Déterminants de la rage humaine au Maroc : variabilité génétique

Médecine et maladies infectieuses 32 (2002) 508–513
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Communication brève
Déterminants de la rage humaine au Maroc : variabilité génétique,
qualité du vaccin ou prise en charge insuffisante
Determining factors for human rabies in Morocco: genetic variability,
vaccine quality, or inadequate management
N. Bouchrit a,*, M. Khyatti a, J. Nourlil a, R. Dardari a, S. Ibrahimy a, N. Tordo b,
H. Bourhy b, A. Benslimane a
a
Centre national de référence pour la rage, unité de virologie, institut Pasteur du Maroc, 1, rue Abou Kacem Ez-Zahraoui, BP 20100, Casablanca, Maroc
b
Centre national de référence pour la rage, unité de la rage, Institut Pasteur de Paris, 25, rue du Dr. Roux, 75724 Paris, cedex 15, France
Reçu le 1 janvier 2001; accepté le 3 décembre 2001
Résumé
Objectifs : Étudier les raisons de la recrudescence de rage humaine au Maroc.
Résultats : Les personnes vaccinées testées présentaient un taux d’anticorps supérieur à 0,5 UI/ml. Le contrôle du vaccin et du sérum
antirabique administrés a montré une bonne efficacité. Les résultats du typage moléculaire des souches rabiques ont indiqué que la souche
marocaine appartenait au groupe Afrique 1, génétiquement très proches des souches vaccinales classiques. Les résultats de l’enquête sur la
qualité de la prise en charge ont montré que les cas mortels semblaient plutôt être liés à une action prophylactique insuffisante.
Conclusion : La virulence de la rage au Maroc n’aurait aucun rapport avec la variabilité génétique du virus circulant, ni avec l’échec de
la vaccination ou une mauvaise qualité du vaccin et du sérum, mais plutôt avec une prise en charge thérapeutique insuffisante et inadéquate.
© 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.
Abstract
Objectives: The authors wanted to determine the cause of a recent upsurge of rabies cases in Morocco.
Results: Serum levels of anti-rabies antibodies were superior to 0.5 IU/ml in all vaccinated persons tested after exposure. Assessing the
efficacy of rabies vaccines and sera administered to people exposed to rabies showed that the quality of products was good. Sequence
comparisons between circulating wild rabies virus and vaccine strains allowed us to show that rabies virus strains circulating in Morocco
were related to Group 1 ‘Africa’, genetically identical to strains used as vaccine seed worldwide. Assessing the quality of management
indicated that death from rabies could be due to inadequate prophylaxis.
Conclusion: Our study clearly demonstrated that death from rabies was not related to genetic variability of circulating viruses, failure
of the vaccination, or to poor quality of vaccines and sera, but rather to insufficient and inadequate therapeutic management. © 2002 Éditions
scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved.
Mots clés: Rage; Vaccination
Keywords: Rabies; Vaccination
* Auteur correspondant.
Adresse e-mail : [email protected] (N. Bouchrit).
© 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.
PII: S 0 3 9 9 - 0 7 7 X ( 0 2 ) 0 0 4 0 7 - 9
N. Bouchrit et al. / Médecine et maladies infectieuses 32 (2002) 508–513
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Tableau 1
Évolution annuelle des cas de rage humaine au Maroc (1980–1999)
Yearly evolution of rabies cases in Morocco (1980–1999)
Année
Nombre de cas a
.
80
50
81
52
82
25
83
15
84
20
85
34
86
26
87
28
88
27
89
17
90
16
91
18
92
20
93
24
94
16
95
29
96
18
97
21
98
19
99
29
a
D’après les données du programme National de la lutte anti-rabique (Ministère de la Santé).
From data of the anti-rabies National program (Ministery of Health).
1. Introduction
Plus de 100 ans après la découverte du premier vaccin
efficace contre la rage, cette maladie demeure encore un défi
et représente toujours un grave problème de santé humaine
et vétérinaire, surtout dans les pays en voie de développement [1,2].
Des études immunologiques (séroneutralisation croisée,
analyse par anticorps monoclonaux) et moléculaires (séquençage des gènes), ont permis de diviser le genre Lyssavirus, virus responsable de la rage, en quatre sérotypes puis
en six sérogénotypes [3,4]. Le virus de la rage classique qui
correspond au génotype 1 est retrouvé dans toutes les
régions du globe, alors que les virus de génotypes 2, 3 et 4
sont exclusivement africains. Tous les génotypes de Lyssavirus ont été responsables de cas humains répertoriés par
l’Organisation mondiale de la santé (OMS) [5]. Cette
diversité des Lyssavirus est une préoccupation réelle de
santé publique et pose des problèmes d’ordre diagnostique
et vaccinal. En effet, les souches vaccinales dérivent souvent de l’isolat original de Pasteur, sans tenir compte de la
variabilité intrinsèque des Lyssavirus. La protection que ces
vaccins confèrent est efficace contre les isolats du génotype
1, mais incomplète ou inexistante vis-à-vis des autres
génotypes [6].
Au Maroc et grâce au Programme National de Lutte
contre la Rage (PNLR), l’étude de la situation épidémiologique de la rage humaine au Maroc a montré une diminution
des cas de rage jusqu’en 1990 (34 cas en 1985, 16 cas en
1990) suivie d’une recrudescence (29 en 1995 et en 1999)
(Tableau 1). Cela pourrait s’expliquer soit par une mauvaise
prise en charge thérapeutique, une mauvaise qualité du
vaccin, un échec de la vaccination ou encore une variabilité
génétique de la souche rabique locale par rapport à la
souche vaccinale. La nécessité d’approfondir les investigations s’impose, et l’objectif de la présente étude est d’infirmer ou de confirmer une des quatre hypothèses.
2. Matériel, méthodes et résultats
Onze personnes mordues par des chiens errant ont fait
l’objet de la présente étude. Trois personnes ont succombé
dans un tableau évocateur de rage malgré le traitement. Ces
patients ont fait l’objet d’une enquête sur dossier concernant
la qualité de prise en charge au niveau du centre de
traitement antirabique. Les éléments étudiés ont été : le
siège de la morsure, le délai de la prise en charge et la nature
du traitement antirabique appliqué (lavage de la plaie, le
vaccin antirabique, et le sérum antirabique).
Le diagnostic de la rage a été effectué et confirmé par
immunofluorescence directe (IFD) sur empreintes de cerveau des trois patients décédés, en utilisant des immunoglobulines antinucléocapside rabique couplées à la fluorescéine. L’isolement du virus rabique a été fait sur culture
cellulaire par inoculation d’un broyât de cerveau sur des
cellules BHK 21.
Le contrôle de la réponse vaccinale a été effectué 24 jours
après la morsure, soit 10 jours après la quatrième vaccination de j14, par titrage des anticorps antirabiques, en
utilisant un test immunoenzymatique quantitatif. Le titrage
des anticorps antirabiques n’a pas été effectué chez les trois
patients décédés de la rage. Tous les patients testés ont un
taux d’anticorps supérieur à 0,5 UI/ml, ce qui est d’après les
experts de l’OMS suffisant pour protéger les sujets exposés
au virus de la rage (Tableau 2).
Le contrôle du vaccin et du sérum antirabique a été
effectué sur des échantillons du stock local de l’institut
Pasteur du Maroc (IPM), ces échantillons appartenant au
même lot de vaccins (Pasteur, Lot LOO65–02–98) et des
sérums (Pasteur, Lot 5893–10–98 à 1000 UI) administrés
aux personnes mordues. Le vaccin de référence utilisé
provient de l’Institut Pasteur de Paris, ce vaccin est titré à
6 UI/ml par rapport au vaccin standard de référence (WHO
Copenhagen) [7]. Les résultats du test NIH montrent que le
vaccin antirabique utilisé titre à 19 UI/ml par rapport au
vaccin de référence. Le sérum antirabique a été contrôlé en
Tableau 2
Évaluation de la réponse vaccinale rabique par technique immunoenzymatique
Evaluation of the rabies vaccine response by immuno-enzymatic assay
Référence
Sexe/Âge
Titre (en UI/ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
.
M/56
M/66
F/65
M/26
M/23
M/17
M/20
M/9
7,04
0,55
3,85
3,3
6,82
14,52
7,92
70,4
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utilisant la méthode du titrage par inhibition de la réduction
des foyers fluorescents (RFFIT). Ce test consiste à déterminer le titre des anticorps antirabiques par séroneutralisation
sur culture cellulaire en utilisant un sérum de référence
interne [8]. Les résultats de ce test montrent que le sérum
antirabique utilisé titre à 390,9 UI/ml par rapport au sérum
de référence qui a un titre de 16 UI/ml.
Typage moléculaire des souches rabiques : 12 cerveaux
reçus, entre 1988 et 1994, au laboratoire de la rage humaine
de l’IPM pour le diagnostic biologique ont été utilisés afin
d’obtenir des isolats rabiques. Des morceaux de bulbe et de
cortex conservés à – 80 °C ont été utilisés pour extraction de
l’ARN qui servira au typage moléculaire. Les 12 cerveaux
étudiés ne comprennent pas les cerveaux des trois patients
décédés de la rage.
Les séquences des isolats humains ont été déterminées
sur une fenêtre de 300 nucléotides, selon la méthode décrite
par Sacramento et ses collaborateurs [9]. Plus des deux tiers
de la région du génome qui code pour la glycoprotéine G du
virus rabique ont été amplifiés en utilisant les amorces
M2H-GHV [10]. La séquence des isolats marocains a
permis de les classer parmi le groupe 1 qui inclue des isolats
de rage d’Europe, d’Afrique du Nord et du Moyen Orient
[5]. Ce groupe est hétérogène (isolats distincts : États-Unis
– Chine), mais assez homogène du point de vue séquence
protéique de l’ectodomaine de G avec 97 % de similitude.
Les résultats montrent que la distance moyenne vis-à-vis
des souches vaccinales est de 45 %. Cependant, un petit
nombre de mutations silencieuses (en moyenne 2 mutations
sur 300 nucléotides) entre les séquences a été noté, mais qui
ne conduit à aucun changement au niveau des séquences
protéiques entre les différents isolats.
Les résultats de l’enquête sur la qualité de la prise en
charge indiquent que la vaccination antirabique a été administrée le même jour correctement à tous les patients selon
le schéma de cinq injections : j0, j3, j7, j14, et j28. Il ressort
cependant de l’enquête, que la sérothérapie antirabique
(Immunoglobulines équines, Pasteur Mérieux) a été administrée en totalité par voie intramusculaire, sans administration autour de la morsure et à des doses insuffisantes sans
respecter la posologie de 40 UI/kg de poids corporel. En
effet, parmi les trois patients décédés de la rage, il y a eu
deux filles âgées de 10 ans et 11 ans qui ont présenté des
morsures profondes au niveau du visage, et qui n’ont reçu
que 400 UI d’immunoglobulines équines chacune en intramusculaire. De plus, le lavage de la plaie au savon et à l’eau
n’a pas été fait sur place. La seule différence notée entre les
patients décédés et ceux non décédés était la profondeur et
la proximité de la morsure par rapport au cerveau. En effet,
ces morsures ont été profondes et à proximité du cerveau
chez les trois patients décédés (front, joue, cuir chevelu),
alors qu’elles étaient distales (jambe, main, creux poplité
droit, etc.) chez les patients mordus non décédés.
3. Discussion
Les experts de l’OMS considèrent qu’un titre en anticorps égal ou supérieur à 0,5 UI/ml est suffisant pour
protéger les sujets exposés aux risques de contamination [9].
Dans la présente étude, les 8 personnes mordues non
décédées, et vaccinées ont un taux d’anticorps supérieur à
0,5 UI/ml, ce qui montre une très bonne réponse vaccinale.
Le contrôle du vaccin et du sérum antirabique a montré un
bon pouvoir immunogène du vaccin antirabique et une
bonne qualité du sérum antirabique administrés aux 11
personnes mordues. Le typage moléculaire des souches
circulantes au Maroc n’a pas montré de variabilité entre les
différents isolats marocains en dépit de quelques variations
de séquences corrélées avec la provenance géographique
des isolats, ce qui indique qu’une seule souche rabique
circule au Maroc. La souche marocaine appartient au groupe
Afrique 1 qui est un sous-groupe du groupe 1, et qui est
génétiquement proche des souches vaccinales classiques
[5]. Ainsi, et vu que la souche marocaine est génétiquement
peu différente des souches vaccinales classiques, elle ne
peut par conséquent être impliquée dans d’éventuels échecs
de vaccination.
Il ressort par ailleurs de la présente étude que l’élimination du virus rabique au site d’infection par des moyens
chimiques ou physiques, constitue le mécanisme le plus
efficace surtout dans les cas de morsures profondes. L’OMS
recommande de laver immédiatement et abondamment à
l’eau et au savon, chose qui n’a pas été effectuée chez les
patients ayant fait partie de cette étude. Les immunoglobulines antirabiques équines doivent être administrées à la
dose de 40 UI/kg de poids corporel [13]. La plus grande
quantité doit être administrée autour des blessures avant la
suture de la plaie. Dans notre étude, on a constaté que la
sérothérapie antirabique est administrée à des doses insuffisantes et en intramusculaire seulement, sans administration
autour de la morsure. Cette administration locale de la
sérothérapie antirabique permet dans le cas des morsures
proximales au cerveau une neutralisation rapide et efficace.
Par ailleurs, la seule différence constatée entre les patients
décédés et non décédés est la proximité de la morsure par
rapport au cerveau chez les trois patients décédés.
4. Conclusion
En conclusion, l’existence de cas de rage humaine au
Maroc ne semble pas avoir de rapport clair avec la variabilité génétique du virus circulant, mais semble plutôt être liée
à une action prophylactique insuffisante. Il est donc indispensable pour y remédier d’avoir un programme plus
dynamique ayant pour objectif final l’éradication de la rage
humaine au Maroc, en insistant sur l’information et la
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formation des médecins et infirmiers des centres antirabiques afin d’assurer une meilleure prise en charge.
management, and the kind of anti-rabies treatment given
(wound cleansing, anti-rabies vaccination, and anti-rabies
serum).
ENGLISH VERSION
2.1. Virological diagnostic of rabies
1. Introduction
Rabies is still a challenge and an important health
problem for humans and animals, especially in developing
countries, despite the discovery of the first effective vaccine
more than 100 years ago [1,2].
Immunological (cross seroneutralization, monoclonal
antibody assessment), and molecular (gene sequencing)
studies have led to dividing genus Lyssavirus, the virus
responsible for rabies, into four serotypes, then into six
sero-genotypes [3,4]. The common rabies virus, which
corresponds to genotype 1, is found all over the world,
whereas genotypes 2, 3, and 4 are exclusively African. All
the Lyssavirus genotypes were implicated in human cases
recorded by the WHO [5]. This diversity of Lyssavirus is a
real matter of concern for public health and has often raised
diagnostic and vaccination problems. Indeed, vaccine
strains often come from the initial Pasteur isolate, without
taking into account the intrinsic Lyssavirus variability. The
protection offered by these vaccines is effective against
genotype 1 isolates, but incomplete or non-existent for other
genotypes [6].
The epidemiological situation of human rabies in Morocco shows that the goal set in 1985 by the National
Program for the Prevention of Rabies (NPPR), the eradication of human rabies in the early 1990s, was not reached. A
decrease in the number of rabies cases was noted after
initiation of the NPPR until 1990 (34 cases in 1985, 16 cases
in 1990), then they began increasing again (29 in 1995)
(Table 1). This could be explained by an inadequate
therapeutic management, a bad quality of the vaccine,
failure of vaccination, or the genetic variability of local
rabies strain compared to the vaccine strain. It was necessary to carry out further investigations, and the goal of the
present study was to test the four hypotheses.
2. Materials, methods and results
The study was made on 11 patients bitten by stray dogs
and treated after exposure. Three of these died presenting
with clinical signs of rabies, despite a prophylactic treatment. These patients’ files were reviewed to assess the
quality of management offered by the anti-rabies treatment
center. The studied items were: the bite site, the delay before
The diagnostic of rabies was confirmed by direct immunofluorescence (IF) on brain prints from the three patients
having died of rabies, using fluorescein-conjugated antirabies nucleocapsid immunoglobulins. The rabies virus was
also isolated from cell culture after inoculation of mashed
brain on BHK 21 cells.
2.2. Checking the vaccine response
The vaccine response was assessed 24 days after the bite,
or 10 days after the fourth vaccination made on D14, by
tittering anti-rabies antibodies, using quantitative immunoenzymatic tests. Anti-rabies antibodies titers were not
determined for the three patients having died from rabies.
The antibody level of all the patients tested was superior to
0.5 IU/ml, which is sufficient to protect people exposed to
the rabies virus, according to WHO experts (Table 2).
2.3. Checking the anti-rabies vaccine and the anti-rabies
serum
The anti-rabies vaccine and the anti-rabies serum were
checked using samples from the local IPM stock belonging
to the same lot of vaccines (Pasteur, Lot LOO65–02–98)
and sera (Pasteur, Lot 5893–10–98 at 1000 IU) given to the
bitten patients. The in vivo potency test (NIH test) was used
to control the vaccine [7], taking as reference a vaccine from
the Pasteur Institute of Paris tittered at 6 IU/ml, compared to
the standard reference vaccine (WHO Copenhagen). The
titers obtained showed that the anti-rabies vaccine used
tittered 19 IU/ml compared to 6 IU/ml for the reference
vaccine.
The anti-rabies serum was checked by using the reduction of fluorescent foci inhibition test (RFFIT) [8]. This test
was performed by determining the titer of anti-rabies
antibodies by seroneutralization on cell culture using our
own reference serum. Our results showed that the serum
tittered 390.9 IU/ml compared to 16 IU/ml of the reference
serum.
2.4. Molecular typing of rabies strains
Twelve brains sent to the human rabies laboratory (Pasteur Institute of Morocco (IPM)) between 1988 and 1994,
for virological confirmation of the diagnosis, were used to
obtain rabies isolates. RNA, to be used for molecular typing,
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was extracted from pieces of bulb and cortex kept at – 80°C.
The 12 brains studied did not include those of the three
patients who had died from rabies.
The sequences of human isolates were determined on 300
nucleotides, according to the method described by Sacramento et al. [9]. More than two thirds of the genome
sequence coding for glycoprotein G of the rabies virus were
amplified by using the M2H-GHV primers [10]. The sequence of Moroccan isolates led to classifying them as
belonging to Group 1, which includes rabies strains from
Europe, North Africa, and Middle-East [5]. This group is
heterogeneous (different strains: USA–China), but rather
homogeneous concerning the protein sequence of ectodomain G with 97% of similitude. Results showed that the
average distance compared to vaccine strains could vary up
to 45%. Nevertheless, a small number of silent mutations
(an average of two mutations for 300 nucleotides) was noted
between sequences, but these never led to any change
concerning protein sequences between the various isolates.
2.5. Results of the inquiry on the quality of management
The results of the inquiry on the quality of management
showed that anti-rabies vaccination was adequately given
on the proper day to all patients according to the five
injection protocol: D0, D3, D7, D14, and D28. Nevertheless, it was noted that anti-rabies serotherapy (equine
immunoglobulins, Pasteur Merieux) was administered only
by intramuscular injections, with no administration around
the bite site, and that doses were too low, taking into
account the dosage of 40 IU/kg of body weight. Indeed,
among the three patients having died of rabies, two girls (10
and 11 years of age) presenting with deep facial bites were
given only 400 IU of equine immunoglobulins each, by
intra-muscular injections only. Furthermore, wound cleansing with soap and water was not performed on the spot
because the anti-rabies center did not have adequate facilities. The only differences noted between the patients who
died and those who were alive were the depth of the bite and
its proximity to the brain. Indeed, these bites were deep and
close to the brain for the three patients who died of rabies
(forehead, cheek, and scalp), whereas they were distal (leg,
hand, right popliteal pit, etc.) for the bitten patients still
alive.
0.5 IU/ml after vaccination, which shows a very good
vaccine response. Checking the anti-rabies vaccine and the
anti-rabies serum revealed a good immunogenic efficacy of
the anti-rabies vaccine, and a good quality of the anti-rabies
serum administered to the 11 bitten patients. Molecular
typing of rabies strains prevalent in Morocco did not show
any variability between the various Moroccan isolates,
despite some variation of sequences correlated to the
geographic origin of isolates, proving that only one rabies
strain is prevalent in Morocco. The Moroccan strain belongs
to the Africa, 1 Group, a sub-group of Group 1 which is
genetically close to typical vaccine strains [5]. Taking this
into consideration, the strain could not be implicated in any
vaccination failure.
This study also stressed that elimination of the rabies
virus from the infection site, using chemical or physical
means, is the most efficient method, especially for deep
bites. The WHO recommends immediate and abundant
washing with water and soap. That was not done for the
patients included in this study. Equine anti-rabies immunoglobulins must be administered at a dose of 40 IU/kg of
body weight. The most important quantity must be injected
around the wounds before suturing. In our study, we noted
that anti-rabies serotherapy was administered at insufficient
doses and only by intra-muscular injections with no administration around the bite. The local administration of
anti-rabies serotherapy leads to a rapid and efficient neutralization if the bite is close to the brain. Indeed, the only
difference that we noted between the dead and living
patients included in our study was the proximity of the bite
to the brain.
4. Conclusion
We conclude that the cases of human rabies in Morocco
are not related to the genetic variability of the prevalent
virus, but rather to an inadequate prophylaxis. It is thus
necessary to have a more efficient program for the eradication of human rabies in Morocco, by improving the infor
mation and the training of physicians and nurses in antirabies centers, to ensure a better management.
Références
3. Discussion
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superior to 0.5 IU/ml is sufficient to protect exposed patients
from contamination risks [7]. In this study, the eight bitten
patients still alive, had an antibody titer equal or superior to
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