Initiation la Recherche Atelier Scrtion Master de Microbiologie M1

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Initiation la Recherche
Atelier Scrtion
Master de Microbiologie M1 (Biochimie et Biologie Cellulaire)
Sophie Bleves, Amel Latifi, et Aurlia Battesti.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram-négatif, pathogène opportuniste
de l’homme. Elle est notamment redoutée dans le milieu hospitalier (infections nosocomiales)
chez les malades immunodéprimés et les grands brûlés. Cette bactérie est aussi connue pour
les complications, souvent fatales, qu’elle entraîne chez les patients atteints de mucoviscidose.
Sa virulence est multifactorielle: elle est liée d’une part à des facteurs associés aux
bactéries, tels que le flagelle, les pili ou l’alginate (un exopolysacharide muqueux), ou à la
sécrétion de diverses toxines et enzymes dégradatives dans le milieu extracellulaire.
Figure 1˚ : Les facteurs de virulence de P. aeruginosa
* r ésistance AB
pompes efflux*
Alginate
(biofilm*, adh ésine,
antiphagocytose
anticompl ément)
*
*
Sécrétion
d'enzymes dégradatives
et de toxines
pigments fluorescents
Squestration du fer
Flagelle
(mobilit,
biofilm)
Pili
(mobilité,
adhésion,biofilm)
2
La sécrétion chez les bactéries à Gram-négatif implique pour les protéines à sécréter
(exoprotéines) la traversée de deux membranes (interne et externe) et d’un compartiment
aqueux, le périplasme. Cinq voies principales de sécrétion sont conservées au sein des
bactéries à Gram-négatif et vous ont été détaillées en cours. Quatre d’entre elles sont
présentes chez P. aeruginosa (figure 2), cette caractéristique en faisant un modèle
particulièrement intéressant pour l’étude des mécanismes de sécrétion.
Voie Gnrale
de Scrtion
Type II
Elastase ( LasB)
Exotoxine A
Protase Las A
Phospholipases
Lipase
Phosphatase alcaline
Type III
Contact dpendant
Exoenzymes S, T, U, Y
Transporteur ABC
Type I
Protase alcaline,
AprX
HasAp,
Membrane plasmique
cellule eucaryote cible
AprF
Xcp
Sec
Tat
AprE
Membrane externe
Psc
AprD
Périplasme
Membrane interne
Cytoplasme
Mcanismes Sec-indpendants
Figure 2˚: Schma de 3 voies de scrtion prsentes chez
NB la voie de scrtion de type V nest pas prsente
P. aeruginosa.
La machinerie de sécrétion de type II est composée de 12 protéines Xcp (extracellular
protein deficient) qui s’associeraient en un complexe multiprotéique reliant les deux
membranes. Elle est nécessaire entre autre à la sécrétion de l’élastase qui se déroule en deux
étapes : traversée de la membrane interne par la voie Sec ou la voie Tat (selon les
exoprotéines), puis traversée de la membrane externe par la voie Xcp. Les 12 gènes xcp sont
organisés sur un même locus, en deux opérons divergents, xcpPQ, et xcpR-Z, alors que les
gènes codant pour les protéines sécrétées sont à différents loci du chromosome. Les protéines
3
XcpT, U, V, W et X sont appelées pseudopilines, de part leur homologie avec la piline des
pili de type IV, et s’assemblent pour former un pseudopilus transmembranaire.
La machinerie de sécrétion de type I est la plus simple et comprend 3 protéines Apr
(alkaline protease). Elle permet notamment la sécrétion en une étape de la protéase alcaline.
Le gène structural de celle-ci (aprA) appartient à l’opéron arpA-F qui code aussi pour les
composants de la machinerie de sécrétion.
Enfin la machinerie de sécrétion de type III se compose d’une trentaine de protéines
Psc (Pseudomonas secretion component), qui forment un conduit permettant le transport des
protéines à sécréter directement du cytoplasme bactérien dans le cytosol de la cellule
eucaryote cible. In vivo c’est le contact avec la cellule cible qui induit l’expression des gènes
psc et des gènes exoS, T, U , et Y codant pour les effecteurs. ExoU est associée à une
chaperonne cytoplasmique. Un activateur transcriptionnel de la famille AraC, appelé ExsA,
est requis pour l’activation du régulon de type III.
Cet atelier a pour but dinitier les tudiants aux techniques classiques des
laboratoires tudiant les mcanismes de scrtion et de leur rgulation, en
plus des techniques de base de microbiologie molculaire.
Quels sont les objectifs de cet atelier?
˚Partie A
Nous allons chercher à déterminer s’il existe un quelconque lien, ou « cross-talk »,
entre les différentes machineries de sécrétion présentes chez P. aeruginosa. Aucune donnée
n’a jamais été publiée à ce sujet chez P. aeruginosa, mais quelques exemples sont décrits
dans la littérature chez d’autres bactéries. Nous avons choisi de vous limiter aux machineries
de type I et II, et souhaitons que vous abordiez cette question à deux niveaux :
- phnotype de la scrtion : une voie de sécrétion influence-t-elle la sécrétion des
exoprotéines transitant par une autre voie de sécrétion ?
- rgulation de lexpression des gnes: si le « cross-talk » existe, à quel niveau se
situe-t-il ?
Nous vous demandons denvisager les manipulations que vous
entreprendriez pour rpondre ces questions.
Dans les annexes, vous trouverez un
tableau récapitulatif des souches bactériennes (sauvage et mutantes), des plasmides, des
oligonucléotides et des anticorps dont vous disposez, ainsi que d’un panel de techniques.
Parallèlement à cette étude, vous allez vérifier le génotype d’une des souches que vous
aurez utilisées lors de cette partie (voir annexe).
Partie B
Nous étudierons plus particulièrement une protéine, XcpY, qui est un composant de la
membrane interne de la machinerie de sécrétion de type II.
4
Par une analyse bio-informatique de sa séquence, vous obtiendrez toutes les
prédictions de topologie la présentant comme une protéine de membrane interne : nombre de
segments transmembranaires (certains et putatifs), orientations possibles du polypeptide
(extrémité N-terminale dans le cytoplasme ou dans le périplasme). Ces prédictions de
topologies seront confirmées par une approche in vivo qui consiste à étudier le phénotype de
fusions traductionnelles de XcpY avec des enzymes rapporteurs (voir le principe en annexe).
Vous étudierez l’interaction de XcpY avec une autre protéine de membrane interne de
la machinerie, XcpZ. Pour ce faire, vous disposerez d’un plasmide (pGM ) qui porte le gène
codant pour XcpY et un gène codant une forme étiquetée 6His de XcpZ. Comment
pourriez-vous mettre en vidence linteraction entre ces 2 protines grce
ce plasmide˚? Quelles seront les diffrentes tapes de cette exprience˚?
Consultez les annexes pour vous aider, et ne perdez pas de vue qu’il s’agit de protéines
membranaires.
Partie C
Nous étudierons la production par Pseudomonas aeruginosa de facteurs de virulence
autres que ceux sécrétés (˙˚ shearing˚¨ -rasage- dappendices extracellulaires,
adhsion sur support inerte, mobilit — swiming et twitching-).
Programme
Lun20/02
M
AM
Mar21/02
M
AM
Mer22/02
Jeu23/02
SB
SB
AB
AL
SB
SB
Ven24/02
M+AM
AM
Lun27/02
M SB
AM SB
1re confrence
Tutorat (binme 1 -14h-, 2
-15h-,3 -16h-)
Introduction au FIL ROUGE
Prparations (milieux, tampons et autres solutions)
Bactries comptentes et transformation
Prparation de plasmides (lyse alcaline)
Comparaison des protocoles ˙lyse alcaline¨ et ˙ semi-boiling¨
Prparation de protines scrtes
Montage SDS-PAGE
Fin prparation chantillons protiques, Electrophorse, Transfert
Conjugaison
Carte restriction (salle TD)
2 me confrence
Analyse topologie XcpY (salle Info)
5
Mar28/02
M+AM SB
AM
Mer01/03
M
AM
Jeu02/03
M (CNRS)
AM
Ven03/03
Immunodtection, Analyse restriction, Electrophorse ADN
Croissance (prparation cellules pour interaction
XcpZ-Y)
Bio-Informatique —Type III- (salle Info)
AB
AL
Prparations (milieux, tampons et autres solutions)
Protocoles (salle TD)
SB
AL
AB
Sonication, Solubilisation dtergent, Ultra@,
Colonne affinit(interaction XcpZ-Y)
Prlvements chantillons (dosage
galactosidase)
PCR sur colonies, Electrophorse ADN
Lun06/03
M
AM AL
Mar07/03
M AL
AM AL
3 me confrence
RT-PCR (salle TD)
Prparation ARN
SDS-PAGE & Coomassie (interaction XcpZ-Y), Dosages protiques et
galactosidase
Mer08/03
M
AM
Jeu09/03
M
AM
Ven10/03
SB
AB
FIL ROUGE Travail thorique
FIL ROUGE
AL
AL
AL
Botes ˙˚ swiming˚—twithching˚¨, test adhsion, shearing
RT-PCR, Electrophorse ADN, test adhsion (lecture 6h)
Test adhsion (lecture ON), SDS-PAGE & Western-Blot (
lecture botes, photos ME
Lun13/03
M
AM
Jeu16/03
M
Ven17/03
M+AM
ALSB
4 me confrence
Bilan final (salle TD)
ECRIT Comptes-rendus rendre
ORAL
AB˚: Aurlia Battesti ([email protected]
SB˚: Sophie Bleves ([email protected] )
AL˚: Amel Latifi ([email protected])
)
Shearing),
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Annexes
Souches
bactriennes
P. aeruginosa
Caractristiques
Sauvage
Délétion du gène xcpY dans la souche PAO1
PAO1
PAO1 xcpY
Insertion Tn dans le gène aprE de la souche PAO1
Délétion des gènes xcpZ et xcpY dans la souche PAO1
PAO1 aprE
PAO1 xcpYZ
PAO1 fliC
PAO1 pilA
PAK pilA fliC
E. coli
DH5
Délétion du gène fliC codant pour la flagelline non flagélée
Délétion du gène pilA codant pour la piline des pili de type IV non piliée
Mutations ponctuelles dans les gènes pilA et fliC dans la souche PAK
F-, f80dlacZDM15, D(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rk, mk+), phoA, supE44, l-, thi-1, gyrA96, relA1
Plasmides AB
pGM
pED
pSB4
pSB52
pSB3
pPlasB
pPapr
pPxcp
pRK2013
Ap, Cb
Ap, Cb
Ap
Ap
Km
Ap, Cb
Tc
Tc
Km
Anticorps
polyclonaux
(de lapins)
Production forme étiquetée de XcpZ 6His et XcpY (expression à partir ptac)
Surproduction pseudopiline XcpT (expression à partir ptac)
Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au résidu 232
Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au résidu 278
Fusion traductionnelle XcpY avec la -lactamase au résidu 363
Fusion transcriptionnelle promoteur lasB-lacZ(lasB code pour l‘élastase)
Fusion transcriptionnelle promoteur aprADEF-lacZ
Fusion transcriptionnelle promoteur xcpR-Z-lacZ
Plasmide mobilisateur
Anti élastase, Anti protéase alcaline, Anti XcpT, Anti XcpY, Anti 6His
Oligonuclotides
lasB amont
lasB aval
rpoA amont
rpoA aval
L1
L2
R1
R2
5’ TGGCGGCCACGAGGTCA 3’
5’ TTACAACGCGCTCGGGC 3’
5’ CATCGTTCAGCCCGGTC 3’
5’ AGGCAGTGGCCTTGTCGT 3’
5’GAGAGGGCCCTAGGAGGTTGA3’
5’CGCCTGCTGAAATTGTCGGAAG3’
5’CCCTGCCCGTTCAACTGCTCCA3’
5’TATACCCGGGACTCCACTCA3’
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Protocoles exprimentaux
Croissances bactriennes
Milieux de culture:
P. aeruginosa est cultivé en milieu PIA (Pseudomonas Isolation Agar) ou milieu riche LB
(Luria broth) supplémenté en cas de besoin par les antibiotiques suivants : carbénicilline (Cb)
500 g /ml, tétracycline (Tc) 200 g/ml. En milieu liquide, la Cb est utilisée à 300 g/ml, et la
Tc à 50 g/ml..
E. coli est cultivée en milieu riche LB supplémenté en cas de besoin par les antibiotiques
suivants : ampicilline (Ap) 50 g /ml, tétracycline (Tc) 15 g/ml, kanamycine (Km) 25 g /ml.
Milieux d identification:
A/ Llastase et la protase alcaline
sont deux protéases, et leur activité enzymatique
peut être mise en évidence sur deux types de boîtes, contenant de la caséine (boîte au lait ou
skim-milk) ou de l’élastine. L’élastase utilise comme substrats l’élastine et la caséine alors
que la protéase alcaline n’utilise que la caséine. Ces activités se traduisent par un halot
d’hydrolyse autour des colonies de Pseudomonas après 24 à 48h de croissance à 37°C.
B/ Botes mobilit ˙˚
swiming˚¨ (flagelle) et twitching (pili de type IV)
Milieu LB semi-solide à 0.3% d’agar (swiming).
Milieu agar (1,5%) innoculé au cure-dent en traversant la gélose, puis coloration au cristal
violet (twitching).
C/ Botes activit phosphatase alcaline
Milieu LB supplémenté de BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) à 0,4mg/ml.
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Techniques de gntique
Transformation
voir Fascicule principes techniques
___________________________________________________________
_
Conjugaison 3 partenaires
-
Déposer sur une boîte LB sans antibiotiques, 10 l de la souche donnatrice et de la souche
mobilisatrice
NB Penser à réaliser tous les témoins
Incuber 2h à 37°C (1er contact= mobilisation)
- Mettre la souche réceptrice pendant ces 2h à 42°C (inhibition des systèmes de restrictionmodification de l’ADN)
- Rajouter alors 10 l de la souche réceptrice
-
Incuber au moins 4h à 37°C (2ème contact)
Resuspendre le « patch » de bactéries dans 500 l de LB
Etaler 200 l sur milieu sélectif PIA + antibiotiques et incuber O/N à 37°C
NB1 les conjugants peuvent n’apparaître qu’après 24 à 48h.
NB2 Réisoler les conjugants sur LB +antibiotiques, le milieu PIA n’étant utilisé que pour
la sélection des Pseudomonas.
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Techniques de biochimie
Prparation de protines scrtes
- prendre la DO 600 des cultures de nuit
* DO600 inoculum de nuit
5-6 ...... quoi faut-il penser?
- ensemencer 50 ml de milieu LB à une DO600 initiale de 0,1
- incuber à 37°C sous agitation
- prendre la DO600 de chaque culture après une heure, puis suivre la croissance toutes les 30
minutes pendant la phase exponentielle de croissance puis toutes les heures jusqu’à DO600= 4
Prélever et transvaser dans un eppendorf de 1,5 ml, 1 ml de culture à DO600 1, 2 et 4
* tracer au fur et mesure sur papier semi-logarithmique la DO 600 en
fonction du temps pour chaque souche
- centrifugation de chaque prélèvement (10’, 8000RPM) inutile de manipuler stérilement
* le surnageant de culture contenant les protéines sécrétées est soigneusement
transvasé dans un nouvel eppendorf, placé dans la glace puis 150 l de TCA 75% (acide
trichloroacétique) sont ajoutés pour précipiter les protéines toute la nuit (ON) à 4°C
* le culot cellulaire est repris à 1 U DO600 par 50 l de tampon de charge SDS-PAGE
puis conservé à –20°C (= C)
- centrifuger les surnageants de culture que vous avez précipité ON à 4°C (30’, 13000RPM),
le surnageant est éliminé et le culot est lavé par 1 ml d’acétone 90%
- centrifugation (10’, 13000RPM), éliminer tout l’acétone et évaporer le reste d’acétone en
laissant les eppendorfs ouverts 5 min à 37°C.
- le culot est repris à 1 U DO600 par 10 l de tampon de charge SDS-PAGE (= SN)
- dénaturer tous vos échantillons (C et SN) pendant 8’ au bain marie bouillant
* fermer soigneusement vos eppendorfs et veiller ce quils ne se
remplissent pas deau du Bain Marie˚!
NB les centrifuger 5 secondes avant de les charger
___________________________________________________________________________
SDS-PAGE (Mini ProteanIII —Biorad-)
- monter le système (présenté dans le fascicule de principes techniques)
- délimiter par un trait de marqueur la hauteur du gel de séparation ( 5 cm)
* vrifier que le systme ne fuit pas en ralisant un essai avec de leau
Tant que l acrylamide na pas polymris, il est toxique˚: MANIPULER AVEC
DES GANTS
- préparer dans 2 béchers (volume pour 2 gels)
10
Acrylamide 30%
H2 0
Lower Tris
Upper Tris
gel de
séparation
(10%)
6,6 ml
8,4 ml
5 ml
gel de
séparation
(12%)
8 ml
7 ml
5 ml
gel de
concentration
0,8 ml
4,8 ml
2 ml
- QUAND VOUS ETES PRETS A COULER LE GEL de sparation
ajouter 800 l
d’APS 1% et 25 l de TEMED dans le bcher correspondant , mélanger doucement et
couler le gel à la pipette Pasteur jusqu’au trait et vérifier le niveau (la surface doit être
horizontale). Déposer délicatement à l’aide d’une pipette Pasteur de l’eau distillée à la surface
du gel.
- quand le gel a polymérisé (vérifier avec ce qu’il reste dans le bécher), éliminer l’eau en
retournant le système
- ajouter 400 l d’APS 1% et 8 l de TEMED dans le bécher du gel de concentration,
mélanger doucement et couler le gel à la pipette Pasteur. Mettre immédiatement les peignes
en évitant autant que possible de faire des bulles.
- monter la chambre d’électrophorèse, la placer dans la cuve et remplir les 2 compartiments de
tampon d’électrophorèse
- enlever délicatement le peigne
- charger la gamme étalon protéine, la protéase alcaline et l’élastase pures, ainsi que
l’équivalent de 0,2 U DO600 de cellules (C) et de 1 U DO600 surnageant (SN)
- appliquer 80V par système pour le gel de concentration, puis migrer à 150V
- suivre la migration par l’avancée du front du bleu et l’arrêter avant qu’il ne sorte ( 1h30)
Tampon de charge SDS-PAGE : 2% SDS, 10% glycérol, 5% -mercapthoéthanol, 62,5mM
Tris-HCl, pH 6,8, bout de spatule de BBP (Bromophénol Blue)
Lower Tris : 1,5M Tris-HCl, 0,4% SDS, pH 8,8
Upper Tris : 0,5M Tris-HCl, 0,4% SDS, pH 6,8
Tampon d’électrophorèse : 250mM Tris, 1,9M Glycine, 35mM SDS
___________________________________________________________________________
Western-blot
- placer le gel dans du tampon de transfert ainsi qu’un feuille de nitrocellulose et 6 feuilles de
papier Whatman
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- mettre dans lordre sur la plaque de l’appareil à blot (transfert semi-sec) en prenant soin
d’éliminer les bulles (en faisant rouler une pipette) : 3 feuilles de papier Whatman, la
membrane de nitrocellulose, le gel, et enfin encore 3 feuilles de papier Whatman (voir
schéma)
* ne jamais toucher la feuille de nitrocellulose avec ses doigts --> des
pinces mtalliques sont votre disposition
3 feuilles de papier Whatman
le gel (attention aux bulles)
la nitrocellulose
3 feuilles de papier Whatman
Plaque appareil à blot
- fermer le capot de l’appareil à blot
- transférer 35 min en se plaçant à 15 V limitant
- quand le transfert est terminé, placer la feuille de nitrocellulose dans un bain de rouge
ponceau (coloration temporaire des protéines), puis la transférer immédiatement dans un bain
d’eau. Agiter doucement, les protéines apparaissent en rouge. Quand la gamme étalon se
détecte bien, repasser au stylo à bille les différentes bandes (94, 67, 43, 30, 20 et 14 kDa),
faire un point au niveau de la protéase alcaline (48 kDa) ou de l’élastase (30 kDa) purifiée,
puis venir me voir pour découper la membrane. Conserver les 2 morceaux de nitrocellulose
dans du papier d’aluminium à 4°C après décoloration totale dans de l’eau.
- immunodétection : incuber la membrane de nitrocellulose sous agitation
- 30 min en TBS lait 5% Tween 20 0,1%
- 1h30 en TBS lait 5% Tween 20 0,1% contenant soit Ac élastase (1/500), soit
protéase alcaline (1/1000),
XcpT (1/1000).
- 3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0,1%
- 1h en TBS lait 5% Tween 20 0,1% contenant Ac secondaire anti IgG de lapins
marqué à la phosphatase alcaline (1/5000)
- 3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0,1%
- Placer la membrane dans 5 ml du kit de détection de l’activité phosphatase alcaline
(Western Blue( Stabilized substrate for alkaline phophatase –Promega-). Agiter et
laisser la coloration se développer et l’arrêter en plaçant la membrane dans de l’eau.
La sécher dans du papier absorbant.
Tampon de transfert : 48mM Tris, 40mM Glycine, 20% Et-OH
TBS (10x) : 0,5M Tris-HCl, 1,5M NaCl, pH8
___________________________________________________________________________
12
Coloration des gels de protines au bleu de Coomassie:
Tampon de coloration
Bleu de Coomassie 0.25%
Ethanol
Acide acétique
H2O QSP
1g
125ml
40ml
500ml
Tampon de Décoloration
250ml d’éthanol et 80ml d’acide acétique, H2O QSP 1 litre.
Solubilisation de protines de membrane interne
- prendre la DO600 des cultures de nuit
- ensemencer 50 ml de milieu LB +AB à une DO600 initiale de 0,1
- incuber à 37°C sous agitation
- à DO600 = 0,5-0,6 ajouter de l’IPTG 2mM
- incuber à 37°C pendant 3h
- @ 45 ml de culture (10’, 5000RPM)
- culot repris dans 6 ml de tampon NaPi + 60 l inhibiteur de protéases (campus J. Aiguier)
- sonication 5X15’’ – arrêts de 45’’ en glace
- @ 6 ml, 10’, 3000RPM (élimination des débris cellulaires et bactéries non cassées)
- @ surnageant , 30’, 45 000RPM (ultra@, campus J. Aiguier)
NB culot de membranes totales est orangé
culot repris dans 1,5 ml de tampon NaPi + DM (n-dodecyl-_-D-maltoside) 1%
30’ en glace
ajouter 375 l glycérol 80%
@ 30’, 45 000RPM (ultra@, campus J. Aiguier)
les protéines de membrane interne solubilisées se retrouvent dans le surnageant
NB culot de membrane externe est translucide
Tampon NaPi: NaH2PO4 50mM, pH8 (ajuster avec NaOH)
Purification de protines
tiquette
6
His
1. Rincer la colonne avec 5 ml d’H2O
2. Charger 0.5ml de 0.1M NiSO4
3. Rincer avec 5ml d’H2O
4. Rincer avec 10ml de tampon A
5. Passer l’échantillon (Solubilisation de protines de membrane interne)
11. Rincer avec 10 ml de Buffer A + 50mM Imidazole
13
12. Elution :
1ml Buffer A + 100mM Imidazole
1ml Buffer A + 200mM Imidazole
1ml Buffer A + 300mM Imidazole
1ml tampon A + 400mM Imidazole
1ml tampon A +500mM Imidazole
13. Dosage des protéines et analyse sur gel SDS-PAGE (12%) du contenu de chaque fraction.
Tampon A : 0.02M de tampon phosphate Na2HPO4, 0.5M NaCl, glycérol 10%, pH 7.4.
Dosage des protines totales
Mthode
Lowry: voir Fascicule de principes techniques
Mthode Bradford:
Gamme talon˚: Diluer 40 l d’albumine bovine (BSA) 10mg/ml dans 960 l d’H2O soit
solution à 400 g/ml
Faire la gamme (5 6 points ) dans les cuvettes : 200 l de BSA, 600 l d’H2O et 200 l de
réactif Bradford
Mlanger 800 l dchantillon et 200 l de ractif Bradford. Incuber 5minutes temprature
ambiante. Lire la densit optique 595. Penser raliser une courbe talon avec la BSA
(albumine bovine).
_________________________________________________
Dosage de la -galactosidase:
_
Voir Fascicule de principes techniques pour connaître le principe
0.1ml de culture est dilu dans 0.9ml de tampon Z plus
Mercaptothanol (27
l de
Mercaptothanol pour 10 ml de tampon Z) plus deux gouttes de chloroforme et une goutte
de SDS 0,1%.
Vortexer 2 min˚, et placer dans un bain 28¡C
Incuber 10 minutes 28¡C
Prendre la DO600 des cellules
0.2ml dONPG (4mg/ml) est ajout pour dbuter la raction, le temps est alors not.
Lorsque la couleur devient jaune, la raction est stoppe par adjonction de 0.5ml de Na 2CO3
1M. Le temps auquel le Na2CO3 est ajout est not.
La DO420 est dtermine. Si le mlange est trouble, centrifuger au pralable afin dliminer les
dbris cellulaires.
NB Tmoins raliser˚?
14
Lactivit
galactosidase est calcule partir de lquation suivante˚:
Units Miller = (DO 420 *1000) / (t* v * DO600)
T = Temps coul entre laddition ONPG et addition de Na
V = volume des cellules utilises en ml
Tampon Z
(pH7)
Conserver 4¡C
Na2CO3
ONPG
2
CO3 en min
60mM Na2HPO4
40mM NaH2PO4
10mM KCl
1mM MgSO4 7H2O
1M
4mg/ml prparer extemporanment en tampon phosphate 0.1M, pH 7,4
Tampon phosphate˚0.1M pH 7,4˚: 77,4 ml de Na2HPO4 1M et 22.6ml de NaH2PO4 1M, qsp
1 litre avec H2O distille.
15
Techniques de biologie molculaire
Miniprparation lyse alcaline˚
Centrifuger 1,5 ml de culture O/N
Resuspendre le culot dans 100 l de Solution I
Ajouter 200 l de Solution II vortexer brièvement et incuber 5 minutes à température ambiante
Ajouter 150 l de Solution III, Vortexer
Centrifuger 5 minutes
Précipiter le surnageant par 270 l (0.6 vol) d’isopropanol, vortexer
Centrifuger 10 minutes
Rincer le culot par 500 l d’éthanol 70%
Centrifuger 5 min éliminer le surnageant, laisser sécher 5-10 minutes et resuspendre dans 25 à
50 l d’eau plus Rnase (1mg/ml)
Solution I : 50mM glucose, 25mM Tris pH8, 10mM EDTA
Solution II : 0.2N NaOH, 1%SDS
Solution III : 2.55M KAcetate, pH 4.8
___________________________________________________________________________
Miniprparation semi boiling
Centrifuger 1,5 ml de culture O/N
Resuspendre le culot dans 1ml de STET + 2 l RNase (1mg/ml préalablement bouillie) + 20 l
Lysozyme (20mg/ml)
Mettre les tubes à 95°C 7min
Les remettre immédiatement en glace 1min
@15 min, 13000RPM
Enlever le culot (visqueux) au cure-dents
Incuber 15 min à 37°C (action RNase)
Ajouter 0,4ml AcNH4, 5M, pH5,5 et 0,9ml Isopropanol
Mélanger par retournements et @10 min, 13000tr/min
Eliminer le surngeant
Laver avec 500 l Et-OH 70% froid
@10 min, 13000RPM
Eliminer le surnageant et laisser sécher 5-10min, et resuspendre dans 20 à 50 l H2O
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STET˚: Tris-HCl 0,1M, pH8, EDTA 50mM, sucrose 8%, Triton X100 0,5%
Prparation dARN
NB : La lyse sera adaptée à Pseudomonas
3. Add 350 l Buffer RLT to the sample. Mix thoroughly by vortexing vigorously. If
insoluble material is visible, centrifuge for 2 min in a microcentrifuge at maximum
speed, and use only the supernatant in subsequent steps.
If more than 5 x 108 bacteria are processed, additional homogenization with a
QIAshredder homogenizer or a syringe and needle may increase RNA yield (see
pages 20—24).
Note: Ensure that ME is added to Buffer RLT before use (see Important notes before
starting).
4. Add 250 l ethanol (96—100%) to the lysate. Mix thoroughly by pipetting. Do not
centrifuge.
A precipitate may form after the addition of ethanol, but this will not affect the RNeasy
procedure.
5. Apply the sample (usually 700 l), including any precipitate that may have formed,
to an RNeasy mini column placed in a 2 ml collection tube (supplied). Close the
tube gently, and centrifuge for 15 s at ‡8000 x g (‡10,000 rpm). Discard the
flow-through.
Reuse the collection tube in step 6.
If the volume exceeds 700 l, load aliquots successively onto the RNeasy column,
and centrifuge as above. Discard the flow-through after each centrifugation step.*
6. Add 700 l Buffer RW1 to the RNeasy column. Close the tube gently, and centrifuge
for 15 s at ‡8000 x g (‡10,000 rpm) to wash the column. Discard the flow-through
and collection tube.*
Skip this step if performing the optional on-column DNase digestion (page 99).
7. Transfer the RNeasy column into a new 2 ml collection tube (supplied). Pipet 500 l
Buffer RPE onto the RNeasy column. Close the tube gently, and centrifuge for 15 s at
‡8000 x g (‡10,000 rpm) to wash the column. Discard the flow-through.
Reuse the collection tube in step 8.
Note: Buffer RPE is supplied as a concentrate. Ensure that ethanol is added to Buffer
RPE before use (see Important notes before starting).
8. Add another 500 l Buffer RPE to the RNeasy column. Close the tube gently, and
centrifuge for 2 min at ‡8000 x g (‡10,000 rpm) to dry the RNeasy silica-gel membrane.
Continue directly with step 9, or, to eliminate any chance of possible Buffer RPE
carryover, continue first with step 8a.
It is important to dry the RNeasy silica-gel membrane since residual ethanol may interfere
with downstream reactions. This centrifugation ensures that no ethanol is carried over
during elution.
Note: Following the centrifugation, remove the RNeasy mini column from the collection
tube carefully so the column does not contact the flow-through as this will result in
carryover of ethanol.
8a. Optional: Place the RNeasy column in a new 2 ml collection tube (not supplied), and
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discard the old collection tube with the flow-through. Centrifuge in a microcentrifuge
at full speed for 1 min.
9. To elute, transfer the RNeasy column to a new 1.5 ml collection tube (supplied). Pipet
30—50 l RNase-free water directly onto the RNeasy silica-gel membrane. Close the
tube gently, and centrifuge for 1 min at ‡8000 x g (‡10,000 rpm) to elute.
Electrophorse dADN
- préparer un gel d'agarose 0,7% en TBE 0,5X
faire bouillir au micro-ondes (salle de pesée)
Laisser refroidir et ajouter une goutte de bromure d' éthydium (Bet) (0,625mg.ml-1) par
50ml de gel préparés
* porter des gants: le Bet est mutagne chez les bactries et est
souponn d’tre cancrigne chez l’homme
Mettre les peignes et couler dans le support
- rajouter 5 l de tampon de charge ADN dans chaque tube et charger 15 l de chaque
échantillon sur le gel d'agarose
Déposer 5 l de marqueur de taille (Smart ladder, Eurogentec)
Tampon de charge ADN: 30% glycérol, 0,25% bleu de bromophénol, 0,25%
-
mercaptoéthanol
TBE 20x 1,8M Tris, 40mM EDTA, 1,8M Acide Borique
___________________________________________________________________________
Vrification par PCR du gnotype dune souche
La souche mutante de sécrétion de type II (PAO1
xcpY) utilisée lors de ce stage porte une
délétion complète du gène xcpY, ce que vous allez vérifier par PCR avec les couples
d'oligonucléotides appropriés sur colonies.
L2
L1
xcpX
R2
2,1kb
1,4kb
xcpY
R1
XcpZ
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Lyse des bactries
- reprendre une colonie de PAOI ou PAO1
xcpY (une souche par groupe) dans100 l d'H2O
et lyser les bactéries comme suit: 15' à -20°C, puis décongeler à 37°C , 15' à -20°C et 10' à
95°C (attention ce que l’eau ne pntre pas dans les tubes!)
centrifuger 5'' les échantillons
PCR
- préparer les mélanges réactionnels suivants dans des eppendorfs PCR sur la glace en
ajoutant l’enzyme quand tous les groupes sont prts lancer la PCR
5 l d'ADN (bactéries lysées, PAOI ou PAO1 xcpY)
+ oligonucléotide R1 ou R2 (20 pmol à partir solution à10pmol/ l)
+ oligonucléotide L1 ou L2 (20 pmol à partir solution à 10pmol/ l)
+ dNTP (1mM final à partir solution 10mM)
+ tampon ADN polymérase (1X final)
+ MgCl2 (1X final)
+ 1 l DMSO (limiter les structures secondaires ADN)
H2O qsp 20 l
+0,2 l ADN polymérase thermostable (Taq polymérase, 5U/ l)
- programmation de l'appareil PCR ( 3h)
95°C 7'
_______________
95°C 1'
55°C 1'
30 cycles
72°C 1'30
________________
72°C 10'
___________________________________________________________________________
Techniques de RT-PCR semi-quantitatives
NB: Toutes les manipulations doivent tre ralises dans des
tubes dpourvues de RNases
1/ Dcontamination la DNase˚:
Pour chaque raction, raliser le mlange suivant˚:
1 g dARN + 1 l de tampon DNase 10X + 1 l de DNase + 1 l dinhibiteurs de Rnases, H 2O
QSP 10 l.
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Incuber 15 20 minutes temprature ambiante. Inactiver la
25mM.
DNase par ajout de 1 l dEDTA
2/ Raction de RT-PCR (en une tape)
Pour chaque raction, raliser le mlange suivant˚:
25 l de tampon 2X + 1 g dARN + 3 l du mlange des 2 amorces (10mM) + 1
l denzyme
+ 1ml dinhibiteur de RNases QSP 50 l. Lancer le programme adquat.
NB: Penser faire une raction dans les mmes conditions avec la
polymrase afin de vrifier la non contamination avec de lADN.
Taq
Exemple de programmes
Un cycle˚: 45 minutes 50¡ C (ceci correspond la raction de reverse transcription)
2 minutes 94¡C
Trente cinq cycles˚: 30 secondes 94¡C
45 secondes 50¡C
1 minute 70¡C
Un cycle˚: 5 minutes 72¡C
NB: Rflchir aux cycles au quels devront tre faits les prlvements.
Chaque prélèvement est analysé en chargeant 10_l de réaction plus 5 _l de tampon de charge
ADN sur gel d’agarose 1,5% en TBE 0,5X.
20
Test dadhrence en plaque polystyrne 24 puits
- Remplir chaque puits par 1 mL de LB
- A partir d’une cultutre O/N en LB+/- antibiotique, inoculer chaque puits à 0,2 UDO600/ml
(Penser à faire plusieurs puits pour une même souche : Contrôle DO600 ; et à garder un puits
sans bactérie : Contrôle négatif de contamination)
- Incuber à 30°C, sans agitation, le temps voulu
- Révéler en ajoutant 100µl de Crystal Violet (1X) dans chaque puits, sauf pour celui qui sert
à mesurer le DO600
- Laisser agir 10 à 15 min
- Enlever le Crystal violet à l’aide d’une pipette non stérile
- Rincer 2 fois à l’ H20 sans toucher les parois
- L’anneau d’adhérence violet s’observe à l’interface air-liquide
- Quantification : Resuspendre l’anneau avec 400µl d’éthanol 95% ; Compléter avec
600µL d’H2 0 et lire la DO à 600 nm
!
!
!!
___________________________________________________
Rasage (Shearing)
-
Etaler les bactéries sur boîtes de Pétri carrées (LB +AB + IPTG frais 2mM) ON à 37°C
Re-suspendre les bactéries dans 1,8ml de LB, MgCl2 10mM NB DO600entre 5 et 10
Les passer 3 fois dans une seringue équipée d’une aiguille 19G
@5’, 13000 RPM (centri eppendorf)
Récuperer 1,5ml de surnageant
@10’, 13000 RPM
Récuperer 1,4ml de surnageant
@5’, 13000 RPM
Récuperer 1,2ml de surnageant
Précipiter 1h dans la glace TCA (10% final)
@ 15’ 13000 RPM
Laver le culot / 500 l acétone 90%
-
@ 5’ 13000 RPM
sécher le culot à 37°C et resuspendre à 2UDO600/ l de SDS-PAGe loading buffer
"
"
- 1U DO600 sur gel
___________________________________________________
Prdiction de la topologie dune protine
transmembranaire, XcpY
Les protéines intégrales de la membrane interne sont ancrées dans celle-ci par des
segments d’une vingtaine de résidus, dont la structure secondaire correspond à des hélices
#
hydrophobes. Une protéine possédant un segment transmembranaire est dite bitopique. Une
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protéine possédant plusieurs segments transmembranaires est dite polytopique. Les
informations déterminant la topologie d’une protéine sont contenues dans sa séquence en
acides aminés, et les paramètres étudiés sont :
L’hydrophobicité --> identification des segments transmembranaires potentiels
La répartition des charges --> orientation de la protéine dans la membrane qui est
déterminée par la distribution des résidus chargés aux extrémités des segments hydrophobes
(« positive inside rule »)
La topologie protéique est prédite in silico : * recherche de séquence dans une banque de
donnée (http://www.pseudomonas.com/). * prédiction de la topologie d’une protéine
membranaire (http://www.expasy.org/)
La topologie de XcpY est confirmée in vivo par la réalisation de fusions
traductionelles avec un gène rapporteur. La -lactamase et la phosphatase alcaline sont 2
$
enzymes périplasmiques qui sont classiquement utilisées. Le principe est de générer des
fusions en phase dans différentes régions du gène à étudier avec la partie du gène rapporteur
codant pour la forme mature de l’enzyme (privée de sa séquence signal). La translocation de
l’hybride à travers la membrane interne est alors dépendante de la présence dans le gène à
étudier d’une région codant pour un segment hydrophobe servant de signal d’exportation.
L’analyse des hybrides repose sur une propriété particulière de l’enzyme rapporteur, qui a une
activité différentielle selon que la protéine est dans le cytoplasme ou dans le périplasme.
Colonne 1 : enzyme rapporteur mature transloquée
dans le prériplasme
Colonne 2: enzyme rapporteur privée de sa
séquence signal, non transloquée
Colonne3: fusion traductionnelle avec un
polypeptide possédant un ou plusieurs segments
transmembranaires, et exposant l’enzyme rapporteur
vers le périplasme
Colonne 4: fusion traductionnelle avec un
polypeptide ne possédant pas de segments
transmembranaires, ou possédant un ou plusieurs
segments transmembranaires, mais exposant
l’enzyme rapporteur vers le cytoplasme
L’activité phosphatase alcaline est détectée sur milieu contenant du BCIP (5-bromo-4-chloro3-indolyl phosphate), un substrat chromogène qui donne une coloration bleue à la bactérie
lorsqu’il est hydrolysé.
En jouant sur la densité cellulaire de la culture bactérienne (colonie isolée ou patch) et la
concentration d’ampicilline, il est possible de différencier les fusions exposant la -lactamase
$
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vers le cytoplasme ou le périplasme. Des bactéries portant une fusion exposant la -lactamase
%
vers le périplasme seront toujours résistantes à l’ampicilline (même en colonies isoléees). Les
bactéries portant une fusion exposant la -lactamase vers le cytoplasme seront uniquement
%
résistantes à l’ampicilline après croissance en patch (gros amas de plusieurse colonies): les
premières bactéries qui essayeront de pousser seront lysées par l’antibiotique, ce qui libérera
leur -lactamase, qui dégradera alors l’antibiotique présent dans le milieu et autorisera la
%
croissance à ce niveau des bactéries suivantes dans la colonie.
Patch test Faire un trait de bactéries à l’oeuse sur boîte LB Ap200
Spot test Resuspendre une oeuse de bactéries dans 100 l de LB, puis procéder à des
&
dilutions en cascade jusqu’à 10-4. Déposer 15 l de chaque dilution et de la solution mère sur
&
Ap50.
___________________________________________________________________________
Rfrences bibliographiques
Eichelberg K, Galan JE. (2000) The flagellar sigma factor FliA (sigma(28)) regulates the
expression of Salmonella genes associated with the centisome 63 type III secretion system.
Infect Immun., 68(5):2735-43
Drew D, Sjostrand D, Nilsson J, Urbig T, Chin CN, de Gier JW, von Heijne G.(2002) Rapid
topology mapping of Escherichia coli inner-membrane proteins by prediction and PhoA/GFP
fusion analysis. Proc Natl Acad Sci U S A., 99(5):2690-5.
˚Helaine S, Carbonnelle E, Prouvensier L, Beretti JL, Nassif X, Pelicic V.(2005) PilX, a pilusassociated protein essential for bacterial aggregation, is a key to pilus-facilitated attachment of
Neisseria meningitidis to human cells. Mol Microbiol. 2005, 5(1):65-77.