Principes du dosage par étalonnage interne

Principes du dosage par étalonnage interne
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Principes du dosage par étalonnage interne
Lors d’un étalonnage, il arrive fréquemment que la réponse du détecteur ne soit pas
parfaitement proportionnelle à la concentration de l’analyte cible, sur la gamme de concentration
choisie. C’est le cas notamment lorsque la détection se fait par spectrométrie de masse. La figure cidessous présente une comparaison de droites d’étalonnage obtenues pour une même molécule en
utilisant deux types de détection.
250
25
200
20
150
15
MS
100
UV (275 nm)
50
10
Intensité UV
Intensité MS
ETALONNAGE EXTERNE : comparaison UV / MS
Métabolite de l'Astemizole
5
0
0
0
20
40
60
80
100
Concentration (µM)
L’étalonnage interne, reposant sur l’ajout, dans les solutions étalon et échantillon, d’une
molécule servant de référence, permet de corriger cet écart à la linéarité.
Lorsque l’étalon interne est ajouté avant que ne soient mises en œuvre les différentes étapes
de traitement de l’échantillon, cette technique permet en outre de s’affranchir des pertes inhérentes
à toute préparation d’un échantillon.
Principe général
Le dosage par étalonnage interne repose sur l’ajout en quantité parfaitement connue et unique, dans
toutes les solutions étalon et tous les échantillons, d’une molécule qui sert de référence durant les
phases de l’analyse. Le dosage, plutôt que d’être fait de façon absolue à partir d’une droite
d’étalonnage de l’analyte cible (étalonnage externe), se fait de façon relative par rapport à cette
molécule de référence, appelée étalon interne.
L’étalon interne doit présenter les propriétés suivantes :
• Ne pas se trouver dans l’échantillon
• Etre distinguable des analytes cibles
• Avoir des propriétés physiques et chimiques proches
Lors de l’analyse, les éventuelles variations d’intensité (instrumentales, erreur de prises
d’échantillon, dilutions, etc…) dans la détection des analytes sont également observées pour les
étalons internes puisque ces molécules se comportent de la même façon. En travaillant avec le
rapport des deux signaux (analyte et étalon interne), il est alors possible de s’affranchir de ces
variations.
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Par ailleurs, si l’échantillon a subi un traitement préalable à l’analyse, les pertes en analyte et
en étalon interne sont également les mêmes. Il est alors possible, grâce à cette technique, de
déterminer la concentration en analyte dans l’échantillon brut, c’est-à-dire avant traitement.
Ce que l’on cherche…
Échantillon initial QiA
Étalons internes de dosage (EID)
QiEID connue
R < 100 %
Traitements
Étalons internes de contrôle
de récupération (EICR)
QEICR connue
Fraction contenant l’analyte QfA, QfEID
Ce que l’on mesure…
QiA = quantité de l’Analyte à doser dans l’échantillon initial (c’est ce que l’on cherche à déterminer)
QiEID = quantité d’étalons internes de dosage introduite dans l’échantillon avant extraction
QfA = quantité de l’Analyte dans la fraction
QfEID = quantité d’EID dans la fraction
QiEICR = quantité d’étalons internes de contrôle de récupération introduite dans l’échantillon avant analyse
En analyse chimique, la réponse d’un détecteur peut être considérée comme linéaire sur une
I x = α x .Qx
plage de valeurs suffisamment petite. On peut alors écrire la relation :
C’est-à-dire que l’intensité du signal est proportionnelle à la quantité de produit introduite. α
est le coefficient de réponse (coefficient d’extinction molaire, coefficient d’ionisation, etc…). Il est
caractéristique de chaque molécule et représente son comportement vis-à-vis de l’appareillage.
On peut appliquer cette relation aux composés présents dans la solution à doser, l’analyte et
son EID :
 I A = α A .QA
I
α
Q
donc A = A . A

I EID α EID QEID
 I EID = α EID .QEID
⇔
IA
Q
= CrA / EID . A
I EID
QEID
avec CrA / EID =
αA
α EID
CrA/EID est alors défini comme le coefficient de réponse de l’analyte par rapport à l’étalon interne
qui va permettre son dosage. Contrairement au coefficient de réponse de l’analyte, Cr ne dépend
plus des variations instrumentales.
Etalon 1
Etalon 2
αA = 10, αEID = 5 Cr = 2
αA = 9, αEID = 4,5 Cr = 2
10 % de variation instrumentale
Etalon 3
αA = 8,1, αEID = 4,05 Cr = 2
10 % de variation instrumentale
ETALONNAGE EXTERNE
ETALONNAGE INTERNE
IA/IEID
I
Cr
Q
QA/QEID
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Détermination de la quantité initiale en analyte (QiA)
On peut écrire la relation suivante :
IA
Qf
= CrA / EID . fA
I EID
QEID
⇔
IA
Qi r
= CrA / EID . i A . 1
I EID
QEID r2
avec r1 et r2 rendement de récupération de l’analyte et de son EID.
Or, dans le principe même du dosage par étalonnage interne, on suppose que les étalons
internes se comportent comme les analytes que l’on souhaite doser, et en particulier lors des
différents traitements que l’on fait subir à l’échantillon initial : c’est-à-dire que l’on suppose qu’ils
subissent les mêmes pertes, i.e. r1 = r2 = r.
On en déduit la relation suivante :
IA
Qi
= CrA / EID . i A ⇔
I EID
QEID
QAi =
1
CrA / EID
.
IA i
.QEID
I EID
IA, IEID : intensités mesurées
CrA/EID : calculé précédemment
QiEID : quantité connue introduite avant traitement de l’échantillon
Calcul des rendements de récupération
On ne peut pas déterminer les rendements d’extraction des analytes directement à partir des
EID. En effet, ces derniers étant déposés sur l’échantillon avant extraction, ils subissent les mêmes
pertes que les analytes. On introduit donc un nouvel étalon interne, appelé Etalon Interne de
Contrôle de Récupération (EICR). C’est par l’intermédiaire de ce dernier, introduit en quantité
connue juste avant l'analyse, qu’il est possible d’accéder aux recouvrements de chaque analyte.
Conformément à ce qui a été fait précédemment, nous pouvons écrire :
I
or
f
Q EID
=
I EID
α
Qf
= EID . EID
AEICR α EICR QEICR
r
i
.Q EID
100
on en déduit que
où r est le rendement de recouvrement
I EID
α
Qi
r
= EID . EID .
I EICR α EICR QEICR 100
⇔
i
QEICR α EID QEID
r
=
.
.
I EICR α EICR I EID 100
Nous avons vu précédemment qu’il existe une relation linéaire entre l’intensité d’un signal et la
quantité d’un analyte correspondant :
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IA
α
Qi
= A . iA
I EID α EID QEID
4
⇔
i
QEID
α
Qi
= A . A
I EID α EID I HAP
On peut donc remplacer, et on obtient :
QEICR α EID α A QAi
r
=
.
.
.
I EICR α EICR α EID I HAP 100
r = 100 ×
QEICR I A
1
× i ×
I EICR QA CrA / EICR
Il est alors possible de calculer le rendement de récupération d’un analyte lors des phases de
traitement de l’échantillon.