Coloration en cuve des bacilles acido

INT J TUBERC LUNG DIS 13(9):1119–1123
© 2009 The Union
Coloration en cuve des bacilles acido-résistants dans les frottis
de crachats : il est temps d’en finir avec un tabou
K. L. Kam,* C. W. Yip,* H. S. Tang,* A. Van Deun†‡
* TB Reference Laboratory, Public Health Laboratory Services Branch, Centre for Health Protection, Department of
Health, Hong Kong, China ; † Mycobacteriology Unit, Institute of Tropical Medicine, Antwerp, Belgium ; ‡ International
Union Against TuberculosIs and Lung Disease, Paris, France
RÉSUMÉ
Un laboratoire à haut débit pratiquant en routine l’examen microscopique par fluorescence à la recherche
des bacilles acido-résistants (BAAR) dans les frottis avec une coloration de groupe de lames automatisée.
O B J E C T I F S : Dans les frottis de crachats provenant de colorations de groupes de lames, déterminer le risque de
bacilloscopies faussement positives se présentant sous forme d’échantillons à bacilloscopie positive et à culture négative ou sous forme d’une diminution des positifs au frottis et à la culture.
S C H É M A : On a pratiqué en routine un frottis direct des BAAR et une culture de Löwenstein-Jensen sur un total de
39.350 échantillons en routine. Parmi ceux-ci, 6633 ont été sélectionnés au hasard pour une coloration individuelle
des BAAR, alors que les 32.717 restants ont été traités par une coloration de groupe de lames automatisée. On a
comparé les résultats positifs en culture et en frottis.
R É S U LTAT S : Dans les frottis colorés individuellement, il y a eu 111 échantillons positifs, parmi lesquels 100 (90,1%)
ont été également positifs à la culture (IC95% 83,0–95,0) ; d’autre part, parmi les 543 frottis positifs après coloration des lames groupées, 504 (92,8%, IC95% 90,6–95,0) étaient également positifs à la culture. Les proportions
d’échantillons à bacilloscopie positive, culture négative ont été de 1,8% après coloration individuelle vs. 2,2% pour
les colorations des lames groupées et les proportions d’échantillons à bacilloscopie positive, culture positive de 90,1%
pour les colorations individuelles vs. 92,8% pour les colorations des lames groupées (non significatif).
C O N C L U S I O N S : Le risque de transfert de BAAR d’un frottis positif à un frottis négatif au cours des colorations de
lames en groupe pour BAAR est négligeable, s’il existe. La coloration de lames en groupes ne doit pas être découragée, puisque même dans les pays à faible revenus, cette méthode permettra d’épargner une importante quantité de
ressources, particulièrement sur le plan humain, et d’améliorer les résultats des colorations dans les laboratoires où la
charge de travail est élevée.
M O T S - C L E S : microscopie ; fluorescence ; coloration ; tuberculose ; contamination croisée
CONTEXTE :
LA MICROSCOPIE À FLUORESCENCE (FM) utilisant des lampes à diodes électroluminescentes (LED)
représent un espoir considérable pour une amélioration de la détection des bacilles acido-résistants
(BAAR). Ces appareils solides et agréables à utiliser
permettent l’usage permanent et répandu de la technique FM plus efficiente et souvent aussi plus rentable.1,2 Toutefois, les recommandations sur l’utilisation de la FM sur le terrain et sur son contrôle de
qualité ne sont pas encore bien élaborées et plusieurs
questions et controverses restent en suspens. Comme
c’est surtout les plus grands laboratoires qui sont
concernés, là où la véritable charge de travail et non le
manque de connaissances techniques constituent l’obstacle principal à l’obtention de résultats de grande
qualité, l’optimisation de chacun de ces détails s’impose véritablement.
Un problème important concerne la coloration
en cuve (manuelle ou automatisée en machine). Les
directives de l’Organisation Mondiale de la Santé
(OMS) et de l’Union Internationale Contre la Tuberculose et les Maladies respiratoires recommandent
de traiter les frottis individuellement en les espaçant
suffisamment sur les râteliers de coloration, etc., afin
d’éviter le transfert de BAAR en provenance de frottis
réellement positifs vers des frottis négatifs.3,4 Cette recommandation semble n’être appliquée que dans des
réseaux de microscopie des BAAR des pays à faibles
revenus, puisque la coloration en cuve est largement
répandue dans les laboratoires des pays à revenus
élevés, y compris certains laboratoires renommés de
référence pour les mycobactéries. Les avantages évidents sont une réduction considérable de la charge de
travail et des coûts salariaux, ainsi qu’une meilleure
Auteur pour correspondance : Armand Van Deun, Mycobacteriology Unit, Institute of Tropical Medicine, Nationalestraat
155, 2000 Antwerp, Belgium. Fax : (+32) 3 247 6333. e-mail : [email protected]
[Traduction de l’article : « Bulk acid-fast staining of sputum smears: time to end a taboo » Int J Tuberc Lung Dis 2009; 13 (9):
1119–1123]
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The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease
qualité tout au moins pour la coloration automatisée
en machine que certains groupes réputés ont signalée.5 En outre, à notre connaissance, aucune publication n’a jamais documenté le transfert de BAAR de
frottis à frottis entraînant des résultats faux positifs.
Ce problème peut être particulièrement intéressant
pour la microscopie à fluorescence, non seulement
parce qu’il concerne souvent de grands laboratoires
mais aussi parce que la technique de coloration à
froid avec l’auramine s’adapte plus facilement à la
coloration en cuve ou automatisée.
Dans cette étude, nous avons essayé d’estimer le
taux de transfert de BAAR depuis des frottis positifs
vers des frottis négatifs en comparant la fréquence
des échantillons à frottis positif et à culture négative
dans une étude prospective utilisant la coloration individuelle versus la coloration automatisée en cuve.
Celle-ci pourrait être le résultat d’une contamination
croisée affectant seulement les frottis mais non les
échantillons de crachats utilisés pour la culture ; on
ait qu’elle peut aussi être le résultat de l’existence de
BAAR non viables dans une petite proportion de
frottis positifs ou encore d’une décontamination trop
puissante ou d’un échec de la culture : on parle souvent alors de culture faussement négative. Ce cas peut
se présenter fréquemment lorsque les patients prennent certains médicaments spécifiques, notamment la
rifampicine, avant le recueil de l’échantillon.6 Bien que
ces causes courantes ne puissent pas être facilement
distinguées des frottis faux positifs dus à un transfert
de BAAR au cours de la coloration en cuve, le taux
de résultats à frottis positif et culture négative (de
n’importe quelle cause) devrait être significativement
plus élevé si le risque d’un tel transfert était présent.
Notre étude a été réalisée comme élément de la pratique de routine au Laboratoire Supranational de Référence de la Tuberculose à Hong Kong dont le matériel consacré à la microscopie de fluorescence et à la
culture est de grande qualité, dont la charge de travail est très importante (environ 800 échantillons par
mois) et qui utilise en routine depuis environ 20 ans
la coloration automatisée en cuve.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
Echantillons
Entre novembre 2007 et mai 2008, on a sélectionné
de façon aléatoire pour une coloration individuelle
un total de 6.633 échantillons de crachats parmi les
échantillons de crachats de routine (n = 39.350). Les
autres échantillons (n = 32.717) ont été colorés par
la méthode de coloration automatisée en cuve. En
quelques mots : les frottis directs ont été préparés à
partir des crachats en utilisant une öse en plastique
de 10 μl à usage unique. Tous les frottis ont été séchés
à l’air et ensuite fixés à la chaleur en passant les lames
plusieurs fois au travers d’une flamme, les frottis dirigés vers le haut.
Coloration en cuve
La coloration en cuve a été réalisée grâce à une machine à coloration (Leica ST 5020, Solms, Germany).
Un total de 30 lames est chargé dans des godets à coloration de 500 ml contenant différentes solutions de
coloration et de l’eau distillée dans l’ordre suivant :
auramine-O 0,3% dans du phénol à 3% pendant
10 min ; eau distillée pendant 1 min ; alcool-acide
pendant 4 min ; eau distillée pendant 1 min ; permanganate de K pendant 1 min ; eau distillée pendant
1 min. Toutes les solutions de coloration et l’eau sont
renouvelées chaque jour et on colore une moyenne de
200 frottis dans les mêmes solutions.
Coloration individuelle
Les colorants et les solutions utilisées pour la coloration individuelle proviennent de la même source que
les produits utilisés pour la coloration automatisée en
cuve. Les frottis sont d’abord colorés à l’auramine-O
pendant 15 min, puis rincés à l’eau, ensuite décolorés
à l’alcool-acide pendant 5 min, rincés de nouveau à
l’eau et finalement contrecolorés au permanganate de
K pendant 1 min.
Examen des frottis à la recherche des BAAR
Après coloration, les frottis colorés en cuve ou individuellement sont séchés à l’air à 65° dans un four à air
chaud avant l’examen microscopique. Durant la période de l’étude un technicien bien formé du laboratoire a réalisé les examens microscopiques des frottis
à la recherche des BAAR. Les lames colorées en cuve
ou individuellement ont été distribuées aux techniciens pour un examen en aveugle en utilisant des microscopes à fluorescence avec lampes à vapeur de
mercure (Zeiss, Gottingen, Germany). En bref, tous
les frottis ont d’abord été examinés en utilisant un
objectif 20×. En cas de suspicion de BAAR, on a utilisé un objectif 63× pour confirmation. Un frottis a
été défini comme positif en présence d’au moins 3
BAAR dans 300 champs optiques. Tous les frottis
positifs ont été réexaminés par un autre technicien
médical ayant plus de 10 ans d’expérience de la microscopie des frottis à la recherche de BAAR. Ce sont
les mêmes techniciens qui ont eu la responsabilité de
l’examen microscopique et de la culture réalisés tant
pour la coloration individuelle que pour la coloration
en cuve.
Culture et identification des BAAR
Après examen des frottis, on a réalisé pour tous les
échantillons une culture standard (n-acétyl-L-cystéine/
hydroxyde de soude) et l’identification de Mycobacterium tuberculosis.7,8 Une culture a été interprétée
comme positive en présence de n’importe quel nombre
de colonies dont le frottis était positif pour les BAAR.
Analyse statistique
Des paramètres comme les proportions d’échantillons
avec frottis et cultures positifs, avec frottis positifs et
Coloration en cuve des frottis de crachats
3
Tableau 1 Nombre d’échantillons et résultats de l’examen microscopique et de la culture en
fonction du procédé de coloration
Procédé de
coloration
Total
enrôlé
n
Frottis
positif
n (%)
Culture
positive
n (%)
Culture
négative
n (%)
Culture
contaminée
n (%)
Individuelle*
En cuve†
6.633
32.717
111 (1,7)
543 (1,7)
494 (7,5)
2.523 (7,7)
5.853 (88,2)
28.875 (88,3)
286 (4,3)
1.319 (4,0)
* Frottis colorés individuellement et bien séparés sur un statif de coloration.
† Frottis colorés en lot par une machine dans des godets de coloration, en utilisant les mêmes solutions.
de cultures positives pour M. tuberculosis, et avec
frottis positifs et cultures négatives (cultures fausssement négatives) ont été comparés pour les frottis colorés en cuve ou individuellement. On a utilisé le test
χ2 de Pearson pour déterminer la signification des
différences entre les proportions. L’étude a avancé
l’hypothèse que si les cultures faussement négatives
étaient significativement plus fréquentes dans le bras
de la coloration automatisée, ce serait la conséquence
du transfert de BAAR. En supposant qu’un maximum
de 2% de cultures seraient faussement négatives avec
la coloration individuelle, une augmentation jusqu’à
5% (probablement due aux frottis faussement positifs) a été considérée comme le maximum acceptable
de perte de spécificité du frottis, étant donné l’énorme
réduction de charge de travail et probablement aussi
l’accroissement de sensibilité du frottis.
RÉSULTATS
On a inclus dans l’analyse tous les échantillons soumis pour un diagnostic par des patients supposés
non-traités.
Le Tableau 1 expose le nombre de patients enrôlés
et les résultats du frottis BAAR et de la culture avec
la méthode de coloration individuelle ou la coloration
automatisée en cuve. Au total 6.633 frottis ont été
colorés individuellement, parmi lesquels 111 (1,7%)
se sont révélés positifs par rapport à 543 frottis positifs (1,7%) parmi les 32.717 frottis colorés en cuve.
Les proportions de cultures positives pour les mycobactéries, de cultures négatives ou de cultures contaminées sont aussi très similaires dans les deux bras de
l’étude. On n’a pas détecté de différences significatives malgré le grand nombre d’échantillons impliqués.
Les échantillons à frottis négatif ont donné 6,0% et
6,3% de cultures positives, respectivement, dans le
bras des colorations individuelles et dans celui des
colorations en cuve.
Le Tableau 2 reprend la même analyse, en se focalisant uniquement sur les échantillons à frottis positif.
Parmi les 111 frottis positifs colorés individuellement,
100 (91,1%, intervalle de confiance [IC] 95% 83,0–
95,0) ont donné également une culture positive par
comparaison avec 504 cultures positives (92,8%, IC
95% 90,6–95,0) sur les 543 frottis positifs après coloration en cuve. La proportion de cultures faussement négatives (1,8%, IC 95% 0,2–6,4 pour la coloration individuelle versus 2,2%, IC 95% 1,1–3,8
pour la coloration en cuve) s’est avérée presque la
même pour les deux bras. Les proportions d’isolats
de M. tuberculosis (66,7% vs. 71,5%) et de cultures
contaminées (8,1% vs. 5,0%) sont légèrement plus
différentes. Aucune des différences n’a atteint une
signification statistique. Parmi les échantillons donnant des cultures faussement négatives, 10 frottis
étaient de positivité 1+ (deux colorés individuellement
et huit colorés en cuve), alors que deux seulement ont
montré quelques très rares BAAR et que dans deux
autres le degré de positivité était 2+, tous ces frottis
provenant du bras avec coloration en cuve.
La coloration individuelle exige deux à trois fois
plus de solution pour coloration et 5 à 7 fois plus
d’heures de travail que la coloration en cuve.
DISCUSSION
Nos résultats, obtenus dans un laboratoire de référence
pour les mycobactéries extrêmement actif, démontrent
que le transfert de BAAR de frottis positifs vers des
frottis négatifs à cause de la coloration en cuve ne
survient que rarement, s’il existe. Bien qu’après coloration en cuve la proportion de cultures faussement
négatives ait été légèrement plus importante, les
Tableau 2 Résultats de la culture pour les seuls échantillons avec examen microscopique
positif seulement en fonction du procédé de coloration
Procédé de
coloration
Individuelle*
En cuve†
Total
frottis positifs
n
Culture
positive
n (%)
Culture
négative
n (%)
Culture
contaminée
n (%)
M. tuberculosis
positif
n (%)
111
543
100 (90,1)
504 (92,8)
2 (1,8)
12 (2,2)
9 (8,1)
27 (5,0)
74 (66,7)
388 (71,5)
* Frottis colorés individuellement et bien séparés sur un statif de coloration.
† Frottis colorés en lot par une machine dans des godets de coloration, en utilisant les mêmes solutions.
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The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease
cultures positives ont été elles aussi plus fréquentes et
la différence principale concerne le taux de contamination. Aucun des paramètres analysés n’a différé de
façon significative, suggérant que les frottis des deux
bras étaient comparables. Le taux plus élevé de positivité des frottis et des cultures après coloration en
cuve suggère que le taux plus élevé de frottis positifs
avec cultures négatives peut s’expliquer par un taux
de contamination plus faible plutôt que par un transfert de bacilles entre frottis. L’accroissement des cultures faussement négatives (frottis positif mais culture
négative), qui pourrait indiquer un transfert de BAAR
au cours de la coloration en cuve, n’a atteint que
0,4%, une très faible différence, bien compensée par
les économies en termes de colorant et de main
d’œuvre. Cette proportion de faux positifs potentiels créés est négligeable par comparaison avec ceux
signalés pour d’autres méthodes standard de diagnostic comme le cliché thoracique, particulièrement dans
le contexte actuel où l’on insiste fortement sur une
augmentation de la détection des cas.9 La proportion
identique d’échantillons à frottis positif suggère que
la qualité de la coloration et de la microscopie a été la
même dans les deux bras.
Notre étude a exploré encore une autre série d’évidences en essayant de quantifier le transfert très redouté mais jamais documenté des BAAR au cours du
processus de coloration. Puisque, lors d’une analyse
de 39.350 échantillons traités par frottis et culture,
nous n’avons pu distinguer le phénomène d’autres
causes possibles de résultats avec frottis positifs et
cultures négatives, nous pouvons seulement déclarer
comme d’autres chercheurs l’ont fait précédemment,
que le transfert de BAAR n’atteint pas un taux détectable. Plus récemment, Affolabi et al. n’ont signalé
aucune preuve de transfert de BAAR dans des études
comportant plusieurs centaines de frottis en double
colorés soit individuellement soit en lot, ou encore
portant sur un ou deux frottis négatifs insérés dans
un lot d’environ 20 frottis fortement positifs et tous
colorés en un seul lot.10 Dans un travail antérieur,
Fodor a étudié la positivité en culture des frottis positifs colorés en cuve en complétant son étude par des
frottis ultérieurs, les antécédents et même des preuves
à l’autopsie ; il a pu confirmer tous les positifs en provenance de 118 lots de coloration en cuves.11 Mitchison et al. ont défendu la coloration automatisée en
cuves des frottis de crachats en raison de sa meilleure
qualité, de son coût moins élevé et de l’absence d’un
transfert de BAAR détectable lors de l’étude de frottis
en double colorés par chaque méthode.5 Finalement,
alors que dans les guides et les manuels réputés le
risque de transfert de BAAR a été mentionné à répétition comme une source importante de frottis faussement positifs,8,12 au mieux de nos connaissances,
aucune étude n’a jamais prouvé son existence, et encore moins à une fréquence suffisamment importante
pour justifier la suppression de cette simplification de
la technique.
Une limitation de notre étude résulte du nombre
relativement faible de cas à frottis positifs (particulièrement avec la coloration individuelle) malgré le grand
nombre de suspects ayant fait l’objet d’un dépistage.
Avec ces nombres, on n’aurait pu atteindre une différence significative qu’avec un excès d’au moins 5% de
cultures faussement négatives. Toutefois, ceci ne peut
pas constituer un argument sérieux contre la validité
de notre étude si l’on considère que la tendance observée après coloration en cuve allait dans le sens, non
pas de moins mais bien de plus d’échantillons vraiment positifs (frottis positifs et cultures positives).
CONCLUSION
Vu les nombreuses difficultés rencontrées dans les laboratoires de microscopie pour BAAR opérant dans
les conditions de terrain, il faudrait faire tous les efforts possibles pour supprimer les obstacles réels. A
l’inverse, ce serait une sérieuse erreur de leur imposer
des restrictions non justifiées et non nécessaires. On a
toujours accepté dans le monde entier qu’un examen microscopique de grande qualité est impossible
lorsque le nombre de frottis à examiner pour les
BAAR excède 25 à 30 par jour ; mais chose étrange,
ce même principe semble n’avoir été appliqué pour
les colorations que dans les pays industrialisés. Les évidences actuelles et antérieures démontrent que lorsque
la charge de travail est plus importante, il est possible
de pratiquer la coloration en cuve des frottis pour
BAAR dans le monde entier sans un risque significatif
d’accroissement des faux positifs.
Remerciements
Les auteurs remercient le personnel des laboratoires de référence
de la TB dans le Centre du Laboratoire de Santé Publique de Hong
Kong qui a exécuté la partie essentielle de cette étude ainsi que la
Fondation Damien Belgique pour son soutien financier. La publication a été possible grâce au soutien fourni par la United States
Agency for International Development (USAID) sous les termes de
l’Accord n° GHS-A-00-03-00045-00. Les opinions exposées dans
ce travail sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement
les vues de l’USAID.
Références
1 Van Deun A, Chonde T M, Gumusboga M, Rienthong S. Performance and acceptability of the FluoLED Easy™ module for
tuberculosis fluorescence microscopy. Int J Tuberc Lung Dis
2008; 12: 1009–1014.
2 Hung N V, Sy D N, Anthony R M, Cobelens F G J, van Soolingen D. Fluorescence microscopy of tuberculosis diagnosis. (Reflection and reaction). Lancet Infect Dis 2007; 7: 238–239.
3 World Health Organization. Laboratory services in tuberculosis
control. Part II: microscopy. Geneva, Switzerland: WHO, 1998.
4 International Union Against Tuberculosis and Lung Disease.
Sputum examination for tuberculosis by direct microscopy in
low-income countries. Technical guide. Paris, France: The Union,
2000.
5 Clancey J K, Allen B W, Rogers D T, Smith L S, Aber V,
Coloration en cuve des frottis de crachats
Mitchison D A. Comparison of machine and manual staining
of direct smears for acid-fast bacilli by fluorescence microscopy. J Clin Pathol 1976; 29: 931–933.
6 Domínguez J M, Vivas E S. Smear-positive and culture-negative
results of routine sputum investigations for the detection and
therapy control of pulmonary tuberculosis. Tubercle 1977; 58:
217–220.
7 Cruciani M, Scarparo C, Malena M, Bosco O, Serpelloni G,
Mengoli C. Meta-analysis of BACTEC MGIT 960 and BACTEC
460 TB, with or without solid media, for detection of mycobacteria. J Clin Microbiol 2004; 42: 2321–2325.
8 Kent P T, Kubica G P. Public health mycobacteriology. A guide
for the level III laboratory. Atlanta, GA, USA: US Department
of Health and Human Services, 1985.
5
9 Toman K, Frieden T R. Toman’s tuberculosis. Case detection,
treatment and monitoring. Questions and answers. Geneva,
Switzerland: World Health Organization, 2004.
10 Affolabi D, Odoun M, Sanoussi C N, et al. Bulk staining of
smears: no demonstrated risk of bacilli transfer from a positive
to a negative smear. Int J Tuberc Lung Dis 2008; 12: 683–685.
11 Fodor T. Bulk staining of sputum by the Ziehl-Neelsen method.
Tubercle 1984; 65: 123–125.
12 International Union Against Tuberculosis and Lung Disease.
Technical guide for sputum examination for tuberculosis by direct microscopy in low-income countries. Bull Int Union Tuberc
1978; 53 (Suppl 2): 4–16.