Cristallisation des protéines membranaires Quelques idées

Cristallisation des protéines membranaires
Quelques idées et exemples
Atelier Cristallisation
GDR Protéines membranaires
Carry-le-Rouet novembre 2007
Institut de Biologie Structurale
[email protected]
CEA-CNRS- Université de Grenoble
Solubilisation
et purification
cristallisation
Mêmes principes que pour protéines solubles ?
1- Généralités sur cristallisation et détergents
2- Paramètres pour criblages initiaux
3- Amélioration des conditions de cristallisation
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
5- Conclusions et perspectives
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Rôle du détergent dans l’empilement cristallin
OmpF porin
Detergent in the tetragonal crystal form
localized by neutron di!raction
Structure (1995) 3, 1051-1059
Micelle size: adapted to the hydrophobic surface of the protein
Crystal contacts: protein-protein interactions
Detergent belt should not hinder protein-protein interactions
Non-ionic or zwitterionic detergents are better
~400 C10DAO molecules per trimer
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Diagrammes de phase des détergents
0
Consolution
boundary
CMC
Micellar solution
Liquid-crystal
phases
100
Detergent concentration (% w/w)
monomeric solution
CMC
Temperature
Temperature
monomeric solution
2 immiscible
liquid phases
0
Micellar solution
Consolution
boundary
Liquid-crystal
phases
2 immiscible
liquid phases
100
Detergent concentration (% w/w)
Schematic phase diagrams for non-ionic detergents in water
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Tête
n=8
180
Chaîne (Å3)
237
micelle
n=12
358
350
n=10
n=12
81
81
296
350
monomère
n=8
m=4
267
237
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Nombre
Rayon d’agrégation
C10-DAO
69
10.48 (0.21%)
C12-DAO
76
1 (0.023%)
b-OG
78
0.01 (0.00029%)
C11-maltoside
74
0.59 (0.029%)
78-149
0.17 (0.0087%)
C13-maltoside
105
0.033 (0.0017%)
C12E8
90-120
0.09 (0.0048%)
C12-maltoside
21 Å
CMC mM
28 Å
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Å
4+25+4
+4
0
2
30 Å 50 Å
Hydrophobic match
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Diagramme de solubilité des protéines
Protéine +
réservoir
Réservoir:
précipitant
Limite de consolution
Favorable conditions:
Close to consolution boundary
(favors micelle-micelle
interactions)
Non-charged detergents
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Limite de consolution
C<8%
C>15%
Photosynthetic complex (purple bacteria)
Coll. C. Jungas (iBEB-CEA, Cadarache)
Precipitant: PEG3350
1- Généralités sur cristallisation et détergents
Limite de consolution
C=10%
Detergent: C12Maltoside with low !- content
Photosynthetic complex (purple bacteria)
Coll. C. Jungas (iBEB-CEA, Cadarache)
Precipitant: PEG3350
2- Paramètres pour criblages initiaux
But: solution de protéine «"active"» et cristallisable
Choix à faire:
Tampon, concentration de protéine, ligand
Detergent: type and concentration
Pour la cristallisation:
Choix du précipitant: type et concentration
Additifs: sel, petites molécules organiques,…
Un compromis entre théorie, retour d’expériences et criblage extensif
2- Paramètres pour criblages initiaux
Détergents utilisés pour des protéines avec hélices TM
N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide
N,N-dimethylundecylamine-N-oxide
nonyl-ß-D-glucopyranoside
octyl-ß-D-glucopyranoside
glucopyranoside mixture
decanoyl-N-methyl glucamide
tridecyl-ß-D-maltoside/Cymal-4 mixture
tridecyl-ß-D-maltoside
dodecyl-ß-D-maltoside
undecyl-ß-D-maltoside
decyl-ß-D-maltoside
octyl-ß-D-maltoside
Foscholine-14
CHAPS (as additive)
methyl-6-O-(N-heptylcarbamoyl)-alpha-D-glucopyranoside
(as additive)
dodecyl nonaoxyethylene ("thesit")
8
1
5
12
1
1
1
1
11
4
4
2
1
1
1
dodecyl octaoxyethylene (as additive)
dodecyl octaoxyethylene
1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
3-laurylamido-N,N'-dimethylpropylamine oxide
("LAPAO")
1
1
1
1
3
www.mpibp-frankfurt.mpg.de/michel/public/memprotstruct.html
2- Paramètres pour criblages initiaux
Précipitants
ammonium sulfate
lithium sulfate
phosphates
citrates
PEG 6000
PEG 4000
PEG 3350
PEG 3000
PEG 2000
PEG 1500
PEG 1450
PEG 1000
PEG 600
PEG 400
PEG 200
triethylene glycol
PEG MME 5000
PEG MME 2000
PEG MME 550
PEG MME 350
Jeffamine 600
2-propanol
2-methyl-2,4-pentanediol
3
2
1
4
2
13
2
1
3
2
1
1
1
1
5
1
1
1
1
2
1
2
3
10
1
1
1
5
1
3
1
1
3
1
1
2
A polytopic, helical type
B ß-stranded, outer membrane of gram negative bacteria and related membrane proteins
C monotopic
D uncertain classification
2- Paramètres pour criblages initiaux
Additifs
heptane-1,2,3-triol
benzamidine
heptyl-ß-D-glucoside
dioxane
ethanol
ethylene glycol
2-propanol
isopropanol
inositol
glycerol
2-methyl-2,4-pentanediol
1,6-hexanediol
dioleylphosphatidylcholine
digalactosyl diacylgycerol
N,N-bis-(3-D-glyconamidopropyl)
deoxycholamide
8
4
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
A polytopic, helical type
B ß-stranded, outer membrane of gram negative bacteria and related membrane proteins
C monotopic
Role of additives: modification of the micelle size or dielectric constant
2- Paramètres pour criblages initiaux
Cristallisation nanogoutte
Sitting drops
Hanging drops 100nL+100nL
Cartesian robot, J. Marquez PSB/EMBL
2- Paramètres pour criblages initiaux
Commercial screens or home-made screens (PEGs)
576 conditions: 70 microL
0.7 mg protein at 10 mg/mL
With a few selected conditions: screening of pH and salts
Screening for additives: organic solvents, detergents, …
2- Paramètres pour criblages initiaux
un compromis entre théorie et criblage extensif
Commercial screens or home-made screens
Commercial: more extensive
Home-made: easier to interpret
A Deniaud, IBS/LPM
AcrB
2- Paramètres pour criblages initiaux
un compromis entre théorie et criblage extensif
18% PEG400
5% PEG8000
A Deniaud, IBS/LPM
36% PEG400
10% PEG8000
2- Paramètres pour criblages initiaux
un compromis entre théorie et criblage extensif
Comment optimiser les chances de réussite?
A Deniaud, IBS/LPM
2- Paramètres pour criblages initiaux
Caractérisation de la solution
Dans la solution de protéine:
Protein-detergent complexes (PDC)
Detergent micelles
Detergent monomers
+ lipids (bound to PDC or more complexes structures with detergent
État de dispersité de la protéine
(pas uniquement monodisperse, Stroebel et al. BBA 2007 vol1768 p1567)
Quantité de détergent lié à la protéine
Lipides liés à la protéine (quantité et nature)
Stabilité de la protéine en solution
Reproductible pour chaque préparation de protéine
2- Paramètres pour criblages initiaux
Caractérisation de la solution
Stabilité conformationnelle
Expérience de protéolyse ménagée
subtilisine
papaine
chymotrip. élastase
trypsine
1/1000 (1/200 à 1/10000)
AcrB
CusA/DDM
Cinétique: 0, 15min,
30 min, 1h, 1H30,
2H, 2H30, 3H
CusA/C12E8
CusA/LDAO
CusA/DDM
+ CuCl2
A Deniaud, IBS/LPM
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Additifs
Organic molecules: adjusting the micelle size
R=21 Å
Aggr. Numb =69
C12DAO (LDAO)
Reaction center R. viridis
Precipitant AmS, additive 3% heptane-triol
Deisenhofer et al. 1985
R=17 Å
Aggr. Numb =34
1% C12DAO
+ 10% heptane-1,2,3-triol
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Stabilisation d’une conformation
Lactose permease (1PV7)
Abramson et al. (2003)
C154G mutant: binds the ligand as well as the native protein but no
transport activity
ADP/ATP carrier (1OKC)
Pebay-Peyroula et al. (2003)
Purification and crystallization in the
presence of an inhibitor
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Augmenter la surface hydrophyle de la protéine:
fragment d’anticorps (Fv or Fab)
Cytochrome C oxydase + Fv (1QLE)
Iwata et al. (1995)
Fab
Fv
KcsA K+ channel + Fab (1K4C)
Zhou et al. (2001)
C. Hunte and H. Michel Curr. Op. Struct. Biol.(2002) 12, 503-508
Phage display strategy with library of antibody Fab fragments
Röthlisberger et al. Febs Lett (2004) 564, 340-348
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Criblage de détergents
glycerol-phosphate transporter from E. coli
J. Lemieux et al. Protein Sci
2003; 12: 2748-2756
4 constructs (with and without Tags, di!erent length in N- and C-ter): choice from
resistance to proteolysis, 3 selected after gel filtration
Identification of 20 lipids necessary for monodispersity: systematic analysis after each
purification step, correlation with crystallization (PE, PG, CDL)
Screening of crystallization conditions: PEG/pH
Final detergent concentration is critical for crystallization (0.2 à 0.3% of DDM)
Final improvement: divalent cations increased crystal contacts
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Criblage de détergents / importance de la pureté du détergent
Na+/H+ antiporter NhaA
E Screpanti et al. JMB (2006) 362, 192-202
a- NhaA purified in the presence of 0.03% !-DDM
b- same xtallization conditions but detergent exchanged to 0.03% "-DDM
during purification
c- same as b addition of 1% !-OG in the reservoir
10 detergents tested during purification
Purity is important: "-DDM has to be lower than 3% to obtain b)
Other example: PSI xtallized in "-DDM: necessitates !-DDM less than 0.1% (Fromme 1998)
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Enlever l’excès de détergent
Immobilizing the protein on a#nity column and exchange detergent during
washing steps
Dialysis (easy when initial detergent has a high cmc)
If not possible:
removal of detergent using biobeads by adding appropriate lipids
the lipid-to-detergent ratio is crucial (2D crystallization)
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Enlever l’excès de détergent
Mitochondrial ADP/ATP carrier from bovine heart
20 g detergent/ g protein (1200:1), Lipids 120:1
Detergent concentration with
14C
detergent, Lipids by phosphate dosage
LAPAO cmc 1.3 mM
First test: 2 hours of incubation
SM2 Bio-beads BioRad 100mg/mg of protein
Holloway (1973) Anal. Biochem.
Small needles obtained with tert-butanol,
isopropanol or MPD
Coll. G Brandolin (BBSI-Grenoble)
3- Amélioration des conditions de cristallisation
Enlever l’excès de détergent
Biobeads treatment
Precipitant: MPD
LAPAO (3-laurylamido-N,N'-dimethylpropylaminoxyde)
C. Dahout-Gonzalez et al. (2003) Acta Cryst. D59, 2353-55
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Cytochrome c oxydase
Importance of the control
of delipidation during
purification
1QLE
1AR1
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Stabilization of proteins: natural environment lipid bilayer
Stabilization of complexes with several sub-units or oligomeric states?
Control of conformational fluctuation?
Lateral pressure?
Applicability to crystallization less restrictive toward endogenous lipids
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Minimal surfaces (Rummel 1998)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Landau and Rosenbusch (1996)
Pebay-Peyroula et al. (1997)
Royant et al. (2001)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Monoolein 60%w/w
Protein solution 40% w/w
mg
Mixing lipids and protein
Dispaching the cubic
phase
mg
Adding precipitants
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Cobalamine transporter BtuB (2GUF)
Nollert Methods (2004)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Idées sur le mécanisme de cristallisation
Cherezov JMB (2006)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Idées sur le mécanisme de cristallisation
E!ect of salt concentration
Crystal growth:
observation under crossed
polarisors
Nollert Febs Lett (2001)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Idées sur le mécanisme de cristallisation
Nollert et al. (2001).
Three steps
1. Insertion of the protein in the cubic phase
2. Destabilization of cubic phase in order to favor protein rearrangements
(shrinking the cubic cell): local 2D patches
3. Interactions in the third dimension within the 2D patches
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
nouveaux lipides
New lipid design working at low temperature
7.9 MAG (2,3-dihydroxypropyl (7Z)-hexadec7enoate)
Cubic phase at 6°C at full hydration
Ca!rey 2004
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
miniaturisation
27 well plate each is loaded
with 1microL precipitant and
50 nL cubic phase
Cherezov (2003)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Autres phases de lipides
Crystallization from Vesicles
Bacteriorhodopsin
Takeda et al. (1998)
4- Les phases de lipides: une nouvelle approche
Autres phases de lipides
Crystallization from bicelles
Bacteriorhodopsin
DMPC/Chapso (3:1) mixture
Faham and Bowie (2002)
Cloning (analog proteins,
domains, mutants,
truncations,…)
Expression (tags, strains,…)
5- Conclusions et perspectives
Gene target
Protein-detergent solution
screening detergents
Ligand
Antibody
lipids
Natural
source
Quality assement and
characterization
Vapor di!usion xtallization
Commercial and/or home-made
screens
Refinement
Di!racting xtals
Phasing
Structure determination
Lipidic cubic
phases
5- Conclusions et perspectives
Beta2-adrenergic receptor
Lipidic cubic phases (monoolein/cholesterol)
Modification of the protein to make more resistant to proteolysis
Cherezov et al. Science (2007)
11 co-auteurs
5- Conclusions et perspectives
Continuité production d’une protéine stable et
fonctionnelle, cristallisation et structure
Stratégie actuelle: mélange entre hasard et rationnel
Futur: augmenter la part du rationnel
Progrès récents montrent l’importance de concepts
nouveaux, ces concepts ont besoin de maturation
Objectifs du GDR: favoriser ces évolutions
Atelier va approfondir certains de ces aspects
Institut de Biologie Structurale
www.ibs.fr
EMBL
ILL
IBS
ESRF
PSB Partnership for Structural Biology
IBS/LPM
Aurélien Deniaud
Céline Juillan-Binard
Iulia Blesneac
A.Dessen
J.Covès/F.Fieschi/L.Serre
R.Kahn, JM.Jault, M.Vivaudou