2 Anal. Mutationnelle - Institut Pasteur de Tunis
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2 Anal. Mutationnelle - Institut Pasteur de Tunis
ANALYSE MUTATIONNELLE DU GENE BRCA1 DE PREDISPOSITION HEREDITAIRE AUX CANCERS SEIN/OVAIRE CHEZ LA FEMME TUNISIENNE S. MESTIRI 1, K. MONASTIRI 1, S. BEN AHMED 2, N. BOUAOUINA 3, N. PRESNEAU4, Y.J. BIGNON 4, H. KHAIRI 5 ET L. CHOUCHANE 1*. Laboratoire d'Immuno-Oncologie Moléculaire, Faculté de Médecine de Monastir, Université du Centre, Tunisie. Département de Carcinologie Médicale, CHU. Farhat Hached, Sousse, Tunisie. 3 Département de Cancérologie Radiothérapie, CHU. Farhat Hached, Sousse, Tunisie. 4 Laboratoire d'Oncologie Moléculaire, INSERM CRI 9502/EA 2145, Centre Jean Perrin, BP392, 58 rue Montalembert, 63011 Clermont-Ferrand Cedex 1, France. 5 Service de Gynécologie Obstétrique, CHU. Farhat Hached, Sousse, Tunisie. * Auteur Correspondant Ce travail a été présenté, partiellement, sous forme de communication orale, dans le colloque de Génétique et de Cytogénétique Humaine, le 9-10 Mai 1997 à Sousse. 1 2 RESUME ABSTRACT INTRODUCTION: Le gène BRCA1 est un gène de prédisposition héréditaire au cancer du sein. Les mutations germinales du gène BRCA1 interviennent dans 5 à 10% des cas de cancer du sein. Le but de cette étude est de rechercher les mutations du gène BRCA1 chez des femmes tunisiennes ayant un cancer du sein familial ou sporadique. METHODES: Les auteurs ont utilisé le test de la protéine tronquée (PTT) et le séquençage d'ADN pour détecter les mutations du gène BRCA1 chez 12 familles tunisiennes atteintes d'un cancer du sein héréditaire et la technique ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide-PCR) pour détecter les mutations 185delAG et 1294del40 chez 150 cas de cancer du sein sporadique. RESULTATS: Une mutation non sens a été retrouvée, par PTT, au niveau de l'exon 11 du gène BRCA1 pour un cas familial. Aucune mutation n'a été détectée, par séquençage sur le reste des exons du gène BRCA1. Une mutation 1294del40, chez un cas de cancer du sein non familial, a été trouvée. La mutation 185delAG n'a été retrouvée chez aucuns des patients. CONCLUSION: Cette étude suggère que des mutations germinales du gène BRCA1 sont impliquées dans le cancer du sein en Tunisie. La mutation 185delAG est absente chez les femmes arabes tunisiennes. Mots clés: Cancer du sein, gène BRCA1, mutation 185delAG, mutation 1294del40, PTT et ASO-PCR. BACKGROUND: BRCA1 is a breast cancer susceptibility gene. Germline mutations in BRCA1 gene are found in 5 to 10% of breast cancer. The aim of this study is to screen the tunisian women with familial or sporadic breast cancer for BRCA1 gene mutations. METHODS: The authors used the Protein Troncation Test (PTT) and DNA sequencing to detect BRCA1 gene mutations in 12 tunisian families with breast cancer and the Allele Specific Oligonucleotide-PCR (ASOPCR) to detect the 185delAG and 1294del40 mutations in 150 tunisian womens with sporadic breast cancer. RESULTS: A nonsens mutation was found, by PTT, in exon 11 of BRCA1 gene in one case of familial breast cancer. None mutation in the rest of exons was found by the DNA sequencing. The BRCA1 1294del40 mutation was found only in a patient with non familial breast cancer. The 185delAG mutation was absent in all cases of breast cancer. CONCLUSION: These data suggest that the germline mutation of BRCA1 is implicated in breast cancer in Tunisia and that the 185delAG mutation is absent in arab tunisian women. Key Words: Breast cancer, BRCA1 gene, 185delAG mutation, 1294del40 mutation, PTT and ASO-PCR INTRODUCTION a été localisé au niveau de la région 21 du bras long du chromosome 17 1 et en 1994 il a été identifié par clonage positionnel 2. Il s'agit d'un grand gène constitué de 5592 Le gène BRCA1 est un gène majeur de prédisposition héréditaire au cancer du sein. En 1990, le gène BRCA1 A r c h s . I n s t . P a s t e u r T u n i s , 2000, 7 6 (1/2/3/4) 11 ANALYSE MUTATIONNELLE DU GENE BRCA1 DE PREDISPOSITION HEREDITAIRE AUX CANCERS SEIN/OVAIRE CHEZ LA FEMME TUNISIENNE nucléotides distribués sur 100 kb d'ADN génomique. Il est formé de 24 exons dont 22 seulement codent pour une protéine de 1863 acides aminés et de 220 kDa, les exons 1 et 4 sont des exons non codants. La protéine BRCA1 est une protéine suppresseur de tumeur qui agit de façon négative sur la différenciation et la prolifération cellulaire, elle joue aussi un rôle dans la réparation de l'ADN 3,4. Les mutations germinales du gène BRCA1 sont retrouvées dans 5 à 10% des cas de cancer du sein, 40 à 50% des cas des cancers du sein héréditaires et elles représentent un facteur de risque très important (85%) dans le développement de la maladie 5. Plusieurs mutations ont été retrouvées sur le gène BRCA1, la mutation 185 de lAG est parmi les mutations les plus fréquentes 6. La majorité des mutations sont des mutations non sens qui conduisent à une protéine tronquée par décalage du cadre de lecture par insertion ou délétion de bases et production d'un codon stop prématuré 7. Le but de notre étude est de rechercher les mutations du gène BRCA1 chez des femmes tunisiennes présentant un cancer du sein sous une forme sporadique ou familiale. POPULATIONS ET METHODES 1- POPULATIONS Notre étude a été menée sur deux populations différentes de femmes originaires du centre tunisien. - Une population de douze familles, avec des cas familiaux de cancer du sein, a été sélectionnée selon les critères d'inclusion du groupe "Génétique et cancer" de la Fédération Nationale française des centres de lutte contre le cancer. Ces critères se résument en trois cas de cancer du sein ou deux cas du cancer du sein avec un cas de cancer de l'ovaire chez des femmes liées au premier ou au deuxième degré et appartenant à la même branche parentale ou la présence d'au moins deux cas de cancer du sein chez des femmes liées au premier degré, dont l'un au moins est bilatéral ou diagnostiqué avant l'âge de 40 ans 8. -Une population de 150 femmes ne présentant aucun cas de cancer du sein dans la famille, se sont les cas de cancer du sein "sporadiques". Le diagnostic de cancers du sein a été basé sur l'étude anatomo-pathologique. 2- METHODES a- Extraction de l'ADN L'ADN génomique est extrait des lymphocytes à partir de 5 ml de sang périphérique en utilisant le principe de la précipitation des protéines, par une solution saline concentrée, selon la technique décrite par Olerup et al. (1992) 9. Les lymphocytes sont centrifugés et lavés avec l'eau. Le culot est incubé avec la protéinase K à 56°C. Les protéines précipitées avec du NaCl saturé sont éliminées après centrifugation. L'ADN restant dans le surnageant est précipité avec l'éthanol et récupéré dans 400µl d'eau. 12 b- Le test de la protéine tronquée ou PTT (Protein Truncation Test) Le PTT identifie les altérations de l'ADN de type mutations non sens qui entraînent la formation de codon stop et l'arrêt prématuré de la traduction de la protéine. Ce test est basé sur la synthèse protéique in vitro à partir d'un fragment d'ADN amplifié par PCR à l'aide d'une amorce contenant en 5' un promoteur de transition T7 et une séquence ATG d'initiation de la traduction 7, 10. L'amplification de l'exon 11, par PCR, a été réalisée à 53°C avec une extension de 1min 30 sec et une autoextension de 3 sec à chaque cycle. Le Kit TNTTM T7 coupled Reticulocyte Lysate System (Cat. No. L4610, Promega) a été utilisé pour l'analyse de cet exon par PTT. La réaction a été effectuée selon les instructions usuelles avec 10µCi de 35 S-Methionine (Amersham). La protéine synthétisée a été séparée sur un gel SDS-polyacrylamide 12% avec un tampon TRIS-glycine. Le gel a été exposé toute TMune nuit, à température ambiante, à un film (Hyperfilm -MP; Amersham). c- Le séquençage d'ADN Le fragment d'ADN à séquencer a été amplifié par PCR selon le protocole de Laplace et al (1999) 11. Le produit de PCR, purifié sur une colonne sephadex G50, a migré sur un minigel d'agarose de 1,5% afin d'évaluer la qualité de l'ADN. L'ADN purifié a été utilisé dans la réaction de séquençage (Kit PRISM Ready Reaction; Applied Biosystems) dont le produit a été déposé sur un gel dénaturant de polyacrylamide 6% en présence de 8,3M d'urée. La migration a été effectuée dans un séquenceur automatique 373A pendant une nuit. La séquence a été analysée par SEQUENCE NAVIGATOR (Applied Biosystems) au laboratoire d'Oncologie Moléculaire du Pr. Y. J. Bignon, centre Jean Perrin, Clermont-Ferrand. d- ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide-PCR) La ASO-PCR est une technique très sensible et spécifique à une mutation. Il s'agit d'une PCR dans laquelle nous utilisons des amorces qui amplifient de façon spécifique l'ADN susceptible d'avoir la mutation 185delAG ou 1294del40. La réaction de PCR est réalisée dans un volume total de 50µl contenant 1,5 mM MgCl2, 200µM dNTP, 100 ng de chaque amorce (Tableau 1), 2,5 U Taq polymérase et 10 ng d'ADN génomique de sujets atteints de cancer du sein sporadique. La PCR est initiée par une étape de dénaturation à 94°C pendant 5 minutes suivie par 35 cycles de 1 minute à 94°C, 1 minute à 57°C ou 55°C pour les mutations 185delAG et 1294de l40 respectivement, 2 minutes à 72°C et une étape finale d'extension de 10 minutes à 72°C. Le produit de PCR est analysé sur un gel d'agarose de 2% et visualisé par marquage par le bromure d'éthidium 12. e- Stratégies d'étude Pour les cancers familiaux, nous avons analysé par PTT l'exon 11 chez les 12 familles. Le reste des exons a été analysé par le séquençage systématique. A r c h s . I n s t . P a s t e u r T u n i s , 2000 S. MESTIRI, K. MONASTIRI, S. BEN AHMED, N. BOUAOUINA, N. PRESNEAU, Y.J. BIGNON, H. KHAIRI ET L. CHOUCHANE Pour les cancers sporadiques, nous nous sommes limités à rechercher deux mutations par ASO-PCR: la mutation 185delAG et la mutation 1294del40. RESULTATS 1 - ANALYSE MOLECULAIRE DES MUTATIONS DE BRCA1 DANS LES CAS FAMILIAUX DU CANCER DU SEIN. Le test de la protéine tronquée a permis d'identifier une altération de la taille de la protéine BRCA1 chez un cas familial du cancer du sein (Figure 1). Le séquençage d'ADN des exons 2 à 24 (sauf l'exon 4) du gène BRCA1 des cas familiaux n'a pas permis de retrouver une anomalie quelconque du gène BRCA1, y compris la mutation 185delAG. Figure 1: Analyse par PTT de l'exon 11 du gène BRCA1: elle révèle une protéine tronquée et une protéine normale pour le cas index (M) et seulement une protéine normale pour une parente non malade (N). T: Témoin positif T7 contrôle (Luciférase, 64 KD). 2 - RECHERCHE DE LA MUTATION 185DELAG Les allèles mutés et sauvages du gène BRCA1 ont été recherchés par ASO-PCR. En absence de mutations, les amorces S-delAGwt et A-delAGwt amplifient un fragment d'ADN de 98pb alors qu'aucune amplification n'est observée avec les amorces S-delAGwt et AdelAGmut. Si la mutation 185delAG est homozygote, les amorces S-delAGwt et A-delAGmut amplifient un fragment d'ADN de 96pb. L'ADN hétérozygote pour cette mutation est amplifié aussi bien avec S-delAGwt et AdelAGwt qu'avec S-delAGwt et A-delAGmut. Pour notre étude, nous avons testé 150 échantillons, aucun échantillon n'a montré la mutation 185delAG. Tome 7 6 (1/2/3/4) 3 - RECHERCHE DE LA MUTATION 1294DEL40 L'ASO-PCR réalisée sur des échantillons non mutés amplifie un fragment d'ADN de 162pb avec les amorces S-del40wt et A-del40wt. Aucune amplification n'est observée avec les amorces S-del40wt et A-del40mut. Lorsque l'échantillon est hétérozygote pour la mutation 1294del40, la ASO-PCR produit un fragment de 162pb avec S-del40wt et A-del40wt et un fragment de 122pb avec S-del40wt et A-del40mut. Sur les 150 échantillons de cancer du sein sporadique testés pour la mutation 1294del40, un seul échantillon porte la mutation de façon hétérozygote (Figure 2). Figure 2: Etude de la mutation 1294del40 du gène BRCA1 par ASO-PCR. Le produit de PCR est analysé par électrophorèse sur un gel d'agarose. L'échantillon sauvage (S -/-), montre une amplification d'un fragment d'ADN de 162pb avec les amorces sauvages S-del40wt et A-del40wt (wt), pas d'amplification avec les amorces S-del40wt et A-del40mut (mut). L'échantillon muté hétérozygote (M +/-) montre une amplification d'un fragment de 162pb avec les amorces Sdel40wt et A-del40wt (wt) et un fragment de 122pb avec les amorces S-del40wt et A-del40mut (mut). DISCUSSION Le gène BRCA1 est un gène majeur de prédisposition héréditaire au cancer du sein. La grande taille et le nombre élevé de mutation rapporté dans la littérature 13 rendent l'étude des mutations du gène BRCA1 compliquée et coûteuse 14. Nombreuses stratégies d'analyse de ces mutations sont utilisées, la plus rentable est celle commençant par l'étude de l'exon 11 par le test de la protéine tronquée. En effet, l'exon 11 est le plus grand exon du gène BRCA1, il couvre 61% de la séquence codante du gène. De plus, comme 90% environ des anomalies du gène sont des mutations frameshift et des mutations non sens, le test de la protéine tronquée a de forte chance de repérer une terminaison précoce de la protéine 7, 15. 13 ANALYSE MUTATIONNELLE DU GENE BRCA1 DE PREDISPOSITION HEREDITAIRE AUX CANCERS SEIN/OVAIRE CHEZ LA FEMME TUNISIENNE D'autres stratégies ciblent certaines mutations connues du gène BRCA1 pour estimer leur fréquence dans une population donnée de femme. Plusieurs techniques de biologie moléculaire sont utilisées telles que la SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), l'hétéroduplex, la TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) et la ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide -PCR). Contrairement à la SSCP, l'hétéroduplex et la TGGE, la ASO-PCR est une technique rapide réalisée en une seule étape, non radioactive, très sensible et spécifique à une seule mutation. Afin d'analyser les mutations du gène BRCA1, deux populations de femmes tunisiennes, atteintes de cancer du sein à contexte familial ou sporadique, ont été sélectionnées. Deux stratégies moléculaires ont été adoptées: dans les cas de cancers du sein familial, l'analyse mutationnelle de l'exon 11 a été réalisée par le test de la protéine tronquée puis par un séquençage systématique des exons 2 à 24 ( sauf l'exon 4). Cette analyse a permis d'identifier une protéine tronquée chez une famille sur 12. La synthèse de cette protéine tronquée serait due à une mutation non sens (en cours de caractérisation moléculaire). La fréquence des mutations germinales de BRCA1 serait donc de 8,3% chez la population de femmes tunisiennes atteintes de cancer du sein héréditaire. Dans le cas des cancers du sein sporadique, deux mutations 185delAG et 1294del40 ont été ciblées. La mutation 185delAG est une mutation framshift qui entraîne le décalage du cadre de lecture, elle est fréquente chez les Juives Ashkénazes et représente 13% des mutations caractérisées sur le gène BRCA1 16. La délétion d'une adénine et d'une guanine en position 185 est retrouvée dans 16% des cas de cancer du sein héréditaire et 39% des cancers de l'ovaire héréditaires chez les femmes Juives ashkénazes 17. Fodor et al. (1998)18 ont recherché la mutation 185delAG du gène BRCA1 chez 268 femmes juives ashkénazes ayant un cancer du sein sporadique. En utilisant l'ASO-PCR, ils ont démontré que la mutation 185delAG a une fréquence de 3%. Ce résultat suggère que la fréquence de la mutation 185delAG diminue lorsqu'il s'agit de cas de cancer du sein sans histoire familiale. Une étude récente 19 a montré que la mutation 185delAG est présente chez des juifs non Ashkénazes (juifs maghrébins et irakiens) avec une fréquence comparable à celle des juifs Ashkénazes. Notre étude n'a retrouvé aucune mutation 185delAG aussi bien pour les cas sporadiques que les cas familiaux. Ce résultat suggère que cette mutation est absente chez les tunisiennes arabes, malgré des origines communes avec des juifs non ashkénazes. La mutation 1294del40 est l'une des mutations non sens de l'exon 11 du gène BRCA1, elle est fréquente chez les familles irlandaises (2 familles sur 11 présen14 tent la mutation) et elle entraîne l'arrêt prématuré de la traduction protéique. Notre étude, effectuée sur la population des cas sporadiques, n'a identifié qu'une seule mutation 1294del40, soit un cas sur 150. Cette mutation aurait donc, une fréquence de 0,66% chez les femmes tunisiennes atteintes de cancer mammaire sporadique. A l'instar de nombreux travaux dans les pays occidentaux 20, 21,11, 22 nous avons démontré l'implication du gène BRCA1 dans la prédisposition au cancer du sein chez la femme tunisienne. Le rôle majeur de ce gène dans la survenue du cancer du sein familial est confirmé dans notre population (1 mutation sur 12). Ce rôle semble beaucoup plus restreint dans les cancers du sein sporadiques (1 mutation sur 150). Néanmoins, par notre stratégie d'analyse moléculaire nous avons probablement sous-estimé le rôle réel du gène BRCA1 dans la survenue du cancer du sein chez la femme tunisienne, une étude avec un effectif beaucoup plus important permettrait de vérifier nos résultats. Par ailleurs, d'autres mutations que celles recherchées auraient pu être impliquées ou d'autres gènes de susceptibilité au cancer du sein comme le gène BRCA2 et le gène TP53 23 pourraient être incriminés. En effet, le gène BRCA2 serait impliqué dans environ 75% des prédispositions héréditaires aux cancers mammaires des femmes jeunes non liées à BRCA1 24. BIBLIOGRAPHIE 1- J. M. Hall, M. K. Lee, B. Newman et al. (1990). Linkage of early onset familial breast cancer to chromosome 17q21. Science. 250: 1684 - 1689 2- Y. Miki, J. Swensen, D. Shattuck-Eidens et al. (1994). A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA. Science. 266: 66 - 71. 3- D.Bertwistle and Ashworth A. (1998). Fonctions of the BRCA1 and BRCA2 genes. Curr. Opin. Genet. Dev., 8: 14 - 20 4- X. Yang and Lippman M. E. (1999). BRCA1 and BRCA2 in breast cancer. Breast Cancer Res. Treat. 54: 1 - 10. 6 - F. J. Couch and Weber B. L. (1996). Mutations and polymorphisms in the familial early-onset breast cancer (BRCA1) gene. Breast information core. Hum. Mutat. 8: 8 - 18 5 - D. Ford, D. F. Easton and Peto J. (1995). 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