Etude de la staphylococcie en élevage de lapins : persistance
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Etude de la staphylococcie en élevage de lapins : persistance
Etude de la staphylococcie en élevage de lapins : persistance clinique au sein de l’élevage et génotypage des souches isolées B. LE NORMAND1, U. LIPINSKA2, C. WILDEMAUWE3, P. FRANÇOIS4,F. AGNOLETTI5, J. LE GUENNEC6 1 2 SCP Fouqué-Gounot-Le Normand-Le Page, Saint Brice en Coglès, 35460, France Université de Gand, Faculté de Médecine Vétérinaire, Département de pathologie, bactériologie et maladies aviaires, Gand, Belgique 3 Institut Pasteur, Bruxelles, Belgique 4 Laboratoire de Recherche Génomique, Service des Maladies Infectieuses, Université de Genève, Suisse 5 Institut Zoo-Prophylactique Expérimental de Vénétie, Trévise, Italie 6 Laboratoire LABOFARM, Loudéac, 22600 France Résumé. 23 souches de Staphylococcus aureus ont été classées suivant leur persistance clinique dans des élevages pourtant correctement traités. La caractérisation de ces souches a été réalisée par typage agr, profil MLVA, contenu en toxines et typage phagiques. La bactériologie sur foetus et lapereaux nouveau-nés a révélé une infection très précoce. Toutes ces données doivent permettre d’améliorer les procédures dans les élevages contaminés par Staphylococcus aureus. Abctract. Staphylococcosis in rabbit farms : clinical persistence and characterization of isolates by genotyping. 23 rabbit Staphylococcus aureus isolates were classified according to their clinical persistence in the farms despite treatments. Characterization of these strains was carried out by agr typing, MLVA profiling, toxin-content and phage typing methods. Bacteriology on fetuses and newborn rabbits showed very early infection. All these data should allow to adopt adapted procedures on S. aureus contaminated farms. Introduction La staphylococcie est une maladie majeure dans les élevages de lapins contaminés car les formes cliniques sont récurrentes malgré les traitements instaurés et la staphylococcie y est économiquement lourde. A côté d’un simple portage détecté par prélèvement cutané (Hermans et al., 2000), la maladie peut prendre des formes cliniques variées : abcès sous-cutanés, mammites, arthrites, péritonites, pyomètres, dermites. Le pouvoir pathogène des souches de Staphylococcus aureus peut être abordé selon 2 protocoles analytiques différents : soit l’étude longue et onéreuse par manipulations géniques (Que et al., 2001), soit l’étude des facteurs de virulence dont les conclusions définitives sont plus difficiles à établir (Ryding et al., 1997, Switalski et al., 1993, Thomas et al., 1999). Les aspects cliniques rétrospectifs étant primordiaux pour déterminer la pathogénicité de la souche en cause, nous avons procédé à l’analyse plus approfondie des souches de Staphylococcus aureus d’élevages connus afin d’améliorer la connaissance de cette maladie. 1. Matériel et méthodes 1.1. Souches bactériennes 23 souches de Staphylococcus aureus (tableau 1) ont été isolées en élevages de lapins en 2006 et 2007 et choisies pour leur diversité géographique, leur diversité d’organes d’isolement et les âges des animaux ciblés. Nous avons classé les souches de Staphylococcus aureus sur une base de persistance clinique : les élevages dans lesquels la staphylococcie est définie comme priorité sanitaire sur un intervalle d’au moins 2 ans sont considérés comme contaminés par une souche de forte pathogénicité. Tableau 1. Répartition des souches de S. aureus Numéro Animal MLVA Sa2 lapine Sa3 lapine Sa4 lapereau 50 j Sa5 lapine Sa6 lapine Sa7 lapine Sa8 lapine Sa9 lapine Sa10 lapine Sa11 lapine FR Sa12 lapine Sa13 lapine Sa14 lapine Sa15 lapereau Sa16 lapine Sa17 lapine Sa18 lapine Sa19 lapereau 12 j Sa20 lapine Sa21 lapine Sa23 lapereau 25 j Sa24 lapereau Sa25 lapine Localisation foie poumons abcès abcès mm poumons poumons utérus utérus utérus poumons utérus abcès mm foie péritoine poumons utérus abcès mm abcès SC utérus utérus abcès SC articulation utérus Persistance clinique oui non oui oui oui oui non oui oui oui non non non oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui 2 souches de Staphylococcus xylosus (Sa 1 et Sa 22) ont été associées lors du génotypage MLVA. 1.2. Analyses effectuées Les toxines d’importance en médecine humaine ont été recherchées sur toutes les souches : PVL (Panton 13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans, France Valentine Leucocidine), TSST (Toxic Shock Syndrome Toxin), exfoliatines. Le locus agr (accessory gene regulatory) est impliqué dans le contrôle de la virulence. Le typage agr distingue 4 groupes alléliques ; il a été réalisé sur les 23 souches. Le génotypage par MLVA (Multiple Loci VNTR Analysis ou Analyse de loci VNTR, VNTR = Variable Number of Tandem Repeats ou Répétition en tandem polymorphe) permet de décrire pour les souches de Staphylococcus aureus un pattern de facteurs potentiellement impliqués dans la pathogénicité, principalement les adhésines. Cette technique analytique de génotypage donne des résultats cohérents avec les techniques de référence (PFGE, MLST et typage spa), tout en étant moins coûteuse et avec une valeur épidémiologique forte : les patterns sont conservés entre souches apparentées (François et al., 2005, , Schouls et al., 2009). La technique permet donc de déterminer si les souches sont clonales ou si elles sont génétiquement éloignées. Les typages agr et MLVA ont été effectuées par P. François, Laboratoire de Recherche Génomique, Genève, Suisse. Des souches de référence humaines communautaires (USA 300) ou hospitalières (USA 700) sont introduites pour comparaison. Les protéines MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) sont impliquées dans l’adhérence et l’attachement cellulaire de Staphylococcus aureus. Les analyses ont été réalisées à l’Institut ZooProphylactique de Vénétie, Trévise, Italie et au Laboratoire de Recherche Génomique de Genève, Suisse. Une analyse PCR de détection des gènes bbp, cna, clfA, clfB, ebpS, eno, bap, icaA, icaD codant pour les facteurs de virulence a été réalisée sur 7 souches (Tristan et al., Vasudevan et al., 2003). L’analyse ciblant les gènes FnbA, FnbB a concerné toutes les souches. Afin de classer les souches LV (Low Virulence), HV (High Virulence) ou HV AT (High Virulence ATypical), une analyse PCR multiplexe ciblant les gènes bbp, selm et flank a été réalisée sur 22 souches à l’Université de Gand, Belgique, suivant la méthode décrite par Vancraeynest et al. (2007). La souche de référence HV AT a été isolée en Belgique en 1994 (Devriese et al.,1996). Des analyses complémentaires de sensibilité aux phages ont été réalisées par l’Institut Pasteur de Bruxelles, Laboratoire de référence de typage phagique de Belgique, à l’aide d’un ensemble de bactériophages internationaux utilisés pour caractériser les souches humaines. S. aureus est le germe le plus fréquemment rencontré dans l’utérus des lapines (Le Normand et al., 2007) ; pour mieux comprendre les modalités de transmission de la maladie, nous avons prélevé des fœtus sur lapines gestantes dans des élevages touchés par la staphylococcie et des lapereaux nouveau-nés dans un élevage contaminé par une souche HV. Des cultures bactériennes classiques ont été réalisées sur les foies des fœtus et des lapereaux en prenant les précautions d’asepsie habituelles lors des prélèvements. 2. Résultats et discussion 2.1. Gènes de toxines, groupes agr Parmi les 23 souches étudiées, aucune souche ne porte de gènes de toxines PVL, TSST ou exfoliatines. Par comparaison, 10 à 30 % des souches humaines portent le gène TSST, et les autres toxines sont plutôt trouvées sur les souches communautaires. Sur les 23 souches cunicoles, 1 est agr II, 5 sont agr III, 17 sont agr IV. Les études menées sur d’autres espèces (Buzzola et al., 2007, Collery et al., 2009, Gilot et al., 2004) montrent la prédominance des souches agr I, II, III parmi les souches de Staphylococcus aureus isolées chez l’homme et les bovins, avec une très faible proportion de souches agr IV. Une relation entre le typage agr et l’expression clinique semble assez nette pour les groupes III et IV chez l’homme (Jarraud et al., 2002). Chez le lapin, Vancraeynest et al. (2006) distinguent les groupes suivants : 12 souches hautement virulentes (HV) sont agr IV, 2 souches faiblement virulentes (LV) sont respectivement agr II et III, 1 souche HV atypique est agr II, Collery et al. (2009) classent 5 souches cunicoles en agr IV. 2.2. Génotypage MLVA Le génotypage MLVA a donné un arbre de dispersion limitée qui permet de distinguer 2 clusters principaux (dendogramme de la figure 1) : un gros cluster (cluster G) de 16 souches proches de souches humaines hospitalières (USA700) qui regroupait toutes les souches agr IV, un petit cluster (cluster P) de 5 souches (Sa12, 3, 8, 13, 14) toutes non agr IV, 1 souche (Sa5, agr IV) proche de la souche humaine communautaire USA300 et 1 souche (Sa24) éloignée de toutes les précédentes qui était agr II. Les souches de Staphylococcus xylosus (Sa1, 22) étaient très éloignées de toutes ces souches. 2.3. MSCRAMMs Les 7 souches analysées étaient négatives pour le gène bap et positives pour bbp. Les gènes icaA, icaD, clfA, clfB, fib, eno étaient présents de façon variable. Ces résultats confirment les résultats déjà obtenus par Vancraeynest et al., 2004. Sur 23 analyses ciblant le gène FnbB, 7 sont positives : les 5 souches du petit cluster et les souches Sa5 et Sa24. 13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans, France Figure 1. Dendogramme du typage MLVA sur 23 souches de Staphylococcus aureus isolées de lapins. 2.4. PCR multiplexe bbp, selm et flank Les résultats sont présentés dans le tableau 2 qui intègre également l’analyse MLVA . Si quelques souches apparaissent atypiques, la majorité des souches de Staphylococcus aureus sont clonales ; la caractérisation en souche HV ou LV par PCR multiplexe apparaît fiable par rapport à la clinique et à l’analyse MLVA. Les 2 souches HV AT (Sa5 et Sa24) ont fait l’objet d’analyses complémentaires et présentent les mêmes types phage (29/54/95/+ et 29±/54±/95/+) ; elles sont sensibles au phage 29 comme la souche de référence HV AT, mais ont des profils PFGE et spa différents : Sa5 est PFGE A et spa t656 (11-12-12-21-17-34-2434-22-25), Sa24 est PFGE sporadique (pas de code) et spa t4461 (14-44-12-17-23-18-261-17-17-17-23-24). La souche Sa12 issue d’un élevage où 100 % des lapines mortes présentaient des pyomètres causés par S. aureus (aucun autre signe clinique, isolements par plusieurs laboratoires), a subi les mêmes analyses : les profils PFGE Y3d et spa t2968 (07-23-21-17-34-3434-34-34-33-34) confirment le statut LV de cette souche qui s’est avérée résistante à tous les phages testés. 2.5. Bactériologie Les cultures réalisées sur les foies de fœtus dans plusieurs élevages atteints de staphylococcie se sont révélées positives. Dans un élevage contaminé par une souche HV (souche Sa4), les foies de lapereaux nouveau-nés s’avèrent également positifs pour Staphylococcus aureus. Ces résultats démontrent une transmission très précoce du germe ; ils incitent à mettre en place des moyens de lutte englobant obligatoirement une gestion du renouvellement des animaux dans l’élevage. Tableau 2. Caractérisation des souches de Staphylococcus aureus selon leur persistance clinique, le type agr, la virulence déterminée par PCR multiplexe et l’analyse MLVA Numéro MLVA Sa2 Sa3 Sa4 Sa5 Sa6 Sa7 Sa8 Sa9 Sa10 Sa11 Sa12 Sa13 Sa14 Sa15 Sa16 Sa17 Sa18 Sa19 Sa20 Sa21 Sa23 Sa24 Sa25 Persistance clinique Type agr Type HV/LV Cluster MLVA oui non oui oui oui oui non oui oui oui non non non oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui IV III IV IV IV IV III IV IV IV III III III IV IV IV IV IV IV IV IV II IV HV LV HV HV AT HV HV LV HV HV HV LV LV LV (NT) HV HV HV HV HV HV HV HV AT HV G P G 13èmes Journées de la Recherche Cunicole, 17-18 novembre 2009, Le Mans, France G G P G G G P P P G G G G G G G G G Conclusion L’approche clinique des élevages sur le long terme permet de définir a posteriori des souches de Staphylococcus aureus à fort pouvoir pathogène ; ces souches ont un profil analytique par génotypage agr, MLVA ou PCR multiplexe bbp, selm, flank qui semble correspondre à la détermination clinique. L’isolement de Staphylococcus aureus sur des foies fœtaux et des foies de lapereaux nouveau-nés suggère une notion de transmission extrêmement précoce du germe, ce qui pourrait remettre en cause l’abord traditionnel de la maladie en élevage. Dans les élevages contaminés par Staphylococcus aureus, il est indispensable de pouvoir connaître, avant de devoir gérer une extension trop importante de la maladie, le statut des souches isolées afin d’adopter des protocoles de soins zootechniques et thérapeutiques adaptés. En complément d’une étude clinique solide, la PCR multiplexe est intéressante et d’un coût raisonnable. Cette approche analytique correspond à une démarche sanitaire cohérente et évite une médicalisation excessive ; une approche raisonnée du renouvellement des animaux est nécessaire, avec mise en place d’un audit des mesures techniques logiques répondant aux facteurs de risques de la contamination des animaux nouvellement introduits. La détection des porteurs sains de Staphylococcus aureus à fort pouvoir pathogène selon les méthodes de prélèvements récemment décrites par Hermans et al. en 2000 ou Agnoletti et al. en 2008, peut dans ce cadre constituer un élément sanitaire d’assainissement ou de contrôle des reproducteurs très intéressant. Remerciements Nous remercions toute l’équipe de LABOFARM qui a manipulé (sans s’impatienter) les souches ces trois dernières années. Références AGNOLETTI F., COCCHI M., BANO L., GUOLO A., BACCHIN C., DRIGO I., MAZZOLINI E., 2008. Validation of a sampling method to detect healthy rabbit Staphylococcus aureus carriers. 9th World Rabbit Congress, Verona, Italy. 899903. BUZZOLA F.R., ALVAREZ L.P., TUCHSCHERR L.P.N., BARBAGELATA M.S., LATTAR S.M., CALVINHO L., SORDELLI D.O., 2007. Differential abilities of capsulated and noncapsulated Staphylococcus aureus isolates from diverse agr groups to invade mammary epithelial cells. Infect. Immun., 75(2):886-891. 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