lumineuse (90µmol m-2 s-1)
produisent un nombre moyen de feuilles de 11,2 (Figure 17C). Le nombre des entre-nœuds a
généralement suivi une tendance similaire à celle de la longueur des tiges. Le meilleur rendement
(en moyenne 5,4 entre-nœuds) a été enregistré chez les vitrosemis élevés sous une faible
intensité lumineuse (Figure 17D).
Figure 16. Influence de l’agent désinfectant sur l’aspect qualitatif des graines.
Noter le changement de la couleur des graines traitées au bichlorure de mercure (HgCl2 :
A) par rapport à celles désinfectées à l’hypochlorite de sodium (NaClO : B).
(A) 9
Parties aériennes
A
Longueur (cm)
A
a
5
a
4
b
3
Racines
200
7
6
Parties aériennes
a
A
A
b
2
Matière fraîche (mg)
8
(B)250
Racines
a
a
150
a
A
A
A
NaClO
HgCl2
A
100
50
1
0
0
HgCl2
NaClO
90µmol m-2 s-1
HgCl2
40µmol m-2 s-1
90µmol m-2 s-1
16
14
Nombre moyen
de feuilles/vitrosemis
NaClO
NaClO
40µmol m-2 s-1
(D) 8
a
a
a
a
a
7
Nombre moyen des entrenoeuds/vitrosemis
(C)
HgCl2
12
10
8
6
4
b
6
5
c
c
4
3
2
1
2
0
0
HgCl2
NaClO
90µmol m-2 s-1
HgCl2
NaClO
40µmol m-2 s-1
HgCl2
NaClO
-2 -1
90µmol m s
HgCl2
NaClO
-2 -1
40µmol m s
Figure 17. Effet de l’agent désinfectant et de l’intensité lumineuse sur les différents paramètres de
croissance de vitrosemis de Pistacia vera L. après 30 jours de culture sur MS0.
(A : Longueur ; B : Matière fraîche ; C : Nombre moyen de feuilles par vitrosemis ; D : Nombre moyen des entrenœuds par vitrosemis. Les valeurs ayant les mêmes lettres ne présentent pas de différence significative à 5%.)
Figure 18. Variation de la taille de vitrosemis élevés
sous deux intensités lumineuses 40 (A) et 90µmol
m-2 s-1 (B). (Barre = 1 cm)
4.5- Discussion et Conclusion
La désinfection au NaClO comme au HgCl2 a empêchée la prolifération des contaminants
microbiologiques et a permit d’obtenir des taux très élevés de germination in vitro des embryons
isolés chez le pistachier fruitier (Pistacia vera L.). Le niveau de contamination enregistré
(moyenne de 05,4%) n’est pas alarmant si on le compare avec d’autres matériels végétaux,
surtout les nœuds provenant d’arbres adultes (Voir Chapitre IV) où plus de 90% d’explants sont
contaminés au cours de l’étape d’établissement des cultures.
Nos essais réalisés ont montré cependant, l’effet significatif de l’intensité lumineuse sur la
croissance des vitrosemis. Une lumière modérée paraît suffire pour la croissance des organes
photosynthétiques durant cette première étape de la culture in vitro des embryons isolés. L’effet
bénéfique de la réduction de l’intensité lumineuse a été déjà signalé par plusieurs auteurs
(Bieysse et Cournac, 1993 ; Möller et al, 2006). Cependant, la culture d’embryons zygotiques de
certaines plantes, cas du noyer nécessite un passage de deux semaines à l’obscurité suivi de trois
semaines à la lumière (Jay-Allemand et Cornu, 1986).
D’un autre coté, Zine et al, 1988 ; Vina et al, 2001 et Shin et Murthy, 2008, signalent l’effet
de la qualité de lumière sur la morphogenèse et la croissance des vitroplants. En générale, le bleu
favorise la caulogenèse, le rouge la rhizogenèse.
5- EFFET DU CHARBON ACTIF SUR LA CROISSANCE DES VITROSEMIS
5.1- Introduction
En forêt, les effets bénéfiques du passage du feu sur le substrat de germination ont souvent
été liés à la présence de charbon et à son effet adsorbant sur les composés phénoliques qui
inhibent la germination et la croissance des semis. Le but de la présente étude visait à mettre en
évidence l'effet du charbon actif sur le développement in vitro des axes embryonnaires et la
croissance des vitrosemis du pistachier (Pistacia vera L.).
5.2- Technique expérimentale
Différentes concentrations de charbon actif (0 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 5 et 10 g l-1) ont été incorporées
dans le milieu de base de Murashige et Skoog (MS0) précédemment retenu et solidifié à 4 g l-1
par Difcoagar. Les embryons isolés de graines matures désinfectées par l’hypochlorite de sodium
(voir chapitre II) sont inoculés dans des tubes à essais en verre (22 x 150 mm) contenant 15 ml
de milieu nutritif et placés dans une chambre de cultures où la température est maintenue à 22°C
sous une intensité lumineuse de 40µmol m-2 s-1 avec une photopériode de 16 heures par jour.
Les paramètres d’appréciations sont : Développement in vitro (%), croissance des tiges et
des racines, organogenèse foliaire, nombre des entre-nœuds ainsi que les biomasses des matières
fraîches des organes aériens et du système racinaire. Le pourcentage d’amélioration de la
croissance est calculé selon la formule : 100 x ((traitement – témoin)/traitement).
5.3- Résultats
Les résultats obtenus montrent que l'ajout de charbon actif dans le milieu de culture n'a pas
eu d'effet sur la germination in vitro des embryons isolés de Pistacia vera L. Le taux de
développement a été de 100% pour l’ensemble des lots expérimentaux étudiés. Pour ce qui est de
la croissance des vitrosemis cependant, le charbon actif exerce un effet stimulateur, et ça pour
l’ensemble des paramètres d’appréciation et pour les différentes concentrations testées (Figure
19). Le pourcentage moyen d’amélioration de la croissance a été de 44,4% pour les organes
aériens et 67,4% pour le système racinaire (Tableau 12).
Tableau 12. Pourcentage d’amélioration de la croissance aérienne et racinaire des vitrosemis de Pistacia vera L.
cultivés sur différentes concentrations de charbon actif (CA).
[CA] g l-1
% d’amélioration de la partie aérienne
% d’amélioration de la partie racinaire
0,5
1
2
5
10
29,2
33,3
56,4
50,7
43,3
52,9
27,9
72,5
74,9
76,2
Moyenne
44,4
67,4
Parties aériennes
Racines
(A) 30
A
A
(B)
A
B
15
C
a
10
C
e
b
c
d
d
Matière fraîche (mg)
Longueur (cm)
20
210
A
c
B
180
A
AB
C
C
120
90
60
30
0
0
0,5
1
2
5
0
10
0,5
(C) 16
a
c
1
2
5
10
Charbon actif (g/l)
Charbon actif (g/l)
ab
abc
a
(D) 9
bc
8
d
Nombre moyen des entrenoeuds/vitrosemis
Nombre moyen
de feuilles/vitrosemis
ab
b
c
150
0
14
Racines
a
ab
240
25
5
Parties aériennes
270
12
10
8
6
4
2
7
b
c
bc
c
6
d
5
4
3
2
1
0
0
0
0,5
1
2
Charbon actif (g/l)
5
10
0
0,5
1
2
5
10
Charbon actif (g/l)
Figure 19. Effet du charbon actif sur les différents paramètres de croissance de vitrosemis de Pistacia
vera L. après 30 jours de culture sur le milieu de base MS0. (A : Longueur ; B : Matière fraîche ; C :
Nombre moyen de feuilles par vitrosemis ; D : Nombre moyen des entre-nœuds par vitrosemis. Les
valeurs représentent la moyenne de 40 mesures individuelles par concentration testée. Les valeurs ayant
les mêmes lettres ne présentent pas de différence significative à 5%.)
5.4- Discussion et Conclusion
L’adjonction de charbon actif dans le milieu de culture a eu un effet favorable sur la
croissance des vitrosemis de Pistacia vera L. Cette amélioration est nettement plus importante
chez la radicule (Figure 20). Le charbon actif adsorbe les polyphénols et les produits de leur
oxydation, qui sont des inhibiteurs de la croissance racinaire (Maene et Debergh, 1985). L’effet
bénéfique du charbon actif sur l’amélioration de la croissance tissulaire en conditions in vitro,
notamment des racines a été rapporté par plusieurs auteurs (Misson et al, 1983 ; Margara, 1989 ;
Pan et Staden, 1998 ; Bousselmame et al, 2001). Dumas et Monteuuis, 1995 signalent que
l’incorporation du charbon de bois dans le milieu de rhizogenèse améliore non seulement le taux
d’enracinement mais aussi la croissance et la qualité racinaire chez des microplants de Pinus
pinaster. Le charbon actif peut affecter l'activité et/ou la stabilité des régulateurs de croissance en
réduisant ou en excluant la lumière. De plus, il élimine des auxines inhibitrices de la croissance
racinaire (Bu et Cheng, 1988).
Figure 20. Morphologies comparées de vitrosemis âgés de 30 jours obtenus après
culture sur MS0 contenant différentes concentrations de charbon actif (g l-1) : A témoin (0) ; B (0,5) ; C (1) ; D (2) ; E (5) et F (10) (Barre = 1 cm)
6- EFFET D’UNE CONTRAINTE SALINE SUR LE COMPORTEMENT DES EMBRYONS ISOLES
6.1- Introduction
La salinisation des sols et la sécheresse sont des facteurs limitatifs majeurs de la production
agricole dans plusieurs pays méditerranéens. L’Algérie, dont une grande partie des régions
agricoles se caractérise par un climat aride et semi aride, est touchée par le processus de salinité.
Actuellement, près de 3,2 millions d’hectares sont menacés de salinisation dans ce pays. Parmi
les actions à entreprendre en vue de valoriser et de développer ces régions, les plantations à base
d’essences végétales adaptées, capables de résister à la sécheresse et de tolérer les sels
constituent une priorité. Le pistachier (Pistacia vera L.) est classé parmi les essences ligneuses
moyennement tolérantes à la salinité.
Les impacts du sel sur le développement et le rendement des plantes sont nombreux. Chez
plusieurs espèces végétales, les dégâts produits par le stress salin se manifestent communément
par une séquence de changements morphologiques et physiologiques (Levigneron et al, 1995).
Les fortes concentrations salines peuvent affecter les différents stades de développement de la
plante (Patridge et Wilson, 1987 ; Thamir et al, 1992). Elles entraînent un déséquilibre ionique et
une toxicité chez les végétaux, ce qui peut affecter certains processus métaboliques vitaux.
La culture in vitro a pris une importance croissante dans les programmes d'amélioration des
plantes pour la sélection de génotypes tolérants à la salinité (Fathi et Prat, 1989). Cette technique
constitue un test précoce et rapide pour évaluer et caractériser le comportement des espèces
végétales face à une contrainte saline (Pourrat et Dutuit, 1994). Elle a été utilisée avec succès
pour la sélection de clones tolérants la salinité chez l’oranger et le bigaradier (Kochba et al,
1982), l’eucalyptus (Morabito, 1994) et le jojoba (Roussos et al, 2007). Quelques recherches ont
été menées afin d’étudier l’effet de la salinité sur la croissance du pistachier fruitier en conditions
in vivo (Tavallali et al, 2008) cependant, les expériences effectuées dans les conditions in vitro
sont très rares (Chelli et al, 2008).
L’objectif de notre recherche est d’étudier l’effet du chlorure de sodium (NaCl) sur le
développement in vitro d’axes embryonnaires de Pistacia vera L. pour exploiter cette technique
dans la sélection précoce de clones tolérants au sel.
6.2-Milieux nutritifs et conditions de culture
Le milieu de culture de base (MS) se compose de sels minéraux de Murashige et Skoog
(1962), des vitamines B5 de Gamborg et al. (1968), de myo-inositol (100 mg l-1), d’hydrolysat de
caséine (500 mg l-1), de 30 g l-1 de saccharose et différentes concentrations en NaCl (0 ; 42,8 ;
85,5 ; 171,1 et 256,6 mM). Sans aucun régulateur de croissance, ce milieu a été semi solidifié par
du Bacto-agar Difco à 4 g l-1. Le pH a été ajusté à 5,7 avec KOH 0,1 N avant passage en
autoclave à 113 °C pendant 20 min.
Après la désinfection des graines à l’hypochlorite de sodium (voir chapitre II), les embryons
isolés ont été cultivés dans des tubes à essai (22 x 150 mm) contenant 15 ml de milieu nutritif et
placés dans une chambre de culture où l’intensité lumineuse est de 40µmol m-2 s-1, sous une
photopériode de 16 h par cycle de 24 h. La température autour des tubes a été maintenue à 22
°C.
6.3- Évaluation de la tolérance au stress salin in vitro
Afin d’explorer la réponse des embryons isolés à la salinité en conditions de culture in vitro,
des observations et des mesures relatives à la germination et à la croissance des vitroplants ont
été réalisées au terme d’un mois de culture. Cette réponse au sel est évaluée grâce aux
paramètres suivants : pourcentage de germination, taux de survie, longueur de la partie aérienne
et racinaire ainsi que le nombre moyen de feuilles formées par embryon développé. La biomasse,
déterminée par type d’organe (racines, parties aériennes), est mesurée par la masse de la matière
fraîche (MF), puis sèche (MS) après séchage dans une étuve à 65 °C pendant 48 h. Les pesées
ont été effectuées grâce à une balance de précision (Sartorius CP 225 D), et sont exprimées en
mg. La teneur en eau, exprimée en % MF (TE = 100 x ((MF – MS)/MF) est calculée après 1
mois de culture.
La réduction relative de la masse de matière exprimée en % du témoin, est une indication de
la vigueur relative des plantes sous les conditions de stress salin : % de réduction = 100 x
((traitement – témoin)/témoin).
6.4- Résultats
6.4.1. Effet de NaCl sur la germination in vitro et la survie des embryons
Après 1 mois de culture, les résultats obtenus montrent que la salinité n’a pas influencé la
germination in vitro des embryons isolés chez le pistachier fruitier (Pistacia vera L.). Tous les
axes embryonnaires mis en culture sur les différents milieux testés ont germé durant la première
semaine. Cependant, la contrainte saline affecte la survie des embryons germés dont le taux varie
entre 100 et 62,9% (Figure 21).
Germination in vitro et survie (%)
Germination in vitro
Survie
100
80
60
40
20
0
0
42,8
85,5
171,1
256,6
NaCl (mM)
Figure 21. Pourcentages de germination in vitro et de survie des embryons isolés de
Pistacia vera L. en fonction de la concentration en sel.
6.4.2. Effet de NaCl sur la croissance des vitrosemis
La présence de NaCl dans le milieu de culture entraîne, après 30 jours de culture, une
diminution significative de la longueur de la tige et la production de feuilles par embryon
développé. Cette réduction augmente avec la concentration du sel dans le milieu (Fig. 22A-F). A
la fin de l’essai, la longueur moyenne de la tige a été de 4 cm et 1,1 cm respectivement pour le
témoin et la concentration la plus élevée de NaCl. La réduction moyenne de la partie aérienne a
été de 56,9%. Cependant, le stress salin, à l’exception de la plus forte concentration testée (256,6
mM) améliore de façon significative l’allongement de la radicule qui passe de 3,4 cm pour le
témoin à 7,3 cm pour les concentrations de 42,8 et 85,5 mM (Tableau 13).
La diminution de la croissance de l’appareil végétatif est accompagnée d’une réduction de
l’organogenèse foliaire. En effet, le nombre moyen de feuilles par vitrosemis varie entre 9,8 pour
le témoin et 2,6 feuilles pour la concentration la plus élevée (Tableau 13).
Au niveau de la production des biomasses aériennes et racinaires, l’analyse statistique a
révélé un effet significatif du sel (p < 0,05). Ainsi, les concentrations élevées du NaCl entraînent
une diminution du poids sec des organes aériens (Figure 23) alors qu’elles améliorent celui des
racines (Figure 24). Le rapport de la matière sèche des racines/parties aériennes augmente avec
la concentration saline en raison de l’inhibition de la croissance des organes aériens. Il passe de
0,4 pour le témoin à 0,8 pour le milieu le plus concentré en NaCl (Tableau 13).
Tableau 13. Effet de la concentration en NaCl sur les paramètres de croissance, le nombre moyen de feuilles par
vitrosemis et le rapport MS racines/MS organes aériens. Les valeurs de la même ligne suivies de la même lettre ne
sont pas significativement différentes entre elles au seuil de 5% (N = 40 embryons développés par traitement).
NaCl (mM)
Paramètres
0
Longueur de la partie aérienne (cm)
Longueur des racines (cm)
Nombre moyen de feuilles/vitrosemis
MS racines/MS organes aériens (mg)
4,0 ± 0,8a
3,4 ± 2,0c
9,8 ± 1,2a
0,4 ± 0,1d
42,8
85,5
171,1
256,6
2,6 ± 0,5b
7,3 ± 1,8a
8,4 ± 1,2b
0,5 ± 0,1c
1,8 ± 0,4c
7,3 ± 1,9a
7,1 ± 1,1c
0,7 ± 0,2b
1,4 ± 0,2d
4,8 ± 1,7b
4,8 ± 1,6d
0,8 ± 0,3a
1,1 ± 0,3e
2,2 ± 0,8d
2,6 ± 1,1e
0,8 ± 0,3a
En ce qui concerne la turgescence des organes, les différentes concentrations salines testées
n’ont eu aucun effet sur l’état d’hydratation des vitrosemis qui est resté presque identique (84%
de la matière fraîche en moyenne) pour les différentes doses de NaCl et les différents organes.
Figure 22. Variation de la croissance des vitrosemis de Pistacia vera L. sous
l’effet de différentes concentrations salines (en mM) : 0 (A) ; 42,8 (B) ; 85,5
(C) ; 171,1 (D) ; 256,6 (E). F : vitrosemis totalement nécrosés en présence
de fortes concentrations salines (Barre = 1 cm).
(A)
80
84,6%
(A)
140
a
120
85,3%
100
b
80
81,5%
83,7%
c
83,8%
c
c
60
40
20
0
0
42,8
85,5
171,1
Matière fraîche du système racinaire (mg)
Matière fraîche des organes aériens (mg)
160
70
84,1%
60
a
85,7%
b
50
20
b
c
10
5
0
0
42,8
85,5
b
20
10
0
0
171,1
256,6
NaCl (mM)
Figure 23. Effet de la concentration en NaCl sur la
biomasse aérienne (A : matière fraîche, B : matière sèche)
des vitrosemis de Pistacia vera L. après un mois de
culture sur MS0.
Matière sèche du système racinaire (mg)
Matière sèche des organes aériens (mg)
a
c
a
42,8
85,5
171,1
256,6
NaCl (mM)
(B)
b
a
30
256,6
30
15
84,7
40
NaCl (mM)
25
81,5%
86,7%
(B)
14
12
10
b
a
c
c
8
c
6
4
2
0
0
42,8
85,5
171,1
256,6
NaCl (mM)
Figure 24. Effet de la concentration en NaCl sur la
biomasse du système racinaire (A : matière fraîche, B :
matière sèche) des vitrosemis de Pistacia vera L. après un
mois de culture sur MS0.
Les valeurs sur les histogrammes correspondent aux teneurs en eau, exprimées en % de la matière fraîche. Les valeurs suivies de la
même lettre ne sont pas significativement différentes (N = 40 embryons développés par traitement).
6.5- Discussion
Les résultats obtenus ont montré qu’une contrainte saline n’a pas affecté la germination in
vitro chez le pistachier fruitier (Pistacia vera L.). Pour l’ensemble des traitements appliqués, le
pourcentage final de germination a été de 100%. Des résultats similaires ont été obtenus chez la
même espèce en condition in vivo (Tavallali et al, 2008). Ainsi, la présence du sel peut améliorer
la germination chez certaines plantes, c’est le cas de mil : le taux de germination passe de 89,3%
pour les témoins à 100% pour les semences stressées à 69 mM (Radhouane, 2008).
L’émergence de plantules en milieu salé chez d’autres espèces végétales est inhibée (Debez
et al, 2001 ; Askri et al, 2007). Chez Atriplex halimus L., la vitesse de germination est ralentie à
partir de 172,4 mM de NaCl et davantage inhibée à des concentrations plus élevées (Zid et
Boukhris, 1977).
La tolérance au sel s’exprime habituellement en termes de croissance, de rendement ou de
survie. Nos résultats obtenus montrent une tolérance au sel chez le pistachier fruitier. En effet,
des taux de survie plus élevés ont été enregistré : 100 ; 98,3 ; 88 et 62,9% obtenus
respectivement en présence de 42,8 ; 85,5 ; 171,1 et 256,6 mM NaCl. Ces résultats sont en
accord avec ceux de Chelli et al, 2008. Ces auteurs signalent que les taux de survie ont dépassé
94% à 131 mM NaCl et étaient de 74,2% à 158 mM et 77,1% à 240 mM respectivement pour
Pistacia vera et Pistacia atlantica. La mortalité des espèces végétales en milieu salin est le
résultat d’une perturbation de l’alimentation hydrique et d’une inhibition du métabolisme
(Flowers et Yeo, 1981).
Le résultat de la croissance des vitrosemis, indique que la salinité a affecté négativement la
croissance de l’appareil végétatif de Pistacia vera L. comparativement à celle des racines. Des
effets similaires ont été remarqués sur la croissance des plantules de pistachier soumises à un
stress salin en conditions in vivo (Tavallali et al, 2008). Les mêmes résultats ont aussi été
obtenus chez d’autres plantes : trèfle (Ben Khaled et al, 2003), agrumes (Rochdi et al, 2005),
sétaire (Ben Ahmed et al, 2008). Cette diminution de la croissance est le résultat au niveau
cellulaire d’une baisse du nombre de divisions cellulaires lors des stress abiotiques (stress salin
et hydrique). La réduction de la croissance aérienne observée au niveau des vitrosemis peut
s’expliquer par des perturbations des taux de certains régulateurs de croissance, notamment
l’acide abscissique et les cytokinines induites par le sel (Kuiper et al, 1990), Termaat et al,
1985). De même, Liu et al, 1998 ont rapporté qu’une baisse de la quantité de cytokinines a été
enregistrée chez Pinus sylvestris, Pinus koraiensis et Abies holophylla soumis à un stress salin.
Concernant la production des biomasses, l’analyse statistique a révélé un effet significatif du
stress salin. Ainsi, la présence de NaCl dans le milieu de culture provoque une réduction des
poids frais et sec des parties aériennes alors qu’il améliore ceux des racines. Selon Zhu, 2001, la
réduction de croissance de l’appareil végétatif aérien est une capacité adaptative nécessaire à la
survie des plantes exposées à un stress abiotique. En effet, ce retard de développement permet à
la plante d’accumuler de l’énergie et des ressources pour combattre le stress avant que le
déséquilibre entre l’intérieur et l’extérieur de l’organisme n’augmente jusqu’à un seuil où les
dommages sont irréversibles.
D’un autre coté, la présence du sel dans le milieu de culture a conduit à une stimulation de la
production de la matière fraîche et sèche des racines du pistachier. Une réponse analogue a été
signalée chez d’autres plantes tolérantes au sel (Bizid et al, 1988 ; Meyer et al, 1989 ; Ben Raïs,
1992 ; Radhouane, 2008). Ces plantes protègent leurs organes aériens contre l’envahissement des
ions toxiques (Na+ et Cl−) par une rétention de ceux-ci dans les racines (Sâadallah et Abdelly,
2001). D’autre part, Bouraoui et al, 1998 montrent que la demande énergétique de la croissance
des racines chez le triticale est augmentée en milieu salé. Ils précisent que le passage des cellules
du stade de division au stade d’élongation s’accompagne d’une modification du métabolisme
respiratoire. Le maintien de l’élongation racinaire et la stimulation de la respiration sur milieu
salé correspondent à l’un des facteurs de tolérance à la salinité.
Du point de vue de la turgescence des organes, on remarque que la teneur en eau des
plantules n’est pas modifiée. Les différentes concentrations de NaCl appliquées n’ont eu aucun
effet sur l’état d’hydratation des vitrosemis qui est resté comparable (84% de la matière fraîche
en moyenne) pour les différents traitements et organes. Les espèces végétales tolérantes
absorbent de grandes quantités d’ions tout en maintenant la turgescence cellulaire et en évitant
leur toxicité grâce à un compartimentage cellulaire et l’accumulation dans les vacuoles.
L’équilibre osmotique du cytoplasme est alors assuré par une synthèse active de composés
organiques solubles (Greenway et Munns, 1980). Chez les Citrus, les cultivars les plus résistants
au stress salin sont ceux qui limitent le plus efficacement possible l’accumulation des sels dans
leur feuilles (Greive et Walker, 1983 ; Walker et Douglas, 1983).
6.6- Conclusion
Au stade juvénile, le pistachier fruitier se comporte comme une plante tolérante à la salinité.
Outre leur capacité germinative élevée, les embryons isolés de Pistacia vera L. ont montré une
grande résistance vis-à-vis du sel. Le taux de mortalité le plus élevé (37,1%) a été enregistré avec
la plus forte concentration saline testée (256,6 mM).
En réponse au sel, le pistachier réduit rapidement son expansion foliaire et sa croissance
aérienne et tend à maintenir le développement de son système racinaire.
L’utilisation des axes embryonnaires pour évaluer la tolérance au sel a montré, dès le départ,
des taux de développement in vitro élevés, même sous stress sévère, indiquant que le taux de
développement pourrait être retenu comme critère précoce d’évaluation de la tolérance au sel
chez Pistacia vera L.. Ainsi, la stimulation de la croissance racinaire en présence de NaCl
semble une stratégie développée par le pistachier pour limiter le stress salin. De plus, la
réduction de la croissance de l’appareil photosynthétique est un indice de la résistance au sel
(Neumann, 1997). La sélection de vitroplants tolérants à la salinité par le biais de la culture in
vitro peut contribuer à obtenir des clones homogènes et tolérants à la salinité.
7- ETUDE DE LA TOLERANCE AU STRESS HYDRIQUE DE PISTACHIER (PISTACIA VERA L.) : EFFET
SUR LE DEVELOPPEMENT IN VITRO DES EMBRYONS ISOLES ET LA CROISSANCE DES VITROSEMIS
7.1- Introduction
En Algérie, la culture du pistachier se développe principalement dans les régions arides et
semi-arides qui semblent être les plus favorables à son implantation, mais où la sécheresse
estivale est fréquente. Afin d’accroître les rendement des cultures non irriguées qui sont plus
nombreuses dans ce pays, l’amélioration de la résistance du pistachier à la sécheresse est d’une
importance primordiale. De plus, le succès des plantations en climats arides ou semi-arides est
souvent lié à la maîtrise des conditions de germination et d’élevage des plants. Ces conditions
sont réglées par des caractéristiques génotypiques mais aussi par les conditions
environnementales et, en particulier, par la disponibilité de l’eau dans le sol. En effet, une des
différences de comportement pour la résistance à la sécheresse des espèces ligneuses peut
apparaître dans la faculté germinative de leurs graines ainsi que la croissance de leurs jeunes
plants en conditions de déficit hydrique.
Pour mettre en évidence les potentialités d’adaptation du pistachier fruitier (P. vera L.) à la
sécheresse, un stress hydrique osmotique a été induit en conditions in vitro. L’abaissement du
potentiel hydrique du milieu de culture se fait par l’adjonction de polyéthylène glycol (PEG
6000), pour son meilleur comportement vis-à-vis des plantes par rapport à d’autres osmoticum
(Lawlor, 1970 ; Nepomuceno et al, 1998). Les taux de germination in vitro, de survie des
embryons isolés et le développement des vitrosemis apprécié par la longueur des parties
aériennes et racinaires ainsi que leurs biomasses ont été utilisé pour étudier la tolérance du
pistachier au stress hydrique en conditions contrôlés.
7.2-Matériel et Méthodes
Le matériel végétal utilisé pour cet essai est composé des axes embryonnaires prélevés de
graines matures de P. vera L. Ces graines ont été désinfectées par l’hypochlorite de sodium
(Chapitre II). Afin de déterminer le seuil qui entrave la germination in vitro et la croissance des
vitrosemis, neuf concentrations croissantes (0 ; 5 ; 10 ; 15 ; 20 ; 25 ; 30 ; 35 et 40 g l-1) de
polyéthylène glycol (PEG 6000) ont été étudiées. Le milieu de base utilisé est celui de MS0
gélosé à 4 g l-1 par Bacto-agar Difco. Le pH a été ajusté à 5,7 avec KOH 0,1 N avant passage en
autoclave à 113 °C pendant 20 min.
Les embryons cultivés dans des tubes à essai (22 x 150 mm) contenant 15 ml de milieu
nutritif ont été placés dans une chambre de culture à une intensité lumineuse de 40µmol m-2 s-1 et
sous une photopériode journalière de 16 heures. La température autour des tubes a été maintenue
à 22 °C.
Après 30 jours de culture, la réponse des embryons isolés au stress hydrique a été évaluée
grâce aux paramètres d’appréciation cités en haut. La biomasse des organes aériens et racinaires
a été mesuré par la masse de la matière fraîche (MF) puis sèche (MS) après séchage de 48 h à
l’étuve réglée à 65°C. Les pesés ont été effectuées grâce à une balance de précision modèle
Sartorius® CP 225 D et sont exprimées en mg. La teneur en eau (TE) exprimée en % MF est
calculée par la formule : (100 x ((MF – MS)/MF). La réduction relative de la masse de matière
exprimée en % du témoin est également calculée : % réduction = (100 x ((traitement –
témoin)/témoin).
7.3- Résultats
7.3.1. Effet de la concentration en PEG sur la germination in vitro et la survie des embryons
Les différentes concentrations de PEG testées n’ont eu aucun effet significatif sur la
germination in vitro des axes embryonnaires de P. vera L. Les taux de germination ont été de
100% pour l’ensemble des lots expérimentaux étudiés à l’exception de la plus forte concentration
de PEG testée où nous avons enregistré 98%. Toutefois, le potentiel hydrique des milieux testés
a influencé significativement le taux de survie et l’aspect qualitatif des jeunes plantules germées.
En effet, plus la concentration de PEG augmente, plus les taux de mortalité et d’hyperhydrie
accentuent (Tableau 14).
Tableau 14. Pourcentages de germination in vitro, de survie et d’hyperhydrie de pistachier (P. vera L.) en fonction
de la concentration de polyéthylène glycol (PEG 6000). Les valeurs de la même ligne suivies des mêmes lettres en
exposant ne sont pas significativement différentes entre elles au seuil de 5%.
Concentration en PEG (en g l-1)
Nombre d'embryons cultivés
Germination in vitro (%)
Survie (%)
Hyperhydrie (%)
0
5
48
50
100a 100a
100a 94ab
0a
0a
10
15
20
25
30
35
40
48
48
48
48
52
46
50
100a 100a 100a 100a 100a 100a
98,0a
91,7b 93,8ab 91,7b 93,8ab 90,4b 93,5ab 90,0b
16,7b 14,6b 14,6b 16,7b 17,3b 30,4b 32,0b
7.3.2. Effet de la concentration en PEG sur les paramètres de croissance
L’effet du stress hydrique par le polyéthylène glycol sur la croissance des vitrosemis est très
remarquable. En effet, une différence statistiquement significative (p < 0,05) a été notée entre les
différentes concentrations de PEG (Tableau 15). A la fin de l’expérimentation, la longueur
moyenne de la tige a été de 4 cm et 1,7 cm respectivement pour le témoin et la plus forte
concentration testée de PEG, alors que, pour le système racinaire, la longueur moyenne a passé
de 3,4 cm pour le témoin à 2,3 cm pour la concentration de 40 g l-1 PEG (Figure 25).
Sous les conditions de stress, le taux moyen de réduction de différents paramètres de
croissance étudiés par rapport au témoin, est de 51,3% pour la longueur de la partie aérienne,
22,8% pour le nombre de feuilles et 19,9% pour la longueur du système racinaire (Tableau 16).
Ce résultat montre que la croissance des parties aériennes des vitrosemis stressés a été plus
affectée par le déficit hydrique que celle des racines. Ces plantules sont caractérisées
généralement par des feuilles de petite taille comparativement à celles des témoins (Figure 25).
En ce qui concerne la production des biomasses, l’analyse statistique a révélé un effet
significatif de polyéthylène glycol. Comme on peut le constater, les différentes concentrations
étudiées de PEG ont entraîné une diminution des biomasses des parties aériennes (Figure 26)
alors que celles des racines ont été améliorées (Figure 27). Par ailleurs, la teneur moyenne en eau
a été de 82,7% pour les organes aériens et 85,2% pour les racines.
Tableau 15. Effet de la concentration en polyéthylène glycol (PEG 6000) sur les paramètres de croissance, le nombre moyen de feuilles par vitrosemis et le rapport MS racines/MS
organes aériens. Les valeurs de la même ligne suivies des mêmes lettres en exposant ne sont pas significativement différentes entre elles au seuil de 5%.
Concentration en PEG (en g l-1)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Longueur de la partie aérienne (cm)
4,0 ± 0,8a
1,1 ± 0,2e
1,2 ± 0,2e
2,4 ± 0,7c
2,6 ± 0,8bc
2,9 ± 0,9b
1,8 ± 0,6d
1,9 ± 0,6d
1,7 ± 0,4d
Longueur des racines (cm)
3,4 ± 2,0a
2,7 ± 1,5bc
2,8 ± 1,7abc
2,5 ± 1,1c
3,1 ± 1,3ab
3,2 ± 1,4ab
2,6 ± 1,0bc
2,6 ± 1,0bc
2,3 ± 1,4c
Nombre moyen de feuilles/vitrosemis
9,8 ± 1,2a
5,4 ± 2,2e
6,7 ± 2,2d
8,0 ± 2,1b
9,6 ± 2,2a
9,3 ± 2,6a
7,6 ± 1,6bc
6,9 ± 1,6cd
7,0 ± 1,5cd
MS racines/MS organes aériens (mg)
0,4 ± 0,1e
1,0 ± 0,4a
1,0 ± 0,3a
0,7 ± 0,2bc
0,5 ± 0,2d
0,6 ± 0,2cd
0,7 ± 0,2b
0,7 ± 0,3bc
0,7 ± 0,2bc
Tableau 16. Pourcentages de réduction (par rapport aux témoins) en longueur de la partie aérienne et racinaire ainsi que le nombre moyen de feuilles des vitrosemis soumis à
différentes concentrations de PEG (6000) après un mois de culture.
Concentration en PEG (en g l-1)
Paramètres
Longueur de la partie aérienne
5
10
15
20
25
30
35
40
Moyenne
72,5
70
40
35
27,5
55
52,5
57,5
51,3
Longueur du système racinaire
20,6
17,6
26,5
8,8
5,9
23,5
23,5
32,4
19,9
Nombre moyen de feuilles
44,9
31,6
18,4
2,0
5,1
22,4
29,6
28,6
22,8
Figure 25. Effet de la contrainte hydrique simulée par le PEG 6000 sur la
croissance des vitrosemis de pistachier (P. vera L.). A : témoin ; B-I) vitrosemis
stressés par PEG (en g l-1) à : 5 (B) ; 10 (C) ; 15 (D) ; 20 (E) ; 25 (F) ; 30 (G) ;
35 (H) et 40 (I). Quelques formes d’hyperhydrie et de nécrose des vitrosemis en
milieux stressés (J. barre = 1cm).
(A)
(A)
84,6%
81,7%
140
a
120
81,8%
100
83,1%
80
82,9% 82,5%
60
d
82,3%
c
c
82,7%
82,9%
b
c
c
c
d
40
20
Matière fraîche des racines (mg)
Matière fraîche des organes aériens (mg)
100
160
84,6%
90
80
70
60
85%
85,8%
84,4%
86,7%
85,5%
85,8%
bc
bc
c
bc
ab
bc
c
50
40
30
20
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0
5
10
15
PEG (g/l)
20
25
30
18
c
15
d
c
c
c
d
10
5
Matière sèche des racines (mg)
c
20
40
(B)
b
a
35
PEG (g/l)
(B)
30
25
84,5%
a
10
0
0
Matière sèche des organes aériens (mg)
c
84,7%
a
16
14
b
12
10
ab
bc
bc
10
15
bc
bc
b
20
25
30
c
8
6
4
2
0
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
PEG (g/l)
Figure 26. Effet de la concentration en PEG sur la biomasse
aérienne (A : matière fraîche, B : matière sèche) des vitrosemis de
Pistacia vera L. après un mois de culture sur MS0.
0
5
35
40
PEG (g/l)
Figure 27. Effet de la concentration en PEG sur la biomasse des
racines (A : matière fraîche, B : matière sèche) des vitrosemis de
Pistacia vera L. après un mois de culture sur MS0.
Les valeurs sur les histogrammes correspondent aux teneurs en eau, exprimées en % de la matière fraîche. Les valeurs suivies de la même lettre ne sont pas significativement
différentes (N = 40 embryons développés par traitement).
7.4- Discussion
Certains travaux ont mis en évidence une relation entre les propriétés germinatives des
graines et l’écologie de la plante entière (Saint-Clair, 1976 ; Fady, 1992), ce qui est le cas de nos
résultats. En effet, la germination in vitro des embryons isolés de P. vera L. n’est pas affectée par
le stress hydrique. Même en présence de fortes concentrations en PEG, les axes embryonnaires
du pistachier ont pu germé ce qui confirme le caractère adaptatif de cette espèce à la sécheresse.
Cependant, nos résultats ont montré que la survie des jeunes germinations a été influencée par la
concentration de polyéthylène glycol. Le pourcentage des vitrosemis survivants a régressé de 6 à
10% avec respectivement 5 et 40 g l-1 PEG. Nous avons obtenus des effets similaires avec le
stress salin (Benmahioul et al., 2009).
L’effet du stress hydrique sur la croissance des plantules est net. L’appareil végétatif a été le
plus sensible au déficit hydrique comparativement au système racinaire. Des résultats
comparables ont été obtenus chez d’autres espèces ligneuses : chênes (Ksontini, 1996), pin (McMillin et Wagner, 1995) et casuarina (Albouchi et al., 2003). Tazi et al., 2003 signalent que la
réduction de la croissance des organes aériens chez les jeunes plantules d’arganier stressées peut
être expliquée par le fait que le polyéthylène glycol agit par augmentation de la pression
osmotique du milieu, ce qui empêche l’absorption de l’eau par le système racinaire et par
conséquent entraîne une réduction au niveau de la croissance de l’appareil végétatif.
Le déficit de biomasse enregistré chez les vitrosemis stressés n’a pas affecté de façon
similaire les deux parties de la plante. En effet, la production des biomasses racinaires a été
améliorée comparativement à celle des organes aériens. Le stress hydrique semble induire une
allocation préférentielle de biomasse vers le système racinaire qui s’est traduit également par des
valeurs du rapport MS des racines/MS des organes aériens supérieur chez les plants stressés. Des
résultats analogues ont été rapportés chez Quercus robur et Fagus sylvatica (Van Hees, 1997),
Quercus petraea et Q. rbur (Thomas et Gausling, 2000) et casuarina (Albouchi et al., 2003).
7.5- Conclusion
Au vu des résultats de cette étude, le pistachier vrai (P. vera L.) manifeste une haute
tolérance au stress hydrique. En effet, les taux de germination in vitro et de survie enregistrés en
présence de polyéthylène glycol confirment sa tolérance au déficit hydrique. Le pistachier tend à
réduire la longueur de ses organes aériens pour surmonter l’effet du stress hydrique provoqué par
le PEG. Ce caractère est un indice de résistance chez les plantes tolérantes. En revanche, les
biomasses racinaires produites par les vitrosemis stressés sont supérieures à celles des témoins.
L’étude du stress hydrique en conditions contrôlés a permit de repérer rapidement les sujets
résistants au déficit hydrique. Cette voie peut être utilisée pour la sélection précoce des
génotypes tolérants. Toutefois, il serait opportun d’étendre cette étude à des essais in vivo afin de
vérifier les résultats obtenus en conditions in vitro.
Chapitre IV - Culture in vitro des
segments nodaux
1- INTRODUCTION
Les techniques de culture in vitro ont toujours été un outil de prédilection pour la production
en masse de plusieurs espèces ligneuses. La propagation in vitro à partir de bourgeons apicaux
et axillaires est plus utilisée pour la production commerciale de plantules d'arbres forestiers et
fruitiers.
Malgré les progrès réalisés en matière de micropropagation de pistachier (Barghchi et
Alderson, 1989), bien que modestes comparativement à d’autres essences fruitières, cette
technique in vitro se heurte à plusieurs problèmes, liés le plus souvent à l’initiation aseptique,
aux problèmes d’oxydation du milieu de culture et de nécrose de bourgeons (Abousalim et
Mantell, 1994).
L’utilisation d’un matériel végétal juvénile produit en serre peut être très intéressant pour
réduire les risques de contamination et d’oxydation phénoliques in vitro qui rendent souvent
impossible l’application de la micropropagation pour les espèces ligneuses. Le but de notre étude
a été de déterminer les conditions favorables pour l’introduction in vitro à partir des bourgeons
chez Pistacia vera L. L’influence de la technique de désinfection, du stade physiologique et de
l’âge du matériel végétal sur le débourrement et la croissance des bourgeons axillaires a été
examinée.
2- MATERIEL ET METHODES
2.1- Matériel végétal utilisé et méthodes de désinfection
Le matériel végétal destiné à l’établissement de culture in vitro est constitué :
-
de boutures de nœuds lignifiées ou herbacées selon la période de prélèvement, récoltées
sur des arbres âgés de 30 ans (pieds femelles).
de pousses herbacées prélevées de jeunes plantules âgées d’environ 6 mois élevés en
serre.
Les rameaux et les pousses herbacées sont débarrassés de leurs feuilles puis lavées à l'eau
savonnée. Après morcellement, les boutures sont rincées à l’éthanol 70% (v/v) puis désinfectées
selon les deux protocoles expérimentaux de désinfection testés (voir chapitre II). La durée de
trempage dans la solution désinfectante étudiée est en fonction de la nature du matériel
végétal utilisé : 10 min pour le matériel juvénile et 15 min pour le matériel âgé.
2.2- Optimisation des conditions de culture
Les explants mis en culture comprennent le bourgeon avec une portion de tige (1cm). Ils
sont installés sur 15 ml de milieu gélosé coulé dans des tubes en verre de 22 x 150 mm. Le
milieu de culture de base utilisé est celui de Murashige et Skoog, 1962 enrichi de vitamines B5
(Gamborg et al, 1968), hydrolysat de caséine (500 mg l-1), AgNO3 (1 mg l-1) et 30 g l-1 de
saccharose. Les milieux ont été solidifiés par agar-agar à 0,7 % (w/v) et autoclavés après
ajustement du pH à 5,7 par KOH 0,1 N, pendant 20 min à 113 °C.
Le brunissement des tissus en culture in vitro des espèces ligneuses est un handicap sérieux.
Il résulte de l’oxydation par les composés phénoliques excrétés par les explants. Afin de limiter
les pertes dues à ce problème d’oxydation du milieu, différents traitements ont été étudiés :
- T1 : Préculture en obscurité pendant 2 semaines avant d’être transféré à la lumière dont la
photopériode est de 16 h/j. et l’intensité lumineuse est de 40 µmol.s-1.m-2.
- T2 : addition du PVP10 (0,1 à 1 % w/v) dans le milieu de culture + T1.
- T3 : repiquages successifs sur des milieux nutritifs neufs tous les 3 jours + T1.
Enfin de l’expérimentation, le taux de débourrement des bourgeons ainsi que l’aspect
morphologique des tigelles obtenues ont été évalués. Les résultats ont été traités par analyse de
variance (ANOVA) et les moyennes significativement différentes ont été séparées par le test de
Duncan au seuil de probabilité de 5 %.
3- RESULTATS
3.1- Effet de la technique de désinfection
Les contaminations microbiologiques endogènes ou exogènes ont toujours limitées
l’établissement in vitro des explants provenant d’un matériel végétal adulte. Les pertes
enregistrées varient en fonction de type d’explants mis en culture, de la période de prélèvement
et de la technique de désinfection étudiée. En effet, les taux d’infection les plus importants (100
%) ont été enregistrés avec les explants prélevés de rameaux d’arbres adultes en fin de croissance
(Tableau 17; Figure 28A). Les prélèvements effectués sur du matériel élevé en serre (jeunes
semis) donnent les meilleurs résultats.
L’efficacité de la technique de désinfection a été constatée chez les explants prélevés sur des
rameaux d’arbres adultes en croissance naturelles (printemps). Les pourcentages d’infection sont
alors de 84,7 % avec l’hypochlorite de sodium (NaClO) et 38,7 % avec le bichlorure de mercure
(HgCl2).
Tableau 17. Les pertes par les infections microbiologiques observées selon le type d’explants mis en culture, la
période de prélèvement et la technique de désinfection appliquée. Les pourcentages ayant les mêmes lettres pour une
même ligne ne présentent pas de différence significative à 5%. Les valeurs entre parenthèses représentent le rapport
entre le nombre d’explants contaminés et le nombre total d’explants cultivés ; (N.T. : non testé).
Type d’explants
Bourgeons axillaires
(arbres âgés)
Stade physiologique
Epoque de prélèvement
Rameaux ligneux
Automne (Octobre)
Rameaux en pleine
croissance
Tiges herbacées
Bourgeons axillaires
(jeunes plants : serre)
Tiges lignifiées
Printemps (Avril)
Printemps (Avril)
Automne (Octobre)
Contamination (%)
HgCl2
NaClO
100a
100a
(60/60)
(60/60)
38,7a
84,7b
(58/150)
(122/144)
a
04,4
04,2a
(02/45)
(02/48)
N.T.
14,4
(31/216)
Il apparaît que le prélèvement des segments nodaux sur des pieds mères adultes en pleine
croissance (printemps) est une période favorable pour limiter les contaminations chez le
pistachier. Cependant, l’utilisation d’un matériel végétal préparé en serre est la méthode qui
présente le moindre risque d’infections microbiologiques.
3.2- Réactivité des explants primaires
3.2.1. Explants nodaux provenant d’arbres adultes
La réactivité du matériel végétal de départ dépend de plusieurs facteurs liés essentiellement
à l’état physiologique des explants mais également aux conditions nutritionnelles et
environnementales de la culture.
Les résultats obtenus après 30 jours de culture montrent que l’introduction in vitro de
Pistacia vera L. à partir d’un matériel végétal âgé est très délicat. En plus du problème des
contaminations, les composés phénoliques ont inhibé considérablement la réactivité des explants
introduits in vitro (Figure 28B). Les taux de débourrement varient entre 16,7 (03/18) et 27,8 %
-1
-1
(05/18), obtenus respectivement sur le milieu M1 [0,5 mg l (BAP+AIB+GA3)] et M2 (0,5 mg l
-1
BAP + 0,2 mg l GA3) (Figure 28C).
Afin d’améliorer la réactivité du matériel végétal du départ, d’autres milieux de culture
variant par les apports hormonaux ont été testés : BAP (0,5 ; 1 ; 2 et 4 mg l-1) et Zéatine (1mg l-1).
Le taux de débourrement des bourgeons n’a pas été amélioré. Des taux de brunissement très
élevés ont été enregistrés (Figure 29). Ce phénomène de brunissement des tissus en culture in
vitro des espèces ligneuses est un handicap sérieux. Il résulte de l’oxydation par les composés
phénoliques excrétés par les explants. L’effet d’une préculture en obscurité sur l’excrétion des
composés polyphénoliques dans le milieu nutritif a été étudié. Ce traitement a permis de réduire
significativement le taux d’oxydation qui passe de 100 % (30/30) chez les explants cultivés
directement à la lumière à 73,3% (22/30) pour ceux ayant séjournés auparavant pendant 2 semaines
à l’obscurité. Cependant, ces derniers explants finissent eux aussi par s’oxyder enfin de
l’expérimentation. Même si l’obscurité n’a pas permis de résoudre complètement le problème
d’oxydation du milieu, elle a retardé le brunissement et la mort des explants cultivés in vitro.
7J
100
30 J
A
A
A
A
A
80
60
a
a
40
a
a
a
20
0
1Z
0.5 BAP
1BAP
2BAP
4BAP
Hormones (mg/l)
Figure 29. Taux d’oxydation des milieux nutritifs après 7 et 30 jours de culture.
(N= 30 explants par milieu)
Nous signalons que l’ajout du PVP10 (Polyvinylpyrolidone) ou même du charbon actif n’a
pas amélioré les résultats. Un taux de débourrement de 06,7 % (02/30) a été enregistré avec la dose
de 0,2% PVP. Les autres explants sains se noircissent et meurent enfin de l’expérimentation.
Le repiquage des explants sur un milieu neuf (MS + 1 mg l-1 BAP) à raison de 2 fois par
semaine a amélioré significativement les résultats. Ce traitement fréquent qui a permis d’éviter
l’intoxication de l’explant engendrée par les sécrétions des composés phénoliques a donné un
taux de débourrement acceptable de 33,3 % (12/36) (Figure 28 D-F). Chez les segments nodaux
provenant de rameaux ligneux, le renouvellement du milieu n’a pas amélioré le débourrement.
Ces explants sains sont issus d’un trempage avec agitation continue pendant 24 heures dans une
solution nutritive à base de sels minéraux de MS contenant 5% de PPM® (Annexe 1) puis
cultivés durant une semaine sur le milieu de base additionné de 0,2% PPM (Figure 28 G) suivi
des repiquages successifs d’une fréquence de 2 fois par semaine. Ce traitement a réduit
significativement les infections (Figure 28 H) à seulement 38,1% (08/21) sans amélioration de la
caulogenèse. Chez certains explants (type écusson) nous avons observé la formation de cal au
niveau de la section (Figure 28 I).
Figure 28. Établissement des cultures in vitro à partir des segments nodaux d’arbres adultes de Pistacia vera L.
A) Explant contaminé ; B) Oxydation du milieu de culture et brunissement de l’explant initial ; C) Eclosion d’un
bourgeon sur le milieu contenant 0,5 mg l-1 BAP + 0,2 mg l-1 GA3. Noter la forte concentration de composés
phénoliques à la base de l’explant ; D) Débourrement d’un bourgeon axillaire suite à des repiquages successifs ; E)
microbourgeon excisé et repiqué sur un milieu neuf pour être allongé; F) Microplantule de Pistacia vera L. issue du
développement d’un bourgeon axillaire après 30 jours de culture sur le milieu de base de MS additionné de 1 mg l-1
BAP ; G) Segment de tige lignifié mis en culture sur MS additionné de 0,2% PPM ; H) Explant infecté. Noter les
filaments mycéliens de couleur blanchâtre développés sur le bourgeon ; I) Ecusson calogène suite aux repiquages
successifs (Barre = 5 mm).
3.2.2- Explants nodaux provenant de jeunes plantules
a) Effet des cytokinines
Les segments de tiges provenant de jeunes plantules élevées en serre (Figure 30A) ont été
désinfectés et découpés en microboutures d’environ 1cm de long. Ces segments nodaux portant
au moins un bourgeon axillaire (Figure 30B) ont été mis en culture sur plusieurs milieux nutritifs
à base de MS (Murashige et Skoog, 1962) variant par les apports en cytokinines. Elles ont été de
quatre types : benzylaminopurine (BAP), Kinétine (KIN) et Zéatine (Z) testées à 0,5 ; 1 ; 2 et 4
mg l-1 et le Thidiazuron (TDZ) à 0,1 ; 0,2 ; 0,4 et 1 mg l-1.
Les bourgeons axillaires des micoboutures mis en culture ont commencé à débourrer après
une semaine, puis ils se sont développés pour former des pousses feuillées en 1 mois. Durant
cette phase, nous avons constaté l’effet de l’agent désinfectant sur le débourrement des
bourgeons et leur transformation en rosettes feuillées. En effet, les meilleurs rendements ont été
enregistrés avec l’hypochlorite de sodium (Tableau 18). Toutefois, cette différence reste non
significative au seuil de 5%. L’hypochlorite de sodium a été retenu pour la suite de nos
expérimentations.
Tableau 18. Effet de l’agent désinfectant sur les taux de contamination, de débourrement des bourgeons et leur
transformation en rosettes feuillées après 30 jours de culture.
Agent
désinfectant
Nombre d’explants
cultivés
Contamination
(%)
Débourrement
(%)
Rosettes feuillées
(%)
HgCl2
45
04,4a
86,7a
66,7a
(02/45)
(39/45)
(30/45)
a
a
NaClO
48
04,2
83,3
75a
(02/48)
(40/48)
(36/48)
Les différentes concentrations de cytokinines testées ont entraîné des différences
significatives du pourcentage de débourrement des bourgeons. Les taux moyens ont été de 34,4 ;
58,3 ; 62,5 et 75,0% enregistrés respectivement avec TDZ, KIN, BAP et Z (Tableau 19). En ce
qui concerne l’effet concentration, la BAP à la dose de 1 mg l-1, la KIN à 2 mg l-1 et la Z à 4 mg
l-1 donnent le pourcentage le plus élevé de débourrement (91,7%). De plus, ces concentrations
ont affiché les meilleurs taux de transformation des bourgeons en pousses feuillées avec
respectivement 87,5 ; 79,2 ; 91,7%.
Le développement de nouvelles pousses a généralement suivi une tendance similaire à celle
du débourrement. En effet, la longueur moyenne des tigelles ainsi que le nombre moyen de
feuilles par pousse feuillée développée ont été affectés par le type et la concentration des
cytokinines étudiées (Tableau 19). La BAP à 1 mg l-1 donne une croissance maximale de 2,0 cm
(Figure 30C), suivie de la Z à 0,5 mg l-1 (1,6 cm, Figure 30D), avec un nombre moyen de feuilles
de 6,9. La kinétine est moins favorable pour l’élongation des bourgeons (0,6 cm en moyenne,
Figure 30E). En revanche, les bourgeons cultivés sur les milieux supplémentés de TDZ ont
manifesté une calogenèse abondante, ce qui a inhibé complètement leur transformation en
rosettes feuillées (Figure 30F).
A la lumière de ces résultats obtenus, la BAP à 1 mg l-1 a été retenue pour la suite de nos
essais.
Tableau 19. Effet de 4 cytokinines de différentes concentrations sur le débourrement des bourgeons et leur
développement in vitro en pousses feuillées (longueur moyenne et nombre moyen de feuilles) après 30 jours de
culture sur le milieu de base de MS. Les valeurs de la même colonne, suivies de lettres distinctes sont
significativement différentes au seuil 5 % (n = 24 explants/milieu).
Cytokinines
(mg l-1)
BAP
0,5
1
2
4
Moyenne (BAP)
Bourgeons
débourrés (%)
Pousses feuillées
produites (%)
Longueur
moyenne (cm)
Nombre moyen de
feuilles par pousse
62,5
91,7
41,7
54,2
62,5ab
54,2
87,5
25,0
20,8
46,9b
0,6 ± 0,1
2,0 ± 1,4
0,4 ± 0,1
0,2 ± 0,1
1,2 ± 1,2a
3,4 ± 1,0
6,9 ± 1,3
2,3 ± 1,0
3,0 ± 1,0
4,8 ± 2,3b
KIN
0,5
1
2
4
Moyenne (KIN)
58,3
50,0
91,7
33,3
58,3b
29,2
41,7
79,2
29,2
44,8b
0,4 ± 0,1
0,7 ± 0,3
0,6 ± 0,3
0,6 ± 0,3
0,6 ± 0,3b
2,6 ± 1,0
3,6 ± 0,7
3,9 ± 1,2
4,0 ± 1,4
3,6 ± 1,2c
Z
0,5
1
2
4
Moyenne (Z)
45,8
83,3
79,2
91,7
75,0a
16,7
75,0
79,2
91,7
63,5a
1,6 ± 1,0
1,3 ± 0,7
1,3 ± 0,7
1,1 ± 0,6
1,2 ± 0,7a
6,9 ± 3,6
5,8 ± 2,3
6,5 ± 2,2
4,8 ± 2,0
5,7 ± 2,3a
TDZ
0,1
0,2
0,4
1
Moyenne (TDZ)
50,0
41,7
33,3
12,5
34,4c
0
0
0
0
0,0c
-
-
b) Effet combiné de BAP/GA3/CA
L’action de 1 mg l-1 de benzylaminopurine associée ou non au charbon actif (CA) à 0,2 % et
à l’AG3 (1 mg l-1) sur le débourrement des bourgeons axillaires et leur développement est
résumée dans le tableau 20.
L’association de l’acide gibbérellique et du charbon actif dans le milieu de culture a eu un
effet négatif sur le débourrement des bourgeons et leur transformation en rosettes feuillées. En
effet, le milieu renfermant ces deux additifs a donné des pourcentages faibles de débourrement
(62,5 %) et de développement des tigelles (41,7 %). Le milieu de base enrichi de 1 mg l-1 BAP
affiche les meilleurs résultats.
Nous signalons que les pousses feuillées obtenues sur le milieu supplémenté de BAP et du
charbon actif (Figure 30G) présentent un aspect qualitatif identique à celui des plants du milieu
témoin.
Tableau 20. Effet de 1 mg l-1 de BAP associée ou non au charbon actif (CA) à 0,2 % et 1 mg l-1 de GA3 sur le
débourrement des bourgeons et leur développement en pousses feuillées (longueur moyenne et nombre moyen de
feuilles) après 30 jours de culture sur le milieu de base de MS. Les valeurs de la même colonne, suivies de lettres
distinctes sont significativement différentes au seuil 5 % (n = 24 explants/milieu).
BAP (témoin)
BAP + CA
BAP + GA3
BAP + GA3 + CA
Bourgeons
débourrés (%)
Pousses feuillées
produites (%)
Longueur
moyenne (cm)
Nombre moyen de
feuilles par pousse
100a
87,5b
87,5b
62,5c
91,7a
75,0a
70,8a
41,7b
1,7 ± 0,5a
1,7 ± 0,8a
1,2 ± 0,3b
1,4 ± 0,4ab
6,6 ± 0,7a
5,9 ± 1,3ab
5,6 ± 1,1b
5,1 ± 1,2b
Figure 30. Initiation de la micropropagation du pistachier (Pistacia vera L.) par culture in vitro de
segments nodaux provenant de jeunes plantules élevées en serre.
Jeunes plantules âgées de 6 mois utilisées comme source de matériel d’initiation in vitro (A); Segment
nodal portant un bourgeon axillaire mis en culture (B); Développement de pousses feuillées après 30 j
de culture sur le milieu de base de MS supplémenté de 1 mg l-1 BAP (C); de 0,5 mg l-1 Z (D) et de 2
mg l-1 KIN (E) ; Calogenèse abondante induite en présence de TDZ (F) ; Microboutures de bonne
qualité obtenues en présence de 1 mg l-1 BAP combinée de 0,2 % CA (G) (barre = 1 cm).
4- DISCUSSION ET CONCLUSION
4.1- Désinfection
Pour la micropropagation d'espèces ligneuses, l'état sanitaire des explants cultivés in vitro
est un problème récurrent qui peut compromettre le développement de la technique (Riffaud et
Cornu, 1981 ; Meynier, 1985). Même chez certaines espèces herbacées, cas d’absinthe
(Artemisia absinthium L.), les infections microbiologiques, notamment les contaminants
bactériens étaient unes des causes principales de perte dans les explants fraîchement installés in
vitro (Nin et al, 1994). Ces auteurs ont dû recourir à l’utilisation de la streptomycine, pour
éliminer les bactéries de leurs cultures. Les mêmes auteurs signalent que l’adjonction de cette
substance antibiotique dans le milieu nutritif a permis de réduire considérablement la
prolifération des bactéries, mais elle a inhibé la croissance des explants initiaux.
Chez le pistachier fruitier, les pertes enregistrées sont variables avec le type d’explant mis en
culture, la période de prélèvement et la technique de désinfection adoptée. Ainsi en plein air, la
prise d’échantillons doit s’effectuer sur des pousses en croissance. Dans le cas de rameaux en
repos physiologique (dormance), les infections sont toujours très importants (100 %) et ont
inhibé fortement le débourrement des bourgeons axillaires. Les prélèvements effectués sur un
matériel végétal juvénile préparé en serre donnent les meilleurs rendements. Ces résultats sont en
accord avec ceux de Dorion et al, 1987. Ces auteurs signalent que les explants de l’orme
provenant d’un matériel végétal préparé en serre sont les plus réactifs alors que ceux prélevés des
sujets âgés en plein air sont inhibés par les fortes contaminations.
Enfin, nos résultats ont montré l’importance du choix de l’agent désinfectant et son
influence sur l’élimination des contaminants microbiologiques, mais également, son effet sur la
réactivité des explants mis en culture. Le bichlorure de mercure est le plus efficace contre les
contaminants du matériel végétal adulte. Le même résultat a été obtenu chez l’olivier
(Grigoriadou et al, 2002). Ces auteurs signalent que le HgCl2 à 0,1 % est efficace
comparativement à l’hypochlorite de sodium. Ce dernier apparaît suffisant pour se débarrasser
des infections exogènes qui se trouvent à la surface des explants provenant de plants préparés en
serre.
4.2- Réactivité du matériel végétal du départ
La morphogenèse et la croissance in vitro des tissus végétaux mis en culture sont fortement
dépendantes du génotype et de l’état physiologique des explants au moment de leur mise en
culture (Hammerschlag, 1982). La reprise des méristèmes ou des apex d’espèces ligneuses
dépend étroitement de l’état physiologique de l’arbre ; elle est d’autant plus difficile que l’arbre
est âgé. En effet, chez le pistachier fruitier, les explants prélevés en printemps d’arbres adultes,
sont plus réactifs que ceux provenant d’un matériel végétal dormant. Ce dernier, présente des
taux de contaminations très élevés empêchant le développement in vitro des bourgeons. Les
infections microbiologiques peuvent être limité considérablement par l’utilisation d’un matériel
végétal préparé en serre (plantes mères juvéniles et traitées le plus souvent par des fongicides).
Plusieurs auteurs ont signalé les difficultés et les obstacles rencontrés lors de l’introduction in
vitro à partir d’un matériel ligneux âgé (Meynier, 1985).
L’oxydation du milieu de culture par les composés phénoliques exsudés par l’explant est
souvent une cause d’échec des premières phases de culture. Les taux d’oxydations enregistrés
durant cette étape sont très élevés. Nos résultats se concordent avec ceux de Gannoun et al.,
1995. Ces auteurs signalent que les composés polyphénoliques excrétés par les segments de tiges
prélevés d’un matériel âgé de Pistacia terebinthus et P. vera L. inhibent fortement le
débourrement des bourgeons. Pour pallier l’effet toxique des composés phénoliques, certains
traitements ont été suggérés par plusieurs auteurs :
-
L’addition des substances adsorbantes comme le charbon actif ou anti-oxydantes comme
l’acide ascorbique ou le polyvinylpyrrolidone (PVP) (Stevenson et Harris, 1980).
Le maintien de la plante-mère dans l’obscurité ou à une faible intensité lumineuse (Marks
et Simpson, 1990).
L’agitation des explants dans l’eau courante pendant plusieurs heures, les cultures sur
milieu liquide (Walali, 1991).
Cependant, chez le pistachier, l’utilisation de certains traitements antioxydants (le PVP et le
charbon actif) n’a pas amélioré les résultats. Ce qui a été constaté également chez d’autres
essences ligneuses, notamment le palmier dattier (Zaid, 1987), le pistachier térébinthe et le
pistachier fruitier (Gannoun et al., 1995). Les teneurs élevés en composés polyphénoliques dans
les différents organes de ces espèces rendent leur propagation végétative classique (notamment
le greffage) et moderne (la culture cellulaire et tissulaire) très difficile. Les composés
phénoliques et les substances de leur oxydation peuvent inhiber l’activité enzymatique, diminuer
et même annuler les échanges entre les tissus de l’explant mis en culture et le milieu nutritif (Hu
et Wang, 1983).
Les repiquages successifs rapides (à raison de 2 repiquages par semaine) ont amélioré
significativement les résultats. En effet, l’élimination des composés phénoliques par le
renouvellement successif du milieu nous a permis d’obtenir 33,3 % de bourgeons débourrés.
L’effet bénéfique du changement du milieu et des repiquages successifs a été signalé chez
certaines espèces végétales comme le canne à sucre (Chriki et al., 2003). Ces auteurs constatent
que le repiquage fréquent a permis la réduction de 27 % du taux d’oxydation. Ce dernier atteint
100 % chez les explants repiqués une seule fois par semaine, alors qu’il était de 73 % pour ceux
repiqués une fois tous les 2 jours. Les repiquages successifs assurant le renouvellement du milieu
de culture et permettant d’éviter l’intoxication des tissus végétaux cultivés causés par les
substances phénoliques.
La difficulté d’introduction des cultures in vitro à partir d’un matériel végétal adulte est
commune à d’autres espèces ligneuses, fruitières et forestières. Le rajeunissement du matériel
par divers moyens a été suggéré par plusieurs auteurs en vue d’améliorer sa réactivité in vitro
(Franclet et al., 1980 ; Howard et al., 1989 ; Fouret et al., 1985 ; Walker, 1986). Nos essais
réalisés sur des plantules juvéniles préparées et élevées en serre nous ont permis d’obtenir des
taux de débourrement des bourgeons élevés comparativement à ceux enregistrés avec le matériel
adulte. L’effet de l’âge du matériel végétal du départ sur la réactivité des explants mis en culture
et leur transformation en microplants a été constaté chez plusieurs espèces ligneuses, c’est le cas
de l’orme (Dorion et al, 1987) et de l’olivier (Abousalim et al., 2005). Ainsi, les jeunes plantules
et/ou les embryons prélevés de semences sont une source privilégiée d’explants utilisés pour la
propagation in vitro chez plusieurs espèces ligneuses : Pistacia vera L. (Abousalim, 1991 ;
Abousalim et al., 1991et 1992 ; Chatibi et al., 1998 ; Ozden-Tokatli et al., 2005), Eucalyptus
camaldulensis (Diallo et Duhoux, 1984) et Acacia albida (Duhoux et Davies, 1985).
Outre l’effet du type d’explant et son statut physiologique sur la réactivité des bourgeons, la
composition du milieu nutritif en phytohormones peut jouer un rôle capital dans la
différenciation des tissus végétaux en conditions in vitro. L’influence des éléments dits
‘trophiques’ sur les différents processus d’organogenèse évoqués, a été plusieurs fois mise en
évidence (Monteuuis et Bon, 1986 ; El Kbiach et al., 2002b ; Grigoriadou et al., 2002 ; Tommasi
et Scaramuzzi, 2004). Durant nos essais sur le matériel juvénile, nous avons constaté une
variation du taux de réactivité au sein des différents lots expérimentaux testés. En effet, les
meilleurs rendements en bourgeons débourrés et en rosettes feuillées ont été obtenus avec le
milieu MS enrichi de 1 mg l-1 BAP. Les concentrations inférieures ou supérieures à 1 mg l-1
n’ont pas amélioré les résultats. La Zéatine donne elle aussi de bons résultats à des
concentrations de 2 et 4 mg l-1 mais nous recommandons l’utilisation de 1mg l-1 BAP et ce pour
des raisons économiques. De plus, l’aspect qualitatif des microboutures obtenues en sa présence
(BAP) ou en combinaison avec le charbon actif (0,2%) est meilleur comparativement aux autres
milieux. Les autres cytokinines, le thidiazuron et la Kinétine sont moins efficaces au
débourrement des bourgeons et à la production des pousses feuillées de Pistacia vera L.
Chapitre V - Prolifération in vitro
de pousses feuillées
1- INTRODUCTION
La multiplication végétative par prolifération in vitro des bourgeons axillaires est la
technique la plus utilisée actuellement pour la production en masse des espèces ligneuses,
notamment les arbres fruitiers. Les plantes obtenues par cette voie de propagation végétative
offrent une plus grande garantie de conformité génétique et de maintien des caractères au cours
des repiquages successifs. Cependant pour les ligneux, de nombreux problèmes restent encore à
résoudre pour qu’elle soit rentable. En effet, la micropropagation in vitro par prolifération des
bourgeons axillaires, se trouve souvent limitée par certains problèmes liés particulièrement aux
faibles taux de multiplication ou au phénomène d’hyperhydricité qui donne des microplants de
mauvaise qualité.
L’objectif de notre travail, est d’améliorer le nombre d’axes végétatifs par rapport à l’effectif
total initialement introduit tout en maintenant un bon aspect qualitatif des vitroplants obtenus,
leur permettant d’induire un bon système racinaire et d’assurer une bonne reprise de croissance
lors de l’acclimatation. A cette fin, nous avons analysé l’effet de différents régulateurs de
croissance, certains utilisés pour la première fois chez le pistachier, sur le taux de multiplication
et la morphogenèse des pousses feuillées obtenues.
2- MATERIEL VEGETAL UTILISE
Les explants utilisés durant cette phase de la culture proviennent tous d’un matériel végétal
juvénile. Les vitrosemis de Pistacia vera L. issus de la culture d’embryons isolés ont été utilisés
pour l’étude de la phase de multiplication afin de minimiser les variations de réponse liées aux
différences génétiques. Des segments nodaux (5 à 10 mm de long) contenant un ou deux
bourgeons axillaires, ont été cultivés sur différents milieux de multiplication.
3- MILIEUX DE CULTURE TESTES
Les milieux de prolifération testés contiennent tous les sels minéraux et la solution ferrique
de Murashige et Skoog (1962), les vitamines B5 de Gamborg et al. (1968), myo-inositol (100 mg
l-1), hydrolysat de caséine (500 mg l-1), 30 g l-1 de saccharose et solidifiés à 6 g l-1 par Bacto-agar
Difco. Le pH des milieux de culture a été ajusté à 5,7 avec KOH 0,1 N avant passage en
autoclave à 113°C pendant 20 min.
4- FACTEURS ETUDIES
Dans un premier temps, notre étude a porté sur l’effet de la BAP (N6-benzylaminopurine)
seule à différentes concentrations (1 ; 2 ; 4 et 6 mg l-1) ou combinée à : 2 et 4 mg l-1 avec l’acide
indole acétique (AIB à 0,1 mg l-1) ou avec l’acide gibbérellique (GA3 à 1 mg l-1) sur la
production des pousses feuillées. Cette expérimentation a été effectuée dans des tubes à essai (22
x 150 mm) contenant 15 ml de milieu nutritif.
A l’issue de cette expérimentation poursuivie sur 4 semaines, les nombres moyens des
bourgeons proliférés et des pousses feuillées développées ont été notés en fonction de la
concentration de BAP seule ou en association avec AIB et/ou GA3.
Afin de déterminer la cytokinine qui optimise les résultats au stade de multiplication chez
Pistacia vera L., l’influence de trois cytokinines : la N6-benzylaminopurine (BAP), la kinétine
(KIN) et la méta-Topoline (mT) sur la prolifération des bourgeons et leur croissance en rosettes
feuillées a été étudiée. Les concentrations alors testées ont été de (0,5 ; 1 ; 2 et 4) mg l-1. Cette
expérimentation a été réalisée dans des boucaux de 500 ml contenant 100 ml de milieu nutritif.
Après 30 jours de culture sur les différents milieux nutritifs étudiés, les paramètres suivants ont
été utilisés pour évaluer l’effet hormonal :
-
Nombre moyen de pousses axillaires produites par explant primaire ;
Longueur moyenne de pousses feuillées utilisables (> 10 mm) ;
Aspects qualitatifs (couleur, hyperhydricité, production de cal,..).
5- RESULTATS
5.1- Effet de la BAP combinée ou non à l’AIB et/ou à la GA3
L’influence de différentes concentrations en BAP, avec ou sans AIB ou GA3, a été analysée
sur le milieu de multiplication de Murashige et Skoog. Les résultats obtenus après 4 semaines de
culture montrent que le nombre moyen d’axes végétatifs est significativement élevé (4,1 et 4,3
bourgeons/explant) lorsque les segments nodaux ont été cultivés en présence respectivement de 2
et 4 mg l-1 BAP (Figure 31A et 32A,B). Par ailleurs, nous avons pu constater que l’addition de
0,1 mg l-1 AIB à la BAP (4 mg l-1) améliore significativement le bourgeonnement axillaire chez
le pistachier fruitier pour atteindre un nombre maximal de 6 bourgeons/explant (Figure 32C).
L’addition de la GA3 à ce milieu de multiplication a réduit la prolifération des bourgeons à 4,7
axes végétatifs par explant.
(A)
4
8
7
b
6
b
b
b
b
5
c
c
4
(B)
a
a
a
3
2
Nombre de pousses feuillées
Nombre de bourgeons produits
9
3,5
b
3
ab
M5
M6
c
2,5
2
ab
cd
1,5
d
1
0,5
1
0
0
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M1
M2
M3
M4
M7
M8
Figure 31. Effet de la benzylaminopurine (BAP) seule ou combinée à 0,1 mg l-1 AIB et/ou 1 mg l-1 GA3 sur la
prolifération des bourgeons (A) et la production de pousses feuillées (B) du pistachier (P. vera L.) après 4
semaines de culture sur le milieu MS : (M1: 1 mg l-1 BAP; M2: 2 mg l-1 BAP; M3: 4 mg l-1 BAP; M4: 6 mg l-1
BAP; M5: 2 mg l-1 BAP+AIB; M6: 4 mg l-1 BAP+ AIB; M7: 2 mg l-1 BAP + AIB +GA3; M8: 4 mg l-1 BAP +
AIB +GA3). Les histogrammes ayants les mêmes lettres ne présentent pas de différence significative à 5%.
L’évolution des axes végétatifs en pousses feuillées est favorisée par l’AIB et la GA3. En
effet, la présence de l’acide gibbérellique dans les milieux de culture a permis d’obtenir en
moyenne 2,3 à 2,6 microboutures allongées dont leur taille dépasse dans certains cas les 2 cm
(figures 31B et 32D).
Figure 32. Prolifération in vitro des pousses axillaires sur le milieu de base de MS enrichi de 2 mg
l-1 BAP (A) ; 4 mg l-1 BAP (B) ; 4 mg l-1 BAP + 0,1 mg l-1 AIB (C) et 4 mg l-1 BAP + 0,1 mg l-1
AIB + 1 mg l-1 GA3(D) (barre = 1cm).
5.2- Effet des cytokinines
La réponse des explants aux cytokinines exogènes est variable selon la nature et la
concentration des cytokinines employées. L’analyse des résultats résumés dans le tableau 21
indique que la Kinétine n’est pas performante pour le bourgeonnement du pistachier (Pistacia
vera L.). En sa présence, le maximum d’explants caulogènes a été de 90% et cela sur le milieu
contenant 2 mg l-1 KIN. A cette même concentration, le nombre moyen de pousses produites par
explant bourgeonné a été faible ne dépassant pas 1,1 dont seulement 0,6 pousses utilisables
observées par explant (Figure 33A). Les autres concentrations en kinétine donnent en générale
des pourcentages d’induction caulogènes et un nombre de pousses très faibles (Figure 33B).
La N6-benzylaminopurine (BAP) stimule la formation des bourgeons chez le pistachier
(Pistacia vera L.) avec un pourcentage de caulogenèse variant entre 96 et 98%. Le nombre
moyen de pousses produites par culture ainsi que celui des microboutures utilisables augmentent
avec la concentration. 4 mg l-1 BAP affiche les meilleurs résultats (Tableau 21 et Figure 33C).
Ces données confirment celles précédemment enregistrées avec la même cytokinine. Toutefois,
l’environnement des bocaux apparaît plus favorable à la croissance des bourgeons et donc à la
production de pousses feuillées utilisables que celui des tubes à essai.
La méta-Topoline (mT) s’est avérée très efficace pour le bourgeonnement axillaire du
pistachier fruitier. Le pourcentage de caulogenèse est élevé (100%) pour l’ensemble des
concentrations testées. Toutefois, la dose optimale pour la multiplication était de 2 mg l-1. A cette
même concentration, on enregistre les valeurs les plus élevées pour le nombre moyen de pousses
utilisables (2,5) et la longueur moyenne (2,3 cm) (Tableau 21 et Figure 33D). Quelque que soit la
concentration utilisée, les microboutures obtenues en présence de méta-Topoline sont de bonne
qualité avec des feuilles généralement bien développées et le plus souvent larges (Figure 33E).
A la lumière de ces résultats obtenus, la BAP et la mT à 2 et 4 mg l-1 ont été retenues pour la
suite de nos essais.
Tableau 21. Effet de différentes concentrations de trois cytokinines (BAP, KIN, mT) sur la production de pousses
feuillées à partir de segments nodaux après 30 jours de culture (n = 50 explants par traitement). Dans une même
colonne, les valeurs ayant la même lettre ne sont pas statistiquement différentes d’après le test de Duncan (P>0.05).
Concentrations des cytokinines (mg l-1)
BAP
KIN
mT
0.5
1
2
4
-
0.5
1
2
4
-
0.5
1
2
4
Explants
Nombre moyen de Nombre moyen Longueur moyenne
caulogènes (%)
pousses par
de pousses
des pousses
explant
utilisables
utilisables (cm)
96ab
96ab
98ab
98ab
70c
52cd
90b
44d
100a
100a
100a
100a
1.8 ± 1.2e
2.2 ± 1.2de
3.0 ± 1.4bc
4.5 ± 2.0a
0.9 ± 0.7fg
0.7 ± 0.7fg
1.1 ± 0.6f
0.6 ± 0.7g
2.3 ± 0.9de
2.7 ± 1.3cd
3.4 ± 1.6b
3.0 ± 1.7bc
0.9 ± 0.7de
1.1 ± 0.8d
1.0 ± 0.9d
1.6 ± 1.0c
0.5 ± 0.6f
0.1 ± 0.3g
0.6 ± 0.5ef
0.1 ± 0.4g
1.1 ± 0.7d
1.6 ± 0.8c
2.5 ± 1.3a
2.0 ± 1.2b
1.7 ± 0.8bc
1.6 ± 0.5c
1.4 ± 0.4c
1.5 ± 0.4c
2.1 ± 1.0ab
1.5 ± 0.5c
2.2 ± 0.8a
1.7 ± 0.4bc
2.2 ± 0.9a
2.1 ± 0.8a
2.3 ± 0.7a
2.3 ± 0.8a
5.3- Effet d’une seconde subculture
Afin d’évaluer le potentiel morphogénétique des microboutures produites en présence de
BAP et mT, un second passage sur les mêmes milieux à des concentrations de 2 et 4 mg l-1 a été
effectué. Les résultats sont rapportés dans le tableau 22.
Tableau 22. Evaluation du potentiel morphogénétique des pousses feuillées obtenues sur BAP et mT (2 et 4 mg l-1)
après deux passages successifs sur le même milieu. (n = 40 explants par traitement). Dans une même ligne, les
valeurs ayant la même lettre ne sont pas statistiquement différentes d’après le test de Duncan (P>0.05).
BAP
Concentrations des cytokinines (mg l-1)
Explants caulogènes (%)
Nombre moyen de pousses par explant
Nombre moyen de pousses utilisables
Longueur moyenne des pousses utilisables (cm)
mT
2
4
2
4
97.5a
3.1 ± 1.7b
1.5 ± 1.1bc
1.6 ± 0.5b
100a
4.9 ± 2.3a
1.2 ± 1.0c
1.7 ± 0.4ab
100a
4.5 ± 2.4a
3.2 ± 1.7a
1.8 ± 0.5a
100a
4.5 ± 2.1a
2.0 ± 1.0b
1.5 ± 0.4b
L’analyse des résultats obtenus après cette seconde subculture indique que la méta-Topoline
à la concentration de 2 mg l-1 est la plus favorable à l’induction des pousses feuillées et à leur
croissance. En effet, en sa présence, un nombre maximal (3,2) de microboutures utilisables a été
enregistré avec une croissance optimale de 1,8 cm et une bonne apparence morphologique
(Figure 33F). En doublant la concentration de mT (4mg l-1), le nombre moyen de pousses
utilisables ainsi que leur croissance diminues (Figure 33G). La BAP à la même dose affiche un
nombre maximal (4,9) de pousses induites par explants mais sans différence significative avec
celui enregistré en présence de mT. Toutefois, le nombre de microboutures utilisables ainsi que
leur taille est significativement faible comparativement à celui des méta-Topolines (Figure 33H).
En ce qui concerne l’aspect qualitatif, les vitroplants obtenus en présence de méta-Topoline
sont les meilleurs avec une taille moyenne d’environ 2 cm et une morphologie foliaire
impeccable (feuilles chlorophylliennes et larges). La production de cal à la base des explants a
été faible comparativement à la première culture.
Figure 33. Prolifération in vitro des pousses axillaires de Pistacia vera L. après 30 jours de culture sur le milieu de
base de Murashige et Skoog (1962). Pousse feuillée obtenue en présence de 2 mg l-1 KIN (A), induction inhibée en
présence de 4 mg l-1 KIN (B), Prolifération intense de pousses feuillées obtenue en présence de 4 mg l-1 BAP (C) et 2
mg l-1 mT (D). Noter l’aspect des feuilles larges qui caractérise les microboutures produites en présence de métaTopoline (E). Pousses feuillées obtenues après une deuxième subculture sur le milieu MS supplémenté de 2 mg l-1
mT (F), 4 mg l-1 mT (G) et 4 mg l-1 BAP (H). (Barre = 1 cm).
6-DISCUSSION ET CONCLUSION
6.1- Effet combiné de BAP/AIB/GA3
L’aptitude organogène des explants dépend de plusieurs facteurs, notamment du stimulus
hormonal apporté par le milieu nutritif. La N6-benzylaminopurine (BAP) est traditionnellement
la cytokinine la plus utilisée pour la prolifération des bourgeons axillaires chez les espèces
ligneuses (David, 1982).
Généralement, des concentrations élevées en cytokinines favorisent la prolifération d’un
grand nombre de bourgeons (Tanuwidjaja et al, 1998). Ainsi, nous avons démontré que
l’utilisation de concentrations de (2 à 4 mg l-1) de BAP augmentait de façon significative le
nombre de pousses axillaires produites par explant. Les faibles et les fortes doses agissent
négativement sur la production de bourgeons et leur développement ultérieur. Nos résultats se
concordent avec ceux obtenus par Barghchi et Aldersen (1983) et Abousalim et al., (1991) chez
le pistachier. Des résultats similaires ont été obtenus chez d’autres espèces ligneuses telles que
Pinus pinaster Sol (Rancillac, 1981) ; Dalbergia sissoo (Gulati et Jaiwal, 1996) ; Annona
muricata L (Lemos et Blake, 1996) ; Irvingia gabonensis (Omokolo Ndoumou et al., 2003) ;
Ricinodendron heudelotii (Fotso et al., 2004) et Annona glabra L. (Deccetti et al., 2005).
Au cours de nos expériences, l’utilisation de la BAP à 4 mg l-1 combinée à 0,1 mg l-1 d’AIB
s’est révélée nécessaire pour maximiser la prolifération de pousses axillaires. L’effet bénéfique
de la combinaison d’une auxine, notamment l’AIB à la BAP durant la phase de prolifération des
bourgeons a été constaté chez plusieurs espèces ligneuses : Juglans regia L (Driver et Kuniyuki,
1984 ; Sanchez-Zamora et al., 2006), Annona muricata L (Lemos et Blake, 1996) ; Ricinus
communis L (Sujatha et Reddy, 1998) et Jatropha curcas L (Sujatha et al., 2005). Cependant,
Chalupa (1984) a montré que l’addition de faibles concentrations d’auxines (AIB ou ANA)
n’affecte pas significativement le débourrement des bourgeons de Quercus robur. De plus,
Zobayed et al., 2002 ont signalé que l’ajout d’une auxine au milieu de multiplication réduit le
taux de bourgeonnement, comparé à l’utilisation de la BAP seule.
La présence de la GA3 dans le milieu de prolifération n’a pas amélioré le rendement en
bourgeons produits chez le pistachier fruitier. Des résultats similaires ont été obtenus chez
d’autres espèces ligneuses : Ceratonis siliqua L (Sebastian et McComb, 1986) et Annona
muricata L (Lemos et Blake, 1996). L’effet inhibiteur de la GA3 sur la caulogenèse de
nombreuses plantes a été signalé par plusieurs auteurs (El Kbiach et al., 2002a ; Deccetti et al.,
2005). Selon George (1996), l’effet du GA3 sur la prolifération des pousses feuillées varierait en
fonction de l’interaction existant avec d’autres régulateurs de croissance et dépendrait également
de l’espèce à multiplier. Pendant longtemps, on a pensé que l'auxine et la gibbérelline agissent
séparément. Récemment, des interactions entre la GA3 et l'auxine ont été clairement démontrées
(Hedden, 2004 ; Weiss et Ori, 2007). L'auxine exerce un effet stimulateur sur les métabolites et
peut changer la concentration de GA3, qui est augmentée par stimulation de synthèse. Ainsi la
dose supra-optimale pourrait être atteinte et rendre compte de la réduction du nombre d’axes
végétatifs par explant cultivé in vitro.
6.2- Effet de la nature et la concentration en cytokinines
La cytokinine N6-benzylaminopurine (BAP) également connue sous le nom de
benzyladenine (BA) est souvent utilisée dans les systèmes de micropropagation. Cependant, il
existe d’autres cytokinines qui peuvent être bénéfiques pour la prolifération des tissus végétaux
cultivés in vitro.
Un composant des tissus végétaux, la N6-(3-hydroxy benzyl) adénine, connue sous le nom
de méta-topoline, a été utilisée pour induire la prolifération in vitro des bourgeons axillaires chez
plusieurs espèces végétales (Holub et al., 1998 ; Escalona et al., 2003). Cette substance
hormonale favorise la ramification des pousses et s’oppose à la dominance exercée par le
bourgeon apical sur les méristèmes axillaires (George, 1996). La méta-Topoline (C12N5OH10),
isolée pour la première fois à partir des feuilles de peuplier, diffère des autres cytokinines
isoprenoïdes par sa structure biochimique et son activité biologique (Strnad et al., 1997). Cette
nouvelle substance hormonale appartenant à la classe des cytokinines naturelles à structure
chimique aromatique, n’a encore, à notre connaissance, jamais été testé sur le pistachier.
Parmi les régulateurs de croissance testés (BAP, mT et KIN), la méta-Topoline s’est avérée
la mieux adaptée à la multiplication des bourgeons axillaires de pistachier (Pistacia vera L.).
Quoique la BAP a stimulé fortement le bourgeonnement chez cette espèce, les pousses feuillées
obtenues en sa présence sont en générale petites comparativement à celles issues de mT. Des
résultats similaires ont été rapportés par Kaminek et al., 1987. Ils ont constaté que la métaTopoline était presque deux fois plus efficace que la BAP dans l'induction des bourgeons et leur
croissance en pousses feuillées. L'effet bénéfique de la mT dans l’amélioration du processus du
bourgeonnement axillaire a été rapporté par plusieurs auteurs (Baroja-Fernandez et al., 2002;
Kubalakova et Strnad, 1992, Escalona et al., 2003; Bairu et al., 2008).
En plus du taux de multiplication élevé enregistré en sa présence, la méta-Topoline assure
un bon aspect morphologique des vitroplants avec des feuilles larges caractérisant les
microplants issus de cette cytokinine aromatique. Nos résultats confirment ceux de Dridi, 2003
qui a obtenu des plantules d’artichaut de feuilles larges comparativement aux autres cytokinines
testées. Werbrouck et al., 1996, eux aussi ont obtenu des plantules de Spathiphyllum d’un vert
très foncé avec la mT, ce qui n’était pas le cas avec les autres cytokinines utilisées dans leurs
essais. Ces résultats sont appréciables dans la mesure où cette cytokinine (mT) donne une qualité
de pousses assez bonne, leur permettant d’obtenir de bons résultats à l’enracinement (voir
chapitre VI).
La Kinétine s’est révélée inefficace pour la micropropagation du pistachier. Avec cette
cytokinine naturelle, les taux de multiplication ont été les plus faibles. Des résultats similaires
ont été obtenus chez le chêne-liège (El Kbiach et al., 2002a). Ces auteurs ont enregistré de
faibles pourcentages de multiplication variant entre 26,7 et 41,7% avec respectivement 2,32 μM
(0,5 mg l-1) et 4,65 μM (1 mg l-1) KIN. Dridi (2003) signale aussi l’inefficacité de la kinétine à la
multiplication d’artichaut puisqu’elle donne de pousses feuillées de petite taille, or une longueur
supérieure ou égale à 2 cm est souhaitable pour réussir la rhizogenèse chez cette espèce
(Harbaoui, 1982).
6.3- Conclusion
L’étude de l’effet des différentes cytokinines testées afin d’optimiser les résultats au stade de
multiplication, nous a permis de choisir la méta-topoline (à 2 mg l-1) comme cytokinine à
incorporer dans le milieu de prolifération des bourgeons chez Pistacia vera L. En effet, cette
cytokinine aromatique a une activité morphogénétique élevée, serait apparemment un bon
remplaçant de la BAP pour la micropropagation du pistachier.
Chapitre VI - Rhizogenèse et
Acclimatation des Vitroplants
1- INTRODUCTION
Chez le pistachier (Pistacia vera L.) la rhizogenèse in vitro présente encore des difficultés
liées principalement aux faibles taux d’enracinement et à la qualité du système racinaire produit
in vitro. C’est la raison pour laquelle on n’a pas encore pu établir une chaîne industrielle fiable
de production de vitroplants de cette essence fruitière. Néanmoins, si nous voulons que ceci se
réalise, il est impératif d’améliorer non seulement les taux d’enracinement mais également
l’aspect qualitatif des racines, assurant ainsi une bonne reprise lors de l’acclimatation.
La néoformation d’un système racinaire fonctionnel et vigoureux est donc indispensable au
servage des vitroplants. A partir des microboutures produites in vitro, plusieurs méthodes
d’enracinement peuvent être envisagées :
•
Enracinement in vitro : deux phases lors de la formation des racines adventives : une
première étape dite « d’induction racinaire » effectuée le plus souvent à l’obscurité et en
présence d’auxines et une seconde dite « d’expression racinaire » effectuée à la lumière
et sans hormone afin de favoriser l’élongation des racines.
•
Enracinement ex vitro : enracinement des microplants en conditions horticoles
traditionnelles.
•
Enracinement mixte : ce type d’enracinement est effectué en deux étapes distinctes : la
première consiste en une induction rhizogène in vitro, tandis que la seconde d’élongation
racinaire est effectuée hors tube dans un substrat horticole.
En ce qui nous concerne, nous retiendrons les deux premières techniques d’enracinement in
vitro et ex vitro. Nous allons étudier dans ce chapitre l’effet de différentes auxines qui ont
donnée déjà de bons résultats de rhizogenèse in vitro chez d’autres plantes. La technique
d’enracinement ex vitro a été utilisée pour la première fois chez le pistachier fruitier (Pistacia
vera L.).
2- ETUDE DE L’ENRACINEMENT IN VITRO
2.1- Matériel et méthodes
2.1.1- Matériel végétal
Des pousses feuillées produites par bourgeonnement axillaire, ayant une longueur variant
entre 1,5 et 4 cm, avec 4 à 9 feuilles, ont été utilisées pour les essais d’enracinement.
2.1.2- Milieu de rhizogenèse
Les microboutures ont été cultivées dans des bocaux contenant 100 ml d’un milieu
Murashige et Skoog dont les macroéléments ont été dilués de moitié (MS/2), tel que préconisé
par Aboussalim et al. (1991). Ce milieu renferme également les microéléments et la solution
ferrique de MS, les vitamines B5 de Gamborg et al. (1968), myo-inositol (100 mg l-1), hydrolysat
de caséine (500 mg l-1), 30 g l-1 de saccharose et 6 g l-1 Bacto-agar Difco. Le milieu est ajusté
avant autoclavage à 5,7 à l’aide de 0,1N KOH.
2.1.3- Induction racinaire prolongée
Trois auxines, l’acide indole- butyrique (AIB), l’acide naphtalène acétique (ANA) et l’acide
3-(Benzo(b)selenyl) acétique (BSAA) ont été testées à différentes concentrations :
-
-
-
2,5 mg l-1 AIB préconisé par Abousalim et al. (1991).
2 mg l-1 AIB + 0,05 mg l-1 ANA préconisé par Chatibi (1999).
2 mg l-1 AIB + 1,5 mg l-1 ANA
ANA 1 mg l-1.
AIB/ANA : 0,5/0,5 mg l-1.
AIB/ANA : 1/1 mg l-1.
BSAA (Acide 3-(Benzo(b)selenyl) acétique) : 0,25 ; 0,5 et 1 mg l-1.
Afin de limiter la prolifération de cal à la base des vitroplants et d’améliorer le taux et la
qualité d’enracinement in vitro, d’autres essais faisant appels à un retardateur de croissance le
paclobutrazol (PBZ) et l’acide jasmonique (AcJas) ont été effectués. Les auxines retenues (ANA
1 mg l-1, AIB/ANA 1/1 mg l-1, BSAA 0,5 mg l-1 et 2,5 mg l-1 AIB) ont été testées en combinaison
avec AcJas (0,25 ; 0,5 ; 1 mg l-1) et/ou à 0,5 mg l-1 PBZ. Nous signalons que l’AcJas et le PBZ
ont été stérilisés par filtration (0,22µm) puis incorporés dans les milieux déjà stérilisés à
l’autoclave.
L’induction racinaire est effectuée à l’obscurité pendant 10 jours puis les pousses ont été
repiquées sur MS/2 ou Knop, dépourvus de régulateurs de croissance. Les cultures ont été
exposées à la lumière (40µmole m-2s-1) 16h par cycle de 24h pour permettre l’élongation des
racines néoformées. La température au tour des bocaux est maintenue à 22 °C.
2.1.4- Induction racinaire rapide
La base des pousses feuillées est trempée pendant 1 heure dans une solution auxinique
stérilisée par filtration (0,22µm), puis les microboutures sont repiquées dans des tubes en verre
(200 x 30 mm) contenant 2-3g de la vermiculite humidifiée d’une solution nutritive (milieu de
MS ou Knop) et placées directement à la lumière. Les milieux ont été préalablement stérilisés à
l’autoclave à 113°C/20 min.
La première phase d’induction rhizogène rapide (le choc auxinique) est effectuée dans des
petits tubes en plastique stériles, sous hotte à flux laminaire. Deux solutions auxiniques ont été
testées: AIB et ANA à 100 mg l-1.
2.1.5- Paramètres étudiés
Les paramètres étudiés après 30 jours de culture sur le milieu d’expression racinaire sont les
suivants :
•
•
•
•
Pourcentage de microplants enracinés ;
Nombre de racines par pousse enracinée ;
Longueur des racines néoformées ;
Production de cal à la base des microplants.
2.2- Résultats
2.2.1- Induction rhizogène prolongée
L’analyse des résultats résumés dans le tableau 23, montre que les taux d’enracinement in
vitro sont relativement faibles. Le maximum d’induction rhizogène (35%) a été enregistré avec
le milieu contenant l’ANA à la concentration de 1 mg l-1 (Figure 34A). L’apport combiné de
l’AIB et l’ANA, à concentrations égales (1 mg l-1) et la BSAA à 0,5 mg l-1 semblent efficaces à
l’enracinement du pistachier comparativement aux autres traitements testés (Figure 34B,D).
Toutefois, les concentrations auxiniques témoins : 2,5 mg l-1 AIB (Figure 34C) préconisée par
Abousalim et al. (1991) et 2 mg l-1 AIB + 0,05 mg l-1 ANA recommandée par Chatibi (1999) ont
donné respectivement que 23,3 et 07,5% de vitroplant enracinés (Tableau 23).
Tableau 23. Effet de différents traitements rhizogènes sur l’induction et l’allongement des racines de vitroplants de
Pistacia vera L. après 30 jours de transfert sur le milieu d’expression racinaire (MS/2). Les valeurs de la même
colonne suivies par des lettres distinctes sont statistiquement différentes entre elles au seuil de 5%.
Régulateurs de
croissance (mg l-1)
Pousses mises
en culture
Pousses
enracinées
Pourcentage
d’enracinement
Nombre de
racines/pousse
Longueur moyenne
de racines (cm)
2,5 AIB
2 AIB + 0,05 ANA
2 AIB + 1,5 ANA
1 ANA
AIB/ANA (0,5/0,5)
AIB/ANA (1/1)
0,25 BSAA
0,5 BSAA
1 BSAA
30
40
60
20
40
50
30
30
30
7
3
7
7
3
12
3
6
2
23,3abc
07,5c
11,7bc
35,0a
07,5c
24,0ab
10,0bc
20,0abc
06,7c
1,1 ± 0,3a
1,0 ± 0,0a
2,0 ± 1,1a
2,0 ± 1,2a
1,3 ± 0,6a
1,5 ± 0,7a
1,0 ± 0,0a
2,0 ± 1,3a
1,0 ± 0,0a
0,9 ± 0,4a
1,3 ± 0,8a
1,0 ± 0,7a
1,1 ± 0,5a
0,3 ± 0,2a
1,1 ± 1,0a
1,1 ± 0,8a
0,9 ± 1,2a
1,1 ± 1,0a
Nous signalons qu’une calogenèse abondante a été observée à la base des vitroplants ce qui
a probablement inhibé la néoformation des racines adventives (Figure 34E).
Afin d’améliorer l’induction racinaire chez le pistachier fruitier, les traitements auxiniques
retenus (2,5 mg l-1 AIB ; ANA à 1 mg l-1 ; ANA/AIB à 1/1 mg l-1 et BSAA à 0,5 mg l-1) ont été
combinés à 0,5 mg l-1 PBZ et à l’acide jasmonique (0,25 ; 0,5 et 1mg l-1).
L’analyse du tableau 24 révèle qu’après un mois de repiquage sur le milieu d’expression
racinaire (Knop), la plupart des traitements étudiés n’ont pas encore donné de taux satisfaisants
d’enracinement. Le maximum d’induction racinaire (30%) a été observé chez les vitroplants
traités par 1AIB/1ANA/0,5 PBZ (mg l-1). Ce traitement a induit un nombre moyen de racines de
2,3 ± 1,9 avec une longueur moyenne de 1,2 ± 0,5 cm (Figure 34F). Les autres traitements ont
donné des taux rhizogènes faibles variant entre 05 et 25%.
Nous signalons que l’addition du paclobutrazol à limiter considérablement la prolifération
calogène à la base des microplants (Figure 34F).
Tableau 24*. Effet de l’acide jasmonique (AcJas) et de paclobutrazol (PBZ) sur la formation des racines et de cals
chez Pistacia vera L. après 30 jours de culture sur le milieu d’expression racinaire (Knop). (n = 20 microplants par
traitement). Les valeurs de la même colonne suivies par des lettres distinctes sont statistiquement différentes entre
elles au seuil de 5%.
0,5 PBZ
associé à : (mg l-1)
Enracinement
(%)
Nombre moyen de
racines/microplant
Longueur moyenne
des racines (cm)
Calogenèse
0,5 BSAA
0,5 BSAA+0,25 AcJas
0,5 BSAA+0,5 AcJas
0,5 BSAA+ 1 AcJas
1 ANA
1 ANA + 1 AIB
20
10
25
05
10
30
2,8 ± 1,7a
2,5 ± 2,1a
1,0 ± 0,0a
1,0 ± 0,0a
1,0 ± 0,0a
2,3 ± 1,9a
1,1 ± 0,8bc
2,1 ± 1,3ab
1,9 ± 1,0abc
0,5 ± 0,0c
2,8 ± 1,1a
1,2 ± 0,5bc
+
+
+
-
(*) Les résultats résumés dans ce tableau ne concernent que les traitements induisant une rhizogenèse. + : présence de cal ; - : absence de cal.
2.2.2- Induction rhizogène rapide
Les différents essais d’induction rhizogène rapide n’ont pas amélioré les résultats. En effet,
les pourcentages d’enracinement ont varié entre 0 et 20% (Tableau 25). L’utilisation de l’ANA
paraît avantageuse à l’induction des racines adventives comparativement à l’AIB (Figure 34
G,H,I). L’ensemble de microplants enracinés a été observé sur la vermiculite humidifiée par la
solution nutritive de MS.
Tableau 25. Effets comparés de l’AIB et de l’ANA sur l’enracinement des microboutures ; induction de 1 h en
solution aqueuse. (n = 20 microplants par traitement). Les valeurs de la même colonne suivies par des lettres
distinctes sont statistiquement différentes entre elles au seuil de 5%.
Auxines
Milieux utilisés pour
humidifier la vermiculite
Enracinement
(%)
Nombre moyen de
racines/microplant
Longueur moyenne
des racines (cm)
Cal
AIB 100 mg l-1
ANA 100 mg l-1
KN
0c
0c
-
-
++
++
AIB 100 mg l-1
ANA 100 mg l-1
MS
10b
20a
1b
2,0 ± 0,8a
0,6 ± 0,4b
1,8 ± 2,7a
+
+
Figure 34. Effet du traitement auxinique sur la formation de racines adventives après 30 jours de
culture sur les milieux d’expression racinaire. (A-F) Plantules enracinées in vitro après un
traitement rhizogène prolongé à l’ANA 1 mg l-1 (A), ANA/AIB à 1 mg l-1 (B), AIB 2,5 mg l-1 (C) et
BSAA 0,5 mg l-1 (D). Noter la prolifération calogène abondante à la base des vitroplants ce qui a
inhibé l’induction et la croissance racinaire (E). Microplants enracinés après un traitement combiné
de l’AIB et l’ANA à concentrations égales (1 mg l-1) et 0,5 mg l-1 PBZ (F). (G-H) Plantules
enracinées in vitro après un trempage rapide (1h) dans une solution auxinique concentrée d’ANA
(G) et d’AIB (H). Vitroplants non enracinés (I). (Barre = 1 cm).
2.3- Discussion
L’effet d’une auxine exogène sur l’enracinement dépend de la nature du composé utilisé et
de la concentration employée. L’AIB est l’auxine la plus utilisée pour induire la rhizogenèse in
vitro chez le pistachier fruitier. Elle est préconisée à des concentrations de 2 à 2,5 mg l-1
(Barghachi et Alderson, 1989 ; Abousalim et al., 1991). Nos essais ont montré que le pistachier
(Pistacia vera L.) différencie mieux les racines avec l’ANA qu’avec les autres auxines testées.
La concentration de 1 mg l-1 donne 35% de microboutures enracinées. Ces résultats se
concordent avec ceux de Ghorbal et al., (1998) obtenus chez le porte-greffe pêcher-amandier
GF-557. Rugini (1984) et Abousalim et al., (2005) ont également rapporté que l’ANA à 1 mg l-1
est plus efficace à l’enracinement in vitro de l’olivier (Olea europaea L.).
L’AIB combiné à l’ANA à concentrations égales (1 mg l-1) s’est révélé efficace pour
stimuler la rhizogenèse in vitro chez le pistachier. Ces deux substances auxiniques pourraient
provoquer un effet synergique bénéfique sur la rhizogenèse. Une telle stimulation de
l’enracinement in vitro sous l’effet de l’association de deux auxines (AIB/ANA) a déjà été
observée chez d’autres espèces ligneuses : Fraxinus excelsior ( Silveira et Cottignies, 1994) ;
Quercus sp. (Ostrolucka et Bezo, 1994) et Argania spinosa (Bousselmane et al., 2001).
La BSAA à 0,5 mg l-1 a donné un taux moyen d’enracinement chez le pistachier vrai.
Cependant, Gaspar (1995), Kevers et al. (1999), Tadino et al., (2003) et Dridi (2003) ont obtenu
de bons résultats avec cette auxine séléniée. Les faibles taux rhizogènes enregistrés sont dus
probablement au développement accru de cals à la base des microplants, ce qui a perturbé la
connexion entre la partie caulinaire et les racines. L’apport d’un retardateur de croissance (le
paclobutrazol) dans le milieu d’induction racinaire a réduit considérablement la prolifération
calogène mais sans amélioration du taux d’enracinement.
La rhizogenèse in vitro du pistachier fruitier est fréquemment une phase difficile à obtenir.
En effet, il faut considérer non seulement le taux d’enracinement des vitroplants mais aussi
l’aspects qualitatif des racines adventives obtenues, ce qui conditionne la réussite de l’étape
ultérieure, à savoir l’acclimatation. Nous avons exploré une autre voie de traitement similaire à
celle pratiquée pour le bouturage. La base des microplants est trempée dans une solution
auxinique concentrée. Les résultats obtenus n’indiquent aucune amélioration d’enracinement où
les taux restent faibles ne dépassant pas les 20%. Le problème de rhizogenèse in vitro a été
signalé chez d’autres espèces ligneuses, c’est le cas du noyer (Meynier, 1985). Malgré les
différentes tentatives effectuées, cet auteur n’a pas pu améliorer le taux d’enracinement in vitro
chez Juglans sp. Monteuuis et Bon (1986) ont obtenu eux aussi des taux rhizogènes faibles de
l’ordre de 11, 14 et 17% après un trempage rapide (2h) de la base des vitroplants de séquoia
géant dans les solutions auxiniques concentrées respectivement à 100 mg l-1 AIB, 100 mg l-1
ANA et 50 mgl-1 AIB + 50 mg l-1 ANA. En revanche, Riffaud et Cornu (1981) signalent un
mauvais aspect qualitatif des plants enracinés après trempage rapide dans les différentes
concentrations d’AIB. Ces auteurs observent un jaunissement et parfois une chute des feuilles
due probablement au choc auxinique et la forte teneur en auxine.
Compte tenu de faibles taux d’enracinement in vitro, nous avons recherché une autre
technique permettant d’assurer non seulement une bonne induction rhizogène mais aussi un bon
aspect qualitatif du système racinaire. Pour cela, l’enracinement ex vitro a été essayé pour la
première fois chez le pistachier (Pistacia vera L.).
3- ETUDE DE L’ENRACINEMENT EX
VITRO
3.1- Matériel végétal et technique expérimentale
Les microboutures (1-3 cm de longueur) ont été transférées dans un milieu frais dépourvu de
régulateurs de croissance, comprenant 2 g l-1 de charbon actif et ceci dans l’optique d’obtenir des
pousses feuillées lignifiées aptes à l’enracinement ex vitro (Figure 35A,B).
Après 30 jours de culture, les microplants ont été lavés à l’eau courante pour éliminer le
reste du milieu de culture. La partie basale des vitroplants (environ 5 mm) est passée dans la
poudre auxinique testée. Les microboutures traitées ont été implantées dans des mottes Fertiss
contenant tourbe-perlite-vermiculite (80-15-5%), placées dans des mini serres avec couvercles
(Figure 35C) dans une salle climatisée dont la photopériode est de16 h par cycle de 24h avec une
température de 22°C le jour et 18°C la nuit. L’arrosage des mottes Fertiss est effectué environ 10
jours après la mise en culture. Il est conseillé d’arroser uniquement quand cela est nécessaire.
Généralement, une humidité relative élevée combinée à un arrosage excessif sont plus favorables
à la pourriture des microplants.
3.2- Facteurs étudiés et critères d’évaluation
Deux poudres auxiniques ont été testées : Rhizopon® AA (2% AIB (acide indole-3butyrique) et Rootone® F (contenant en %: 0.065 ANA, 0.056 AIB et 0.013 2-Methyl-1Naphthyl Acetamide). L’effet du milieu de multiplication des pousses feuillées sur
l’enracinement ex vitro du pistachier fruitier est également suivi.
Après 6 semaines, l’humidité a été réduite progressivement en ouvrant le couvercle des mini
serres. Les plantules survivantes ont été transplantées dans des pots contenant tourbe-perlitevermiculite (1 :1 :1 v/v/v). Les pourcentages de survie et d’enracinement ainsi que le nombre
moyen de racines par microplant enraciné et la longueur moyenne des racines ont été déterminés
à la fin de l’expérimentation.
3.3- Résultats
3.3.1- Effet de la poudre auxinique
Les résultats obtenus sont très encourageants. Après environ 2 à 3 semaines de culture, les
premières racines commencent à émerger et perforent les tissus des mottes Fertiss (Figure 35D).
Dans ce premier essai, nous avons étudié l’effet de la nature de la poudre auxinique
commerciale testée sur l’enracinement des vitroplants provenant de la méta-Topoline. Les taux
de survie des microplants ont été élevés de l’ordre de 100 ; 92,9 et 87,1% enregistrés
respectivement avec le témoin (sans traitement hormonal), Rootone® F et Rhizopon®. Toutefois,
le lot témoin affiche un taux d’enracinement significativement faible (47,5%) comparativement à
celui enregistré avec Rhizopon® (78,6%) ou Rootone® F (74,3%) (Tableau 26).
Les meilleurs rendement en racines produites par microplants enracinés ont été observés
chez le lot traité par Rhizopon® avec une moyenne de (3,8 ± 2,7) ce qui représente le double des
racines obtenues avec le témoin (1,7 ± 0,9) (Tableau 26 ; Figure 35E,F,G). La longueur des
racines adventives a été influencée par la poudre hormonale testée. En effet, la longueur
moyenne la plus élevée (5,9 cm) a été enregistrée chez les témoins suivie de Rootone® F (3,5
cm).
Tableau 26. Effet de la poudre auxinique sur l’enracinement ex vitro des microplants de Pistacia vera L. après 6
semaines de culture. Les valeurs de chaque ligne suivies des lettres distinctes sont significativement différentes au
seuil de 5%.
Témoin
Rootone F
Rhizopon AA
Survie (%)
Enracinement (%)
Nombre de racines/microplant
Longueur de racines (cm)
100 (40/40)a
47,5b
1,7 ± 0,9b
5,9 ± 4,5a
92,9 (65/70)ab
74,3a
2,6 ± 1,6b
3,5 ± 3,1b
87,1 (61/70)b
78,6a
3,8 ± 2,7a
1,9 ± 1,6c
3.3.2- Effet du milieu de multiplication
Durant ce second essai, nous avons étudié l’effet du milieu de prolifération des pousses
feuillées sur l’enracinement ex vitro. La base des microboutures issues de la méta-Topoline (mT)
et de la benzylaminopurine (BAP) a été passée dans la poudre auxinique (Rhizopon®). Par la
suite, les vitroplants traités ont été repiqués dans des mottes Fertiss puis placés dans des miniserres. Les conditions ambiants de la salle climatisée sont les mêmes que celles du premier essai.
Les résultats obtenus après 6 semaines de culture ne montrent aucune différence
significative entre les types de vitroplants utilisés. Les pourcentages d’enracinement ont été
élevés de l’ordre de 82,5 et 75% enregistrés chez les microboutures issues respectivement de la
méta-Topoline et de la benzylaminopurine (Tableau 27). Le nombre moyen de racines par
plantule enracinée a varié entre 3 et 4 racines (Figure 35H,I).
Tableau 27. Effet du milieu de multiplication sur l’enracinement ex vitro des microboutures de Pistacia vera L.
traitées par Rhizopon® 2% AIB. (n=40 pousses feuillées par traitement). Les valeurs ayant les mêmes lettres pour
une même ligne ne présentent pas de différence significative à 5%.
Survie (%)
Enracinement (%)
Nombre de racines/microplant
Longueur de racines (cm)
BAP
mT
82,5a
75a
3,1 ± 2,4a
2,3 ± 1,9a
92,5a
82,5a
3,8 ± 2,3a
1,9 ± 1,6a
Nous signalons que la technique d’enracinement ex vitro a été utilisée en routine pour
enraciner et acclimater les microboutures de Pistacia vera L. Pour l’ensemble des essais
effectués, les taux rhizogènes ont varié entre 70 et 82%. L’aspect qualitatif du système racinaire
produit ex vitro assure une bonne reprise de la croissance des vitroplants après transfert en serre
(Figure 35J).
Figure 35. Enracinement ex vitro et acclimatation des microplants de Pistacia vera L.
Préparation des vitroplants à l’enracinement ex vitro. Noter le bon aspect qualitatif des pousses feuillées après
un passage de 30 jours sur un milieu dépourvu d’hormone et supplémenté de 2 g l-1 de charbon actif (A-B).
Microboutures repiquées dans des mottes Fertiss et placées dans une mini serre (C). Formation de racines
adventives après 2 à 3 semaines de la mise en culture (D). Microplants enracinés ex vitro après 6 semaines de
culture : Rhizopon (E), Rootone F (F), Témoins (G). Enracinement ex vitro de pousses feuillées issues de
méta-Topoline (H) et de benzylaminopurine (I) après un traitement auxinique par Rhizopon. Reprise de la
croissance des microplants après 2 mois de transfert en serre (J). (Barre = 1cm.)
3.4- Discussion
La réussite de la production industrielle de vitroplants dépend largement du pourcentage
d’enracinement et de la qualité du système racinaire obtenue. La rhizogenèse ex vitro a été
appliquée pour simplifier le processus de la micropropagation et de réduire le coût de la
production. Par ailleurs, elle présente l’avantage de raccourcir le protocole de production de
plants puisque les deux dernières étapes de la micropropagation, à savoir l’enracinement et
l’acclimatation s’effectuent en même temps.
L’enracinement ex vitro a été appliqué avec succès chez plusieurs plantes : Quescus robur
(Meier-Dinkel et al., 1993), Fraxinus spp. (Kim et al., 1998), Stackhousia tryonii (Bhatia et al.,
2002), Ceratonia siliqua (Romano et al., 2002), Rotula aquatica et Eupatorium triplinerve
(Martin, 2003a,b). Cette technique n’a jamais fait l’objet d’étude chez le pistachier fruitier
(Pistacia vera L.). Les microplants produits in vitro ont été enracinés et acclimatés ex vitro.
L’utilisation de la poudre auxinique commerciale (Rhizopon® 2% AIB) a donné le meilleur
résultat en terme de pourcentage d’enracinement et en nombre de racines produites par
microplant. L’effet bénéfique de l’AIB dans l’induction racinaire ex vitro a été rapportée chez
plusieurs essences ligneuses : Corylus sp. (Yu et Reed, 1995), Fraxinus pensylvanica (Kim et al.,
1998) et Malus zumi (Xu et al., 2008).
Pruski et al. (2000) signalent que les meilleurs taux d’enracinement ex vitro (84%) chez
Prunus virginiana et P. pensylvanica sont obtenus après un traitement auxinique combinant
l’AIB et l’ANA. Ils mentionnent également que l’utilisation de la poudre hormonale ‘Rootone®
F’ a permis aux 75% de pousses feuillées de s’enraciner mais qui n’est pas statistiquement
différente de l’AIB seule où 71% d’enracinement ex vitro a été enregistré. La Rootone® F s’est
révélée bénéfique pour stimuler la rhizogenèse ex vitro chez le pistachier (Pistacia vera L.) où
74,3% de pousses feuillées traitées par cette poudre commerciale ont été enracinées. Cependant,
Bhatia et al., (2002) rapportent que la combinaison de deux ou plusieurs auxines réduit le
pourcentage d’enracinement ex vitro indiquant ainsi un effet antagoniste.
Nous avons montré également que l’enracinement ex vitro chez le pistachier n’est pas
influencé par le milieu de prolifération de pousses feuillées. Cependant, les microplantules issues
de la méta-Topoline donnent le maximum d’enracinement (82,5%) comparativement à celles
provenant de la BAP (75%). Bairu et al., (2007) rapportent que les plants traités avec la métaTopoline montrent une croissance et un enracinement supérieur comparé à la BAP. L’effet
bénéfique de mT a été signalé non seulement sur la rhizogenèse mais aussi en acclimatation des
vitroplants (Werbrouck et al., 1995).
4- ACCLIMATATION DES VITROPLANTS
La production de plusieurs plantes, entre autre le pistachier fruitier, par micropropagation in
vitro reste peu exploitée à l’échelle industrielle et commerciale. Ceci est dû particulièrement au
coût élevé de la main d’oeuvre et aux échecs enregistrés lors de l’acclimatation des vitroplants.
Cette phase est très critique puisqu’elle concerne le passage des plantules d’un environnement
bien contrôlé à un autre totalement différent, entraînant le plus souvent des modifications
morphologiques, anatomiques et physiologiques. Ces changements d’environnement impliquent
le passage: d’une mixotrophie vers une autotrophie.
Chez plusieurs espèces ligneuses, les faibles taux d’enracinement et le disfonctionnement
des racines adventives régénérées, sont responsables des pertes importantes de plants enracinés
in vitro au cours de la phase d’acclimatation (Meynier, 1985 ; Kenny, 1998).
Le pistachier vrai est une espèce très difficile à enraciner et à acclimater. Les racines
adventives formées in vitro sont en générale de mauvaise qualité ce qui a entraîné des taux de
mortalités élevés (40-60%) lors de l’acclimatation. Chatibi (1999) rapporte des difficultés lors de
l’acclimatation des plants de Pistacia vera L. enracinés in vitro. La plupart des vitroplants
transférés en serre finissent par se nécroser.
Utilisé pour la première fois chez le pistachier, l’enracinement ex vitro a amélioré non
seulement le pourcentage de plants enracinés mais aussi la qualité du système racinaire. En effet,
les racines sont fines et ramifiées alors que celles produites in vitro sont généralement épaisses,
succulentes et pourrissent bien souvent après transfert des vitroplants en serre. En revanche, les
mottes Fertiss (Annexe 2) possèdent un mélange de substrats paraissant plus propice à la
formation de racines adventives immédiatement fonctionnelles ce qui a donné un taux de reprise
élevé de l’ordre de 81,5% lors de passage des microplants en serre. Cette méthode
d’enracinement des pousses ex vitro a été utilisée et recommandée par plusieurs auteurs,
puisqu’elle offre ainsi l’opportunité de combiner l’enracinement et l’acclimatation dans une
seule étape; ceci élimine les frais causés pas l’enracinement in vitro surtout que les racines
formées peuvent mourir en cours d’acclimatation (Debergh et Maene, 1981). Des applications
commerciales rapides pouvaient être espérées.
5- CONCLUSION
L’étape d’acclimatation est étroitement liée à la qualité du système racinaire et la vigueur de
la partie caulinaire des microplants. L’enracinement ex vitro des vitroplants de Pistacia vera L. a
été effectué sans difficulté dans les conditions décrites plus haut. Cette technique appliquée pour
la première fois chez le pistachier a permis non seulement d’améliorer le pourcentage de plants
enracinés mais aussi la qualité du système racinaire obtenu (racines fasciculées et ramifiées).
L’application de cette méthode devrait être étendue à bien d’autres espèces ligneuses réfractaires
à l’enracinement.
Chapitre VII- Étude de l’identification
du sexe chez le pistachier (Pistacia
vera L.) par l’utilisation de
différentes approches
1- INTRODUCTION
Le pistachier est une espèce dioïque : il existe des plants mâles et des plants femelles. Seuls
ces derniers sont producteurs de pistaches, après pollinisation par le vent ou, artificielle par
l’homme.
La complexité de l’espèce caractérisée essentiellement par sa dioïcie, sa haute hétérozygotie
et sa croissance généralement moyenne rend impossible la détermination de son sexe à l’âge
juvénile. Il faut attendre plusieurs années (5 à 8 ans) avant de pouvoir différencier les plants
femelles des plants mâles et éliminer ces derniers dans une large mesure, ne conservant au verger
que le nombre nécessaire de pollinisateurs.
L’utilisation des techniques de biologie moléculaire pour l’identification précoce du sexe
s’avère intéressante pour le gain de temps, l’économie de moyens et la sélection des génotypes
performants issus de l’in vitro.
Dans cette stratégie, le présent travail a pour objet de caractériser des régénérants in vitro et
des jeunes semis en vue de distinguer leur sexe, en utilisant plusieurs outils d’analyse :
- les distinctions chromosomiques éventuelles. Dans un premier temps, une vérification
du stock chromosomique chez Pistacia vera L. a été réalisée ;
- les marqueurs moléculaires de type PCR (Polymerase Chain Reaction) ;
- l’approche morphologique de la distinction des trichomes.
Il s’agit ici d’un travail préliminaire sur une question importante et complexe à appréhender.
2- ETUDE CHROMOSOMIQUE
2.1- Matériel et Méthodes
2.1.1- Matériel végétal utilisé
Le matériel végétal utilisé pour dénombrer les chromosomes chez le pistachier fruitier
(Pistacia vera L.) est composé des apex racinaires prélevés sur des vitrosemis âgés de 30 jours
issus de la culture in vitro d’axes embryonnaires sur le milieu de base MS0 supplémenté de 0,2%
charbon actif (Figure 36).
Figure 36. Vitrosemis obtenus après 30 jours de culture sur MS0 enrichi de 0,2%
charbon actif. Noter l’aspect qualitatif des racines utilisées (couleur blanche)
2.1.2- Préparation des racines
L’heure de prélèvement des apex racinaires est déterminante. Il est préférable de prélever le
matériel végétal en période lumineuse sur des plantes en croissance. Les extrémités (1 à 2 cm)
de racines en croissance et de couleur blanc nacré ont été prélevées sur des vitrosemis en phase
de croissance active (période lumineuse - vers 10 h du matin) et placées dans la colchicine à la
concentration de 0,025% (w/v H2O distillée). Ce prétraitement est effectué pendant 3 jours à
l’obscurité et à une température d’environ 4 °C à l’obscurité.
Les échantillons sont par la suite traités pendant 24 h à 4 °C dans le fixateur (Carnoy I) 3:1
(3 volumes d’éthanol absolu + 1 volume d’acide acétique glacial). Cette solution fixatrice des
divisions cellulaires doit être préparée au dernier moment ou au moins le jour même de
l’expérimentation. Après 48 h maximum, le fixateur est remplacé par de l’éthanol à 70° et
stocké à 4 °C jusqu’à utilisation. Les échantillons peuvent se conserver plusieurs mois à -20 °C.
2.1.3- Traitement des racines
Les racines sont rincées 2 fois 10 min à l’eau distillée ultra-pure afin d’éliminer le fixateur.
Après ce rinçage effectué à la température ambiante, les racines sont transférées pendant 15 min
dans un tampon citrate de sodium à 0,01 M pH 4,5. Ensuite, le tampon est éliminé et on ajoute
environ 100 µl d’une solution enzymatique (Annexe 3). Cette digestion enzymatique de 30 min
est effectuée en chambre humide (boîte de Pétri contenant du papier humidifié) dans une étuve
réglée à 37 °C. Les racines subissent par la suite un choc osmotique on les plaçant dans du l’eau
ultra-pure, 30 min à température ambiante.
2.1.4- Préparation d’étalements des chromosomes
Une fois déposé sur la lame, l’échantillon est traité par 10 µl de fixateur 3:1 puis rapidement
écrasé et étalé. Sous la sorbonne, les tissus étalés sont recouverts d’une goutte de Vectashield®
puis de la lamelle. Enfin un liseré de colle à caoutchouc a été appliqué sur le pourtour de la
lamelle.
Les observations ont été effectuées au microscope (Leica MR60) associé à une caméra
refroidie CoolSnap® au grossissement x100. La prise de vue et le traitement d’image sont
réalisés grâce au logiciel MetaVue®.
2.2- Résultats obtenus
Le protocole adopté a permis l’observation des chromosomes en métaphase, non condensés
d’une longueur variant entre 2 et 7 µm (Figure 37). Les photographies sont très claires pour
réaliser un comptage chromosomique chez le pistachier vrai (P. vera L.) de 2n = 30. Un nombre
stable de chromosomes a été observé durant tous les essais effectués. Ce résultat confirme celui
rapporté par Fasihi Harandi et Ghaffari (2001). Leurs travaux antérieurs ont permis le
dénombrement chromosomique de quelques espèces du pistachier : P. vera (2n = 30), P. khinjuk
(2n = 24) et P. atlantica (2n = 28). Les mêmes auteurs ont observé deux chromocentres en
interphase, prophase et métaphase qui sembleraient être les candidats pour les chromosomes
sexuels dans ce taxon. Nako et al., (2002) rapportent que la plante dioïque, Silene latifolia
possède des chromosomes sexuels hétéromorphes : les chromosomes X et Y. Le chromosome Y
est le plus grand des deux. Ce dimorphisme n’a pas été constaté chez le pistachier fruitier.
Figure 37. Photos représentatives du nombre chromosomique (2n = 30) chez Pistacia vera L. (Barre = 10µm)
3- ETUDE MOLECULAIRE
3.1- Matériel végétal
L’étude a porté sur un matériel végétal juvénile de Pistacia vera L. composé de 10
échantillons de feuilles de jeunes semis élevés en serre et 10 échantillons de feuilles de
vitroplants.
3.2- Extraction de l’ADN génomique
Après avoir été lyophilisées, les feuilles ont été broyées à l’aide d’un broyeur à billes
Retsch(R) MM301 (fréquence : 30,0 1 s-1, durée : 1 min). L’extraction de l’ADN génomique a été
réalisée suivant le protocole décrit par Doyle et Doyle (1990). Les principales étapes de ce
protocole sont décrites succinctement ci-dessous :
1- Lyse cellulaire : le broyat de chaque échantillon est placé dans un tube Eppendorf mené
de son code. A cette poudre (10 à 15 mg) est ajoutée 500µl de milieu d’extraction (ME)
(Annexe 4), agiter doucement, on peut mélanger avec une spatule la solution mais il faut
faire très attention à ne pas contaminer l’ADN : la spatule doit être laver et stériliser à
l’alcool à chaque fois qu’on passe d’un échantillon à un autre. Les tubes renfermant les
échantillons sont placés dans un flotteur et sont incubés dans un bain marie à 65°C
pendant environ 45 - 60 min (au milieu de cette étape, agiter les tubes (vortex) pour
homogénéiser les solutions).
2- Elimination des protéines : Sous sorbonne, 500µl du mélange chloroforme/alcool
isomylique (24 : 1 ; v/v) est ajouté à chaque tube d’échantillon. Les tubes sont ensuite
agités (vortex).
3- Purification de l’ADN : Les tubes d’échantillons ont été centrifugés à 6000 g 15 min à
température ambiante. Le surnageant est récupéré dans des nouveaux tubes stériles avec
le code de chaque échantillon. Afin de précipiter l’ADN au fond du tube, 320 µl
d’isopropanol (2-propanol) ont été ajoutés. Après une légère agitation (vortex, niveau 3),
les tubes ont été centrifugés à 6000 g pendant 15 min. Le surnageant est alors éliminé ; le
culot est lavé avec 500 µl d’alcool à 70° puis centrifugé une seconde fois 5 min à 6000 g.
Après élimination du liquide, les tubes contenant l’ADN (culot) sont séchés à l’évaporateur à
vide (SpeedVac®). Le culot est dissout dans 100 µl TE (pH 8) et laissé à 4 °C (frigo) pendant
une nuit avant dosage et vérification de la qualité de l’ADN sur gel.
3.3- Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction, PCR)
L’ADN précédemment extrait a été dilué au 1/5ème puis mélangé à un mix réactionnel dans
des barrettes de puits (200 µl). La composition du mix est donnée dans le tableau ci-dessous.
Tableau 28. Composition du mix réactionnel utilisé pour l’amplification d’ADN de P. vera L.
Composants
Volume pour 1 échantillon (µl)
Volume pour 22 échantillons (µl)
2,5
1
1
0,3
14,2
1
55
22
22
6,6
312,4
22
Tampon (Tp 10X)
MgCl2 50 mM
dNTPs 5 mM chacun
Taq polymérase (enzyme)
H2O stérile
Amorce(s)
Les amorces préconisées par Yakubov et al. (2005) pour l’identification du sexe chez le
pistachier ont été utilisées dans cette étude. Il s’agit de SCO-08For, SCO-08Rev, PVF1 et PVF2
(Tableau 29).
Tableau 29. Amorces SCAR utilisées pour identifier le sexe chez le pistachier (Pistacia vera L.)
Amorces
Séquence de l’amorce
SCO-08 For
SCO-08 Rev
5’-CCTCCAGTGTGAATCAAGTAAAC-3’
5’-CCTCCAGTGTTATGTAATACCAAAA-3’
PVF1
PVF2
5’-GTCGTAGATGAAAACACC-3’
5’-TAATAGAAGCCATAGA-3’
Amplification d’ADN
chez les deux sexes
(♂ et ♀)
uniquement
chez les ♀
Toutes les réactions en chaîne de la polymérase (PCR) ont été effectuées dans un milieu
réactionnel de 25 µl contenant 20 µl du mix réactionnel et 5µl d’ADN dilué au 1/5ème dans H2O
distillée stérile. Les milieux réactionnels contenus dans des tubes PCR ont été placés dans un
thermocycleur (C1000TM Thermal Cycler) avec un programme spécifique pour la technique
SCAR. Le protocole d’amplification par SCAR comprend une phase de dénaturation à 94 °C
durant 3 min, suivie par 30 cycles, comprenant chacun une étape de dénaturation à 94 °C
pendant 1 min, une étape d’hybridation à 52 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 2 min et une étape
ultime d’élongation à 72 °C pendant 5 min.
3.4- Électrophorèse sur gel d’agarose
Les produits de PCR ont été séparés par électrophorèse sur des gels d’agarose à 1,5 %.
L’électrophorèse est réalisée à 110 V dans une cuve immergée, régulée à 20 °C, pour une durée
d’environ 40 min.
Les gels d’agarose sont ensuite plongés dans un bain de bromure d’éthidium (BET),
visualisés sous lumière UV puis photographiés à l’aide d’une caméra reliée à un microordinateur
utilisant le logiciel Biocapt®. La taille des bandes obtenues a été estimée grâce au marqueur de
poids moléculaire 1 kb DNA Ladder (Invitrogen) (Annexe 5).
3.5- Résultats et discussion
3.5.1- Vérification et évaluation de la qualité d’ADN extrait
Afin d’évaluer la qualité de l’extraction d’ADN effectuée, la technique d’électrophorèse a
été pratiquée. Une migration de l’ADN sur gel d’agarose à 1,2 % a été effectuée. La figure 38
montre que l’ADN révélé sur le gel est de bonne qualité, les bandes sont relativement intenses et
homogènes entre elles et de poids (nombre de paires de base) très élevé.
1500
600
Figure 38. Révélation de l’ADN de Pistacia vera L. extrait par la technique Doyle et
Doyle (1990). Le gel présente la migration des échantillons correspondant à 20
individus : 10 provenant de jeunes semis (S1-S10) et 10 de vitroplants (V1-V10).
M(pb) : marqueur de masse moléculaire de l’ADN (100 pb).
3.5.2- Analyse des profils SCAR
L’analyse comparée des profils SCAR obtenus à partir des amorces SCO-08For et SCO08Rev, a montré la présence d’une bande située à environ 900 pb (Figure 39). Ce résultat
confirme celui rapporté par Yakubov et al. (2005) chez la même espèce. Ils signalent eux aussi
une bande chez l’ensemble des individus et de taille proche de 905 pb.
L’utilisation des amorces PVF1 et PVF2 a permis d’obtenir une bande située à environ 300
pb (Figure 40), ce qui a été constaté également par Yakubov et al. (2005). La bande observée
chez les pieds femelles de Pistacia vera L. se situe à 297 pb. Pour ces auteurs, cette bande est
absente chez les sujets mâles. Dans notre cas, les individus S5, S6, S8, S10 et V1, V3, V4, V7 V8,
V9 et V10 seraient de plants de sexe mâle.
~900 pb
~900 pb
Figure 39. Profil SCAR sur gel d’agarose 1,5% obtenu après amplification
d’ADN de jeunes semis (S1-S10) et de vitroplants (V1-V10) de pistachier
fruitier avec les amorces SCO-08For et SCO-08Rev. M(pb) : marqueur de
masse moléculaire de l’ADN (100 pb).
~300 pb
~300 pb
Figure 40. Profil SCAR sur gel d’agarose 1,5% obtenu par amplification
d’ADN de jeunes semis (S1-S10) et de vitroplants (V1-V10) du pistachier
fruitier avec les amorces PVF1 et PVF2. M(pb) : marqueur de masse
moléculaire de l’ADN (100 pb).
L’identification du sexe chez les plantes dioïques est basée sur les marqueurs moléculaires.
Ganeshaiah et al. (2004) ont identifié chez la noix de muscade un marqueur spécifique des
femelles (416 pb de long) suggérant ainsi que la femelle peut être hétérogamétique.
George et al. (2007) identifient eux aussi des marqueurs spécifiques chez les mâles et les
femelles de Borassus flabellifer L. Ces auteurs ont pu distinguer les mâles à l’aide d’une bande
située à 600 pb par l’utilisation de l’amorce OPBE-12 et une autre à 1100 pb avec OPA-06, alors
qu’une seule bande a été distinguée chez les pieds femelles située à 500 pb observée grâce à
l’amorce OPBA-13.
Le résultat que nous avons obtenu indiquerait une proportion d’environ 50/50
mâles/femelles chez le pistachier fruitier, pour les individus testés. L’analyse de la figure 40,
montre l’amplification de l’ADN chez 9 individus sur 20 étudiés. Les individus identifiés (semis
et vitroplants) sont conservés en serre et pourront servir de contrôle au moment de leur floraison.
4- UTILISATION DES TRICHOMES POUR IDENTIFIER LE SEXE CHEZ LE PISTACHIER VRAI
4.1- Matériel végétal et méthode expérimentale
Cette approche est basée sur une éventuelle différence morphologique chez les plants mâles
et femelles, observables sur des organes végétatifs au niveau microscopique.
Le matériel végétal utilisé dans ces essais est composé de feuilles récoltées sur des arbres
adultes mâles et femelles. Ces feuilles sont lavées à l’eau de robinet puis séchées sur papier
absorbant.
Après élimination des nervures, les feuilles de chaque sexe sont découpées en petits carrés
d’environ 5 mm de côté, séparément dans une boite de Pétri. A l’aide d’une pipette pasteur, on
ajoute une solution plasmolysante contenant 13 % de mannitol. Après 1 h, cette solution est
remplacée par une solution enzymatique à raison de 1 ml pour 50 mg de matériel végétal.
Les enzymes utilisés (Macerozyme R-10 (3%) + Cellulase Onozuka RS (4%) + Pectolyase
Y-23 (0,2%)) sont dilués dans le milieu nutritif MS/4. Les boîtes de Pétri renfermant les
échantillons sont fermées à l’aide de Parafilm® et placées à l’obscurité à 25 °C en agitation
continue. L’observation des trichomes est effectuée à l’aide d’un microscope inversé.
4.2- Résultats
Les résultats obtenus après environ 18 h de digestion à l’obscurité montrent des différences
de longueur entres les trichomes des deux sexes. Les feuilles provenant de pieds femelles
possèdent des trichomes longs (environ 100µm) comparativement à ceux des pieds mâles (Figure
41).
Figure 41. Trichomes de Pistacia vera L. après 18 h de digestion dans la solution enzymatique. Les trichomes de
feuilles provenant de pieds femelles (A) sont longs par rapport à ceux des pieds mâles (B). (Barre = 100 µm).
4.3- Conclusion
L’utilisation des trichomes comme caractère de distinction entre les pieds mâles et femelles
pourrait constituer sans doute une simple et intéressante approche d’identification du sexe chez
le pistachier vrai. Cependant, des études plus approfondies sont nécessaires afin de confirmer ou
infirmer ces premiers résultats.
La technique moléculaire est actuellement la seule voie permettant l’identification de
marqueurs associés au sexe chez le pistachier fruitier et contribue à l’élimination précoce des
individus mâles pour la production de plants en ne laissant que les sujets femelles performants.
Chapitre VIII – Cryoconservation
d’embryons isolés de Pistacia vera L.
1- INTRODUCTION
La conservation des espèces végétales est une tâche difficile à mener. La méthode la plus
couramment utilisée pour conserver les ressources phytogénétiques est le stockage des semences.
Fort heureusement, de nombreuses espèces cultivées produisent en effet des semences dites
orthodoxes, qui peuvent être conservées pendant des périodes plus ou moins longues (Roberts,
1973). Cependant, d’autres plantes dites récalcitrantes, présentent des problèmes pour la
conservation de leurs semences. Il s’agit exclusivement d’espèces ligneuses parmi lesquelles on
trouve beaucoup d’arbres forestiers et fruitiers (Suszka et al., 1994). D’après Jacquy (1972b), les
semences du pistachier (P. vera L.) sont incapables de garder leur pouvoir germinatif et perdent
leur viabilité avec le temps.
La cryoconservation des axes embryonnaires est la méthode de choix pour assurer la
préservation à long terme, en toute sécurité et à coût réduit, des espèces à graines récalcitrantes.
Le matériel végétal peut être conservé à très long terme sans détérioration de son état
physiologique. Il est préalablement conditionné en tubes étanches résistants au froid extrême. De
nombreux articles ont été publiés ces dernières années sur la cryoconservation d’embryons
isolés d’espèces ligneuses : Castania sativa, Carya sp, Juglans cinerea, J. nigra et J. regia
(Pence, 1990), Quercus suber et Q. ilex (Gonzalez-Benito et al, 2002) et Pinus radiata
(Hargreaves et al, 2004). Ceci pourrait mener à la conclusion que la congélation d’embryons est
une procédure applicable en routine chez ces essences. Cependant, chez le pistachier une seule
étude de cryoconservation de graines entières a été publiée (Ozden-Tokatli et al., 2007). A notre
connaissance, aucune étude n’a été entreprise pour préserver les axes embryonnaires de Pistacia
vera L. dans l’azote liquide.
Notre travail a porté dans un premier temps sur l’étude de l’effet de la conservation des
graines sur la viabilité des embryons cultivés in vitro. Dans un second temps, des essais de
cryoconservation des axes embryonnaires de P. vera L. ont été effectués avec pour objectif
principal la détermination de la teneur en eau idéal pour la préservation de ce matériel végétal
dans l’azote liquide (-196°C).
2- MATERIEL ET METHODES
2.1- Matériel végétal
Ces expérimentations ont été effectuées à partir d’embryons isolés de graines matures de P.
vera L. Ces dernières ont été désinfectées par trempage de 10 min dans la solution
d’hypochlorite de sodium (voir chap. II). Pour faciliter le prélèvement des axes embryonnaires,
les graines sont maintenues dans l’eau distillée stérile pendant 1 nuit.
Afin d’étudier l’effet de la conservation des graines sur la viabilité des embryons isolés de P.
vera L., trois lots de semences conservés au laboratoire à une température et une hygrométrie
ambiantes ont été étudiés :
•
•
•
Graines issues de la récolte de l’année en cours (0 à 6 mois).
Graines conservées 12 à 18 mois.
Graines conservées plus de 24 mois.
Les axes embryonnaires utilisés dans les essais de cryoconservation ont été isolés de graines
matures de l’année en cours.
2.2- Techniques de cryoconservation
Afin d’éviter leur dessèchement, les embryons zygotiques sont placés en attente dans une
boite de Pétri contenant de l’eau distillée stérile (Figure 42A). Ils sont ensuite séchés pendant
environ 1 minute sur un papier filtre stérile pour absorber l’excès d’eau (Figure 42B).
La vieille de l’expérimentation, les boites en verre contenant 40 g de silica gel sont
préalablement déshydratées (à 65°C) puis stérilisées 24 heures (à 100°C) dans l’étuve. Les boites
de silica gel stériles sont refroidies au moins 1 ou 2 heures avant de recevoir les axes
embryonnaires. Placés à raison de 12 par boite (Figure 42C), les embryons isolés ont subi
différentes durées de déshydratation : 0 ; 30 ; 60 ; 90 et 120 min. La température de la salle a
été de 22°C. Afin d’éviter l’oxydation des embryons, la déshydratation est effectuée à
l’obscurité. Pour chaque traitement un lot d’embryons est cultivé directement sur le milieu
nutritif, l’autre transféré dans des tubes cryobiologiques contenant chacun 6 à 7 axes
embryonnaires (Figure 42D) et immergé rapidement dans l’azote liquide. Après environ deux
heures de stockage à -196°C, les échantillons sont réchauffés puis cultivés sur les milieux
nutritifs. Le réchauffement d’une minute est réalisé dans un bain marie réglé à 40°C.
Pour déterminer leur teneur en eau avant congélation dans l’azote liquide, 20 axes
embryonnaires ont été utilisés par traitement. Les pesées ont été effectuées à l’aide d’une balance
de précision « Sartorius® CP 225 D » avant et après déshydratation pour calculer les teneurs en
eau ; le poids sec d’embryons isolés est obtenu après séchage à l’étuve (24 h/65°C). Ces données
nous ont permis de déterminer la quantité d’eau contenue dans les cellules des axes
embryonnaires au moment de l’immersion dans l’azote liquide.
2.3- Milieux nutritifs et conditions de culture
Les embryons isolés sont inoculés dans des tubes à essais en verre (22 x 150 mm) contenant
15 ml de milieu nutritif. Le milieu de base de Murashige et Skoog (MS0) précédemment retenu
(chap. III, 5) a été utilisé. Il contient 0,2% de charbon actif et 4 g l-1 d’agar-agar. Pendant les 3
premiers jours, les cultures sont placées à l’obscurité puis sont ensuite transférées à 22°C avec
une photopériode de 16 heures de lumière/8 heures d’obscurité et une intensité lumineuse de
40µmol m-2 s-1.
3- RESULTATS ET DISCUSSION
3.1. Effet de la conservation des graines sur la viabilité des embryons isolés
Pour déterminer si la conservation des graines a une influence sur la viabilité des embryons
isolés de P. vera L., les graines issues de trois récoltes différentes ont été étudiées. Il s’agit
d’embryons isolés de graines matures fraîchement récoltées (de l’année en cours) et d’autres
prélevés de graines des récoltes 2006 et 2007 conservées à la température ambiante.
Les résultats de cette expérimentation effectuée en Avril 2009, montrent qu’une
conservation plus prolongée de graines a un effet plus marqué sur la viabilité des axes
embryonnaires de P. vera L. La germination in vitro est passée de 100% avec les embryons
isolés de graines fraîchement récoltées à 87,3 et 30,9% avec ceux provenant de graines
conservées respectivement entre 12-18 mois et plus de 24 mois (Figure 43). Cela, indique
clairement qu’au-delà d’une année de conservation, les embryons isolés de P. vera perdent
progressivement leur pouvoir germinatif et leur viabilité après 24 mois. Ces résultats sont en
accords avec ceux de Jacquy (1972b). Cet auteur observe en condition in vivo, une réduction du
pouvoir germinatif des graines de P. vera L. conservées. Bani-Aameur et Alouani (1999)
signalent eux aussi que le pourcentage de germination des noyaux entiers d’arganier (Argania
spinosa L.) conservés à la température ambiante ne dépasse pas 27%.
100
a
Germination in vitro (%)
60/60
b
48/55
75
50
c
25
21/68
0
0-6
12 à 18
> 24
Durée de conservation (mois)
Figure 43. Effet de la conservation des graines sur la germination in vitro
d’embryons isolés de P. vera L. Les valeurs sur les histogrammes correspondent au
rapport entre le nombre des axes embryonnaires germés et le nombre total cultivé.
Les valeurs suivies de lettres distinctes sont significativement différentes à 5%.
Une bonne partie des plantes produit des graines de courte viabilité (Suszka et al., 1994). A
l’heure actuelle, le maintien de ces ressources phytogénétiques est assuré sous forme de
collections en champs. Cependant, ce mode de conservation nécessite l’utilisation de surfaces
importantes et un entretien coûteux. La seule technique susceptible d’assurer la préservation à
long terme, en toute sécurité et à coût réduit est la cryoconservation (Engelmann et Dussert,
2000).
3.2. Cryoconservation d’embryons isolés
3.2.1. Effet sur la survie et la germination in vitro
La reprise de croissance des embryons isolés de P. vera L. a été constatée dès le 3ème jours
de la culture (Figure 42E). Trois types de tissus vivants sont distingués : plantules complètes,
plantules anormales (le plus souvent sans racine) et embryons calogènes (Figure 42F-K).
Les résultats obtenus montrent que la déshydratation n’a pas affecté la survie et la
germination des axes embryonnaires. Les taux moyens ont été de 100% pour la viabilité et
97,5% pour la germination. Cependant, la tolérance des embryons isolés de P. vera L. à une
congélation dans l’azote liquide dépend de leur teneur en eau. L’optimal de germination a été
observé avec les embryons ayant une teneur en eau comprise entre 0,2 et 0,1 (g d’eau g-1 matière
sèche) (Tableau 30). Les teneurs élevés en eau (1,05 et 0,42 g g-1) dans les cellules des axes
embryonnaires des lots expérimentaux T0 et T1 ont entraîné une cristallisation de cette eau ce qui
a inhibé la reprise de croissance après la congélation dans l’azote liquide. Ces résultats
concordent avec ceux de Berjak et Dumet (1996). Ils signalent que l’optimal de cryoconservation
(100%) a été obtenu avec les axes embryonnaires d’Azadirachta indica déshydratés sur silica gel
à une teneur d’eau de 0,23 ± 0,03 (g d’eau g-1 matière sèche). Gonzalez-Benito et al., 2002
obtiennent eux aussi un taux élevé de survie (80%) après cryoconservation lorsque la quantité
d’eau des axes embryonnaires de chênes a été diminuée à 0,34 g g-1.
Ozden-Tokatli et al., 2007 signalent qu’une déshydratation de 8 heures sur silica gel a
permis d’obtenir 90% de germination de graines cryoconservées de P. vera. En revanche, chez
P. terebinthus et P. lentiscus, une courte durée de déshydratation (1 heure et 15 minutes,
respectivement) est la plus efficace pour la germination avec respectivement 16 et 47%.
Tableau 30. Viabilité et germination in vitro d’embryons isolés de P. vera L. après déshydratation et
cryoconservation (n=20 axes embryonnaires par traitement). Les valeurs ayant les mêmes lettres pour une même
colonne ne présentent pas de différence significative à 5%.
Viabilité
Germination in vitro*
T.E.I.
T.E.C.
Traitements Déshydratation
(g H2O g-1
(g H2O g-1
(min)
matière sèche) matière sèche)
Sec
Sec+ AL
Sec
Sec+ AL
T0
T1
T2
T3
T4
0
30
60
90
120
1,05
1,06
1,01
1,05
1,06
0,42
0,20
0,14
0,09
95a
100a
100a
100a
100a
90a
100a
95a
100a
100a
85a
95a
100a
100a
95a
0b
10b
90a
85a
100a
T.E.I. : Teneur en eau initiale; T.E.C. : Teneur en eau au moment de la congélation dans l’azote liquide à -196°C, correspondant ainsi à la teneur
en eau d’embryons isolés après déshydratation; AL : Azote liquide ;* Germination in vitro : un embryon est considéré comme germé lors qu’il
développe ses deux parties, aérienne et racinaire.
La déshydratation est une étape clé pour la réussite de la cryoconservation. Elle permet un
ralentissement du métabolisme des explants et une protection contre la formation de cristaux
d'eau intracellulaires généralement létaux lors de l’exposition à des températures très basses (196°C). L’interaction entre la teneur en eau, la congélation à -196°C et la survie des axes
embryonnaires a été démontrée chez d’autres espèces, cas d’Aesculus hippocastanum L. (
Wesley-Smith et al., 2001). Ces auteurs observent une réduction du taux de survie d’embryons
isolés en fonction de leur teneur en eau : aucune survie à une teneur supérieure à 1 g g-1 ; entre 1
et 0,75 g g-1 les axes survivent mais avec un développement anormal. La proportion des
embryons développés normalement après cryoconservation est celle des axes contenant une
teneur en eau inférieure à 0,75 g g-1. Ce que nous avons également observé chez le pistachier
fruitier. En effet, l’optimal de la cryoconservation (100%) avec un développement normal de
plantules a été enregistré avec les axes embryonnaires déshydratés à une teneur en eau d’environ
0,1 g g-1. Cependant, une quantité d’eau supérieure ou égale à 0,2 g g-1 a affecté après
congélation, la croissance de l’appareil végétatif ainsi que l’aspect qualitatif des vitroplants
régénérés (Figure 42G,H,I).
La cryoconservation des axes embryonnaires de quelques espèces ligneuses est difficile.
Beardmore et Wendy, 1998 signalent que 36% d’embryons isolés de Juglans cinerea avec
approximativement 3 mm de tissu cotylédonaire ont germé après exposition à -196°C. Toutefois,
l’utilisation des milieux cryoprotecteurs améliore significativement les taux de survie après
congélation. Boucaud et al., 1991 ont montré que la solution cryoprotectrice contenant 5M 1,2propanediol supplémenté de 20% de saccharose a amélioré les résultats chez le noyer commun
(Juglans regia L.). Le DMSO (Diméthyle sulfoxide) donne également de bons résultats (Panis
et Thinh, 2001 ; De Carlo et Lambardi, 2005). Ces traitements cryoprotecteurs sont donc inutiles
pour les embryons isolés de Pistacia vera L.
Figure 42. Cryoconservation d’embryons isolés de Pistacia vera L.
A) Axes embryonnaires isolés et laissés dans l’eau distillée stérile pour éviter leur dessèchement. B) Séchage des
embryons sur papier filtre stérile avant la déshydratation. C) Déshydratation des axes embryonnaires sur silica gel. D)
Axes déshydratés transférés dans cryotubes résistants aux basses températures : la photo donne la taille de l’embryon
zygotique de P. vera L. par rapport à la graine entière et le cryotube qui peut contenir plus de 50 axes. E) Reprise de
croissance des embryons isolés après environ 3 jours de la culture. F) plantule obtenue sans aucun traitement (T0) après 4
semaines de culture. Noter l’inhibition de la germination de l’embryon congelé directement dans l’azote liquide à -196°C,
sans déshydratation (tube de gauche), G-J) Effet de la durée de déshydratation des axes embryonnaires sur la croissance
ultérieure des vitrosemis (vitroplants obtenus après déshydratation (tubes de gauches), vitroplants issues d’embryons
cryoconservés après une déshydratation (tubes à droite) de : 30 min =T1 (G), 60 min =T2 (H), 90 min =T3 (I) et 120 min
=T4 (J). Quelques anomalies de développement d’embryons cryoconservés souvent sans racines (K). (B : bar = 5 mm ; EK : bar = 10 mm).
3.2.2. Effet sur la croissance des vitrosemis
Les résultats obtenus après 30 jours de culture montrent des différences significatives entre
les différents traitements testés. En effet, une déshydratation de 90 à 120 min est plus favorable
au développement in vitro des axes embryonnaires cryoconservés. Les vitrosemis de ces lots
expérimentaux (T3 et T4) ont des longueurs moyennes de la partie aérienne et racinaire
identiques à celles du témoin (T0 sans congélation) (Figure 44 A,B). Cependant, une
déshydratation de 30 ou 60 min est généralement insuffisante pour obtenir un développement
normal d’embryons isolés de pistachier fruitier. En revanche, chez ces lots expérimentaux (T1 et
T2), les différents paramètres de croissance étudiés notamment la longueur des tiges, le nombre
de feuilles et de nœuds par vitrosemis ont été affectés après congélation dans l’azote liquide
(Figure 44 A-D).
Longueur de la partie aérienne (cm)
8
a
a
(A)
D/AL
a
a
a
7
a
a
b
6
5
4
c
d
3
2
1
d
D
0
12
a
a
a
a a
a
a
ab
b
10
8
6
4
2
c
0
T0
T1
T2
T3
T4
T0
T1
Traitements
T2
T3
T4
Traitements
(B)
25
(D)
a
a
a
20
a
a
a
a
a
a
15
10
5
b
0
Nombre moyen de noeuds/vitrosemis
7
Longueur des racines (cm)
(C)
D/AL
14
Nombre moyen de feuilles/vitrosemis
D
6
a
abc
abc
abc
ab
c
a
bc
5
d
4
3
2
1
e
0
T0
T1
T2
Traitements
T3
T4
T0
T1
T2
T3
T4
Traitements
Figure 44. Effet de la déshydratation (D) et de la congélation dans l’azote liquide (AL) des axes embryonnaires
de Pistacia vera L. sur la croissance de la partie aérienne (A) et des racines (B) ainsi que le nombre moyen de
feuilles (C) et de nœuds par vitrosemis (D) après 30 jours de culture sur le milieu MS0 supplémenté de 0,2% de
charbon actif. Les histogrammes ayant des lettres distinctes sont significativement différentes au seuil de 5%.
En ce qui concerne la production des biomasses des organes aériens et racinaires, un effet,
significatif a été enregistré chez les lots étudiés. Les meilleurs rendements en matières fraîches et
sèches des parties aériennes et racinaires des vitrosemis issus des axes embryonnaires
cryoconservés ont été enregistrés chez les lots expérimentaux T4 et T3 (Figure 45 A-D).
(A)
D/AL
D
200
250
abc
abc ab
bc abc
200
bc
c
150
d
100
50
d
160
a
ab
140
ab
ab
120
ab
b ab
b
80
60
40
c
0
T1
T2
T3
T4
T0
T1
Traitements
T2
T3
T4
Traitements
(B)
40
(D)
25
a
ab
b
b
ab
b
25
20
15
10
5
Matière sèche des racines (mg)
ab
ab
a
a
ab
35
30
ab
100
20
0
T0
Matière sèche des organes aériens (mg)
(C)
D/AL
180
a
ab
Matière fraiche des racines (mg)
Matière fraiche des organes aériens (mg)
D
300
a
a
20
a
a
a
a
a
15
10
5
c
b
0
0
T0
T1
T2
Traitements
T3
T4
T0
T1
T2
T3
T4
Traitements
Figure 45. Effet de la déshydratation (D) et de la congélation dans l’azote liquide (AL) des axes embryonnaires de
Pistacia vera L. sur la production des biomasses aériennes (A -B) et racinaires (C-D) des vitrosemis après 30 jours
de culture sur le milieu MS0 supplémenté de 0,2% de charbon actif. Les histogrammes ayant des lettres distinctes
sont significativement différentes au seuil de 5%.
4- CONCLUSION
Pour le pistachier, les techniques traditionnelles de propagation sont généralement difficiles.
La perspective de propagation végétative la plus performante est la micropropagation par
bourgeonnement axillaire. Nous avons montré dans les chapitres précédents des taux de
multiplication très élevés qui peuvent dépassés les 500 000 plants/an. De plus, la culture in vitro
leur confère un état sanitaire impeccable et une vigueur supérieure à celle de boutures
horticoles : taux d’enracinement ex vitro et de reprise de croissance élevés ce qui permet de
démarrer au plus vite la production de plants de qualité.
La cryoconservation est à l’heure actuelle la première technique permettant d’assurer la
conservation à long terme des espèces à graines récalcitrantes. Elle assure le maintien des
caractéristiques des cultures et permet leur stockage sur un mètre carré avec des coûts d’entretien
faibles comparativement aux techniques classiques (collections en champs). A -196°C la division
cellulaire est arrêtée et tous les processus métaboliques sont bloqués sans être altérés.
L’efficacité et la simplicité de la technique de cryoconservation mise au point pour les
embryons de P. vera L. (Figure ci-dessous) la rendent utile pour le stockage et la préservation du
pistachier. La régénération avec succès de plantules à partir d'embryons congelés permettra sans
doute l’établissement d’un cryoconservatoire de clones de P. vera L. sélectionné et amélioré en
Algérie.
En conclusion, l’application en routine de la cryoconservation est possible pour les
embryons zygotiques du pistachier avec ce procédé simple. Une déshydratation de 120 minutes
des axes embryonnaires sur silica gel suivie d’une congélation à -196°C dans l’azote liquide
assure 100% de reprise avec un bon aspect qualitatif des vitroplants cryoconservés.
Utiliser des graines de l’année en cours récoltées sur des arbres
sélectionnés (éviter les graines blessées et de petite taille)
Désinfection des graines dans une solution
d’hypochlorite de sodium (2,6% chlore actif) 10 min.
Prélèvement des axes embryonnaires (en faisant
attention à ne pas endommager les embryons)
Déshydratation des embryons isolés 120 min
sur silica gel (en conditions stériles)
Les axes embryonnaires sont transférés dans des tubes cryobiologiques
puis congelés rapidement dans l’azote liquide (-196°C)
Après avoir réchauffés environ 1 min dans un bain marie réglé à 40°C,
les axes embryonnaires cryoconservés reprisent leur développement in
vitro sur le milieu MS0 supplémenté de 0,2% de charbon actif
Figure 46. Schéma du procédé de cryoconservation des axes
embryonnaires de pistachier fruitier (Pistacia vera L.)
Conclusion générale et Perspectives
La multiplication in vitro par micropropagation est une alternative de propagation conforme
et rapide pour la multiplication du pistachier. Au terme de cette étude, on peut conclure que le
pistachier comme la plupart des espèces ligneuses est un matériel « plutôt récalcitrant ». En
revanche, l’ensemble des essais effectués a montré que cette espèce fruitière peut être cultivée in
vitro jusqu’à l’obtention de plants acclimatés.
Dans ce travail, nous nous sommes proposés d’optimiser les différentes phases de la
micropropagation in vitro du pistachier.
1- Culture in vitro d’embryons isolés
La réponse morphogénétique en condition in vitro d’embryons isolés dépend de nombreux
facteurs. En effet, l’étude de certains milieux nutritifs a révélé que celui de Murashige et Skoog
(1962) demeure le plus approprié pour la culture des axes embryonnaires de Pistacia vera L. De
plus, la réduction de la concentration en agar-agar a permis une nette amélioration de la
croissance des vitrosemis.
Utilisé à différentes concentrations, le saccharose oriente significativement le développement des
axes embryonnaires du pistachier vrai. Les concentrations de 20 à 40 g l-1 donnent les meilleurs
résultats. Toutefois, une lumière modérée paraît suffire pour un développement équilibré des
embryons isolés. Nos essais ont montré également que l’adjonction de charbon actif dans le
milieu de culture a amélioré significativement la croissance des vitrosemis.
L’utilisation des axes embryonnaires pour évaluer la tolérance du pistachier aux stress
abiotiques, (salin et hydrique) a montré, dès le départ, des taux de développement in vitro et de
survie élevés indiquant ainsi une haute tolérance. En revanche, le pistachier réduit rapidement
son expansion foliaire et sa croissance aérienne et tend à maintenir le développement de son
système racinaire. Les essais effectués nous ont permis de repérer rapidement les sujets résistants
au déficit hydrique et au stress salin. Cette voie peut être utilisé pour la sélection précoce des
génotypes tolérants.
2- Culture in vitro des segments nodaux
La micropropagation du pistachier à partir d’un matériel végétal adulte est délicate. L’état
sanitaire des explants cultivés in vitro est un problème récurrent qui compromet le
développement de la technique. La morphogenèse et la croissance in vitro des tissus végétaux
mis en culture sont fortement dépendantes de l’état physiologique des explants au moment de
leur mise en culture. Nous avons montré que les explants prélevés en printemps d’arbres adultes,
sont plus réactifs que ceux provenant d’un matériel végétal dormant. Ce dernier présente des
taux de contaminations très élevés empêchant le développement in vitro des bourgeons. Des
repiquages successifs rapides (à raison de 2 repiquages par semaine) ont permis l’élimination des
composés phénoliques et l’amélioration de la réactivité des bourgeons. Toutefois, l’utilisation
des plantules juvéniles préparées et élevées en serre a permis de limiter considérablement les
contaminations microbiologiques et d’obtenir des taux de débourrement des bourgeons élevés
comparativement à ceux enregistrés avec le matériel adulte. Outre l’effet du type d’explant et son
statut physiologique sur la réactivité des bourgeons, la composition du milieu nutritif en
phytohormones joue un rôle capital dans la différenciation des tissus végétaux en conditions in
vitro. Les meilleurs rendements en bourgeons débourrés et en rosettes feuillées ont été obtenus
avec le milieu MS enrichi de 1 mg l-1 BAP. Le thidiazuron et la kinétine sont moins efficaces au
débourrement et la production de vitropousses de Pistacia vera L.
3- Prolifération in vitro des pousses feuillées
Au cours de la phase de prolifération intensive, qui consiste à induire le développement des
bourgeons axillaires préexistants sur des microboutures, l’étude portée sur l’effet de différentes
concentrations de BAP combinée ou non à l’AIB et/ou à la GA3 a révélé que la combinaison
bihormonale composée de 4 mg l-1 BAP et 0,1 mg l-1 AIB semble donner des résultats
intéressants aussi bien pour le taux de multiplication que pour l’aspect qualitatif des pousses
feuillées produites. En revanche, l’étude comparative de certaines cytokinines a montré l’effet
bénéfique de la méta-topoline dans l’amélioration du bourgeonnement axillaire chez Pistacia
vera L. La concentration de 2 mg l-1 assure le meilleur rendement et la bonne qualité
morphologique des microplantules obtenues. Cette cytokinine aromatique, se révèle ici une
bonne alternative à la BAP pour la micropropagation du pistachier.
4- Rhizogenèse et acclimatation des vitroplants
Chez le pistachier, la rhizogenèse in vitro présente encore des difficultés liées
principalement aux faibles taux d’enracinement et à la qualité du système racinaire obtenu. Nos
essais ont montré que Pistacia vera L. s’enracine davantage avec l’ANA qu’avec les autres
auxines testées. En outre, la combinaison auxinique (AIB/ANA) à concentrations égales (1 mg l1
) s’est révélée efficace pour stimuler la rhizogenèse in vitro chez cette espèce fruitière.
Toutefois, les faibles taux d’enracinement enregistrés ainsi que l’aspect qualitatif des racines
produites in vitro souvent de mauvaise qualité, rendent difficile la reprise de croissance lors de
l’acclimatation.
Testé ici pour la première fois chez le pistachier, l’enracinement ex vitro a amélioré
significativement les résultats. En effet, les microplants traités par la poudre auxinique
commerciale « Rhizopon® » à 2% d’AIB, produisent un système racinaire satisfaisant. De plus,
les vitroplants enracinés par cette technique ont montré des taux de reprise élevés lors du passage
en serre.
5- Identification du sexe chez le pistachier fruitier
La complexité du pistachier caractérisée essentiellement par sa dioïcie, sa haute
hétérozygotie et sa croissance généralement moyenne rend impossible la détermination de son
sexe à l’âge juvénile. Il faut attendre environ 8 ans avant de pouvoir différencier les plants mâles
des plants femelles. Cependant, l’utilisation de certaines techniques modernes, notamment
moléculaires, a permis l’identification des marqueurs associés au sexe chez le pistachier fruitier :
les amorces PVF1 et PVF2 s’amplifient uniquement chez les sujets femelles, ce qui nous a
permis d’éliminer précocement les pieds mâles dans un système de production optimisé.
6- Cryoconservation d’embryons isolés de Pistacia vera L.
Nous avons montré dans un premier temps qu’une conservation prolongée de graines a un
effet marqué sur la viabilité d’embryons isolés de Pistacia vera L. En effet, au-delà d’une année
de conservation, les axes embryonnaires perdent progressivement leur pouvoir germinatif et leur
viabilité après 24 mois. La cryoconservation est à l’heure actuelle la seule technique permettant
d’assurer la conservation à long terme des espèces à graines récalcitrantes.
L’efficacité et la simplicité de la technique de cryoconservation mise au point pour les
embryons isolés de Pistacia vera L. la rendent utile pour le stockage et la préservation de cette
ressource phytogénétique. Une déshydratation de 120 minutes sur silica gel suivie d’une
congélation à -196°C dans l’azote liquide assure 100% de reprise avec un bon aspect qualitatif
des vitroplants cryoconservés. La régénération avec succès de plantules à partir d'embryons
congelés permettra sans doute l’établissement d’un cryoconservatoire de clones de P. vera L.
sélectionnés et améliorés en Algérie.
Perspectives
Les résultats présentés dans ce travail, contribuent à l’amélioration du processus de
production de plants de qualités de Pistacia vera L. En dehors des améliorations apportées aux
différentes étapes de la micropropagation in vitro du pistachier fruitier, il est maintenant
nécessaire d’accorder plus d’attention à la sélection génétique de meilleurs clones produits in
vitro.
Ainsi, nous allons focaliser nos études sur :
•
•
•
•
l’identification du sexe chez les vitroplants par l’utilisation des trichomes, en plus des
analyses moléculaires ;
la cryoconservation de bourgeons
l’embryogenèse somatique ;
la transformation génétique.
Il convient aussi d’adapter la technique de micropropagation, avec utilisation de la métatopoline et enracinement ex vitro, à la production de certains porte-greffes intéressants pour la
multiplication du pistachier fruitier, à savoir Pistacia atlantica
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