Qu`est-ce que la spectrométrie de masse

Qu’est-ce que la spectrométrie de masse ?
C’est une méthode de mesure des rapports masse-sur-charge (m/z) de molécules individuelles et ionisées
Vocabulaire et Unités : Unité de masse
ème
Unité de masse atomique : u m a, notée u définie comme 1/12 masse d ’un atome de carbone 12
-3
-1
23
-27
1 u = 1 Da = 1/12 .12 . 10 kg.mole / N (N = 6, 022045 . 10 )
Et donc:
1 Da = 1,66054 . 10 kg
Isotopes / Abondances isotopiques
Massif isotopique
Profil isotopique
Eléments chimiques existent sous forme de
différents isotopes
12
C
= 12,000000 (98,90%)
Sur un spectre de masse, on observe plusieurs pics m/z
correspondant à la combinaison des différents isotopes,
soit plusieurs possibilités  massif isotopique
Il reflète l’abondance isotopique de la molécule.
+ les masses des peptides augmentent + la quantité
d’incorporation des isotopes augmentent.
→Le pic monoisotopique diminue
13
C
= 13,003355 (1,10%)
1
H
= 1,007825 (99,98%)
2
H
= 2,014100 (0,02%)
16
O
17
O = 16,999131 (0,04%)
= 15,994915 (99,76%)
18
O = 17,999160 (0,20%)
14
N
= 14,003074 (99,63%)
15
N
= 15,000108 (0,37%)
Le massif isotopique donne une information de
- masse exacte : en mesurant le pic
monoisotopique
- masse moyenne : en mesurant la masse du
barycentre du profil isotopique
→ En fonction de la résolution du spectrometre de
masse, ce massif peut être détecter
Détermination de l’état de charge :
Mesure de l’écart entre les pics du massif
1 da : 1+
0.5 da : 2+
0.33 : 3+
Schéma d’un spectromètre de masse
Ionisation des peptides et protéines
Mode MS
Mode d’ionisation
MALDI
Matrix Assisted Lazer Desorption Ionization
Ionisation basée sur l’utilisation d’une matrice :
Les peptides sont co-cristallisés avec la matrice (en
large excès) sur une cible. →Peptides sous forme solide
Les ions se forment lors de tir laser sur le dépôt:
La matrice absorbe l’énergie du laser puis désorption et
ionisation par protonation des molécules.
ESI
Electrospray Source Ionization
Les peptides ou protéines arrivent sous forme liquide. A
l’entrée de la source, un sprayeur vaporise le liquide.
Sous l’action conjuguée de la pression d’azote et du
chauffage, les goutelettes sont évaporées, puis
explosent pour créer des ions multichargés
Type d’ions
En mode positif
MH+
L’ensemble des peptides peuvent être vus en une seule
analyse.
Gamme de masse
700 – 5000 da en m/z En résolution mono-isotopique
L’ionisation massive de matrice limite la mesure des
petites masses < 700 Da
En mode positif
Multichargés : (M+nH)n+
Principalement des MH2 2+ et MH3 3+
→ un même peptide ou protéine peut être vu sous
différents état de charge sur le même spectre.
→ complexité de l’analyse → nécessité de séparer la
mixture en amont : par gradient d’hydrophobicité nano
HPLC
400- 2500 dalton en m/z En résolution mono-isotopique
Ce qui correspond à une masse de
800 Da pour un composé dichargé 2+
Et 4500 Da pour un composé 3 x chargé 3+
Fragmentation des peptides
Mode MSMS
Les ions chargés peuvent être fragmentés →Information de séquence et de PTM
Nomenclature lors de la fragmentation :
La charge va soit du coté Nter, soit du coté Cter : ceci
détermine le type d’ions.
Le morceau chargé est visible sur spectre
Ions y : charge positive coté Nter
et b : charge positive coté Cter
A noter :
Des ions Y-H2O et Y-NH2 peuvent être observés.
Ions x : charge positive coté Nter
et a : charge positive coté Cter
Ions c : charge positive coté Nter
et z : charge positive coté Cter
Ions immonium
Ions internes
Ions satellites
A retenir
Fragmentation préférentielle en fonction du
type d’ionisation
MALDI
ESI
Y, b, Y-NH2,Y-H2O,x,z,a,c,ions immoniums, d, v, w, et
Y, b, Y-NH2, Y-H2O, fragments internes, ions
fragments internes …
immoniums