POTENTIEL DE LA LC-ESI-MS/MS POUR L`ANALYSE DES

POTENTIEL DE LA LC-ESI-MS/MS POUR
L’ANALYSE DES RESIDUS DE MEDICAMENTS
VETERINAIRES
Assemblée annuelle de la SSCAE
Berne, 12 septembre 2003
Patrick Edder, Didier Ortelli, Claude Corvi
Service de protection de la consommation
Quai Ernest Ansermet 22, 1205 Genève
Service de Protection de la Consommation
Introduction
Médicaments vétérinaires dans l’alimentation = Sujet sensible
Nombreux scandales ces dernières années
Nouvelles exigences quant aux performances
des méthodes analytiques (qualitatif et quantitatif)
Nouvelles technologies
Couplage LC-MS suffisamment performant pour les analyses de
routine : outil de choix pour ce domaine d’activité
Service de Protection de la Consommation
Analyses des médicaments vétérinaires
Trois problèmes majeurs :
1. Nombreuses substances et structures très différentes
2. Matrices d’intérêts complexes et variées.
3. Méthodes quantitatives, car les teneurs
en résidus sont réglementées.
MRL très variées selon les substances
et les matrices.
Service de Protection de la Consommation
Analyses classiques LC-UV ou LC-Fluo
Extraction
Elimination des protéines
Limitation des graisses
Purification des extraits
Extraction(s) liquide-liquide
Extraction(s) sur phase solide (SPE)
Dérivatisation
en mode pré ou post-colonne
Chromatographie liquide avec détection
UV ou fluorescence
Service de Protection de la Consommation
Avantages de LC-MS/MS
1. Principe de la détection ESI-MS/MS
Dosage simultané de substances de structures différentes
2. Très haute sélectivité
3. Grande sensibilité
4. Rapidité du développement de méthode
Service de Protection de la Consommation
Dérivatisation, à oublier ?
Molécules sans chromophores suffisamment sensibles ou spécifiques ï
méthodes avec dérivatisation et clean-up complexes
Ex : Pénicilline, Erythromycine
LC-MS/MS = simplification de la procédure analytique
Petites molécules : dérivatisation reste intéressante pour obtenir des
fragments de m/z plus élevés et donc plus spécifiques
Ex : Nitrofuranes
O
O2N
N
O
N
O
tissus
Métabolisation
O
O
N
N
Hydrolyse
H2 N
N
O
O
avec 2-NBA
acide
Furazolidone
O
Dérivatisation
AOZ
N
N
N O2
2-NBA-AOZ
Service de Protection de la Consommation
O
Avantages de LC-ESI-MS/MS
Ø Principe de la détection
Dosage simultané de substances de structures différentes
Ø Très haute sélectivité
Ø Grande sensibilité
Ø Rapidité du développement de méthode
Service de Protection de la Consommation
Sélectivité : LC-MS/MS pour confirmer
Analyse des sulfamidés dans le miel
Interférence due à un herbicide, l’asulam
SA
STZ
SDD
SA
SMX
Standard
SMPD
Asulam
Miel avec de
l’asulam +
sulfanilamide
SA=sulfanilamide; STZ=sulfathiazole, SDD=sulfadimidine;
SMPD=sulfamonomethoxypyridazine, SMX=sulfamethoxazole
Service de Protection de la Consommation
Sélectivité de la détection en mode MRM
Ø LC-ESI-MS/MS : méthode de choix, surtout en mode MRM (multiple
reactions monitoring)
Collision gas
Detection
Q1
Mass filter
Q2
Collision cell
Q3
Mass filter
Si possible MH+ comme ion parent et deux ions filles
Service de Protection de la Consommation
Analyse par spectrométrie de masse
Exigences selon le document EEC/657/2002
Principe des points d’identification
Technique MS
Points par ion
MS basse resolution (LR)
1.0
MS/MS Ion précurseur LR
1.0
MS/MS Ion fille LR
1.5
Substance autorisée : min 3.0 pts
Substance interdite : min 4.0 pts
Technique(s)
Nombre ions
Points
GC/MS (EI ou CI) ou LC/MS
4 ions
4
GC/MS/MS ou LC/MS/MS
1 précurseur + 2 filles
4
GC-MS-MS ou LC/MS/MS
2 précurseur + chacun 1 fille
5
Service de Protection de la Consommation
Une ou deux transitions MS ?
Standard 100 mg/kg
280403-04 Sm (Mn, 1x2)
100
280403-11 Sm (Mn, 1x2)
100
6.25
26308
6.25
Viande agneau
AN-03/06549
QC 100 [ppb]
205 > 178
205 > 178
Analyse du levamisole dans la
viande par LC-ESI-MS/MS
%
%
0
MRM of 25 Channels ES+
205 > 178
482
Area
MRM of 25 Channels ES+
205 > 178
8.42e4
Area
0
6.25
100
205 > 91
205 > 91
%
%
MRM of 25 Channels ES+
205 > 91
1.49e4
Area
MRM of 25 Channels ES+
205 > 91
5.21e4
Area
6.18
6.13
4367
100
6.25
15928
Signal sur 1 seule transition
14.75
7177
15.83
2036
0
6.00
8.00
10.00
0
12.005.00
6.00
14.007.00
8.0016.00 9.00
10.00
18.00 11.00
17.08
897
17.83
812
Time
12.00
13.00
14.00
15.00
16.00
17.00
18.00
19.00
Time
Service de Protection de la Consommation
Très bonne sélectivité, mais …
En mode MRM, seules les substances recherchées
sont observées !
Ne permet pas de mettre en évidence des métabolites inconnus
ou l’utilisation de nouvelles substances !
Dihydrostreptomycine (DHSTP) dans la viande et les organes
Ø Echantillon positif au Charm II test
Ø Positif en DHSTP avec méthode fluorimétrique
(2 SPE + dérivatisation)
Ø Non confirmé en LC-ESI-MS/MS
Présence possible d’un métabolite inconnu !!!
Service de Protection de la Consommation
LC-ESI-MS/MS : la panacée ?
Sélectivité assurée avec la LC-ESI-MS/MS
mais…
aspect quantitatif pas toujours évident !
Présence d’effets de matrice
Ø Diminution du signal par suppression de la ionisation
ex : chloramphénicol dans le miel
Service de Protection de la Consommation
Effets de matrice en LC-ESI-MS/MS
Pour les éviter ou les maîtriser, ne pas négliger :
Ø Les clean-up (LLE,SPE)
Ø La chromatographie précédant la détection MS/MS
Ø L’utilisation de standard interne
Ø L’utilisation d’étalonnage externe
sur matrices dopées
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Avantages de LC-MS/MS
Ø Principe de la détection
Dosage simultané de substances de structures différentes
Ø Très haute sélectivité
Ø Grande sensibilité
Ø Rapidité du développement de méthode
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LC-ESI-MS/MS pour le screening
Pas de test de compétition pour l’ensemble de certaines familles
d’antibiotiques.
Cas typique : les quinolones
Utilisation d’une méthode LC-MS/MS rapide et semi-quantitative pour
dépister simultanément dans les poissons et crustacés :
- l’enrofloxacine
- la danofloxacine
- la sarafloxacine
- l’acide oxolinique
- la fluméquine
Service de Protection de la Consommation
Avantages de LC-MS/MS
Ø Principe de la détection
Dosage simultané de substances de structures différentes
Ø Très haute sélectivité
Ø Grande sensibilité
Ø Rapidité du développement de méthode
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Applications SPCo de la LC-ESI-MS/MS
Substances
Méthodes classiques
Méthode LC-ESI-MS/MS
Sulfamidés
Manque de sélectivité
Confirmation
Tétracyclines
Manque de sélectivité
Confirmation
Analyse quantitative (miel)
Quinolones
Plusieurs méthodes
Pas de test de dépistage
Screening
Confirmation
Macrolides
Plusieurs méthodes
Pas de chromophore pour certains
Analyse quantitative
Streptomycine
Manque de sélectivité (abats)
Confirmation
Chloramphenicol
Manque de sensibilité et de sélectivité
Analyse quantitative
Nitrofuranes
Manque de sensibilité et de sélectivité
Analyse quantitative
Benzimidazoles +
lévamisole
Plusieurs méthodes
Manque de sélectivité et de fidélité
Analyse quantitative
Triphénylméthanes
Problème d’identification
Confirmation
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Conclusions
Ø Technique extrêmement performante
• Très haute sélectivité
• Très sensible
• Permet de simplifier les procédures analytiques
• Gain de temps en analyse de routine et en développement
Ø Utilisable comme technique de screening, analyse
quantitative ou de confirmation
Ø Ne permet pas de négliger systématiquement la
« chimie analytique » traditionnelle
• Clean-up
• Dérivatisation
• Chromatographie
• Standard interne ou étalonnage externe sur matrices dopées
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