BCM2003-H10 Protéomique

Protéomique Séance 1
Introduction aux données de
protéomique et aux outils de
recherche
Professeur: Hervé Philippe
Auxiliaire: Mathieu Courcelles
BCM2003 Hiver 2010 - Protéomique
BCM2003-H10 Protéomique
¾Démonstrateur:
Mathieu Courcelles
¾Questions?
¾Via
le tutorat en ligne (http://www.agorabcm.com/)
¾Disponibilités
BCM2003 Hiver 2010
sur rendez-vous (email)
2
1
Horaire
Séance 1
25 Mars
¾Introduction
aux données de protéomique et aux
outils de recherche
Séance 2
1 Avril
¾ Phosphoprotéomique:
À la recherche des
modifications post-traductionnelles
¾
Séance 3
8 Avril
¾Séance
Distribution du devoir
¾Mise
4
15 Avril
en contexte des identifications
¾Remise du devoir
¾Temps et questions sur le mini-projet
BCM2003 Hiver 2010
3
Application de la protéomique
¾Étudier le protéome à petite (une ou quelques protéines)
ou grande échelle (centaines à milliers en même temps).
¾Comprendre
la signalisation cellulaire, le
développement.
¾Modifications post-traductionnelles (phosphorylation,
acétylation/méthylation, ubiquitination, glycosylation, etc).
¾Isoformes
et mutations.
¾Biomarqueurs pour cancer et maladies (analyse
quantitative)
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4
2
Expérience typique de protéomique
Extraction
des protéines
Digestion
Trypsique
Mélange de
peptides
MS
Analyse des données
HPLC
Chromatographie liquide et
spectrométrie de masse
Identification / Quantification
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5
Comment fonctionne un spectromètre de masse?
¾Vidéos
MALDI-TOF
http://www.youtube.com/watch?v=OKxRx0ctrl0
Agilent Q-TOF
http://www.youtube.com/watch?v=R_d-NI0fK7A
Waters Q-TOF
http://www.youtube.com/watch?v=zVgyz8felqo&feature=PlayList&p=72B2A72090F4AEDC&in
dex=0&playnext=1
http://www.youtube.com/watch?v=ywO_0C0zaBE&feature=PlayList&p=72B2A72090F4AEDC
&index=7
FT-ICR
http://www.youtube.com/watch?v=A7QMkPYpZSA
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6
3
Identification des peptides
Intensité relative
MS Survey Scan
masse / charge (m/z)
Data dependent analysis
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Identification des peptides
Intensité relative
MS Survey Scan
1. Isolation d’un ion
masse / charge (m/z)
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4
Identification des peptides
Intensité relative
MS Survey Scan
1. Isolation d’un ion
2. Fragmentation
masse / charge (m/z)
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Identification des peptides
Intensité relative
MS Survey Scan
1. Isolation d’un ion
2. Fragmentation
masse / charge (m/z)
MS/MS
Scan
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5
Identification des peptides
MS/MS dataset
(milliers)
Interprétation
automatisé des
spectres
Identification des
peptides/protéines
MS/MS
Scan
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Détection des peptides
Détection des
ions peptidiques
dans les données
brutes pour
extraire leur
intensité
Légende:
Basse Itensité
Haute Intensité
MS Survey Scan
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6
Détection des peptides
Région agrandite
On peut voir différents ions peptidiques.
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Détection des peptides
H1,2
C12,13
N14,15
O16,17,18
S32,33,34,36
Profile
isotopique
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7
Détection des peptides
∆m/z = 1/z
Sommet
d’intensité
et charge
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Détection des peptides
Liste de peptides avec leur valeurs
-m/z
-temps de rétention
-intensité
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8
Format de fichiers
¾Données
brutes (format binaire propriétaire)
(Agilent)
¾.raw (dossier) (Micromass MassLynx)
¾.raw (ThermoFinnigan Xcalibur)
¾.wiff
¾Liste
de pics
(Micromass MassLynx)
¾.mgf (Mascot generic format)
¾.dta (Sequest)
¾.mzData (XML) (HUPO Proteomics Standards Initiative (PSI) )
¾.mzXML (Institute for Systems Biology )
¾.mzML
(effort pour combiner .mzData et .mzXML)
¾.pkl
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HUPO Proteomics Standards Initiative
http://www.psidev.info/
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9
Interprétation des spectres MS et MS/MS
• Empreintes de masse
peptidiques
•
– Mascot, Sequest, OMSSA,
X!Tandem, PepSplice, Sonar,
SALSA, Peptide Search, SCOPE,
OLAV, MassMatrix, Zcore
– Mascot, Profound, MS-Fit,
Aldente, VEMS
• Séquençage de novo
(comparable à la méthode
manuelle).
Recherche d’ions MS/MS
•
Comparaison de spectres
– X!Hunter, BiblioSpec, Bonanza,
SpectraST
– Peaks, VEMS, PepNovo,
LutefiskXP, AUDENS,
NovoHMM
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Pré-traitement des spectres MS/MS
– Détermination de la charge du peptide précurseur
– Ajustement de la masse du précurseur au pic mono-isotopique
– Simplification du spectre pour faciliter l’interprétation automatisé
• Enlever le bruit
• Réduire les charges
• Réduire les isotopes (si haute résolution)
– Combinaison de spectres
– Qualité des spectres MS/MS
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10
Données et outils pour le TP
¾
Données sur ESILBAC:
¾
¾
/UDEM/COURS_BAC/BCM2003/dbcm2003/Proteomique/tp1_data
Mascot
¾
http://mascot.iric.ca/mascot
¾
¾
¾
¾
http://www.matrixscience.com
Peaks Online
¾
¾
http auth: usager: CHM3101, mot de passe: johnfenn
usager: p0xxxxxx, mot de passe: temp2003
http://www.bioinfor.com:8080/peaksonline/
X! Hunter
¾
http://h201.thegpm.org/tandem/thegpm_hunter.html
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Empreintes de masse peptidiques
Protéine
MSFLSKLSQIRKSTTASKAQVQDPLPKKNDEEYSLLPKNYIRDEDPAVKR
Digestion à la trypsine
Peptides
MSFLSK LSQIR
K
K
NDEEYSLLPK
STTASK
NYIR
AQVQDPLPK
DEDPAVK
R
Spectrométrie de masse
Spectre
MS
m/z
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11
Empreintes de masse peptidiques
Peptides
Séquences
protéiques
(db)
Spectres
MS
Masses
Observées
Digestion
in silico
Masses
Théoriques
Comparaison
Liste de peptides
et protéines
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*Adaptation référence [1]
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Base de données protéiques
• Choisir une base de données qui contient les protéines
d’intérêt mais qui ne soit pas trop grosse.
• NCBI nr, IPI, Uniprot
•
•
•
•
•
Filtre par espèce
6 cadres de lectures
Isoformes et polymorphismes
Prédictions
Instabilité des bases de donnés (insertion, délétion,
modification des séquences)
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12
Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)
• Les ions peptidiques sont fragmentés pour obtenir la
séquence peptidique.
• Analyse MS/MS avec un triple quadripôle
Source
MS (Full scan)
Détecteur
Source
MS/MS
Filtre de masse
Fragmentation
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*Adaptation référence [1]
25
Fragmentation des peptides
• Exemple de spectre MS/MS et tableau des fragments
– L’espacement entre les pics permet de retrouver la séquence
L
RL
D
GL
L
D
G
L
LR
N
Fragments b
Y
Fragments y
Intensité relative (%)
YN
masse/charge
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13
Peaks - Séquençage de novo
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Mascot – Recherche d’ions MS/MS
Peptides
Séquences
protéiques
(db)
Spectres
MS/MS
Fragments
Observées
Fragments
Théoriques
Digestion
in silico
Comparaison des masses des peptides
et des masses des fragments
Liste de peptides
et protéines
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*Adaptation référence [1]
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14
X!Hunter – Comparaison de spectres
Spectre à interpréter
Déterminer le % d’identité
Base de données de spectres annotés
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Interprétation des spectres MS et MS/MS
• Empreintes de masse
peptidiques
•
Recherche d’ions MS/MS
–
– Mascot, Profound, MS-Fit,
Aldente, VEMS
•
• Séquençage de novo
(comparable à la méthode
manuelle).
Mascot, Sequest, OMSSA, X!Tandem,
PepSplice, Sonar, SALSA, Peptide
Search, SCOPE, OLAV, MassMatrix,
Zcore
Comparaison de spectres
–
X!Hunter, BiblioSpec, Bonanza,
SpectraST
– Peaks, VEMS, PepNovo,
LutefiskXP, AUDENS,
NovoHMM
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Comparaison des méthodes d’interprétation
des spectres MS/MS
•
Différences importantes
d’identifications de peptides
entre les outils.
•
•
•
•
M: Mascot
O: OMSSA
S: Sequest
Z: Zcore
Peptides identifiés
chez la levure
Proteomics. 2010 Jan;10(1):164-7.
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Références
¾Mascot
Perkins. D., Pappin D., Creasy D., Cottrell J. (1999) Probability-based protein
identification by searching sequence databases using mass spectrometry data.
Electrophoresis 20(18), 3551-67
¾Peaks
Ma B, Zhang K, Hendrie C, Liang C, Li M, Doherty-Kirby A, Lajoie G (2003)
PEAKS: powerful software for peptide de novo sequencing by tandem mass
spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 17(20), 2337-42
¾X!Hunter
Craig R., Cortens J. C., Fenyo D., and Beavis R. C. (2006) Using annotated
peptide mass spectrum libraries for protein identification. J. Proteome. Res.
5(8), 1843-1849
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