Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l`enfant

Transcription

DIPLÔME D’ÉTUDES SUPÉRIEURES SPECIALISÉES EN PHARMACIE HOSPITALIÈRE
Session 2001-2003
Travail de diplôme
Optimisation de la nébulisation du
salbutamol chez l’enfant sous ventilation
mécanique
Mise au point d’une méthode de dosage du
salbutamol et sa détermination dans l’urine et
le plasma de volontaires sains
Anne-Laure SIDLER-MOIX
Pharmacienne
Supervision
Pr. André PANNATIER
Pharmacien Chef
Pharmacie du CHUV-LAUSANNE
CHUV
Service de Pharmacie
Lausanne 2004
Vue d’ensemble
1
Historique de l’aérosolthérapie 11
2
Aspect technique des aérosols 15
3
Les aérosols 26
4
La nébulisation chez les patients sous ventilation
mécanique 45
5
La nébulisation chez l'enfant 52
6
Une substance sous la loupe: le salbutamol 70
7
Objectifs du travail 77
8
Matériel et Méthode 85
9
Résultats et discussion 100
10 Conclusion générale 108
11 Bibliographie 110
12 Annexes 119
Table des matières
1
2
2.1 Rappel morphologique des voies respiratoires 15
2.2 Déposition pulmonaire 17
2.2.1 Transit ou inhalation 18
2.2.2 Captation ou déposition 20
2.2.3 Rétention 21
2.2.4 Absorption 21
2.3 Concepts pharmacocinétiques de la voie pulmonaire 22
2.3.1 Administration systémique 22
2.3.2 Administration par aérosol 22
2.3.3 La clairance mucociliaire 24
2.3.4 Résorption systémique 24
2.3.5 Métabolisme intrapulmonaire 24
3
Les aérosols 26
3.1 Définitions: 26
3.2 Les aérosols-doseurs pressurisés 28
3.2.1 Les pulvérisateurs à gaz comprimé 29
3.2.2 Pulvérisateurs à gaz comprimés insolubles 29
3.2.3 Pulvérisateurs à gaz comprimé soluble 31
3.2.4 Pulvérisateurs à gaz liquéfié: 31
3.3 Les inhalateurs de poudre sèche 33
3.4 Les nébuliseurs 35
3.4.1 La nébulisation pneumatique 36
3.4.1.1 Les systèmes de nébulisation traditionnels 38
3.4.1.2 Les systèmes de nébulisation à double venturi 39
3.4.1.3 Les nébuliseurs intermittents ou dosimétriques 39
3.4.2 La nébulisation piézo-électrique ou ultrasonique 40
3.4.2.1 Les appareils avec circuit de nébulisation intégré 41
3.4.2.2 Les appareils avec circuit de nébulisation indépendant
41
3.4.3 Nouvelles technologies 42
3.4.4 Quelques accessoires liés aux nébuliseurs 43
3.4.4.1 Interface nébuliseur-patient 43
3.4.4.2 Filtre expiratoire 43
4
La nébulisation chez les patients sous ventilation
mécanique 45
4.1 Les systèmes de ventilation 45
4.2 Le système de nébulisation 48
4.2.1 Les aérosols-doseurs 49
4.2.2 Les nébuliseurs 49
4.2.3 Nébuliseurs ou aérosol-doseurs ? 50
5
5.1 Les caractéristiques anatomiques et physiologiques de l'appareil
respiratoire de l'enfant 53
5.1.1 Le cycle respiratoire de l'enfant 53
5.1.2 La respiration nasale et les voies aériennes supérieures 54
5.1.3 Les voies aériennes inférieures 54
5.1.4 La déposition pulmonaire d'un aérosol chez l'enfant 55
5.2 Les pathologies respiratoires de l'enfant et leur traitement 56
5.2.1 L'asthme 56
5.2.1.1 Les symptômes de l'asthme chez l'enfant: 59
5.2.1.2 L'asthme aigu 60
5.2.1.3 Le traitement de fond de l'asthme 60
5.2.2 La bronchiolite virale 61
5.2.3 La mucoviscidose 62
5.2.3.1 La rhDNase 63
5.2.3.2 Les antibiotiques 63
5.2.4 L'infection à Pneumocystis carinii (PC) 64
5.2.5 Le bronchospasme postopératoire 64
5.3 Médicaments nébulisés 65
5.3.1 AMM pour la nébulisation pédiatrique 66
5.3.2 Les médicaments nébulisés lors de VM 68
6
6.1 Synthèse du salbutamol 70
6.2 Pharmacologie du salbutamol 71
6.2.1 Mécanisme d’action 73
6.2.2 Pharmacocinétique du salbutamol 74
6.2.2.1 Absorption 74
6.2.2.2 Distribution 74
6.2.2.3 Métabolisme 74
6.2.2.4 Elimination 74
6.2.3 Indications du salbutamol 75
6.2.4 Les effets indésirables 75
7
7.1 Présentation de l’unité des S.I.P du CHUV 77
7.2 Travaux effectués 78
7.2.1 Revue de l’utilisation du salbutamol 78
7.2.1.1 Résultats de l’étude 78
7.2.2 Etude in vitro 78
7.3 Etude actuelle 81
7.3.1 Les méthodes pharmacocinétiques 81
7.3.1.1 Les études plasmatiques: 81
7.3.1.2 Les études urinaires: 82
7.3.2 Buts de l'étude 83
8
8.1 Préambule 85
8.2 Réactifs 85
8.3 Récolte des échantillons 86
8.4 Préparation des échantillons 87
8.4.1 Les principes de l’extraction SPE 88
8.4.2 Procédure d’extraction en phase solide (SPE): 91
8.4.2.1 Colonne Supelclean® C18 91
8.4.2.2 Colonne Oasis® HLB 91
8.4.2.3 Colonne Oasis® MCX: 92
8.4.2.4 Colonnes SPEC® 92
8.4.2.5 Bon-Elut Certify® I HF 92
8.4.2.6 Colonne Bond-Elut® Si: 92
8.4.2.7 Extraction plasmatique 93
8.4.2.8 Extraction urinaire 93
8.5 Méthodes 93
8.5.1 Détection 93
8.5.2 Choix de l’étalon interne 96
8.6 Procédure de validation 97
8.6.1 Linéarité 97
8.6.2 Spécificité-sélectivité 98
8.6.2.1 Influence de la matrice: 98
8.6.2.2 Influence des produits de dégradation: 98
8.6.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement 99
8.6.4 Rendement d’extraction 99
8.6.5 Limite de détection - Limite de quantification 99
8.6.6 Etude de stabilité 99
8.6.6.1 Etude de stabilité du salbutamol dans le plasma: 99
8.6.6.2 Etude de stabilité du salbutamol dans l’urine: 99
9
9.1 Les conditions analytiques 100
9.1.1 Extraction 100
9.1.1.1 Rendement d’extraction 101
9.2 Procédures de validation 101
9.2.1 Linéarité 101
9.2.1.1 Méthode plasmatique 102
9.2.1.2 Méthode urinaire 102
9.2.2 Spécificité-sélectivité 103
9.2.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement 103
9.2.4 Seuils de détection et de quantification 103
9.2.5 Etudes de stabilité 103
9.2.5.1 Stabilité urinaire du salbutamol: 104
9.3 Etude chez les volontaires sains 105
9.4 Conclusion 106
10 Conclusion générale 108
11 Bibliographie 110
12 Annexes 119
Remerciements
Et voilà il est déjà temps d’écrire la ……. première page de ce mémoire !!!
Il est vrai que je ne pensais jamais y arriver, assise seule en face de mon ordinateur.
Seule ? Pas vraiment en fait, car durant ces trois années de formation effectuées au sein
du service de pharmacie du CHUV, je ne me suis rarement retrouvée seule.
Je voudrais tout d’abord remercier les quatre personnes les plus impliquées dans cette
étude :
M. le Professeur André Pannatier, pharmacien chef du service de pharmacie, qui jusqu’il y
a peu corrigeait encore ce mémoire. Je le remercie pour l’aide qu’il m’a apportée et la
confiance qu’il m’a témoignée.
Le Dr. Jacques Cotting, médecin responsable des Soins Intensifs de Pédiatrie, pour son
optimisme, la passion qu’il met dans son travail et qu’il sait si bien transmettre.
Le Dr. Markoulina Berger, pharmacienne responsable du laboratoire de contrôle de
qualité de la pharmacie du CHUV, dont l’encadrement a été riche tout autant d’un point
de vue scientifique qu’humain. Son immense disponibilité, sa gentillesse et son goût pour
le travail bien fait m’ont permis d’apprendre beaucoup durant ces trois ans et j’espère
encore pouvoir en profiter dans les années à venir.
Le Dr. Ermindo Di Paolo, pharmacien responsable de l’assistance pharmaceutique
pédiatrique du CHUV qui, il y a trois ans, m’a confié son « bébé » et n’a eu de cesse
depuis de m’aider à le faire grandir.
Mais ce travail de mémoire représente bien plus qu’une étroite collaboration entre cinq
personnes. Et je voudrais profiter de l’occasion qui m’est donnée pour remercier tous
mes collègues du CHUV qui de près ou de loin m’ont permis de progresser dans le
monde de la pharmacie hospitalière.
Plus spécialement je salue Florence, Marie-Christine, Charles, Stéphane, Nicolas,
Bertrand, Valia, Stéphanie, Brigitte, pour leur amitié et leurs rires et tout ce que nous
avons déjà partagé ensemble.
Que dire de Greg ou plutôt que lui dire …… et bien il sait déjà ce que je pense de son
insupportable caractère, mais une fois n’est pas coutume, je lui dirai simplement merci
pour toutes ces soirées passées au CHUV où il n’avait pas grand chose à faire si ce n’est
me soutenir dans mes interminables séances d’extractions.
Ce travail a dépassé les frontières du grand bâtiment gris puisque même en Valais le
salbutamol n’a plus de secret pour les êtres qui me sont chers.
Je remercie mes parents de m’avoir toujours soutenu dans tous mes périples, d’avoir été là
pour partager mes joies et d’avoir toujours su trouver les mots justes quand le moral était
au plus bas.
Et puis à mes frères et sœur, je voudrais lancer un grand cri : c’est presque la dernière fois
que je vous fais subir mon stress et ma mauvaise humeur et que je vous empêche de
goûter au somptueux repas de Nouvel An, promis! Mais surtout merci pour l’exemple
que vous me donnez.
Je finirai de remplir cette page de merci en écrivant le plus gros pour Fredo, celui qui
partage mon quotidien et qui ne cesse de l’embellir. Son amour et son humour m’ont
profondément touché durant ces douze dernières années, mais encore plus, je crois,
durant ces derniers mois.
Résumé
Optimisation de nébulisation du salbutamol chez l’enfant: Mise au point d’une
méthode de dosage du salbutamol et sa détermination dans l’urine et le plasma de
volontaires sains – Anne-Laure SIDLER-MOIX
La voie inhalée est la voie de délivrance privilégiée des traitements à visée respiratoire en
raison de la haute concentration du médicament obtenue au site actif et du faible passage
systémique permettant de limiter les effets secondaires. Le succès d’un traitement inhalé
dépend de l’efficacité du système de délivrance et de son mode d’administration.
L’optimisation d’un traitement inhalé passe donc par la connaissance parfaite des
techniques d’inhalation.
La nébulisation fait partie des différents systèmes permettant d’amener un médicament au
poumon. Si les aérosols-doseurs pressurisés et les inhalateurs de poudre sèche ont
l’avantage d’être plus pratiques, moins onéreux et tout autant efficaces, la nébulisation ne
nécessite pas une coordination main-poumon. Elle peut être donc être facilement utilisée
chez les jeunes enfants et les personnes âgées. De plus une gamme réduite de
médicaments, essentiellement les bronchodilatateurs et les corticoïdes, se retrouvent sous
forme d’aérosols-doseurs pressurisés ou d’inhalateurs de poudre sèches.
Aux Soins Intensifs de Pédiatrie, les jeunes patients se trouvant sous ventilation
mécanique, reçoivent dans plus de 50% des cas des bronchodilatateurs. Si le dépôt
pulmonaire résultant de la nébulisation, est de l’ordre de 10% chez une personne
respirant spontanément, celui-ci tombe à moins de 5% chez les patients ventilés. Les
modalités de la nébulisation sous ventilation mécanique sont peu détaillées dans la
littérature et les pratiques hétérogènes. Il apparaît donc utile d’étudier les paramètres
physico-chimiques d’une telle administration, ainsi que d’évaluer la délivrance pulmonaire
d’aérosols de salbutamol. Ceci a été réalisé au moyen d’un modèle in vitro de ventilation
mécanique pédiatrique selon trois modes d’administration différents. Les résultats
obtenus contredisant les recommandations internationales, nous avons décidé de les
confirmer in vivo, chez l’enfant sous ventilation mécanique.
L’étude se déroule en deux temps : tout d’abord la délivrance pulmonaire du salbutamol
est évaluée chez des volontaires sains adultes, ceci afin de justifier l’investigation chez de
jeunes patients. Le protocole d’étude a été accepté par la Commission d’Ethique de la
Falcuté de Médecine de Lausanne. Dans un deuxième temps, et pour autant que les
résultats obtenus confirment l’étude in vitro, une investigation sera faite chez le jeune
patient. En effet, la déposition pulmonaire d’un adulte ne souffrant pas de maladie
respiratoire ne peut être extrapolée à un enfant malade.
L’objectif de ce travail de mémoire est donc tout d’abord de se familiariser avec les
techniques de nébulisation et de développer une méthode analytique permettant de doser
le salbutamol dans les liquides biologiques (plasma et urine). Deux méthodes de dosage
ont été validées, une au niveau plasmatique et l'autre au niveau urinaire. Les deux
méthodes ont été testées chez 5 volontaires sains. Les résultats obtenus ont montré que la
méthode urinaire était suffisamment sensible pour cette application. La méthode
plasmatique nécessite encore une amélioration dans sa phase d’extraction dans le but
d'atteindre un seuil de détection plus bas, reflétant mieux les concentrations rencontrées
dans le sang suite à la nébulisation.
Chapitre 1
1
Historique de l’aérosolthérapie
Pour administrer une thérapeutique à visée pulmonaire, la
voie la plus simple et la plus naturelle est la voie inhalée.
La pénétration pulmonaire nécessite la génération de
particules suffisamment fines pour rester en suspension dans
l’air: ce sont les aérosols. Le nom aérosol a été donné, en
1932, par Whytlaw Gray et Patterson à partir de aer (air) et
de sol (solution). Avant l’adoption de ce mot, de nombreux
termes furent utilisés pour désigner une suspension de
gouttelettes dans un gaz formées par condensation ou par
dispersion: brouillard, microbrouillard ou brume.
Pedanus Dioscorides, au 1er siècle après J.-C., ère de la
pharmacie, prescrivait des fumigations de soufre, alors que
Galien (v. 131-v. 201) recommandait à ses malades d’aller
respirer sur les pentes du Vésuve les fumérolles chargées de
vapeurs sulfureuses. Pendant des millénaires la pipe sera
utilisée pour inhaler des substances à visée hallucinogène.
Les Indiens fumaient dans leur pipe les feuilles et les racines
de Datura ferox pour soigner l’asthme.
En France, des cigarettes médicinales ont été utilisées pour
combattre l’asthme. L’Officine dans son édition de 1844, en
présente trois variétés: les cigarettes arsenicales de Boudin ou
de Trousseau, celles de Raspail au camphre (toux) et les
cigarettes mercurielles de Bernard contre les ulcérations
spécifiques du nez et de la gorge. Trousseau, célèbre
médecin français (1801-1867) proposait aussi des cigarettes
antiasthmatiques dont la composition était complexe: feuilles
de belladone, de jusquiame, de stramoine, ainsi que de
l’extrait gommeux d’opium, sans oublier de l’eau distillée de
laurier-cerise !
11
Chapitre 1
Il existait également des poudres ayant la même composition. Il fallait former à l’aide
d’une cuillère à café de poudre un tas bien pointu, en allumer le sommet, inspirer
normalement la fumée et l’expirer de préférence par le nez.
Au milieu du XIVe siècle, dans les stations thermales, pour répondre à la mode des
inhalations d’eau, se développa la technologie de la pulvérisation. On utilisa des appareils
à air comprimé, qui produisaient un fin brouillard, pour les malades pulmonaires.
Malheureusement on ajouta à ces eaux minérales des substances telles que la térébenthine
et le pétrole, produits dangereux pour le poumon (pneumopathies interstitielles). De ce
fait, de nombreux médecins mirent en doute l’efficacité de ces thérapeutiques. La
nébulisation retomba dans l’oubli.
Cependant, à la fin du XIXe siècle, l’explosion de la tuberculose, comme d’ailleurs celle
du SIDA un siècle plus tard, remettra à la mode les inhalations antiseptiques. Devant le
peu d’efficacité de ces thérapeutiques, la nébulisation quitta l’arsenal médical à nouveau.
La découverte de l’adrénaline et de l’éphédrine redonnera une seconde jeunesse aux
aérosols. En 1912, l’adrénaline sera utilisée pour la première fois dans les crises d’asthme.
Ces inhalations furent administrées le plus souvent par de petits appareils de type «
vaporisateurs à parfum ». La pression nécessaire à la vaporisation était obtenue à l’aide
d’une poire en caoutchouc. Ces appareils pulvérisent une faible quantité de produit dont
la taille des particules vaporisées est inadéquate pour atteindre l’arbre bronchique et les
alvéoles. Celles-ci sont en effet trop grosses et impactent dans les voies aériennes
supérieures. L’adrénaline ou l’éphédrine sont absorbées et passent par la voie sanguine
avec tous les effets secondaires qui en découlent: tachycardie, hypertension, etc.,
cependant leurs effets bénéfiques sur l’œdème de Quincke en font un traitement de choix
utilisé par les allergologues et les urgentistes.
Si à cette époque le corps médical ignorait l’influence de la taille des particules sur la
bonne pénétration pulmonaire, des études sur ce phénomène furent entreprises par des
chimistes qui travaillaient sur les aérosols toxiques utilisés comme gaz de combat et des
hygiénistes qui étudiaient le rôle des microbrouillards comme transporteurs de microbes.
Le problème crucial de la pénétration des particules jusqu’au fond des alvéoles n’était pas
encore résolu dans le monde médical; les préparatifs puis la guerre de 39-45 ont permis
de faire avancer les connaissances sur les aérosols par les travaux sur les gaz de combat.
En France le pneumologue Robert Tiffeneau étudie les effets broncho-pulmonaires
d’aérosols d’acétylcholine chez des asthmatiques et met au point les tests de provocation
bronchique en utilisant d’abord l’air résiduel (volume résiduel) pour apprécier le
bronchospasme induit par l’acétylcholine, puis en 1947 il développe le test de la CPUE
(Capacité Pulmonaire Utilisable à l’Effort), appelée maintenant le VEMS (Volume
Expiratoire Maximum en 1 seconde). Il définit également la DLAC, la Dose Liminaire
d’Acétylcholine qui fait chuter le VEMS de 20%.
Chapitre 1
Aux Etats-Unis les nébuliseurs ultrasoniques font leur apparition en 1949 en tant
qu’humidificateurs, mais rapidement les médecins ajouteront des substances
médicamenteuses pour produire des aérosols thérapeutiques.
En 1956 apparaît un nouveau type de dispositif permettant de délivrer un aérosol: les
aérosol-doseurs. Ces appareils, petits, peu onéreux et faciles théoriquement à mettre en
œuvre, ont conquis le monde médical en faisant tomber en désuétude, sauf chez les ORL,
les nébuliseurs bruyants et peu efficaces de l’époque.
En 1958, l’anglais B.M. Wright développe un nouveau nébuliseur pneumatique, avant
d’inventer un an plus tard son célèbre Peak-Flow Meter permettant de mesurer le Débit
Expiratoire de Pointe (DEP) pour le suivi des patients asthmatiques.
Dans les années 1960 et au début des années 70, on constate un net recul de la
nébulisation au profit des aérosol-doseurs. Les connaissances sur les dépôts trachéobronchiques et pulmonaires s’enrichissent grâce aux traceurs radioactifs, d’abord au
moyen d’or 198 et d’indium 111 fixés sur l’hydroxyde de fer, puis avec de l’albumine
marquée au technétium radioactif TC99m ou en mélangeant uniformément la solution
avec des radionucléotides dans le nébuliseur [1].
En 1975 Rosenthal et French inventent la méthode dosimétrique: nébulisation déclenchée
par l’inspiration [1]. A la même époque, Hargreave développe la méthode dite « de
nébulisation continue » de bronchoconstricteurs à l’aide du nébuliseur de Wright. Ces
deux méthodes donnent des résultats comparables mais la méthode dosimétrique est plus
rapide et plus simple [2].
Dans les années 80 le traitement des pneumonies à Pneumocystis carinii associées au
SIDA ainsi que celui de la mucoviscidose donnent un nouvel élan à la. nébulisation. Il en
résulte une amélioration de l’appareillage et de nouveaux médicaments nébulisables telles
que la nébulisation de pentamidine dans les pneumocystoses que la trithérapie anti-HIV a
fait quasiment disparaître et la nébulisation de pénicilline dans les infections à
Pseudomonas aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose [3]. La gentamicine,
la colistine et la tobramycine sont actuellement largement utilisées, ce qui diminue le
nombre de cures intraveineuses d’antibiotiques [4].
Dans les années 80 encore, la technologie de la nébulisation s’améliore [5], en particulier
pour la nébulisation à domicile. De petits appareils ultrasoniques connaissent un grand
succès grâce à leur simplicité et à leur facilité d’utilisation.
En 1994, toujours dans le cadre de la mucoviscidose, la rhDNase [6] commence à être
nébulisée dans un but mucolytique.
Une autre maladie bénéficie de l’aérosolthérapie: l’asthme. En 1972, l’Australien Galf
nébulise avec succès du cromoglycate chez des patients asthmatiques, et en 1992, la
nébulisation de corticoïdes améliore de façon notable la prise en charge des jeunes
asthmatiques. 50 ans auparavant, l’hydrocortisone avait été utilisée, mais présentant un
faible tropisme pulmonaire, elle agit surtout par le biais d’une absorption systémique,
Chapitre 1
alors que la béclométhasone et la suspension de budénoside agissent directement sur le
poumon. Dans le cas de l’asthme aigu grave, Salmeron a mis en évidence en 1994 que
l’adrénaline nébulisée est plus efficace qu’administrée en perfusion [7]. La voie inhalée est
largement acceptée comme étant la façon optimale d’administrer des médicaments tels les
corticoïdes ou les β2-agonistes pour le traitement des patients souffrant d’obstruction des
voies aériennes.
La voie inhalée est une voie millénaire puisque des fumigations étaient pratiquées déjà du
temps d'Hippocrate. A l’exception de pathologies telles que l'asthme où une action
localisée est recherchée, cette voie fut longtemps négligée. Elle revient aujourd'hui en
force, non pas pour une action locale pulmonaire ou bronchique mais pour une action
systémique.
Au cours de ces dernières années la recherche a fait des progrès importants dans le
domaine de la délivrance des médicaments. Il y a une raison à cela: les médicaments
modernes, qui contiennent des substances actives composées de peptides ou de protéines,
ne peuvent pas être administrés sous forme de comprimés ou de capsules, au risque d’être
dégradés dans l’estomac. La voie pulmonaire présente un certain nombre d'avantages qui
ne sont pas négligeables. Tout d'abord, elle représente un accès facile à la circulation
sanguine. En effet, au niveau des bronches ou des alvéoles pulmonaires, les membranes
physiologiques à traverser pour atteindre le sang sont très fines. De plus, elle permet
d'administrer des molécules trop sensibles à l'acidité ou aux enzymes protéolytiques pour
être absorbée par voie orale. Avec l'avènement des biotechnologies, un bon nombre de
médicaments auront ces caractéristiques, tels certaines hormones et en particulier
l'insuline [8], [9] ou encore certains antalgiques majeurs [10]. Enfin, elle est facile
d'utilisation, moins contraignante que l'injection sous-cutanée qui est actuellement une
des seules alternatives pour les molécules fragiles. Cet avantage est d'autant plus
important si le patient doit recevoir une injection quotidienne. La voie inhalée est donc
une alternative à la voie sous-cutanée avec l'inconvénient d'être peut-être moins
accessible, notamment si les patients souffrent d'une affection pulmonaire, bronchique ou
oto-rhino-laryngologique.
Ainsi des thérapies à visée systémique se sont développées ces dernières années, tels
l’insuline, l’hormone de croissance, la LH-RH, la calcitonine et l’héparine [11]. De même
que la nébulisation d’adénovirus et de liposomes, dans la thérapie génique des patients
atteints de mucoviscidose, semblent être une voie d’avenir intéressante [12].
Chapitre 2
2
Aspect technique des aérosols
Les muqueuses des voies aériennes permettent d’administrer
de relativement petites doses de médicament pour produire
des concentrations locales importantes et minimiser dans un
même temps l’absorption dans la circulation systémique.
Ces voies peuvent être subdivisées en:
♦ Voies aériennes supérieures pour lesquelles on
distingue différents niveaux tels que les fosses nasales
et les sinus, la bouche (organe commun aux voies
digestives et respiratoires), le pharynx (rhino-pharynx,
bucco-pharynx et organes lymphoïdes) et le larynx.
♦ Voie pulmonaire qui comporte la trachée, les
bronches et les alvéoles pulmonaires.
Nous allons nous intéresser plus spécifiquement à la voie
pulmonaire comme voie d’administration des médicaments.
2.1 Rappel morphologique
des voies respiratoires
L’appareil respiratoire comprend le nez, la trachée, les
bronches et les poumons. Les parois de la trachée et des
bronches présentent des anneaux cartilagineux qui
maintiennent l’ouverture béante. Les deux bronches
supérieures se ramifient en de nombreuses bronches et
bronchioles. Ces dernières sont caractérisées par un
épithélium dépourvus de cils et les cellules externes
deviennent cubiques. Les lobules pulmonaires (cf Figure 1)
sont des petits sacs polyédriques de 1 cm3 environ, tassés les
uns sur les autres. La bronchiole qui arrive dans un lobule
15
Chapitre 2
pulmonaire se divise en ramifications s’ouvrant dans des cavités dont chacune porte le
nom d’acinus. Il y a une trentaine de ces cavités par lobule. Chaque acinus se prolonge
par trois à cinq chambres ramifiées partant du même point. Les logettes ultimes de
chacune de ces chambres sont les alvéoles pulmonaires. Elles ne mesurent que 0,2 à 0,3
mm. C’est à travers ces alvéoles que se font les échanges gazeux et l’absorption de
médicaments. Leur paroi est très mince, avec quelques fines fibres élastiques et des
cellules épithéliales aplaties où un réseau de capillaires très fin permet le passage des
globules rouges. Les poumons constituent la partie essentielle de l’appareil respiratoire.
Chaque poumon est recouvert d’une séreuse, la plèvre, formant un sac à deux feuillets;
l’un, viscéral, adhére au poumon, l’autre, pariétal, est adjacent à la paroi thoracique et au
diaphragme.
Figure 1
Subdivisions et structure des voies intrapulmonaires
La muqueuse de l’appareil respiratoire est formée d’une couche conjonctive et d’un
épithélium à cellules cylindriques ciliées avec des cellules à mucus dont les sécrétions
s’ajoutent à celles de nombreuses glandes en grappes.
Le mucus est un gel visco-élastique de pH variant entre 5,5 et 6,5. Il constitue une couche
rendue continue par le mouvement ciliaire. La couche de mucus est composée de deux
phases, une phase supérieure de viscosité relativement élevée et une phase inférieure de
très faible viscosité, où baignent les cils vibratiles. L’épaisseur de la couche de mucus se
situe entre 0.5 et 2 mm. Les extrémités des cils vibratiles parviennent au niveau de la
couche externe et entraînent ainsi cette dernière d’avant en arrière.
La fonction mucociliaire dépend de la dynamique des cils et de la composition chimique
des fluides recouvrant l’épithélium, donc à la fois de la nature du mucus et, lors d’une
inhalation, de la préparation médicamenteuse administrée. La fonction ciliaire (cf Figure
2) peut en effet être influencée par la nature chimique du principe actif et des excipients
Chapitre 2
et les propriétés physiques de la forme galénique (par exemple viscosité). Les cils
vibratiles assurant le déplacement du tapis muqueux ont un mouvement biphasique: le cil
se dresse, permettant ainsi à sa pointe de pénétrer la couche visqueuse, puis il se plie et se
déplace dans la couche fluide pour reprendre sa place initiale.
Figure 2
Représentation du mouvement ciliaire
L’onde de propagation du mouvement de l’ensemble des cils se développe de façon
métachrone: le mouvement ciliaire d’ensemble provient du décalage de phase existant
entre cils voisins. Chaque cil est légèrement en avance sur celui qui le suit et en retard sur
celui qui le précède, créant ainsi un mouvement ondulatoire.
La phase supérieure visqueuse du mucus à laquelle adhèrent les particules étrangères est
mise en mouvement. L’intégrité de cette phase est une condition du bon fonctionnement
ciliaire. Le temps de clairance mucociliaire est très variable d’un individu à l’autre, mais
dépend de nombreux facteurs. On admet qu’une particule à la surface du tapis muqueux
se déplace, chez 80% des individus, à une vitesse variant de 1 à 25 mm/min., 20% ayant
une clairance lente inférieure à 1-2 mm/min.
2.2 Déposition pulmonaire
Le médicament inhalé doit passer par un ensemble de « tuyaux » dont le diamètre est de
plus en plus petit, avec un débit d’air qui diminue en proportion. Cette réduction
progressive du débit d’air complique la préparation d’une forme médicamenteuse
possédant les caractéristiques optimales de déposition (cf Tableau 1). Ceci sera développé
par la suite.
Tableau 1
Facteurs affectant la déposition de particules dans l’appareil respiratoire
Caractéristiques des particules
Diamètre, densité, forme, charge, solubilité,
hygroscopicité
Caractéristiques des aérosols
Vitesse, distribution de la taille des particules,
évaporation du gaz propulseur
Chapitre 2
Caractéristique du tractus respiratoire
Humidité, anatomie (géométrie), jouant un rôle pour
la reproductibilité, états pathologiques
Caractéristique de la respiration
Volume d’air inspiré, vitesse de l’air inspiré,
respiration par le nez ou par la bouche
Après dispensation de l’aérosol par le dispositif approprié, le devenir des particules
dépend du mode d’administration, du transport du principe actif vers son site d’action, de
la dose administrée et du temps d’exposition, souvent très court.
Il est courant de distinguer 4 étapes dans ce long trajet:
♦ Transit ou inhalation
♦ Captation ou déposition
♦ Rétention et clairance
♦ Absorption
2.2.1 Transit ou inhalation
La pénétration des aérosols dans les voies respiratoires hautes et basses dépend en
premier lieu de la taille des particules (cf Figure 3). Seules les particules inférieures à 1,2
μm franchissent les canalisations des bronches sans s’y fixer, alors que seules celles dont
le diamètre est inférieur à 0,2 μm parviendront vraiment à l’alvéole.
Figure 3
Transit en fonction de la taille des particules
Ce transit dépend aussi du mode de respiration et de la vitesse du courant gazeux. En
sachant que le volume d’air inspiré et expiré est d’environ 500 ml avec une respiration
normale de 12 à 15 cycles par minute, le rythme moyen de respiration est donc de 22 à 25
Chapitre 2
litres/minutes. Une augmentation de cette vitesse d’air inspiré peut amener dans les
alvéoles des particules qui n’y seraient pas parvenues normalement. Au contraire, un
ralentissement du rythme augmente le temps de séjour et la rétention des aérosols.
La nature de l’écoulement à travers le tractus respiratoire peut être soit laminaire, soit
turbulent (cf Figure 4). Selon la loi de Poiseuille, si les dimensions du conduit restent
constantes, la vitesse du fluide devient directement proportionnelle à la pression et
inversement proportionnelle à la viscosité. L’écoulement est dit laminaire.
Loi de Poiseuille:
V r 4 ⋅ P ⋅π
=
t
8 ⋅η ⋅ l
t = temps (sec.) nécessaire au volume V (ml) d’un fluide de viscositéη, pour circuler à
travers un tube d’une longueur l (cm), de rayon r (cm), sous une pression P (dyn×cm-2).
Quand un fluide est forcé fortement à travers un tube ou au contact d’un obstacle,
l’écoulement laminaire devient turbulent, ce qui signifie que le liquide tourbillonne dans le
conduit et que la direction du mouvement moléculaire est en continuel changement.
L’écoulement d’un fluide est fonction du nombre de Reynolds (Re):
Re = ⋅
d ⋅v⋅ ρ
η
où d = diamètre du tube (en cm), v = vitesse du fluide (en cm x s-1), r = densité (en g ⋅
cm-3) et η = viscosité (en cm2 ⋅ s-1).
Quand le nombre de Reynolds dépasse 2000, le flux est considéré comme turbulent.
Figure 4
Représentation schématique d’un écoulement laminaire et turbulent
L’humidité de l’air dans la profondeur des poumons intervient également dans le
processus de transit. Selon leur nature, les particules pourront absorber de l’eau, l’air
Chapitre 2
expiré étant saturé d’eau (34 g/m3), à 37°C). Il en résulte une augmentation de la taille des
particules. La température joue un rôle non négligeable. Le poumon est en principe plus
chaud que l’aérosol. Ce dernier point est particulièrement important. En effet, l’aérosol
inhalé à une température inférieure à celle du corps devra être réchauffé et humidifié par
l’organisme, ce qui risque d’augmenter la taille de ses particules. Au contraire, si l’aérosol
est inhalé à une température supérieure à celle du corps, il devra être refroidi et l’eau qu’il
contient se condensera sur les bords de l’épithélium.
2.2.2 Captation ou déposition
La captation ou déposition constitue la seconde étape: les particules de l’aérosol sont
fixées par l’épithélium broncho-alvéolaire. Les études expérimentales sur la dynamique
des fluides dans les voies aériennes ont montré que le dépôt des particules était fonction
de l’étage trachéo-bronchique. Dans les voies aériennes supérieures, ainsi que dans la
trachée et jusqu’aux bronches principales, les grosses particules se déposent par impaction
du fait des turbulences. Au-delà, les particules se déposent par sédimentation et par
diffusion jusqu’aux alvéoles:
♦ Impaction par inertie. Ceci concerne les particules de 0.5 à 50 μm qui sont
sensibles au changement de direction. La probabilité d’impaction par inertie croît
avec le diamètre des particules, la vitesse de l’air, le rayon de courbure et la
diminution du diamètre bronchique.
♦ Sédimentation par gravité. Elle s’effectue surtout dans les dernières divisions de
l’arbre bronchique. Son rôle est prédominant quand le débit s’annule entre
inspiration et expiration. La sédimentation est inversement proportionnelle à la
vitesse du fluide aérien et proportionnelle à la masse des particules.
♦ Diffusion (mouvement brownien) (cf Figure 5). Ce phénomène se déroule
spécialement dans les bronchioles terminales et concerne les particules très fines
(0.002 à 0.5 μm). Toutes les particules ayant une densité plus élevée que l’air
subissent une force due à la gravité.
Chapitre 2
Figure 5
Représentation schématique des différents mécanismes de déposition
2.2.3 Rétention
La rétention caractérise le temps plus ou moins long où les particules sont retenues à leur
lieu de déposition. Elle dépend de la vitesse de dissolution et de diffusion à travers la
couche de mucus et du mécanisme d’épuration pulmonaire par l’ascenseur mucociliaire.
Celui-ci est le mécanisme d’épuration probablement le plus important après l’action des
macrophages alvéolaires.
2.2.4 Absorption
La quatrième et dernière phase est celle de l’absorption (ou résorption) de la fraction de
principe actif inhalée qui est absorbée par les muqueuses du tractus respiratoire. Cette
absorption, mise en évidence par des mesures de taux plasmatiques ou urinaires, est donc
réelle. Le taux d’absorption spécifique à chaque segment, du nez et de la bouche aux
alvéoles, est difficile à évaluer. Si l’absorption bronchique spécifique est difficile à mettre
en évidence, l’absorption alvéolaire est significative. Elle peut être indésirable si les effets
systémiques ne sont pas recherchés ou souhaités pour certains principes actifs. En effet,
l’alvéole est un site d’absorption privilégié grâce à la grande surface représentée par ces
très nombreux petits sacs polyédriques (300×106) et à leur réseau capillaire très dense.
L’administration sous forme d’aérosol permet une concentration locale supérieure à celle
obtenue par la voie orale. Pour les bronchodilatateurs par exemple, la dose efficace par
aérosol se situe dans un rapport de 1/200 en comparaison de la voie orale [13]. Il s’agit de
substances dont le dosage est de l’ordre du centigramme ou du milligramme, car il n’est
pas possible de pulvériser une quantité de médicament suffisante pour des principes actifs
fortement dosés. C’est donc là une des limites au recours de l’aérosolthérapie.
Chapitre 2
De ce fait on trouve des substances administrées en aérosols pour leur action systémique
et d’autres destinées à un traitement local.
L’aérosol suit donc, depuis son administration, un long chemin, tortueux et fortement
diversifié du début (nez, bouche) à l’extrémité inférieure (alvéole).
La pénétration et le dépôt des aérosols dans les voies aériennes dépendent de trois
facteurs: les caractéristiques aérodynamiques de l’aérosol, la géométrie des voies aériennes
et les conditions d’inhalation. Ces notions ont d’abord été établies sur des modèles
pulmonaires artificiels ou chez des sujets sains. Elles ne sont pas toujours transposables
en pathologie, comme le montrent des études cliniques réalisées ces dernières années. En
1981, Itoh a montré l’implication des anomalies de la fonction respiratoire sur la diffusion
des aérosols [14]. Chez les patients atteints de BPCO, la déposition périphérique d’un
aérosol de colloïde marqué au technétium est d’autant plus réduite que l’obstruction
bronchique est importante. D’autres études ont porté sur des aérosols médicamenteux,
dans différentes pathologies, et notamment la mucoviscidose
2.3 Concepts pharmacocinétiques de la voie
pulmonaire
2.3.1 Administration systémique
Le sort d’un médicament est habituellement décrit en trois phases successives:
l’absorption, la distribution et l’élimination. L’absorption décrit le passage du site
d’administration (muscle, tube digestif, etc.) à la circulation sanguine. A l’exception de la
voie intraveineuse, le passage du médicament dans le sang n’est pas toujours total et l’on
désigne par biodisponibilité le pourcentage de médicament administré qui atteint le
sérum. La distribution du médicament vers les tissus se réalise généralement par voie
sanguine. Elle dépend, en quantité et en vitesse, des caractéristiques physico-chimiques
des molécules administrées et des propriétés des tissus eux-mêmes, notamment de leur
perfusion sanguine. L’élimination se fait en règle générale à partir du sang, les deux
principaux émonctoires étant le rein et le foie. Dans ce dernier cas, la disparition du
médicament peut résulter soit de son élimination au sens propre par sécrétion biliaire puis
par élimination digestive, soit d'une métabolisation. Certains médicaments sont également
métabolisés dans le sérum ou en périphérie dans certains tissus. L'élimination d'un
médicament est décrite par sa demi-vie d'élimination, exprimée en heures ou minutes et
par la clairance, exprimée en ml/min.
2.3.2 Administration par aérosol
Dans le cas de l'administration d'un aérosol, la situation est très différente en raison de la
différence de trajet du médicament dans l'organisme (cf Figure 6).
Chapitre 2
Figure 6
Trajet d’un médicament à visée pulmonaire en cas d’administration systémique (A) ou par
nébulisation (B)
En effet, le site d'activité thérapeutique se situe alors en amont d'une éventuelle
résorption systémique. Cette particularité entraîne plusieurs conséquences:
♦ la résorption systémique n'est pas une condition sine qua non à l'efficacité
thérapeutique. La notion de biodisponibilité ne peut s'appliquer, tout du moins
dans son sens classique. Au contraire, dans certains cas, la résorption sanguine du
produit n'est responsable que des effets indésirables du médicament;
♦ la notion de dose elle-même diffère de celle utilisable pour d'autres modes
d'administration en raison du rendement de la nébulisation et de la variabilité de la
topographie de dépôt du médicament. On distingue la dose nébulisée, la dose
inhalée, la dose déposée et la dose résorbée;
♦ afin de déterminer l'efficacité clinique d’un médicament, on considère deux
paramètres pharmacologiques que sont la concentration initiale au site d'activité et
sle temps de présence. La clairance corporelle totale du médicament inhalé doit
être distinguée de sa disparition du poumon ou clairance pulmonaire, qui peut
résulter de trois voies (cf Figure 7), la clairance mucociliaire, la résorption
systémique ou le métabolisme local.
Chapitre 2
2.3.3 La clairance mucociliaire
Elle s’applique aux médicaments en solution ou en suspension dans le tapis de mucosité
que l'appareil ciliaire fait remonter vers le carrefour aérodigestif. Le médicament est alors
éliminé dans le tube digestif et se comporte pharmacologiquement comme lors d'une
administration orale. A ce titre, les médicaments peuvent être absorbés par les muqueuses
et ainsi augmenter la partie résorbée systémique.
La cinétique d'élimination par clairance mucociliaire dépend du site de dépôt initial. Les
études portant sur des particules marquées par des isotopes radioactifs montrent que si la
demi-vie de passage de l'oropharynx vers le tube digestif n'est que de 10 minutes, elle est
de 100 minutes pour le transfert des bronches à l'oropharynx et de 8 heures des
bronchioles aux bronches. Au-delà des bronchioles, en l'absence de cellules ciliées, les
transferts des alvéoles vers les bronchioles se chiffrent en dizaines, voire centaines, de
jours [15].
2.3.4 Résorption systémique
Les médicaments déposés peuvent quitter la lumière aérienne pour être résorbés
directement par le riche réseau de capillaires alvéolaires. La paroi alvéolaire repose sur un
réseau très dense de capillaires. La barrière séparant l’air du sang varie entre 0.3 et 0.7
mm, ce qui est nettement inférieur à celle de la paroi intestinale (» 40 mm). Les
médicaments peuvent aussi transiter par l'interstitium pulmonaire pour rejoindre
secondairement la voie sanguine par voie lymphatique.
2.3.5 Métabolisme intrapulmonaire
Si la voie pulmonaire évite l’effet de premier passage hépatique, elle n’est pas pour autant
dépourvue d’action enzymatique susceptible d’engendrer un « pseudo-effet » de premier
passage. Ces enzymes jouent souvent le rôle de « barrière défensive » contre l’entrée de
xénobiotiques qui pourraient pénétrer dans l'organisme lors de la ventilation. Ils sont
capables de métaboliser le principe actif avant son arrivée dans le torrent circulatoire,
donc avant l’absorption proprement dite. Parmi ces différentes « usines enzymatiques »,
on compte le cytochrome P450 et aussi d’autres enzymes tels la glycuronyl-tranférase, la
sulfo-transférase, la N-acétyl-transférase et la mono-amine-oxydases [15]. Néanmoins, le
rôle de ces voies métaboliques sur l'élimination des médicaments administrés par
inhalation reste mineur. Pour diminuer ou éviter l’action de ces enzymes, en particulier
lors d’administration de molécules peptidiques ou protéiniques, on peut protéger la
substance active par une forme galénique appropriée (liposomes, nanoencapsulation, etc.)
ou ajouter à la préparation des inhibiteurs enzymatiques. Il est évident que ces substances
doivent être bien tolérées et dépourvues d’activités pharmacologiques propres.
Chapitre 2
Figure 7
Elimination pulmonaire et corporelle totale d’un médicament inhalé
Chapitre 3
3
Les aérosols
Le terme aérosol fait l’objet de définitions variées, puisque
l’on donne à ce mot une double signification, en désignant
soit un système physique, soit le dispositif permettant de
l’obtenir.
3.1 Définitions:
Ci-dessus sont présentées
dictionnaires classiques:
quelques
définitions
des
♦ Petit Robert:
“AEROSOL [aeRɔsɔl]. n.m. (1948; de sol 4). Système
réalisant la dispersion, en particules très fines, d’un liquide ou
d’une solution dans un gaz. Les aérosols sont employés
comme véhicules de certains agents médicamenteux
(aérosol-thérapie).”
♦ Grand dictionnaire des lettres (Larousse):
“aérosol [aeRɔsɔl] n.m. (du préf. Aéro-et sol, solution;1950,
Larousse). Dispersion, en particules très fines, d’un liquide
ou d’une solution dans un gaz (air ou oxygène): Les aérosols
constituent un mode d’administration de certains
médicaments (pénicilline, atropine, etc.).”
♦ Dictionnaire historique de la langue française:
“Aérosol n.m. (1928),
8), où sol, emprunté à la langue anglaise,
représente solution, désigne la suspension de particules dans
26
Chapitre 3
Les aérosols 27
un gaz, par métonymie, le système qui projette cette suspension.”
D’un point de vue galénique, l’aérosol est un système dispersé, dont la phase externe est
un gaz (ou un mélange de gaz) et la phase interne ou dispersée peut être solide ou liquide
[16].
♦ Pharmacopée:
La Pharmacopée Européenne (4ème édition, addendum 2000) n’utilise pas le terme
d’aérosol mais celui de préparations pharmaceutiques pressurisées (en latin Praeparationes
pharmaceuticae in vasis cum pressu) pour désigner à la fois le contenant et le contenu:
« Les préparations pharmaceutiques pressurisées sont des préparations conditionnées
dans des récipients spéciaux, sous la pression d’un gaz. Elles contiennent un ou plusieurs
principes actifs. Elles sont libérées du récipient à l’aide d’une valve appropriée, sous
forme d’un aérosol (dispersion de particules solides ou liquides dans un gaz, la taille des
particules étant adaptée à l’usage prévu) ou d’un jet liquide ou semi-solide, par exemple
une mousse. La pression nécessaire pur assurer la projection de la préparation est
produite par des gaz propulseurs appropriés.
Les préparations pharmaceutiques pressurisées se présentent sous forme de solution,
d’émulsion ou de suspension. Elles sont destinées soit à l’application locale sur la peau ou
les muqueuses des divers orifices corporels soit à l’inhalation. »
La Pharmacopée réserve une définition spéciale pour les préparations pour inhalation ou
Inhalanda:
« Les préparations pour inhalation sont des préparations liquides ou solides destinées à
être administrées dans les poumons sous forme de vapeurs ou d’aérosols, en vue d’une
action locale ou systémique. Elles contiennent un ou plusieurs principes actifs qui
peuvent être dissous ou dispersés dans un excipent approprié.
Les préparations pour inhalation peuvent, suivant leur type, contenir des gaz propulseurs,
des co-solvants, des diluants, des conservateurs antimicrobiens, des solubilisants, des
stabilisants, etc. Ces excipients n’exercent aucun effet notable sur les fonctions de la
muqueuse de tractus respiratoire et de ses cils. »
Les aérosols médicamenteux sont utilisés pour différentes voies d’application,
principalement les voies respiratoires supérieure et inférieure, mais aussi la peau ou
l’orifice buccal.
Dans ce travail de mémoire, nous nous intéresserons principalement aux aérosols
amenant un principe médicamenteux au niveau des voies respiratoires, prévus pour une
application ou une absorption pulmonaire, donc plu précisément aux Inhalanda.
Chapitre 3
Les aérosols 28
Trois types de systèmes d’administration sont documentés dans la Pharmacopée, deux
liquides et un solide:
♦ Les aérosols-doseurs pressurisés
♦ Les inhalateurs à poudre sèche
♦ Les nébuliseurs
3.2 Les aérosols-doseurs pressurisés
Ils sont aussi appelés inhalateurs pressurisés à valve doseuse et, en anglais, Metered-Dose
Inhalers abrégé MDIs. Ce sont des préparations délivrées dans des récipients spéciaux
sous la pression d’un gaz (cf Figure 8). Ce gaz comprimé ou liquéfié fonctionne comme
un piston, exerçant sur le contenu une pression supérieure à la pression atmosphérique et
permettant son expulsion par une valve. On réalise ainsi une dispersion plus ou moins
grossière de particules médicamenteuses dans un mélange de gaz propulseur et d’air
atmosphérique. La préparation, contenant un ou plusieurs principes actifs, se présente
sous forme d’une solution, d’une émulsion ou d’une suspension.
Figure 8
Aérosol-doseur pressurisé
Les pulvérisateurs sont de deux types (cf Figure 9):
Chapitre 3
Les aérosols 29
♦ à gaz comprimé (gaz insoluble: azote, argon ou soluble: CO2, N2O)
♦ à gaz liquéfié (butane ou hydrocarbures fluorés)
Figure 9
Schéma d’un pulvérisateur à gaz comprimé (gauche) et d’un pulvérisateur à gaz liquéfié (droite)
3.2.1 Les pulvérisateurs à gaz comprimé
La dispersion du liquide en fines gouttelettes dans l’air atmosphérique est uniquement
assurée, dans le cas du gaz comprimé, par son passage sous pression à travers l’orifice
supérieur du gicleur. Il s’agit donc d’une dispersion mécanique. La pression est due au gaz
comprimé. Elle s’exerce à la surface du liquide et se transmet au sein du liquide jusqu’à
l’orifice du gicleur.
3.2.2 Pulvérisateurs à gaz comprimés insolubles
Ils forment avec la phase liquide un système biphasique. Un tel système est caractérisé
par:
♦ Un récipient étanche contenant:
♦ une phase liquide à disperser qui est soit un principe actif liquide, soit un
principe actif en solution, en émulsion ou en suspension
♦ une phase gazeuse: le gaz propulseur
Chapitre 3
Les aérosols 30
♦ Une valve assurant le bouchage et comprenant le dispositif de pulvérisation. La
valve comporte:
♦ Un tube plongeur amenant le liquide vers un gicleur dont l’orifice débouche
sur l’extérieur.
♦ Un clapet ou soupape qui permet ou non, selon sa position, la
communication entre le tube plongeur et le gicleur.
♦ Un ressort qui assure la fermeture du clapet en période de non-utilisation.
♦ Un bouton-poussoir qui, actionné par l’utilisateur, permet l’ouverture du
clapet.
Les valves doseuses caractérisent pratiquement toutes les préparations destinées au
traitement des affections respiratoires avec administration d’une dose précise de principe
actif (cf Figure 10). A chaque pression sur la tête de la valve, il se dégage une quantité
déterminée, fixée à l’avance et constante de produit. Pour cela, il existe une chambre
intermédiaire entre l’intérieur du flacon et l’air ambiant. Cette mini-chambre est donc en
relation soit avec l’intérieur, soit avec l’extérieur du flacon, mais jamais avec les deux.
Figure 10
Principe d’émission avec valve doseuse
Chapitre 3
Les aérosols 31
Ces gaz, qui sont inertes vis-à-vis du principe actif et très bon marché, se situent audessus du produit actif, assurant la pression nécessaire à l’expulsion et à la vaporisation.
3.2.3 Pulvérisateurs à gaz comprimé soluble
Ces aérosols ont les mêmes caractéristiques que les pulvérisateurs à gaz comprimé
insoluble, à la différence qu’une réserve de gaz est dissoute dans la phase liquide, ce qui
permet un taux de remplissage plus élevé qu’avec les gaz insolubles, soit environ 80% de
la capacité du récipient.
Les pulvérisateurs à gaz comprimé ont l’avantage d’avoir une pression variant très peu en
fonction de la température. Les risques d’explosion sont faibles lorsque l’appareil est placé
dans un endroit à température assez élevée. Malheureusement la dispersion, uniquement
mécanique, est moins efficace. L’obtention d’une pression importante nécessite la
présence d’un volume de gaz important, environ 50% du volume total du récipient. En
effet la pression à l’intérieur du récipient diminue au cours de l’utilisation, lorsque le
volume occupé par le gaz augmente (PV = constante).
3.2.4 Pulvérisateurs à gaz liquéfié:
Dans ce cas, la phase liquide est constituée par un mélange de principe actif et de gaz
liquéfié: le principe actif peut être en solution, en suspension ou en émulsion dans le gaz
liquéfié. La phase gazeuse est formée par la vapeur du gaz liquéfié. L’action de ce type de
gaz est double. La dispersion ici n’est pas uniquement mécanique. La pression gazeuse y
joue un rôle mais n’est pas seule à intervenir. En effet, en plus de leur rôle de propulseur,
les gaz éiquéfiés participent au processus d’aérosolisation, c’est-à-dire à l’obtention de très
fines gouttelettes. Cette aérosolisation est obtenue par l’effet physique d’évaporation. Le
gicleur propulse un mélange de principe actif et de gaz liquéfié. Ce dernier se trouve
brutalement à la pression atmosphérique et passe instantanément de l’état liquide à l’état
de vapeur en dispersant le principe actif auquel il se trouvait mêlé.
Les pulvérisateurs à gaz liquéfié ont un mécanisme de dispersion plus efficace avec un
volume occupé par la phase gazeuse plus faible (environ 25%), ce qui assure une pression
constante pendant toute la durée de l’utilisation du fait qu’il y a vaporisation de gaz
liquéfié au fur et à mesure que le volume disponible pour la phase gazeuse augmente. Par
contre il faut noter une importante modification de la tension de vapeur, soit de la
pression, avec les changements de température. Les pulvérisateurs à gaz liquéfié ne
doivent jamais être stockés à une température supérieure à 50°C, car il y a risque
d’explosion. De plus ces gaz, dont le coût est élevé, ne sont pas inertes et ne sont donc
pas compatibles avec tous les principes actifs ou autres substances à disperser.
Il est à noter que les premiers gaz liquéfiés utilisés étaient des hydrocarbures fluorés ou
chlorofluorés, contestés en raison de leur action perturbante sur la couche d’ozone. Le
protocole de Montréal de 1987 a stipulé l’arrêt de leur utilisation pour l’an 2000. Les CFC
ont été substitués par des hydrocarbures hydrofluorés, ou HFC, non toxiques. Depuis
1998, la société Glaxo-Wellcome a commercialisé en Suisse le Ventolin® (salbutamol) et
Chapitre 3
Les aérosols 32
l’Axotide® (fluticasone) sans CFC. A ce jour neuf aérosols-doseurs pressurisés
commercialisés en Suisse (Axotide® (0.05 mg), Becloforte®, Becotide®, Bricanyl®,
Dospir®, Ecovent®, Foradil®, Pulmicort® et Serevent®) contiennent toujours du CFC.
Si les aérosols-doseurs pressurisés sont très pratiques pour les traitements ambulatoires,
en raison de leur petite taille, de leur prix de revient faible, de leur emballage multidoses,
d’une bonne stabilité à l’oxydation, à la lumière et à l’humidité et de la possibilité d’une
administration rapide sans besoin de maintenance. Leurs principaux inconvénients sont
un dépôt dans l’oropharynx important (80%), responsable d’un accroissement des effets
secondaires locaux (par exemple: dysphonie, candidoses bucco-pharyngées avec les
corticoïdes inhalés) et la nécessité d’une bonne coordination main-poumons qui est
difficilement réalisable surtout chez les enfants avant 7-8 ans et les personnes âgées [17],
[18].
Cet inconvénient majeur a conduit aux développements suivants:
♦ Des dispositifs à déclenchement automatique pendant l’inspiration. Cette
innovation est coûteuse et reste orpheline puisqu’une seule spécialité est disponible
sur le marché: Maxair® Autohaler de Synthélabo véhiculant le pirbutérol, un β2stimulant peu utilisé, de plus elle exige un effort inspiratoire important.
♦ La chambre d’inhalation (cf Figure 11): il s’agit d’un réservoir de 130 à 750ml en
plastique ou en métal (non électrostatique). Le flacon d’aérosol est fixé en
communication à une des extrémités de cette chambre et le patient respire par un
orifice situé à l’autre extrémité à travers une valve unidirectionnelle inspiratoire ou
des valves bidirectionnelles inspiratoire et expiratoire [19]. Des chambres
d’inhalation dotées d’un masque facial conçues pour le nourrisson sont
disponibles.
Ces chambres ont l’avantage d’augmenter la distance entre la sortie de l’aérosoldoseur et la bouche. Ceci conduit à une diminution de la taille des particules et
donc à une meilleure pénétration pulmonaire, ainsi qu’à une diminution de la
sensation de froid (« cold freon effect ») qui peut produire, dans certains cas, une
toux réflexe. De plus les grosses particules sont impactées dans la chambre, ce qui
diminue le dépôt oropharyngien. Elles sont également une aide à l’inhalation lors
de problèmes de coordination main-poumons. L’inconvénient majeur des
chambres en plastique est leur charge en électricité statique, qui provoque
l’adsorption des particules d’aérosol sur leurs parois. Pour y remédier, on peut
appliquer un détergent ou une peinture antistatiques, saturer les sites d’adsorption
en actionnant plusieurs fois l’aérosol-doseur ou, le plus simplement, tremper la
chambre dans de l’eau contenant du liquide à vaisselle et de la laisser sécher telle
quelle à l’air sans la frotter avec un chiffon. L’appareillage reste somme toute assez
encombrant [19].
Chapitre 3
Les aérosols 33
Figure 11
Chambre d’inhalation en métal
Différentes études ont montré que les MDIs additionnés d’une chambre d’inhalation
étaient aussi performants que les nébuliseurs pour administrer des médicaments au niveau
pulmonaire et ceci même chez des enfants âgés de 2 ans et moins [20], [21], [22], [23]
3.3 Les inhalateurs de poudre sèche
Ils sont également appelés en anglais Dry Powder Inhalers ou DPIs. Le principe actif se
trouve sous forme de poudre micronisée et conditionnée dans des gélules, des blisters ou
dans un réservoir de poudre et est généralement additionné de diluants inertes (par
exemple le lactose) [24]. Les doses de poudre pharmacologiquement actives sont
généralement petites, variant de 50 mg à environ 20 mg [24]. Le passage des particules
dans le tractus respiratoire se fait par inhalation d’une dose de poudre lors de l’inspiration
par le patient. La dispersion pulvérulente n’est donc pas propulsée par le dispositif,
comme c’est le cas avec les récipients pressurisés.
Il faut différencier:
♦ Les inhalateurs de poudre sèche unidoses
♦ Les inhalateurs de poudre sèche à doses unitaires multiples
♦ Les inhalateurs de poudre sèche multidoses
Ces trois types d’inhalateurs sont représentés à la Figure 12.
Dans les deux premiers systèmes, après ouverture de la gélule ou du blister par des
pointes qui les perforent, une désagrégation mécanique est obtenue par passage à travers
les pales d’une hélice d’un ventilateur mis en marche par une inspiration rapide de la part
Chapitre 3
Les aérosols 34
du malade. L’appareil doit être rechargé chaque fois, ce qui constitue un inconvénient non
négligeable d’un point de vue pratique et de l’observance.
Les inhalateurs de poudre sèche multidoses sont plus simples d’emploi. Ils ont un
réservoir de poudre qui permet, grâce à un système particulier de délivrer par simple
rotation une dose fixe de principe actif. Elle est alors inhalée par le patient après
inspiration d’air qui, en traversant le dispositif, entraîne la poudre. Les inhalateurs de
poudre sèche multidoses sont les plus agréables pour les patients, mais ils n’atteignent pas
la précision des systèmes unidoses.
Quel que soit le système, il prépare et délivre l’aérosol en même temps que le patient
inhale, ce qui évite le problème de coordination main-poumon. Il faut cependant relever
que, en dépit d’une micronisation poussée des poudres, la dose unitaire d’un principe actif
ainsi administré est habituellement au moins le double de celle nécessaire dans une
préparation pharmaceutique pressurisée. De plus Ranade [24] relève que pour atteindre
les poumons les particules de principes médicamenteux doivent se situer de préférence
entre 2 et 3 μm. Cette taille est atteinte par micronisation de la poudre, mais ce processus
peut provoquer des agglomérats de poudre, en changeant certaines propriétés de la
poudre, l’adhésion et la cohésion par exemple. Ce problème ne se pose pas avec les MDIs
ou les nébuliseurs, le principe actif étant en suspension dans un véhicule liquide.
Ces dispositifs sont somme toute écologiques, puisqu’ils n’utilisent pas de gaz
propulseurs, très pratiques du point de vue de leur petite taille pour le traitement
ambulatoire et parce qu’ils ne demandent pas de coordination main-poumons. Toutefois
ils demandent une inhalation rapide et un flux de 60 L/min pour une administration
correcte du médicament; leur coût est relativement élevé et la poudre inhalée peut
provoquer des bronchospasmes.
Des études in vivo [25], [26] ont été réalisées en pratiquant des inhalations de molécules
radiomarquées, détectées par scintigraphie gamma. Elles ont montré ainsi clairement la
distribution du produit radiomarqué dans la bouche, la gorge, les poumons et l’estomac et
permettent sa quantification. Les résultats obtenus montrent que seul 10 à 15% de la dose
inhalée à l’aide d’un MDI est déposée dans les poumons. Les résultats sont plus variables
avec les DPIs, allant de 10 à 30% Avec les systèmes DPIs le dépôt pulmonaire est plus
dépendant du design de l’appareil et de sa construction.
Chapitre 3
Les aérosols 35
Figure 12
Les différents types d’inhalateurs de poudre sèche
3.4 Les nébuliseurs
L'appareil de nébulisation comporte un réservoir dans lequel est introduit le liquide à
nébuliser, une chambre de nébulisation, lieu de production de l'aérosol, d’un raccord
permettant l’aspiration (pièce en T seule, avec masque facial ou embout buccal) et une
source d'énergie - pneumatique ou piézo-électrique - utilisée pour créer l'aérosol.
Les appareils de nébulisation sont soumis aux exigences de la directive européenne
relative aux dispositifs médicaux au sein de laquelle ils sont rattachés à la classe IIa.
L'appareil de nébulisation se distingue de l'aérosol-doseur et se caractérise par les
propriétés suivantes:
♦ il peut délivrer une quantité importante d'aérosol;
♦ il ne nécessite généralement pas de coordination main-inspiration;
♦ il peut nébuliser tout médicament liquide choisi par le prescripteur.
Ces trois caractéristiques distinguent avantageusement, dans certaines circonstances, les
appareils de nébulisation des aérosol-doseurs pressurisés et des inhalateurs de poudre
sèche [27].
Deux principes de nébulisation sont utilisés pour produire un aérosol médicamenteux
[28]. La nébulisation pneumatique et la nébulisation piézo-électrique ou ultrasonique.
Chapitre 3
Les aérosols 36
3.4.1 La nébulisation pneumatique
Chronologiquement, c'est le premier mode de production d'un aérosol et le plus répandu.
Il utilise une source de gaz comprimé, air ou oxygène, qui est connectée au nébuliseur par
un fin gicleur. En pratique, la source de gaz comprimé est généralement un compresseur
d'air. Ce peut être aussi une bouteille d'oxygène ou une installation centrale hospitalière de
gaz comprimé.
Les nébuliseurs pneumatiques fonctionnent selon le principe de Bernoulli (1700-1782):
Lorsqu’un fluide circule à grande vitesse dans un tube, sa pression est basse, alors qu’à
faible vitesse, elle est élevée. D’où l’équation:
P + ½ rv2 + rgh = constante
où P = pression dans le tube, r = masse volumique du fluide, v = vitesse du fluide, g =
accélération gravitationnelle et h = hauteur au-dessus d’une valeur de référence.
Cette équation suppose que l’écoulement est régulier et laminaire et que la viscosité est
négligeable.
Pratiquement, le jet d'air traverse le nébuliseur par un venturi (endroit où le gaz
propulseur rentre en contact avec la préparation pour inhalation) et aspire le liquide à
travers un fin conduit capillaire. Le liquide est expulsé à vitesse élevée sous forme d'un jet
composé de petites gouttelettes, c'est la génération primaire. Ce jet de gouttelettes est
ensuite brisé sur un déflecteur et une fraction de gouttelettes très fines est constituée et
forme l'aérosol, c'est la génération secondaire. L'aérosol produit est directement acheminé
à l'extérieur du nébuliseur par le courant d'air provenant de la source de gaz comprimé (cf
Figure 13).
Chapitre 3
Les aérosols 37
Figure 13
Principe de nébulisation d'un générateur pneumatique
Dans ce processus, une part importante du jet est recyclée en continu sous forme de
grosses gouttelettes qui retombent au fond de la cuve. La détente de l'air comprimé dans
le nébuliseur et l'évaporation liée au recyclage continu du liquide provoquent une baisse
importante de la température (entre 9 et 12°C)[29].
Une concentration du principe actif peut également se produire dans le nébuliseur au
cours de la nébulisation en raison du phénomène d'évaporation [30], [31]. Ceci s’explique
de la manière suivante: le gaz propulseur utilisé (air comprimé ou oxygène) est
pratiquement anhydre. Durant la nébulisation, il est saturé par la vapeur d’eau provenant
de la solution pour aérosol. Suite à cette évaporation d’eau, la solution restant dans le
nébuliseur se concentre. Plus le volume de la solution de départ est réduit, plus le
phénomène de concentration est rapide. Il est donc important de nébuliser la totalité du
contenu du nébuliseur. Une étude réalisée au CHUV à mis en évidence ces deux
phénomènes en comparant différents nébuliseurs [29]; nous y reviendrons plus tard. Une
fraction du volume de liquide placé dans le nébuliseur reste piégée dans le système de
nébulisation sous forme de gouttes fixées dans les gicleurs, sur les parois de la cuve et de
la chambre de nébulisation et dans les raccords, tuyaux, embouts du circuit de délivrance.
Cette fraction est appelée le volume résiduel. Il est important d'en connaître la valeur
pour introduire dans le nébuliseur un volume au moins égal à la somme: volume résiduel
+ volume que l'on souhaite nébuliser.
La pression d'alimentation en air comprimé du nébuliseur varie selon les appareils de 0.4
bar à 3.5 bar (pression des gaz muraux utilisés en milieu hospitalier). Pour un nébuliseur
Chapitre 3
Les aérosols 38
donné, l'augmentation de la pression d'alimentation diminue la taille des gouttelettes et
ainsi la granulométrie de l'aérosol. C'est un moyen simple de produire un aérosol
composé de petites particules. Les nébuliseurs peu élaborés nécessitent une pression
élevée pour produire un aérosol respirable (< 2 μm). En revanche, les nébuliseurs de
conception élaborée produisent un aérosol respirable composé de très fines particules
avec une faible pression. Les avantages d’une faible pression de fonctionnement sont un
refroidissement moindre de l'aérosol par détente de l'air comprimé, donc un meilleur
confort, une meilleure protection des molécules fragiles, et une grande fiabilité des
compresseurs.
Parmi les appareils de nébulisation pneumatique, on distingue trois types principaux (cf
Tableau 2):
Tableau 2
Principaux types de nébuliseurs
Les nébuliseurs:
-pneumatiques (cf Figure 15):
traditionnels
à double venturi
intermittents ou dosimétriques
-ultrasoniques
- nouvelles technologies
Les différents nébuliseurs pneumatiques et leur délivrance médicamenteuse durant le
cycle respiratoire sont illustrés à la Figure 15.
3.4.1.1 Les systèmes de nébulisation traditionnels
Les systèmes de nébulisation pneumatique standard utilisent un nébuliseur dont le débit
d'aérosol est fixe et identique au débit de la source d'air comprimé, par exemple 6 L/min.
Si le patient inspire à un débit plus élevé (10 L/min), l'air supplémentaire nécessaire (4
L/min) sera de l'air de dilution pénétrant dans le circuit par un orifice placé sur le chemin
de sortie de l'aérosol. La quantité de liquide délivrée sous forme d'aérosol sera
relativement limitée, souvent à une valeur comprise entre 0.1 et 0.2 ml de solution par
minute, et sera identique en phase inspiratoire et en phase expiratoire. Le médicament est
donc rejeté vers l’extérieur en phase expiratoire, d'où un gaspillage du médicament.
Les inconvénients de ce type de nébuliseurs sont une durée de nébulisation longue,
entièrement fixée par le débit de la source d'air comprimé, et un gaspillage important de
l'aérosol en phase d'expiration.
Exemples: Microneb® (Europe Medical), Cirrus® (Intersurgical), où le gaz est introduit
par le bas et Upmist® (Hospitak), par le haut.
Chapitre 3
Les aérosols 39
3.4.1.2 Les systèmes de nébulisation à double venturi
Les systèmes de nébulisation pneumatique de conception élaborée utilisent un nébuliseur
à double venturi.
Dans ce cas, le débit inspiratoire du patient, lorsqu'il est supérieur à celui du compresseur,
active un deuxième venturi constitué par un orifice d'appel d'air placé à l'entrée du
nébuliseur et par un circuit qui achemine cet air additionnel au niveau des gicleurs où se
produit la génération primaire de l'aérosol. Ce débit liquide est d'autant plus élevé que le
débit inspiratoire est important et peut atteindre la valeur de 0.4 ml/min.
En revanche, pendant la phase expiratoire, ce double venturi sera inactivé par arrêt de
l'appel d'air supplémentaire et la quantité de médicament gaspillée sera limitée à la valeur
minimale liée au débit du compresseur.
Les nébuliseurs à double venturi présentent ainsi le double avantage d’une nébulisation
accrue durant l’inspiration, et d’une réduction des pertes de médicament pendant
l'expiration [32]. Exemples: Sidestream® et Ventstream (Medic-Aid), Pari LC® Plus
(Pari).
Il sont toutefois déconseillés aux enfants de moins de 3 ans, ceux-ci ayant un débit
inspiratoire trop faible, de l’ordre de 100 ml/min.
3.4.1.3 Les nébuliseurs intermittents ou dosimétriques
Les nébuliseurs pneumatiques dosimétriques permettent de délivrer l’aérosol uniquement
pendant la phase inspiratoire. Outre la nébulisation en seule phase inspiratoire, le système
peut délivrer à chaque inspiration des bouffées calibrées, indépendantes du débit
inspiratoire du patient. L'objectif est de délivrer une quantité d'aérosol parfaitement
connue par séance. Le temps de nébulisation en est allongé, mais là encore on évite une
perte du principe actif.
Ces appareils sophistiqués et onéreux sont conçus pour l'administration de médicaments
à visée systémique et de produits coûteux pour lesquels la dose effectivement inhalée doit
être contrôlée très précisément. Exemples: Pari LL® (Pari) (cf Figure 14)
Figure 14
Le nébuliseur Pari LL
Chapitre 3
Les aérosols 40
Figure 15
Les nébuliseurs pneumatiques et leur délivrance médicamenteuse durant le cycle respiratoire.
A. Traditionnel; B. A double Venturi (breath-enhanced); C. Intermittent ou dosimétrique
3.4.2 La nébulisation piézo-électrique ou ultrasonique
Un élément piézo-électrique communément appelé quartz génère une vibration à haute
fréquence (entre 1.2 et 2.4 MHz selon les appareils). Cette vibration transmise au liquide
(solution médicamenteuse) crée une colonne en surface appelée fontaine de cavitation
d'où vont se détacher les particules formant l'aérosol.
Ce mode de production d'un aérosol se caractérise par des débits généralement élevés
(jusqu'à 1 ml/min).
La vitesse de production des particules est modulable sur de nombreux appareils en
fonction de l'intensité de la vibration qui est transmise au liquide, permettant d'adapter la
délivrance de l'aérosol au patient. Ainsi, pour des nourrissons et des jeunes enfants, on
privilégiera des débits moins élevés que pour des adultes.
Les particules ainsi générées sont alors stockées dans la chambre de nébulisation. Ces
dernières sont véhiculées vers le patient de deux manières:
Chapitre 3
Les aérosols 41
♦ soit au moyen de l'air mobilisé par le patient: un système de valves intégrées au
circuit de nébulisation permet une délivrance des particules uniquement en phase
inspiratoire du patient;
♦ soit par une ventilation intégrée à l'appareil qui autorise une délivrance en continu
de l'aérosol.
On distingue généralement deux types d’appareils ultrasoniques: les appareils avec circuit
de nébulisation intégré et ceux avec circuit indépendant.
3.4.2.1 Les appareils avec circuit de nébulisation intégré
La nébulisation de la solution médicamenteuse se fait directement au contact du quartz.
De conception assez ancienne, ces appareils présentent deux inconvénients majeurs:
♦ l'élévation de température que produit le quartz peut dégrader certaines molécules
fragiles;
♦ Ces appareils sont très difficiles à désinfecter et. les éléments du circuit de
délivrance ne sont pas démontables. Ils ne peuvent donc être utilisés par plusieurs
patients.
Exemples: Nebutur® (Tur), Atomisor Megahertz (Atomisor)
3.4.2.2 Les appareils avec circuit de nébulisation indépendant
La nébulisation de la solution médicamenteuse se produit dans un circuit séparé du quartz
(cf Figure 16). Dans cette architecture, tous les éléments en contact avec la solution
médicamenteuse sont à usage patient unique. Une interface d'eau est présente entre le
quartz et le circuit de nébulisation. De ce fait, la solution médicamenteuse n'étant pas en
contact avec le quartz, il ne se produit aucune élévation de température au cours de la
séance [33]. De plus, l'utilisation de l'appareil par plusieurs patients ne pose pas de
problèmes, dans la mesure où un circuit de délivrance neuf est attribué à chaque nouveau
patient.
L’engouement pur les nébuliseurs ultrasoniques a été important au début de leur
commercialisation. Par la suite, on a constaté que les gouttelettes d’aérosols produites
étaient relativement grossières et que les suspensions ne pouvaient être nébulisées (par
exemples Pulmicort®). Du fait de ces deux inconvénients majeurs, les nébuliseurs
ultrasoniques sont moins utilisés de nos jours [29].
Chapitre 3
Les aérosols 42
Figure 16
Nébulisateur ultrasonique
3.4.3 Nouvelles technologies
De nouveaux types de nébuliseurs ont été développés comme le eFlow® de Pari (cf
Figure 17), l ‘Aeroneb® d’Aerogen ou le Respimat Soft Mist® de Boehringer Ingelheim.
Figure 17
Nébuliseur eFlow®de Pari
Le nébuliseur eFlow® permet l’inhalation de nombreux médicaments liquides à l’aide
d’une membrane vibrante actionnée par un système électronique. L’Aeroneb fonctionne
selon un principe similaire.
Le Respimat® est un nébuliseur multi-doses qui génère un aérosol durant 1.2 secondes,
soit environ six fois plus longtemps qu’un aérosol-doseur pressurisé conventionnel.
Chapitre 3
Les aérosols 43
Ces nouveaux dispositifs semblent prometteurs et nous verrons ces prochaines années
s’ils remplaceront les dispositifs actuellement utilisés.
3.4.4 Quelques accessoires liés aux nébuliseurs
3.4.4.1 Interface nébuliseur-patient
L'interface entre l'appareil et le patient peut être de différents types: masque, embout
buccal, embout nasal, embout narinaire, raccord trachéal, tuyau ouvert.
♦ Le masque bucco-nasal est destiné aux patients ayant des difficultés à n'inspirer
que par la bouche ou que par le nez (nourrisson, personne âgée) et au traitement
des laryngites chez l'enfant.
♦ L'embout buccal est préféré pour tous les traitements broncho-pulmonaires et de
la laryngite de l'adulte, car il évite le dépôt d'aérosol dans les fosses nasales et
favorise la pénétration trachéo-bronchique et pulmonaire.
♦ L'embout nasal est utilisé pour tous les traitements naso-sinusiens, car il optimise
le dépôt d'aérosol dans les fosses nasales.
♦ L'embout narinaire se distingue de l'embout nasal par le fait qu'il s'applique sur les
narines sans pénétrer dans le nez. Il réalise ainsi une étanchéité au niveau des
narines.
3.4.4.2 Filtre expiratoire
Lorsque le médicament nébulisé peut être toxique pour l'entourage du patient (cas de la
pentamidine par exemple), on utilise un circuit double auquel on ajoute un filtre à très
haut pouvoir de rétention sur le circuit expiratoire du nébuliseur (cf Figure 18). Le patient
doit alors expirer dans le nébuliseur et l'aérosol non fixé dans l’organisme est piégé dans
le filtre [34]. Selon les recommandations de la SUVA (site internet http://www.suva.ch),
lors de nébulisation d’iséthionate de pentamidine, le nébuliseur doit être muni d’un filtre
expiratoire, l’embout buccal anatomiquement bien conformé, avec un interrupteur de
pause ou déclenchement automatique lors du retrait de l’embout buccal. Un exemple de
ces filtres inspiratoires est le Respirgard® II de Marquest Medical (cf Figure 18).
Chapitre 3
Figure 18
Filtre Respirgard II
Les aérosols 44
Chapitre 4
4
La nébulisation chez les patients
sous ventilation mécanique
4.1 Les systèmes de
ventilation
La ventilation mécanique (VM) ou artificielle a pris une place
de plus en plus importante dans le traitement des patients en
défaillance
respiratoire
(hypoventilation
alvéolaire,
hypoxémie). Les ventilateurs sont raccordés aux voies
aériennes au moyen d’un tube endotrachéal par le nez ou par
la bouche ou, plus rarement, d’une canule de trachéotomie.
En plus de leur rôle de branchement aux ventilateurs, ces
tubes permettent l’aspiration des sécrétions à l’aide d’une
sonde.
Il existe plusieurs types de ventilateurs:
♦ Les ventilateurs à volume constant (volumétriques):
ils délivrent au patient un volume de gaz préréglé,
avec l’avantage d’être constant en dépit des
modifications des propriétés mécaniques des
poumons, assurant une bonne ventilation des
poumons.
♦ Les ventilateurs à pression constante (barométriques):
Ils délivrent le gaz à une pression préréglée, avec un
système de valve coupant l’apport de gaz lorsque la
pression est atteinte. Le pic de pression ne pouvant
dépasser la pression maximale réglée, ils diminuent les
risques de barotraumatismes. Ces ventilateurs sont
couramment utilisés en néonatologie.
45
Chapitre 4
La nébulisation chez les patients sous ventilation mécanique 46
Les ventilateurs modernes (Exemples: Galileo®) (cf Figure 19) peuvent combiner les
deux modes de fonctionnement.
Figure 19
Le ventilateur Galileo®
♦ Les ventilateurs-caissons: une pression négative est appliquée à l’extérieur du
thorax et du reste du corps (à l’exception de la tête). Ils étaient employés
couramment autrefois lors de poliomyélite bulbaire et le sont encore
occasionnellement dans le cas de maladies neuro-musculaires.
Dans la nébulisation de médicaments chez le patient ventilé mécaniquement, Il faut
signaler quelques aspects contraignant supplémentaires par rapport à la nébulisation
classique.
♦ le circuit de ventilation et le tube endotrachéal sont susceptibles d'influencer le
dépôt pulmonaire du médicament. Mais inversement, sous réserve d'une bonne
adaptation du patient à son ventilateur, la possibilité de contrôler chaque aspect de
la ventilation (fréquence, volume courant, débit d'insufflation, rapport I/E) peut
permettre d'optimiser les conditions de nébulisation. Cela suppose bien sûr que des
données soit disponibles et permettent de définir précisément quelles sont ces
conditions optimales;
♦ une faible fraction des études cliniques réalisées en matière de nébulisation
concerne des patients sous VM. La plupart de ces études se sont intéressées à la
nébulisation de bronchodilatateurs. Seule la nébulisation de β2-agonistes ou
d'anticholinergiques en cas de bronchospasme montre une utilité «probable». En
effet, chez les patients sous ventilation mécanique, les traitements par aérosol sont
importants, permettant le soulagement des bronchospasmes avant que l’arrêt de la
ventilation mécanique ne soit possible [35]. Différentes études [36] ont démontré
l’efficacité de l’utilisation des bronchodilatateurs chez ces patients. En effet, la
résistance aérienne, le peak pressure et l’auto-PEEP (persistance en fin d’expirium
d’une pression alvéolaire supérieur à zéro) diminuent lors d’une thérapie efficace
Chapitre 4
avec ces substances. Les autres indications à la nébulisation en VM ne reposent
que sur des opinions d'experts [37] (cf Tableau 3).
Tableau 3
Niveaux de preuve justifiant la nébulisation de médicaments chez les patients en ventilation mécanique D'après O'Doherty, [37]
Indications
Médicaments
Utilité probable
Bronchospasme/asthme
β2-agonistes, anticholinergiques
Utilité possible
Infection à VRS de l'enfant
Dysplasie broncho-pulmonaire de l'enfant
Cortisoniques
SDRA
Surfactants
Infection broncho-pulmonaire
Antibiotiques
HTAP
Prostacycline
SDRA: syndrome de détresse respiratoire aiguë; VRS: virus respiratoire syncytial; HTAP:
hypertension artérielle pulmonaire
♦ La nébulisation en VM est globalement peu utilisée et de pratique très hétérogène
[15], résultat probable d’une connaissance imparfaite de ses modalités techniques
et des limites des études cliniques.
Le dépôt pulmonaire des aérosols administrés durant une ventilation mécanique est
inférieur à 5% (1-3%), alors qu’il est de 10% chez les patients respirant spontanément.
Ceci est dû à la rétention de l’aérosol sur les parois des tubes du ventilateur, l’humidité du
circuit, la respiration suboptimale, à la marque de nébuliseur et à la taille du tube
endotrachéal, facteurs ne pouvant souvent être modifiés ou contrôlés. Afin d’optimiser la
nébulisation, le volume nébulisé devrait être de 5.0 ml au moins et le flux de nébulisation
entre 6 et 10 L/min [35]. De plus les nébuliseurs pneumatiques devraient être placés,
selon les recommandations américaines [38], sur le tuyau inspiratoire du circuit de
ventilation à une distance variant entre 10 et 30 cm du tube endotrachéal et être actionnés
uniquement durant l’inspiration.
Tableau 4
Facteurs influençant le dépôt pulmonaire de médicaments lors de la nébulisation en ventilation mécanique D'après Manthous, 1994 [39]; Dhand, 1996[40]
Facteurs liés au ventilateur
Mode de ventilation
Volume courant
Chapitre 4
Fréquence respiratoire
Rapport I/E
Forme du débit inspiratoire
Pression expiratoire positive
Mode de déclenchement de l'insufflation
Insufflation manuelle surajoutée
Gaz alimentant le ventilateur (densité, viscosité)
Facteurs liés au système de nébulisation
Pour les nébuliseurs:
- volume de remplissage
- débit de gaz pour les nébuliseurs pneumatiques
- amplitude de vibration pour les nébuliseurs ultrasoniques
- caractéristiques intrinsèques, notamment granulométrie
- masse de médicament délivrée
Pour les aérosol-doseurs:
- moment du déclenchement
- type de chambre ou d'adaptateur
- utilisation d'un cathéter intratrachéal
- granulométrie de l'aérosol
- masse de médicament délivrée
Facteurs liés au circuit
Position du système de nébulisation dans le circuit
Humidification des gaz inspirés
Diamètre et longueur du circuit
Diamètre de la prothèse endotrachéale
Facteurs liés au patient
Degré du syndrome obstructif
Eventuelles sécrétions trachéo-bronchiques
Adaptation au ventilateur
Existence de cycles de ventilation spontanée ou assistée
Présence d'une hyperinflation dynamique
4.2 Le système de nébulisation
Les aérosols peuvent être administrés chez les patients sous VM à l’aide de trois types de
dispositifs: les aérosols-doseurs pressurisés, les nébuliseurs pneumatiques ou les
nébuliseurs ultrasoniques. Un débit inspiratoire insuffisant et l’agrégation de la poudre
dans les tuyaux de ventilation empêchent l’utilisation des inhalateurs de poudre.
Chapitre 4
4.2.1 Les aérosols-doseurs
Ils doivent être actionnés pendant la phase inspiratoire et ré-actionnés toutes les 20-30
secondes, jusqu’à ce que la dose totale soit administrée [36]. Leur évaluation pendant la
VM est encore incomplète et les produits disponibles se limitent aux
bronchodilatateurs (β2-mimétiques et anticholinergiques) et aux cortisoniques, utilisés
notamment en anesthésiologie [41]. L'utilisation d'une chambre d'inhalation placée sur le
circuit inspiratoire du ventilateur augmente considérablement la masse de médicament
délivrée [42], [43]. Il est également possible de connecter l'embout de l'aérosol-doseur à
un fin cathéter glissé dans la prothèse endotrachéale, ce qui in vitro augmente
considérablement la masse de médicament arrivant dans la trachée [44], [45]. Une étude
chez un modèle animal a montré des lésions sévères de la muqueuse trachéale à l'extrémité
du cathéter. Celles-ci étaient sans doute liées à la toxicité des Fréons [46], qui ne devraient
plus se trouver dans les aérosols-doseurs. Il est possible que l'adjonction d'une chambre
d'inhalation au circuit augmente également cette masse délivrée Des études ont
démontré que l’utilisation des MDIs doit se faire avec une chambre d’inhalation qui
augmente le dépôt pulmonaire de 4 à 6 fois [47], [36].
4.2.2 Les nébuliseurs
Certains ventilateurs incluent, souvent en option, un système de nébulisation reposant
habituellement sur un nébuliseur pneumatique (exemple: Draeger Babylog), plus rarement
sur un nébuliseur ultrasonique (exemple: Siemens Servo 300A). Il est également possible
d'intercaler sur le circuit inspiratoire un nébuliseur non spécifiquement dédié à la
ventilation mécanique.
Selon les recommandations américaines [38], [48], les nébuliseurs pneumatiques doivent
être placés sur le tuyau inspiratoire du circuit de ventilation à une distance de 10 à 30 cm
du tube endotrachéal, une localisation plus rapprochée diminuant la masse de
médicament délivrée; le circuit ne doit pas être humidifié [49], [47], [50] et être actionné
uniquement durant l’inspiration, évitant ainsi la perte de médicament en phase
expiratoire [15]. Car si le nébuliseur pneumatique fonctionne en continu, l'aérosol
produit et propulsé en phase expiratoire est perdu pour le patient [15]. Les paramètres du
ventilateur doivent, si nécessaire, être modifiés en fonction du flux additionnel provenant
du nébuliseur.
Certains auteurs parlent plutôt en faveur des nébuliseurs ultrasoniques, car l'aérosol est
initialement statique dans la cuve de nébulisation et sa mobilisation nécessite un débit
gazeux, en pratique celui du ventilateur. L'aérosol n'est donc délivré qu'en phase
inspiratoire sans nécessiter de système externe de synchronisation, même si le
nébuliseur n'est pas spécifiquement dédié à la VM [51], [52]. Les nébuliseurs
ultrasoniques offrent l'avantage de ne pas avoir à intégrer dans les réglages du
ventilateur le débit de gaz nécessaire pour générer l'aérosol.
Quel que soit le type de nébuliseur, il convient de porter attention au volume de
remplissage de la chambre de nébulisation, en règle générale de 2 à 6 ml, selon les
Chapitre 4
recommandations du constructeur, sachant qu'un volume plutôt élevé tend à
augmenter la masse de médicament délivrée [47]., [52]. Dans le cas des nébuliseurs
pneumatiques, un débit gazeux élevé (8 L/min versus 5 L/min) pour générer l'aérosol tend à
augmenter la masse délivrée. La synchronisation sur l'insufflation produit le même effet,
cependant au prix d'une augmentation de la durée de nébulisation [49].
Du fait de son faible diamètre comparativement à la trachée, la prothèse endotrachéale
est responsable de turbulences et donc de phénomènes d'impaction. Il ne semble
cependant pas y avoir de différence notable en terme de nébulisation entre des sondes de 7
et 9 mm de diamètre [49]. Chez l'enfant, par contre, les sondes d'un diamètre inférieur à 4
mm diminuent nettement la masse délivrée [46]. Bien que peu de données sur la
nébulisation en VM chez des patients trachéotomisés ont été publiées, celle-ci ne semble
pas poser de problème spécifique [53], [54]. Il est également possible de réaliser une
nébulisation de bronchodilatateurs chez des patients en ventilation non invasive avec un
masque facial [55]. Les données publiées restent cependant très fragmentaires.
Le Tableau 5 résume les recommandations portant sur le bon usage de la nébulisation en
VM.
Tableau 5
Optimisation de l'utilisation des nébuliseurs en ventilation mécanique[40], [47], [36], [53]
Placer le nébuliseur en série sur la ligne inspiratoire et entre 10 et 30 cm du raccord en Y
Ne pas utiliser d'humidificateur chauffant:
ni pendant la nébulisation
ni dans les minutes précédentes
Ne pas utiliser d'échangeur de chaleur et d'humidité
Placer un filtre de basse résistance sur la ligne expiratoire (pour éviter de noyer le capteur de
débit)
Utiliser le volume de remplissage de la cuve indiqué par le fabricant, en règle générale entre 2 et
6 ml (en l'absence de précision, choisir 5 ml)
Si le débit de gaz du nébuliseur pneumatique est réglable, choisir 8 L/min
Adapter la ventilation-minute pour compenser
Si possible, choisir un volume courant ≥ 500 ml (adulte)
Ti/Ttot doit être > 0,3
Surveiller très attentivement l'état clinique, la saturation transcutanée en O2 et les paramètres de
ventilation pendant la nébulisation
En fin de nébulisation, revenir au circuit et aux réglages de ventilateur antérieurs
4.2.3 Nébuliseurs ou aérosol-doseurs ?
Le choix ne se pose en pratique que pour l'administration de bronchodilatateurs, ou plus
rarement de cortisoniques. Il est vraisemblable que le respect des règles énoncées cidessus est plus important que le choix du système de nébulisation per se [50]. L'efficacité
Chapitre 4
des deux systèmes semble globalement identique, sous réserve d'une utilisation adéquate,
quand bien même la masse de médicament délivrée in vitro est plus élevée avec le
nébuliseur [56]. Cela souligne au passage la nécessité d'une validation clinique des données
expérimentales. Le coût et la charge de travail infirmier sont souvent considérés comme
plus élevés avec les nébuliseurs, mais cela mériterait d'être évalué plus précisément. Il existe
un risque de contamination bactérienne des nébuliseurs, source potentielle de
pneumopathies nosocomiales [57].
Un des avantages des nébuliseurs est la possibilité de nébuliser une plus large gamme de
médicaments, et même des médicaments développés pour une utilisation parentérale.
Cependant, il s'agit là d'une utilisation hors AMM, sous l'entière responsabilité du
praticien. Dans ces conditions, certaines règles de prudence s'imposent afin de limiter le
risque d'intolérance locale. Il convient notamment de se renseigner sur l'osmolarité et le
pH de la solution. Une solution hypo- ou hyperosmotique peut être responsable de
bronchospasmes. Une solution acide peut également entraîner une réaction bronchique.
La vancomycine, par exemple, ne peut être utilisée en nébulisation à cause de son pH
acide. Certaines formes parentérales, notamment les solutions d'aminoglycosides, à
l'exception de l'amikacine et de la tobramycine, contiennent des sulfites dont le risque
bronchoconstricteur est bien documenté.
Les MDIs sont aussi utilisés pour délivrer des bronchodilatateurs ou des stéroïdes chez
des patients sous ventilation mécanique. Différentes études ont montré que les
nébuliseurs autant que les MDIs sont des systèmes efficaces lors de ventilation mécanique
[36].
Chapitre 5
5
La nébulisation chez l'enfant
La nébulisation est largement utilisée en pédiatrie, mais elle
garde encore actuellement un caractère empirique.
L'enfant présente des particularités anatomiques
physiologiques qui le distinguent de l'adulte.
et
Chez le nourrisson, les principales différences de structure
des voies aériennes pouvant entraîner des conséquences dans
certaines circonstances sont [58]:
♦ l’étroitesse relative des voies aériennes par rapport au
tissu pulmonaire;
♦ la contribution beaucoup plus importante des petites
voies aériennes (bronchioles) à la résistance totale des
voies aériennes, 85% de la résistance totale chez le
nourrisson, alors qu’elles ne contribuent que pour
20% chez l’adulte. Ceci explique les mauvaises valeurs
respiratoires des nourrissons lors d’atteinte des petites
voies aériennes (la bronchiolite par exemple);
♦ le fait que la trachée et les bronches sont plus
facilement compressibles.
De plus, le réflexe de toux, très peu présent à la naissance,
uellement avec l’âge. La toux est essentielle
augmente graduellement
non seulement pour évacuer le mucus constamment produit
dans l’arbre bronchique, mais aussi comme mécanisme
protecteur des voies aériennes inférieures. Le nourrisson
utilise comme mécanisme protecteur des ses voies aériennes
l’apnée plutôt que la toux, ce qui l’expose plus fortement à
52
Chapitre 5
des complications graves dans l’hypothèsse de sécrétions abondantes ou de liquide dans la
région laryngée.
5.1 Les caractéristiques anatomiques et
physiologiques de l'appareil respiratoire de
l'enfant
La particularité principale du poumon du nouveau-né réside dans sa capacité à continuer
à se développer après la naissance [59]. Le nombre d’alvéoles présentes dans le
parenchyme pulmonaire continue d’augmenter par division jusqu’à l’âge de 18 à 24 mois
environ. On en trouve 50 x 106 chez le nouveau-né à terme et 300 x 106 chez l’adulte.
Ainsi, d’après de multiples données expérimentales chez l’animal et des études cliniques
chez l’homme, il semble que des lésions du parenchyme pulmonaire ou une résection
pulmonaire apparaissant à un stade précoce peuvent être en grande partie compensées
par la croissance et la division des alvéoles. Par contre les bronches et les bronchioles ne
se divisent plus après la naissance.
Une des différences majeures entre le nourrisson et l’adulte se manifeste dans les
propriétés mécaniques et élastiques non seulement du poumon lui-même, mais aussi de la
cage thoracique et de l’interaction entre les deux structures. La cage thoracique du
nouveau-né est particulièrement susceptible de se déformer. Par contre son poumon est
plus rigide que le poumon adulte. Chez le nourrisson, il y a une tendance prononcée au
collapsus du poumon, car la force qui favorise la rétraction du poumon est plus grande
que celle qui favorise la rétraction de la cage thoracique. Le stade auquel ces forces
contraires s’équilibrent (capacité résiduelle fonctionnelle: CRF), soit à la fin de l’expiration
normale, se situe chez l’adulte sain vers 20% de la capacité pulmonaire totale, alors qu’il
est nettement plus bas chez le nourrisson (15% de la capacité pulmonaire totale). Pour
compenser ce phénomène, les nourrissons utilisent une sorte de frein pendant
l’expiration, une activité caractérisée par un début d’inspiration avant l’exhalation
complète. En respirant rapidement les nourrissons maintiennent artificiellement une CRF
plus élevée, qui se rapproche de celle de l’adulte. Le nouveau-né touché par une maladie
pulmonaire (p.ex. pneumonie) ne peut plus maintenir une fréquence respiratoire accélérée
pour conserver une CRF proche de celle de l’adulte sans se fatiguer rapidement.
5.1.1 Le cycle respiratoire de l'enfant
La déposition pulmonaire dépend du cycle respiratoire. Une respiration à débit
inspiratoire lent et à grand volume courant (Vt) augmente le dépôt pulmonaire
périphérique. Au contraire, un débit inspiratoire élevé favorise l'impaction des particules
au niveau des voies aériennes supérieures et des bronches proximales. Aucune
coopération n'est possible chez le jeune enfant qui a souvent une respiration très
irrégulière. Cette irrégularité des cycles respiratoires peut encore s'accentuer par les cris
de l’enfant pendant les séances de nébulisation. Le cycle respiratoire physiologique du jeune
enfant se compose d'un faible Vt et d'une fréquence rapide. Cela explique pourquoi celui-ci
Chapitre 5
inhale finalement une quantité importante d'aérosol rapporté à son poids. Un nourrisson
inhale à chaque inspiration un aérosol «pur». Lorsque l'enfant grandit, son Vt augmente et
dépasse le volume de l'aérosol généré par le nébuliseur. Il inhale à chaque inspiration un
volume supplémentaire d'air. Au-delà d'un certain Vt, la même quantité d'aérosol va être
inhalée par l'enfant et l'adulte. Mais la quantité d'aérosol inhalée, rapportée au poids du
sujet, est ainsi la plus importante chez le nourrisson et diminue ensuite avec l'âge à partir de
6 mois environ [60]. Les tests de provocation bronchique ont permis de mettre en
évidence ce phénomène [61]. Des nourrissons âgés de 1 mois avaient une réactivité
bronchique à l'histamine beaucoup plus importante que des enfants âgés de 10 ans [62].
Mais lorsqu'on rapporte la réactivité bronchique à la quantité d'histamine effectivement
inhalée, elle est la même dans les deux groupes. Il est donc important de tenir compte,
dans l'analyse du seuil de réactivité bronchique, de la quantité de bronchoconstricteur
inhalée rapportée à l'âge ou à la taille du sujet.
5.1.2 La respiration nasale et les voies aériennes
supérieures
Le jeune enfant a une respiration nasale au repos. Ce phénomène est encore amplifié chez
le nouveau-né, qui ne sait pas respirer par la bouche. Lorsqu'un adulte respire par le nez,
le dépôt pulmonaire d'un aérosol est diminué de 50 % [63]. Peu de données comparant la
respiration nasale et buccale sont disponibles chez l'enfant. On peut penser qu'une
respiration nasale entrave moins le dépôt pulmonaire d'un aérosol chez l'enfant que chez
l'adulte, car ses voies aériennes supérieures sont proportionnellement plus larges. Par
ailleurs, la pilosité nasale ne se développe pas avant l'adolescence. Pourtant, l'obstruction
nasale liée à l'hypertrophie adénoïdienne et aux rhinites, fréquentes à cet âge, limite la
déposition d'une substance nébulisée. Cela souligne l'importance de désobstruer les voies
aériennes supérieures du nourrisson avant une séance de nébulisation. Il arrive qu'un
grand enfant conserve une respiration nasale, lorsqu’il reçoit un aérosol par un embout
buccal. Cela diminue également l'efficacité de la nébulisation. Lorsqu'un masque est utilisé
chez le nouveau-né ou le nourrisson, celui-ci doit être appliqué de manière hermétique sur
le visage de l'enfant. En effet, une diminution de 85 % du dépôt s'observe lorsque le
masque facial est éloigné du visage de 2 cm [64].
5.1.3 Les voies aériennes inférieures
Les voies aériennes inférieures sont proportionnellement plus étroites chez l'enfant que
chez l'adulte. La résistance d'un conduit est inversement proportionnelle au rayon. Une
réduction de calibre des voies aériennes due à une bronchoconstriction, une
inflammation ou une hypersécrétion augmente donc considérablement les résistances
des voies aériennes, ce qui favorise un dépôt central. Lors d’une administration
médicamenteuse, le diamètre optimal des particules est ainsi plus petit chez l'enfant que
chez l’adulte et plus encore en cas d’obstruction des voies aériennes.
Chapitre 5
5.1.4 La déposition pulmonaire d'un aérosol chez l'enfant
Plusieurs modèles expérimentaux ont été développés pour calculer le dépôt d'un aérosol
dans les voies aériennes de l'enfant. Ces modèles sont fondés sur les particularités
physiologiques du cycle respiratoire et les caractéristiques anatomiques des voies aériennes
de l'enfant. Thomas et coll., estimant les dimensions des voies aériennes supérieures à
partir du diamètre trachéal, stipulent que la déposition d'un aérosol dans les fosses
nasales augmente avec l'âge, passant de 0,2 % avec des particules ayant un diamètre inférieur
à 2 μm chez le nourrisson de 1 mois à 37,8 % chez un enfant de 10 ans [65]. Avec un
calcul différent, Xu et coll. estiment que 6 % des particules de 2 μm de diamètre ont une
déposition buccale chez l'enfant âgé de 1 mois, alors que celle-ci est de 0 % chez l’enfant
de 10 ans [66]. Mais ces calculs demandent à être confirmés in vivo.
En clinique, la déposition pulmonaire peut être estimée directement par le marquage
radioactif d'une substance nébulisée, plus rarement par son dosage dans les sécrétions
bronchiques, le lavage broncho-alvéolaire (LBA), ou indirectement par le dosage de la
substance dans le sérum ou les urines, ce qui reflète l'absorption systémique. D'une
manière générale, les quantités déposées effectivement au niveau des poumons sont très
faibles, entre 1 et 10 % de la dose initiale présente dans le nébuliseur. Plusieurs études ont
évalué le dépôt pulmonaire d'un aérosol chez des enfants atteints de mucoviscidose. Une
solution de 120 mg de tobramycine radiomarquée a été nébulisée chez 27 enfants et
jeunes adultes atteints de mucoviscidose [67]. La dose moyenne déposée au niveau du
poumon représentait 6.7 % de la dose initiale présente dans la cuve de nébulisation. Les
variations interindividuelles étaient cependant très importantes. Aucune corrélation
entre l'âge et la déposition pulmonaire n'a pu être mise en évidence.
O'Doherty a évalué le dépôt pulmonaire d'une solution de pentamidine radiomarquée
chez 8 enfants âgés de 8 à 13 ans [68]. Seulement 2.5 % de la dose initiale était retrouvée
au niveau du poumon, ce qui correspond à la dose retrouvée chez l'adulte. La taille des
particules semble surtout jouer un rôle important chez le nourrisson; une
déposition deux fois plus importante a été observée avec un aérosol ayant des
particules de 3.6 μm par rapport à un aérosol donnant des particules de 7.7 μm [69].
Au-delà de 4 ans, l'effet de l'âge diminue.
En pratique, la réalisation d'études de déposition pulmonaire chez l'enfant est difficile.
Aucune coopération n'est en effet possible chez le jeune enfant. Pour des raisons
éthiques, des études de dépôt chez l'enfant sain utilisant des produits radiomarqués ne
sont pas possibles. Les études sont donc faites sur un faible nombre de patients ayant
souvent une atteinte respiratoire plus ou moins sévère. Ces études chez l'enfant sont
toutefois indispensables pour
♦ vérifier l'efficacité in vivo d'un nébuliseur;
♦ optimiser le dépôt d'une substance au lieu souhaité;
Chapitre 5
♦ déterminer la dose à administrer et l'intervalle entre deux doses.
5.2 Les pathologies respiratoires de l'enfant
et leur traitement
5.2.1 L'asthme
L’asthme est une maladie chronique des voies respiratoires caractérisée par une
inflammation persistante des voies respiratoires, qui entraîne des difficultés à respirer, des
quintes de toux et une respiration sifflante. La crise d'asthme est liée à un rétrécissement
brutal du diamètre des bronches, c'est le bronchospasme, et d'une inflammation de la
paroi des bronches. Cette maladie démarre la plupart du temps dans l’enfance. Elle est en
augmentation pratiquement partout dans le monde. Selon l’Organisation mondiale de la
santé (OMS) il s’agit de la maladie chronique la plus répandue chez les enfants et sa
prévalence et sa sévérité ne cessent de croître.
L’augmentation rapide des cas d’asthme dans le monde est un des plus grands mystères
de la médecine moderne. Dans certaines régions du monde 20 à 36 % des enfants sont
touchés, notamment en Amérique du Sud et en Australie. Mais partout, l’accroissement
du nombre de jeunes asthmatiques est signalé. En trente ans, les progrès du traitement de
l’asthme bronchial ont progressé au point de laisser espérer aux enfants correctement pris
en charge, une vie tout à fait normale. Mais cela n’est pas le lot de tous puisque l’asthme
cause le décès de 25 000 enfants chaque année.
L'asthme est une maladie complexe qui associe plusieurs types d'anomalies:
♦ un spasme du muscle lisse bronchique
♦ une inflammation, caractérisée par une infiltration cellulaire, où dominent les
polynucléaires éosinophiles (l'asthme est considéré comme une bronchite
chronique à éosinophiles) au côté desquels on trouve des polynucléaires
neutrophiles, des lymphocytes et des monocytes.
♦ une hypersécrétion de mucus et une hypertrophie des glandes à mucus. Cette
hypersécrétion participe à la formation des bouchons muqueux obstruant les
bronches
On insiste aujourd'hui aussi sur l'importance des lésions de l'épithélium bronchique
conduisant à une mise à nu de la membrane basale et des terminaisons nerveuses
sensibles à l'irritation et à une facilitation de la pénétration des allergènes et des agents
irritants nocifs.
Outre l'éosinophile et les cellules inflammatoires et immunocompétentes, le mastocyte
joue un rôle essentiel dans la physiopathologie de l'asthme puisqu'il est la cible de la
réaction antigène-anticorps, spécifique de l'asthme allergique, et qu'il libère les médiateurs
Chapitre 5
à l'origine de la crise initiale. L'asthme met donc en jeu toute une série de médiateurs dont
les effets vont se succéder, s'associer ou s'inhiber. L'importance de ces phénomènes
physiopathologiques de base évolue dans le temps et on peut en effet distinguer
chronologiquement trois étapes:
♦ Une réaction initiale, qui survient immédiatement après l'inhalation de l'antigène,
caractérisée surtout par une bronchoconstriction,
♦ Une phase dite tardive qui survient 6 à 12 heures après la réaction initiale et où la
réaction cellulaire et inflammatoire est importante;
♦ Un passage à la chronicité lorsque les crises se succèdent ([70] (cf Figure 20):
l'inflammation s'installe et on assiste à la mise en place d'une hyperréactivité
bronchique, caractéristique de la maladie asthmatique. Cette phase est marquée par
la détérioration des fonctions respiratoires en dehors des épisodes critiques; elle est
dominée par l'inflammation chronique et l'installation d'un processus de fibrose
bronchique. L'hyperréactivité bronchique est explorée par le test à la métacholine.
L’asthme se caractérise par les modifications pathologiques suivantes[70]:
♦ Bronchospasme
♦ Congestion vasculaire
♦ Oedème de la muqueuse
♦ Hypertrophie des glandes à mucus
♦ Hypersécrétion de mucus
♦ Desquamation épithéliale
♦ Epaississement de la membrane basale
♦ Infiltration de cellules inflammatoires
Chapitre 5
Figure 20
Succession d'événements aboutissant au passage à la chronicité de la maladie asthmatique
La sévérité de l’asthme d’un patient peut être évaluée selon les critères présentés dans le
tableau suivant:
Tableau 6
Les différents paliers de l’asthme et leurs caractéristiques
Palier
Symptômes
1
Intermittent
léger
2
Persistant
léger
3
Persistant
modéré
4
Persistant
sévère
≤ 2 / semaine
Asymptomatique
entre les crises
> 2 / semaine
< 1 / jour
Tous les jours
Continus
Chapitre 5
Crises
Brèves (de qq
heures à qq
jours)
Peuvent retentir
sur le sommeil
et l’activité
Retentissent sur
le sommeil et
l’activité
Peuvent durer
plusieurs jours
Utilisation quot.
d’un β2-agoniste
Fréquentes
Retentissent sur
le sommeil et
l’activité
Symptômes
nocturnes
≤ 2 / mois
> 2 / mois
> 1 / semaine
Fréquents
DEP ou VEMS
≥ 80% prédits
≥ 80% prédits
60-80% prédits
< 60% prédits
Variabilité du
DEP
< 20%
20-30%
> 30%
> 30%
La présence d’un élément de sévérité suffit pour classer un patient dans une des
catégories. L’évaluation de la sévérité d’un asthme conditionne la prise en charge
médicamenteuse du patient.
L'asthme infantile est la maladie chronique la plus fréquente. Il touche 10% des enfants et
50% des asthmes débutent dans l'enfance avant l'âge de 5 ans. L'asthme touche deux fois
plus de garçons que de filles [71]. Un second pic d’apparition de l’asthme se situe aux
environs de 50 ans (asthme tardif, pas forcément allergique).
5.2.1.1 Les symptômes de l'asthme chez l'enfant:
On parle d'asthme chez le nourrisson quand l'enfant fait une bronchiolite et trois
épisodes successifs de bronchite sifflante [72]. La bronchiolite est une infection
respiratoire aiguë qui prédomine sur les petites bronches ou bronchioles. Ce virus infecte
généralement l'enfant de moins de 2 ans, et surtout de moins de 6 mois. Cette infection
concerne environ 30% des enfants de cette tranche d'âge. Cependant, la maladie est très
rarement mortelle, et la plupart des enfants guérissent totalement sans complications.
Chez le petit enfant, les tableaux cliniques peuvent être très variables:
♦ Une véritable crise d’asthme avec un sifflement audible à l'expiration de l'air, un
ralentissement de la fréquence respiratoire avec une gêne à l'expiration de l'air.
♦ Une toux chronique diurne et nocturne qui réveille l'enfant.
Facteur déclenchant d’une crise d'asthme chez l'enfant:
♦ Les infections virales: surtout chez le nourrisson (bronchiolite à VRS, virus
respiratoire syncytial).
Chapitre 5
♦ Les allergènes, nombreux, d'origine respiratoire, alimentaire ou médicamenteuse:
acariens, pollens, poussières, polluants atmosphériques, poils d'animaux (chat et
chien), champignons, arachides, lait, œufs, aspirine.
♦ Le froid et le rhume.
♦ Les efforts physiques, le sport et même le rire.
5.2.1.2 L'asthme aigu
L’asthme aigu grave peut être défini comme une crise d’asthme aiguë persistant malgré
l’administration de trois doses successives d’un β2-mimétique, habituellement donné en
nébulisation.
L’événement essentiel dans la physiopathologie de la crise grave est l’obstruction
bronchique liée au bronchospasme, à l’œdème et aux bouchons muqueux de
l’hypersécrétion.
Les bronchodilatateurs sont le traitement de choix de l'asthme aigu. Leur administration
par nébulisation a depuis longtemps fait la preuve de son efficacité. Dans la crise
d'asthme, ils doivent être administrés avec de l'oxygène, à la fois pour maintenir un niveau
d'oxygénation suffisant et éviter l'hypoxie. L'administration continue ou répétée à court
terme des bronchodilatateurs est plus efficace [73], [74], [75]. Les effets secondaires de la
nébulisation continue de bronchodilatateurs sont comparables à ceux de l'administration
intermittente [76].
L'adjonction d'un anticholinergique à un bronchodilatateur lors d'une crise d'asthme
sévère potentialise l'effet bronchodilatateur [77]. Par contre, aucun bénéfice n'est
actuellement démontré dans la crise modérée [78].
Certains auteurs ont constaté une efficacité comparable des β2-mimétiques administrés en
nébulisation et en spray avec une chambre d'inhalation. Toutefois, l'expérience clinique
plaide en faveur de la nébulisation en première intention lors d'une crise sévère. Comme
nous l'avons souligné, une administration continue d'un bronchodilatateur est très efficace
et impossible à obtenir avec un spray et une chambre d'inhalation.
5.2.1.3 Le traitement de fond de l'asthme
Selon le document de consensus international du NHLBI [79], le traitement au long cours
est basé sur quatre paliers thérapeutiques en fonction de la sévérité de l’asthme. Il repose
sur l’utilisation de bronchodilatateurs associés ou non aux corticoïdes. Ces derniers sont
introduits précocement dès le deuxième palier.
Les médicaments sont classés en deux categories:
Chapitre 5
♦ Ceux pour le soulagement immédiat (« quick-relief medications »): il s’agit des β2agonistes à courte durée d’action (salbutamol, terbutaline) et des anticholinergiques
(ipratropium).
♦ Ceux pour le contrôle à long terme (« long-term control medications »: il s’agit de
corticoïdes inhalés, d’anti-inflammatoires (cromoglycate, nédocromil), β2-agonistes
de longue durée d’action (salméterol, formotérol) et antileucotriènes.
Le document de consensus distingue le traitement de fond de l’enfant de 5 ans et de
l’adulte de celui de l’enfant de moins de 5 ans. Chez ce dernier, on notera l’utilisation en
première intention du cromoglycate et du nédocromil comme anti-inflammatoire. Les β2agonistes de longue durée d’action n’ayant pas été étudiés dans cette catégorie d’âge, ils ne
figurent pas comme traitement de base, contrairement au consensus britannique où ils
sont introduits au palier 3 [80].
L’évaluation du traitement doit être effectuée régulièrement (chaque 1-6 mois). Une
diminution de la thérapie est effectuée progressivement, lorsque les symptômes de
l’asthme sont bien contrôlés. La posologie des corticoïdes inhalés est réduite à la dose
minimale efficace, l’innocuité de ces médicaments étant inconnue chez l’enfant de moins
de 5 ans pour le traitement au long cours.
5.2.2 La bronchiolite virale
Avec un pic entre le 4ème et 6ème mois de vie, la bronchiolite virale aiguë est la maladie
infectieuse des voies respiratoires inférieures la plus fréquente durant la première année
de vie. La grande majorité des bronchiolites aiguës sont dues au virus respiratoire syncitial
(VRS), mais d'autres virus respiratoires peuvent également se présenter avec le même
tableau clinique[81].
La bronchiolite aiguë est en principe la première manifestation d'une maladie pulmonaire
obstructive du nourrisson, mais peut occasionnellement aussi être récidivante. Lors de
récidives, on devrait toujours penser à un asthme bronchique du petit enfant, tout
particulièrement en présence d'atopie ou d'une anamnèse familiale positive. Le diagnostic
différentiel comprend la mucoviscidose, la broncho-aspiration, une malformation
cardiaque, de rares anomalies congénitales de la trachée ou des bronches ainsi que le
syndrome des cils immobiles.
Bien que la majorité des nourrissons soient traités ambulatoirement, la bronchiolite aiguë
est toujours l’une des causes d'hospitalisation les plus fréquentes pendant les mois d'hiver.
Le diagnostic de la bronchiolite aiguë est clinique: après un premier stade caractérisé
d’une rhinorrhée et d’une toux sèche, irritative, la bronchiolite aiguë se présente avec un
tableau clinique caractéristique de râles crépitants, sibilances, hyperinflation, tachypnée et
tirage ainsi que, selon sa gravité, des difficultés alimentaires et une cyanose. Chez de petits
nourrissons, la survenue d’apnées peut en être le premier signe.
Chapitre 5
Le diagnostic du VRS est rapide et se fait dans les sécrétions nasopharyngées. Lorsque la
clinique n'est pas claire et la recherche de VRS négative, il faut envisager la recherche
d'autres virus (parainfluenza, influenza, rhinovirus, adénovirus et métapneumovirus
humain) dans les sécrétions nasopharyngées pour assurer le diagnostic.
La décision d’hospitaliser ou non un nourrisson dépend de la gravité de la bronchiolite.
Plusieurs facteurs jouent un rôle: une détresse respiratoire débutante, une saturation en
oxygène insuffisante, une incapacité de boire, l'apparition de signes de déshydratation
ainsi que les conditions sociales. Les nourrissons avec une bronchiolite de gravité
moyenne ou sévère devraient être soignés en milieu hospitalier; l'observation d'une apnée
est également une indication à l'hospitalisation. L’indication à une hospitalisation est
renforcée chez les nourrissons avec des maladies sous-jacentes comme une
mucoviscidose, une dysplasie broncho-pulmonaire, une malformation cardiaque
congénitale. La ventilation mécanique est instaurée chez moins de 2% des nourrissons
hospitalisés.
L’utilisation de bronchodilatateurs est controversée [82], [83], [84]. Ce traitement est
largement utilisé en Amérique du Nord, alors qu’il est remis en question en GrandeBretagne et en Australie. Bien que l'inflammation des muqueuses soit un élément
important de la bronchiolite aiguë, l'utilisation des corticoïdes ne s'est pas avérée efficace.
Les études faites jusqu'ici n'ont pas pu prouver un effet des stéroïdes inhalés ou
systémiques [82]. L’utilisation de la ribavirine est également sujette à controverse, cet
antiviral étant réservé aux formes graves chez les enfants à risque (maladie cardiopulmonaire ou immuno-déficience) [85]. L’immunisation passive au moyen
d’immunoglobulines anti-VRS est recommandée aux USA chez les enfants de moins de 2
ans atteints de maladie pulmonaire chronique [86]. L'administration thérapeutique du
paliviziumab, une immunoglobuline anti-VRS, n'influence pas le décours de la
bronchiolite aiguë.
5.2.3 La mucoviscidose
La mucoviscidose, ou fibrose kystique selon la terminologie anglo-saxonne, est la maladie
génétique récessive, autosomale, léthale, la plus répandue dans les populations
européennes et nord-américaines. La mucoviscidose est caractérisée par un
dysfonctionnement généralisé des glandes exocrines, ce qui provoque un épaississement
des sécrétions muqueuses et une exceptionnelle richesse de la sueur en chlore et en
sodium. Cette affection est liée à des mutations du gène CFTR (Cystic Fibrosis
Transmembrane Regulator), situé sur le chromosome 7, qui code pour la synthèse d'une
protéine appelée Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator.
Environ une personne sur 50 est porteuse du gène muté et un enfant sur 2500 naît atteint
de cette maladie. Les progrès médicaux réalisés dans le traitement de cette pathologie ont
fait évoluer l'espérance de vie des patients atteints de mucoviscidose, suivant les pays, de
la petite enfance à 35-45 ans, avec une importante réduction de la mortalité infantile.
Chapitre 5
Cependant, on ne dispose pas à l'heure actuelle de traitements efficaces pour ralentir la
destruction des tissus pulmonaires et pancréatiques.
L'atteinte respiratoire est responsable de plus de 90% des décès. Les traitements
consistent en l’administration de rhDNase et d’antibiotiques.
5.2.3.1 La rhDNase
La rhDNase est une DNase recombinante humaine qui clive le DNA extracellulaire provenant des cellules inflammatoires, et des polynucléaires neutrophiles en particulier. Ce
DNA extracellulaire est en effet le déterminant majeur de l'hyperviscosité des sécrétions
bronchiques dans la mucoviscidose. La nébulisation quotidienne de 2,5 mg de rhDNase
chez des patients âgés de plus de 5 ans et ayant une atteinte respiratoire modérée
(capacité vitale > 40 % de la valeur attendue) améliore modestement la fonction pulmonaire (avec une amélioration moyenne du VEMS de 6 %) et diminue le risque relatif d'un
traitement antibiotique intraveineux pour une surinfection bronchique chez un tiers des
patients [6]. La prescription de la rhDNase obéit à des règles strictes: elle doit être
protégée de la lumière et de la chaleur (utilisation de nébuliseurs pneumatiques et non
ultrasoniques); elle doit être utilisée seule, car la protéine peut être altérée si elle est mélangée
à d'autres molécules; son administration doit être suivie d’une kinésithérapie respiratoire.
A l'heure actuelle, en conclusion des nombreuses études réalisées avec ce produit, on peut
dire que la rhDNase a un effet significatif chez un tiers des patients, nul chez un tiers et
elle est associée à une dégradation de l'état clinique et/ou fonctionnel chez le tiers restant.
5.2.3.2 Les antibiotiques
Bien que les antibiotiques soient largement prescrits dans la mucoviscidose, seuls deux, la
tobramycine et la colistine, ont actuellement l'autorisation de mise sur le marché (AMM)
pour la nébulisation. Pseudomonas aeruginosa (PA) est un germe spécifique de cette maladie.
Il apparaît généralement au cours de l'adolescence et constitue un tournant évolutif
dans l'atteinte respiratoire. Après une première infection, ce germe va réapparaître de
manière inéluctable, après un délai variable, pour ensuite persister de manière
permanente au niveau des voies aériennes. La colonisation est définie par la présence de
PA sur au moins trois examens cytobactériologiques de crachats (ECBC) sur une période
de 6 mois et/ou par la présence de précipitines antipyocyaniques positives.
Les aérosols d'antibiotiques ont pour but de diminuer la charge bactérienne locale au
décours ou entre les cures intraveineuses, pour éviter ou retarder la réapparition du PA,
mais aucun bénéfice n'est actuellement démontré en ce qui concerne leur emploi au
moment d'une cure intraveineuse. L'avantage de la voie nébulisée est qu'elle permet
l'utilisation de molécules inactives par d'autres voies, comme la colistine, et qu'elle
permet d'obtenir des concentrations locales élevées et systémiques faibles. Sur le plan
pratique, la nébulisation est moins contraignante que la voie intraveineuse et peut être
faite au long cours. Les antibiotiques utilisés pour la nébulisation sont les aminosides
(tobramycine, amikacine, gentamicine), la colistine et certaines bêtalactamines (ceftazidime,
carbénicilline). En pratique, la colistine et la tobramycine sont les molécules les plus
Chapitre 5
utilisées. La colistine peut diminuer et retarder la colonisation par PA après une
première infection à ce germe [87]. Une étude contrôlée et prospective a montré que
l'association de la ciprofloxacine et de la colistine nébulisée pouvait prévenir ou retarder
la réapparition du PA sur une période de 18 mois [88].
Les effets secondaires des antibiotiques nébulisés sont l'induction d'un bronchospasme
et l'apparition de mutants résistants. Il est conseillé de réaliser une spirométrie avant et
après la première nébulisation, afin de rechercher une bronchoconstriction induite par
l'antibiotique, liée le plus souvent à une hyperosmolarité excessive de la solution
nébulisée. Le risque environnemental pour le personnel médical et la famille du patient a
été soulevé. L'emploi d'un filtre expiratoire est conseillé.
5.2.4 L'infection à Pneumocystis carinii (PC)
Les nébulisations de pentamidine sont indiquées dans la prévention de l'infection à PC.
La pentamidine est indiquée en première intention en cas de contre-indication au
cotrimoxazole (hypersensibilité, résistance thérapeutique). Elle est utilisée en
prophylaxie secondaire après une première infection à PC. En pratique, elle est peu
employée dans le traitement de l'infection à PC, car le cotrimoxazole, l'association
clindamycine et primaquine, ou l'atovaquone sont beaucoup plus efficaces. La
pentamidine doit être déposée au niveau des alvéoles. Elle doit être administrée avec un
nébuliseur produisant des particules de petite taille. Les effets secondaires de la
pentamidine sont liés au dépôt dans les voies aériennes supérieures et se résument à
une hypersialorrhée, un goût métallique dans la bouche, des nausées, une toux, une
dyspnée et un bronchospasme.
L'emploi d'un filtre expiratoire est nécessaire pour éviter les effets secondaires pour
l'entourage (cf 3.4.4.2), et les séances doivent se faire dans une pièce isolée, séparée des
autres patients immunodéprimés pour éviter la transmission d'infections opportunistes
comme la tuberculose.
5.2.5 Le bronchospasme postopératoire
La phase de réveil anesthésique est marquée par la disparition progressive des effets
résiduels de l'anesthésie, alors qu'apparaissent les conséquences de l'acte chirurgical. Les
particularités physiologiques et la dépendance environnementale de l'enfant ou du
nourrisson, rendent cette période à haut risque d'incidents ou d'accidents. La plupart des
études portant sur la morbidité péri-opératoire montrent que c'est au cours de la période
de réveil que surviennent la majorité des accidents d'anesthésie [89], [90]. En effet la
plupart des anesthésiques généraux possèdent des propriétés bronchodilatatrices et
l’incidence du bronchospasme au cours de l’opération est faible. Les complications lors
du réveil chez l'enfant sont essentiellement respiratoires [91], [91]. Le bronchospasme
apparaît surtout chez les enfants ayant une pathologie bronchique préexistante ou lors
d'un stimulus, alors que l'anesthésie s'allège. L'irritation mécanique des voies aériennes ou
la présence de sécrétions dans l'arbre bronchique sont des facteurs favorisants. Le
traitement de choix consiste à administrer par nébulisation des β2-mimétiques.
Chapitre 5
Les nébulisations sont largement employées en pédiatrie et constituent une voie
d'administration indispensable pour certains médicaments. L'évolution des
thérapeutiques avec l'apparition de nouvelles molécules disponibles pour cette voie est
également observée en pédiatrie. Toutefois, l'optimisation de la nébulisation chez l'enfant
passe par des études analysant le dépôt pulmonaire des aérosols et évaluant l'efficacité
clinique de ces traitements.
5.3 Médicaments nébulisés
Seules vingt-deux substances actives ont une autorisation de mise sur le marché (AMM)
en Suisse pour la nébulisation en pneumologie [92] (cf Tableau 7). Lors de
l’administration, il importe également de ne pas mélanger ces produits sans s'être assuré
de leur compatibilité. La rhDNase, par exemple, doit être employée seule, alors que le
budésonide peut être mélangé aux différents bronchodilatateurs.
Tableau 7
Liste des médicaments ayant l'autorisation de mise sur le marché (AMM) en Suisse pour la nébulisation en
pneumologie
Classe pharmacologique
DCI
Spécialité
Bronchodilatateurs
Anticholinergiques
Ipratropium
Atrovent®, Berodual®, Dospir®
Tiotropium
Spiriva®
Salbutamol
Buventol®, Ecovent®, Ventolin®,
Ventodisk®, Dospir®
Fénoterol
Berotec®, Berodual®
Terbutaline
Bricanyl®
Formoterol
Foradil®, Oxis®, Symbicort®
Salmeterol
Serevent®, Seretide®
Réproterol
Aarane®
Cromoglicate de
sodium
Cromosol® UD, Glicinal®,
Lomudal®, Aarane®
Nédocromil
disodique
Tilade®
Fluticasone
Axotide®, Seretide®
Béclométhasone
Becloforte®, Beclomet Easyhaler,
Becodisk®, Becotide
Budénoside
Mifloride®, Pulicort, Symbicort®,
β2-sympathomimétiques
Antiallergiques
Corticoïdes
Mucolytiques
Chapitre 5
Acéthylcystéine
Ecomucyl®, Fluimucil®, Solmucol®
Ambroxol
Mucabrox®
Bromhexine
Bisolvon®
Mesna
Mistabron®
rhDNase
Pulmozyme®
Zanemivir
Relenza®
Pentamidine
Pentacarinat®
Colistiméthate de
sodium
Colistin®
Tobramycine
Tobi®
Anti-viral
Anti-parasitaire
Anti-infectieux
5.3.1 AMM pour la nébulisation pédiatrique
Le nombre de médicaments se restreint encore lorsque l’on prend en considération dans
cette même catégorie ceux ayant une autorisation de mise sur le marché pédiatrique (cf
tableau 7).
Tableau 8
Liste des médicaments ayant l'autorisation de mise sur le marché (AMM) pédiatrique en Suisse pour la
nébulisation en pneumologie
Médicaments avec AMM
Limitation d’âge
Ipratropium
Atrovent®, Berodual®,
Dospir®
> 6 ans
> 12 ans
Tiotropium
Spiriva®
Pas d’AMM
pédiatrique
Salbutamol
Buventol®,
Ventolin®, Ecovent®,
Ventodisk®,
> 6 ans
> 18 mois
> 3 ans
Fénoterol
Berotec®,
Berodual®
> 1 mois
> 6 ans
Terbutaline
Bricanyl®
> 3 ans
Formoterol
Foradil®, Oxis®, Symbicort®
> 6 ans
Salmeterol
Serevent®,
Seretide®
> 18 mois
> 4 ans
Réproterol
Aarane®
> 2 ans
Classe pharmacologique et DCI
Bronchodilatateurs
Anticholinergiques
β2-sympathomimétiques
Chapitre 5
Antiallergiques
Cromoglicate de sodium
Cromosol® UD, Glicinal®,
Lomudal®, Aarane®
> 2 ans
Nédocromil disodique
Tilade®
> 2 ans
Fluticasone
Axotide®, Seretide®
> 4 ans
Béclométhasone
Becloforte®, Beclomet
Easyhaler, Becodisk®,
Becotide
Budénoside
Mifloride®,
Pulmicort®,
Symbicort®,
> 12 ans
nourrissons
> 6 ans
Acéthycystéine
Ecomucyl®, Solmucol®,
Fluimucil®
> 1 an
nourrissons
Ambroxol
Mucabrox®
> 5 ans
Bromhexine
Bisolvon®
> 2 ans
Mesna
Mistabon®
Pas d’AMM
pédiatrique
rhDNase
Pulmozyme®
> 5 ans
Zanemivir
Relenza®
> 5 ans
Pentacarinat®
Pas d’AMM
pédiatrique
Colistiméthate de sodium
Colistin®
> 12 ans
Tobramycine
Tobi®
> 6 ans
Corticoïdes
> 12 ans
> 3 ans
> 4 ans
Mucolytiques
Anti-viral
Anti-parasitaire
Pentamidine
Anti-infectieux
Les limitations d’âge signalées dans le Tableau 8 correspondent aux solutions pour
inhalation et non aux aérosols-doseurs pressurisés ou aux inhalateurs de poudre sèche.
Pour ces derniers, elle est encore plus élevée. Ce tableau montre bien que même pour une
indication courante en pédiatrie, l’asthme, les AMM concernent peu les nourrissons et les
petits enfants.
En pédiatrie, en milieu hospitalier comme en ambulatoire, les médicaments se prescrivent
couramment hors AMM, ou ont une AMM dans une autre indication, une autre
posologie, une autre forme galénique ou un autre âge. Ceci résulte d'un défaut
d'évaluation des médicaments chez l'enfant avant leur commercialisation. Cette situation
prive l’enfant d’éventuelles avancées thérapeutiques ou l'expose à des risques accrus et
notamment aux erreurs d'administration.
Chapitre 5
L’absence de posologie pédiatrique oblige le prescripteur à « choisir » la posologie admise
par la communauté scientifique pédiatrique et implique une surveillance particulière de la
tolérance. En l'absence de dose validée par l’AMM, la dose initialement choisie est le plus
souvent extrapolée à partir de la dose adulte (rapportée au poids ou à la surface
corporelle), modulée par le niveau de maturation théorique, hépatique et rénal prévisible
sur l’âge et les pathologies associées.
La prescription hors AMM est importante en pédiatrie. Elle concerne 90% des patients à
l’hôpital et 39% des médicaments prescrits selon une étude-pilote réalisée au CHUV dans
les six unités du Département médico-chirurgical de Pédiatrie (Néonatologie, Soins
Intensifs, Soins Continus, Médecine et Chirurgie pédiatrique) entre 2001 et 2002 [93]. Ces
résultats montrent que l’enfant est bien « l’orphelin » de l’industrie pharmaceutique pour
des raisons essentiellement économiques. Depuis 2002, l’Institut Suisse des Produits
Thérapeutiques ou (Swissmedic), qui enregistre les médicaments et délivre les
autorisations de mise sur le marché en Suisse, a annoncé son intention d’accorder une
prolongation de la durée de la protection du brevet de cinq ans pour les nouveaux
développements destinés aux enfants et de revoir l’information du Compendium Suisse
des Médicaments [94].
5.3.2 Les médicaments nébulisés lors de VM
Chez les patients ventilés peu de médicaments ont été évalués. Les plus étudiés sont les
bronchodilatateurs, utilisés chez des patients ayant un syndrome obstructif ou un SDRA
(Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë). Paradoxalement, on ne dispose pas d'étude
concernant des patients ventilés pour asthme grave. Ces études concordent pour
montrer une diminution de la résistance des voies aériennes sous l'effet des
bronchodilatateurs inhalés. Il ne s'agit que d'études à court terme, et aucune n'a eu
comme critère de jugement une diminution du risque barotraumatique, une facilitation
du sevrage ou une réduction de la durée de VM. Une relation dose-réponse a pu être
établie pour le salbutamol administré avec un nébuliseur, avec un effet plateau obtenu pour
une masse placée dans la cuve de nébulisation de 7.5 mg [95], une posologie plus élevée
entraînant des effets systémiques (nausées, tremblements, arythmies) sans bénéfice
supplémentaire. Une relation dose-réponse a également pu être établie avec un aérosoldoseur de salbutamol, montrant un effet en plateau pour 4 bouffées, soit 360 pg, l'effet
sur les résistances persistant au bout de 1 heure [96]. La différence entre les deux valeurs
n'est qu'apparente: en effet, avec les aérosols-doseurs, un pourcentage plus important du
médicament administré arrive réellement à son site d'action [56]. Une étude à court terme
chez des patients ventilés pour SDRA a montré qu'une nébulisation de salbutamol
permettait d'obtenir une diminution de la résistance mais aussi des pressions des voies
aériennes [97]. L'effet des anticholinergiques a été beaucoup moins étudié que celui des
12-mimétiques.
Bien que la nébulisation d'antibiotiques semble pratiquée assez régulièrement en
réanimation [15], très peu de travaux cliniques lui ont été consacrés. La place de la
nébulisation d'antibiotiques dans le traitement curatif des pneumopathies est restreinte,
Chapitre 5
entre autre par le fait nécessaire fait appel à des molécules diffusant bien dans le
parenchyme pulmonaire et présentant un index thérapeutique large (β-lactamines) ou une
toxicité maîtrisable (aminoglycosides en cure courte avec surveillance des concentrations
plasmatiques). La place de la nébulisation de colimycine mériterait sans doute d'être
évaluée pour le traitement de certaines pneumopathies à sérotypes multirésistants. Un
essai randomisé en double insu, ayant inclus 41 patients, a conclu à l'absence de bénéfice
de la nébulisation de ribavirine chez des enfants ventilés pour une bronchiolite due au virus
respiratoire syncytial [98], pratique courante dans les unités de réanimation pédiatrique
[15].
Les bronchodilatateurs ont été évalués au bloc opératoire chez des patients ventilés ayant
un bronchospasme peranesthésique et chez des patients en réanimation ayant un
syndrome obstructif chronique ou un SDRA. Paradoxalement, on ne dispose pas d'étude
concernant des patients ventilés pour asthme grave. Toutes les études concordent pour
montrer une diminution de la résistance des voies aériennes sous l'effet des
bronchodilatateurs inhalés. Il ne s'agit que d'études à court terme, et aucune n'a eu
comme critère de jugement une diminution du risque barotraumatique, une facilitation
du sevrage ou une réduction de la durée de VM. Une relation dose-réponse a pu être
établie pour le salbutamol administré avec un nébuliseur, avec un effet plateau obtenu pour
une dose de 7,5 mg placée dans la cuve de nébulisation [95], une posologie plus élevée
entraînant des effets systémiques, (nausées, tremblements, arythmies) sans bénéfice
supplémentaire. Une relation dose/réponse a également pu être établie avec un aérosoldoseur de salbutamol, montrant un effet en plateau pour 4 bouffées, soit 360 pg, l'effet
sur les résistances persistant au bout de 1 heure [96]. La différence entre les deux valeurs
n'est qu'apparente: en effet, avec les aérosol-doseurs, un pourcentage plus important du
médicament administré arrive réellement à son site d'action [56]. Une étude à court terme
chez des patients ventilés pour SDRA a montré qu'une nébulisation de salbutamol
permettait d'obtenir une diminution de la résistance mais aussi des pressions des voies
aériennes [97]. L'effet des anticholinergiques a été beaucoup moins étudié que celui des
β2-mimétiques.
L’administration de prostacycline par aérosol chez des patients ventilés pour SDRA a
montré un effet bénéfique sur l'oxygénation artérielle
L'administration de corticoïdes, possible par aérosols-doseurs ou nébuliseurs, a été
proposée dans la dysplasie broncho-pulmonaire de l'enfant, mais son intérêt et son
innocuité restent mal évalués. L'effet du furosémide nébulisé sur la mécanique ventilatoire
d'enfants atteints de dysplasie est diversement apprécié.
L'administration de rhDNase a été ponctuellement utilisée chez une patiente ayant une
atélectasie persistante sous VM [99].
Chapitre 6
6
Une substance sous la loupe: le
salbutamol
6.1 Synthèse du salbutamol
Le salbutamol (cf Figure 21) a été développé à partir d’un
transmetteur naturel, la noradrénaline.
Figure 21
Molécule chimique de la noradrénaline
Les substances adrénergiques sont utilisées dans le
traitement de l’asthme depuis le début du siècle. La
noradrénaline stimulant les récepteurs α et β, une molécule
se liant plus spécifiquement aux récepteurs β est recherchée
afin de diminuer les effets indésirables. En 1941, le
remplacement d’un hydrogène sur l’amine par un groupe
isopropyl, permet la création du premier β2–agoniste
synthétique, l’isoprénaline (cf Figure 22).
Figure 22
Molécule chimique de l’isoprénaline
70
Chapitre 6
Toutefois l’isoprénaline est inactivée trop rapidement par l’enzyme Catéchol-Ométhyltransférase pour être utilisée efficacement dans le traitement de l’asthme. De plus,
dans les années 50, la reconnaissance de récepteurs β1 et β2 conduit au développement
d’agonistes β2-sélectifs, tels que la terbutaline (classe des résorcinols) et le salbutamol
(classe des saligénines). Le salbutamol (cf Figure 23) a été développé dans les années 60,
en remplaçant le groupement isopropyl par un groupement t-butyl et l’alcool du noyau
aromatique par un méthanol [100]. Le salbutamol est un agoniste β2-sélectif et est de plus
métaboliquement stable.
Figure 23
Molécule chimique du salbutamol
Le salbutamol possède un carbone asymétrique et a été commercialisé jusqu’à ces
dernières années sous forme de mélange racémique (-)R et (+)S (cf Figure 24). Comme
pour la majorité des β-sympathomimétiques, l’activité thérapeutique est due
principalement à l’énantiomère (-)R, l’énantiomère (+)S provoquant une hyperactivité
bronchique. La FDA a accepté la commercialisation de cet isomère, le levoalbuterol HCL
(XopenexUSA et SepracorUSA, solutions pour nébulisation). Les premières revues publiées
montrent que l’énantiomère a une activité tout aussi efficace que le mélange racémique,
mais les effets indésirables, notamment cardiaques, semblent tout autant importants et
son prix est nettement plus élevé[101], [102].
(-)R-salbutamol
(+)S-Salbutamol
Figure 24
Molécules chimiques du (-)R-salbutamol et du (+)-Salbutamol
6.2 Pharmacologie du salbutamol
Le salbutamol appartient à la classe des agonistes β2-adrénergiques. L’essentiel de l’action
des β2-stimulants repose sur la relaxation du muscle lisse bronchique, des grosses
bronches aux bronchioles (la sous-classe des récepteurs β2 est la plus représentée dans le
muscle lisse bronchique). Lorsque le médicament arrive dans les voies aériennes
pulmonaires l’effet s’installe très rapidement (80% de l’effet après moins de 5 minutes
avec les β2 à action rapide et de courte durée d’action). L’effet est intense dans la mesure
Chapitre 6
où les β2-stimulants peuvent relâcher le muscle lisse bronchique préalablement contracté.
De plus il s’agit d’un antagonisme fonctionnel capable d’induire une relaxation des
muscles lisses bronchiques, quel que soit le médiateur ayant provoqué la contraction.
Les autres propriétés des β2-stimulants sont présentées dans le Tableau 9. Leur rôle
respectif dans l’effet thérapeutique n’est pas démontré à ce jour. En aucun cas, ils ne
peuvent être considérés comme des anti-inflammatoires.
Tableau 9
Principaux effets bronchopulmonaires des β2-stimulants
Type cellulaire
Effets
Bronches/parenchyme
muscle lisse
Relaxation +++
innervation cholinergique
Inhibition de la libération d’acétylcholine
innervation NANCe
Inhibition de la libération des neuropeptides
cellules épithéliales
Augmentation du battement ciliaire
glandes à mucus
Augmentation de la sécrétion de mucus
cellules de Clara
Augmentation de la sécrétion de lipides
pneumocytes de type II
Augmentation de la sécrétion de surfactant
vaisseaux
Vasodilatation, inhibition de l’extravasation des
protéines plasmatiques
Cellules de l’inflammation
mastocytes
Inhibition de la dégranulation et de la libération
des médiateurs néoformés
éosinophiles
Inhibition du recrutement et de l’activation
(explosion oxydative, libération des médiateurs
néoformés)
Le Tableau 10 montre que les β2-stimulants sont regroupés en fonction de leur latence et
durée d’action. Les agonistes β2 à longue latence et longue durée d’action ne sont pas un
traitement de la crise d’asthme, leur action bronchodilatatrice étant plus longue à s’établir
que celle d’un β2 stimulant d’action rapide.
Tableau 10
Délai et durée d’action des principaux bêta-2-agonistes à des doses équiactives
Doses délivrées par
une bouffée d’aérosol
Délai d’action
[min]
Durée de la
bronchodilatation
[heure]
[μg]
Salbutamol
100
0.8
3-5
Terbutaline
250
1.1
3-6
Fénotérol
100
1.1
3-6
Chapitre 6
Salmétérol
25-50
17
12
Formotérol
6-12
17
12
6.2.1 Mécanisme d’action
La liaison du salbutamol aux récepteurs β2, suivie de leur stimulation, provoque la
stimulation d’AMP cyclique. L’augmentation d’AMPc va induire l’activation de protéines
kinases qui vont déclencher une cascade de réactions de phosphorylation de protéines
régulatrices du tonus musculaire lisse. Les principaux événements biochimiques sousjacents à la stimulation du récepteur β2-adrénergique sont résumés dans la Figure 25. Les
β2-agonistes à longue latence et longue durée d’action se dissolvent dans les lipides de la
membrane cellulaire d’où ils migrent pour agir sur le récepteur β2-adrénergique où ils se
fixent au niveau d’un site d’ancrage et exercent une bronchodilatation prolongée.
Figure 25
Principaux événements biochimiques sous-jacents du récepteur β2-adrénergique AC: adényl
cyclase; DAG: diacylglycérol; IP3 inositol triphosphate; IP4: inositol tétraphosphate; PKA et
PKG: protéines kinases A et G; PLC: Phopholipase C; KCLM; Kinase des chaînes légères de la
myosine; PCLM: phophatase des chaînes légères de la myosine.
Les autres propriétés des β2-stimulants liées à la stimulation des récepteurs β1 et/ou β2
extra-pulmonaires sont:
♦ Effets cardiovasculaires: tachycardie sinusale, hypotension par vasodilatation
♦ Transfert intracellulaire de potassium facilitant les contractions (présence de
récepteurs β2 au niveau des muscles striés).
♦ Baisse de la motilité intestinale
♦ Augmentation de la sécrétion de rénine
Chapitre 6
♦ Relaxation de l’utérus gravide
♦ Effets métaboliques observés à doses élevées: hypokaliémie, hyperglycémie ...
6.2.2 Pharmacocinétique du salbutamol
Les caractéristiques pharmacocinétiques du salbutamol déterminées chez l’adulte sont les
suivantes:
6.2.2.1 Absorption
Le salbutamol est bien absorbé par le tractus gastro-intestinal et suite à l’administration de
4 mg po, un pic plasmatique apparaît après 1-4 h (Cmax = 10-17 μg/L). La
biodisponibilité est d’environ 50%. Lors d’administrations répétées de 4 x 4 mg/j, le
plateau est atteint au troisième jour. Après administration pulmonaire, le pic plasmatique
apparaît dans les 10 à 40 mn.
6.2.2.2 Distribution
Le modèle pharmacocinétique qui convient le mieux au salbutamol est un modèle bicompartimental avec cinétique d’absorption de premier ordre. Le volume de distribution
est de 1,6 à 3,5 L/kg (bonne distribution tissulaire) et la liaison aux protéines est
relativement faible (< 20%). Le rapport [sanguine] / [plasmatique] est d’environ 1.
6.2.2.3 Métabolisme
Le salbutamol est métabolisé essentiellement par conjugaison au niveau hépatique
(réaction de phase II), le métabolite principal étant le dérivé 4’-O-sulfate (inactif). La
réaction est énantiosélective, l’énantiomère (-)R ayant plus d’affinité pour l’enzyme
sulfotransférase. Cette enzyme se trouve également au niveau de la muqueuse intestinale
et du tissu pulmonaire. Après administration par voie orale ou pulmonaire, les taux de
métabolite sulfaté sont plus importants qu’après administration intraveineuse, ce qui
suppose un métabolisme pré-systémique et expliquerait la biodisponibilité orale moyenne
du salbutamol.
6.2.2.4 Elimination
La demi-vie d’élimination (t1/2) est de 2,4 à 5,4 h. L'excrétion urinaire du salbutamol et
de son métabolite principal est rapide (70% éliminés après 24 h.) et varie selon le mode
d'administration: 64 ± 7% de salbutamol et 12 ± 3% de dérivé sulfaté sont excrétés après
administration iv, versus 32 ± 2% et 48 ± 7%, respectivement après administration orale.
La clairance rénale du salbutamol après administration orale est de 272 ± 38 ml/min. et
celle de son métabolite sulfaté de 98 ± 24 ml/min. Etant donné le métabolisme
énantiosélectif, la quantité de (+)S-salbutamol libre retrouvé dans les urines est plus
grande que celle du dérivé (-)R.
Très peu d’études pharmacocinétiques (ou mesure des taux plasmatiques du salbutamol)
ont été réalisées chez des patients pédiatriques. Une étude a été faite après administration
rectale et pulmonaire chez 10 enfants de 5 à 14 ans [103]; une autre après nébulisation
Chapitre 6
chez 10 adolescents atteints de mucoviscidose [104]; une troisième après perfusion
intraveineuse sur 30 min chez 6 nourrissons atteints de dysplasie bronchopulmonaire
[105]. Dans cette étude, les auteurs ont déterminé une tl/2 de 118 ±14 min, un Vd de 1291
± 397 ml/kg et une clairance de 7,5 ± 2,6 ml/kg-min . Une quatrième étude a été réalisée
après perfusion sous-cutanée continue; les taux plasmatiques se situaient entre 12 et 23
ng/ml [106]. Une dernière étude a été faite après nébulisation [107].
6.2.3 Indications du salbutamol
En aérosol: prévention et traitement des bronchospasmes dans l’asthme, y compris
l’asthme d’effort, et la bronchite chronique.
Par voie intraveineuse: bronchospasme sévère et comme tocolytique lors de menaces
d’accouchement prématuré non compliqué (dernier trimestre de la grossesse).
Par voie orale (utilisation rare): traitement et prévention des bronchospasmes dans
l'asthme bronchique, la bronchite chronique et l'emphysème pulmonaire.
6.2.4 Les effets indésirables
Avec la voie inhalée, certains effets indésirables sont liés au passage systémique. Ils sont
observés surtout avec les doses fortes.
♦ tremblement des extrémités et crampes musculaires dues à une stimulation directe
des récepteurs β2 au niveau des muscles squelettiques;
♦ tachycardie sinusale, palpitations (effets directs et indirects sur le muscle
cardiaque);
♦ troubles du rythme cardiaque;
♦ excitation, nervosité, anxiété;
♦ céphalées;
♦ sueurs;
♦ glycogénolyse avec hyperglycémie et hyperlactatémie (stimulation des récepteurs β2
du muscle squelettique);
♦ hypokaliémie par transfert de potassium dans les cellules par stimulation de la
pompe Na-K du muscle squelettique;
♦ toux et parfois bronchospasme à la suite de l’inhalation.
Chapitre 6
Une tolérance par désensibilisation des récepteurs (down-regulaiton) peut se développer
après quelques semaines de traitement, mais est sans conséquence au niveau clinique. Les
corticoïdes inhiberaient d’ailleurs cet effet.
Les contre-indications sont rarissimes: troubles du rythme non contrôlés, insuffisance
cardiaque décompensée. La prudence est de rigueur chez les patients avec pathologie
cardiaque, spécialement chez les personnes âgées.
Chapitre 7
7
Objectifs du travail
Ce travail de diplôme, qui se poursuivra par un travail de
thèse, prolonge une étude in vitro conduite de 1996 à 2000
à la pharmacie du CHUV et intitulée: l’optimisation de la
nébulisation du salbutamol chez l’enfant sous ventilation
mécanique.
7.1 Présentation de l’unité
des S.I.P du CHUV
L’unité de Soins Intensifs de Pédiatrie (SIP) du CHUV est
une unité composée de 9 lits accueillant tous les enfants, de
la naissance à l’âge de 16 ans, qui nécessitent un soutien
vital pour des raisons médicales ou chirurgicales. L’équipe
médicale est composée d’un médecin-chef (Dr. Jacques
Cotting, PD et MER), d’un médecin-associé (Dr. Stücki
Pascal), de deux chefs de clinique, travaillant à 50 et 100%,
et de 4 médecins-assistants en formation en pédiatrie ou en
chirurgie pédiatrique (engagés pour 3 ou 4 mois). L’unité se
trouve également renforcée par les différents spécialistes en
charge des patients hospitalisés: chirurgiens, anesthésistes,
médecins consultants de cardiologie, d’infectiologie, …
L’équipe infirmière est composée d’une infirmière cheffe de
service ou ICS (Mme Anna-Maria Gonzalez), d’une
infirmière cheffe d’unité de soins ou ICUS (Mme ClaireLise Chollet), de 26 infirmières diplômées (EPT) et
d’infirmiers-enseignants. D’autres professionnels travaillent
dans l’unité comme un responsable du matériel, des aidessoignants, des physiothérapeutes, des assistantes sociales,
un aumônier, un éthicien, du personnel administratif, etc.
Parmi les consultants on peut également signaler la
présence d’un pharmacien qui chaque semaine s’entretient
77
Chapitre 7
avec l’ICUS des problèmes rencontrés lors de l’administration des médicaments et qui
chaque mois participe à la visite médicale. Le pharmacien est disponible le reste du temps
sur appel.
Cela fait maintenant plus de 10 ans (dès 1991) que les SIP effectuent un contrôle de
qualité par l’évaluation de la mortalité(score PRISM [108]), des complications iatrogènes
évitables, de l’utilisation des médicaments et du matériel, de la pertinence des admissions
et des journées de séjour et de l’état neurologique des patients à la sortie des SIP.
7.2 Travaux effectués
7.2.1 Revue de l’utilisation du salbutamol
En 1997, dans l’étude citée ci-dessus, une revue de l’utilisation du salbutamol chez les
enfants hospitalisés dans l’unité des Soins Intensifs médico-chirurgicaux de Pédiatrie du
CHUV (SIP) avait été faite. Le but de cette étude était de connaître l’emploi du
salbutamol dans l’unité des SIP en réalisant:
♦ Une statistique de la consommation et de l’utilisation du salbutamol de 1996 à
1998,
♦ Une observation des pratiques dans l’unité et une revue rétrospective de dix cas
d’enfants hospitalisés en 1997
7.2.1.1 Résultats de l’étude
La revue de l’utilisation du salbutamol dans cette unité a monté que les bronchospasmes
chez les enfants hospitalisés aux SIP sont relativement fréquents. Ils peuvent résulter
d’une crise d’asthme sévère, d’une bronchiolite à VRS ou des suites d’opérations
chirurgicales au niveau ORL, thoracique ou abdominal. Pour les traiter, on utilise
notamment le salbutamol en aérosol. Ainsi, de 1996 à 1998, 30 à 50% des enfants sous
ventilation mécanique ont reçu des bronchodilatateurs. Des trois marques de nébuliseurs
pneumatiques utilisés dans l’unité chez les patients intubés, le Microneb NA420, le
Sidestream Durable et le Babylog, seul ce dernier est prévu pour une utilisation avec le
ventilateur du même nom. Les deux autres sont commercialisés pour des thérapies par
inhalation chez des patients en ventilation spontanée et ne sont pas prévus pour une
propulsion au moyen d’un ventilateur. Il était donc tout à fait légitime de s’interroger sur
le rendement de la nébulisation et l’efficacité de tels traitements chez les enfants intubés.
7.2.2 Etude in vitro
Cette étude qui avait pour buts, à travers la comparaison de six modèles de nébuliseurs
pneumatiques, de:
♦ tester différents paramètres physico-chimiques, comme les variations d’osmolalité,
de taille de particules, de concentration en principe actif, de température et de pH
des solutions de salbutamol au cours de la nébulisation [109];
Chapitre 7
♦ évaluer la délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle in vitro
de ventilation mécanique pédiatrique selon trois modes d’administration différents:
durant l’inspiration, l’expiration ou en continu (cf Figure 26).
Les résultats obtenus contredisent les recommandations américaines [38], puisque le
mode standard (nébulisation pendant l’inspiration) est le moins efficace. Le mode de
nébulisation durant l’expirium (activité durant la phase inspiratoire du cycle ventilatoire)
est celui ayant donné les meilleurs résultats (environ 300x plus efficace suivant le modèle
de nébulisateur). Ceci peut s’expliquer par le fait que durant l’expiration, le nébuliseur est
activé et le tuyau inspiratoire se remplit d’aérosol (effet spacer). Ensuite, pendant
l’inspiration suivante, l’aérosol atteint le bout du tube endotrachéal.
Figure 26
Le tableau suivant (cf Tableau 9) résume quelques résultats obtenus lors de cette étude
qui montrent clairement la supériorité de la distribution de l’aérosol en mode expirium:
Tableau 11
Délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle pédiatrique in vitro
Nébuliseur
Mode de
Nébulisation
Proportion de Proportion de Proportion de Proportion de
PA
PA
PA
PA
inhalé (%)a b
expiré (%)a b
restant dans
déposé ailleurs
Chapitre 7
Microneb
Sidestream
7.2 ± 0.8
85.3 ± 0.7
7.2 ± 0.9
B Continu b
1.5 ± 0.2
19.1 ± 2.4
71.3 ± 3.5
8.1 ± 1.8
C Intermittent/ 2.7 ± 0.9
Expirium c
10.0 ± 2.8
81.6 ± 3.3
5.7 ± 3.5
D Continu/
Externe b
1.9 ± 0.2
11.9 ± 1.6
77.6 ± 2.4
8.6 ± 3.0
A Intermittent/ 2.7 ± 0.6
Inspirium b
31.8 ± 4.1
50.0 ± 7.8
15.5 ± 3.3
B Continu b
5.0 ± 0.7
44.2 ± 0.7
32.4 ± 1.6
18.4 ± 2.5
Expirium c
39.8 ± 4.7
32.3 ± 2.5
18.9 ± 6.4
5.4 ± 0.5
46.5 ± 1.2
31.9 ± 2.5
16.2 ± 2.9
Inspirium b
17.4 ± 1.5
72.4 ± 5.2
9.4 ± 3.8
B Continu b
5.8 ± 0.6
47.4 ± 2.9
28.9 ± 2.9
17.9 ± 0.9
Expirium c
28.7 ± 7.9
37.3 ± 5.0
26.8 ± 12.7
4.6 ± 0.8
35.8 ± 6.9
36.0 ± 6.1
23.6 ± 12.7
Inspirium b
29.1 ± 5.0
55.3 ± 7.1
13.8 ± 5.0
B Continu b
3.5 ± 0.7
28.9 ± 7.8
26.8 ± 7.4
40.8 ± 14.5
Expirium c
23.6 ± 10.9
42.6 ± 9.8
29.1 ± 16.7
3.4 ± 0.7
30.4 ± 9.3
30.9 ± 3.7
35.3 ± 7.8
Inspirium b
30.4 ± 3.0
51.4 ± 8.1
14.8 ± 4.8
B Continu b
3.8 ± 0.7
33.7 ± 4.7
46.6 ± 7.0
15.9 ± 3.5
Expirium c
30.1 ± 7.4
43.2 ± 8.0
19.6 ± 10.0
4.0 ± 0.5
37.5 ± 2.2
43.0 ± 2.2
15.5 ± 2.3
Inspirium b
31.7 ± 2.4
51.4 ± 3.2
14.3 ± 2.5
B Continu b
4.7 ± 0.2
39.1 ± 2.4
41.9 ± 2.1
14.3 ± 1.7
Expirium c
34.9 ± 2.6
43.1 ± 3.7
13.7 ± 1.7
D Continu/
45.6 ± 3.6
33.9 ± 3.0
14.9 ± 1.6
D Continu/
Externe b
Cirrus
D Continu/
Externe b
Upmist
D Continu/
Externe b
Micro Mist
ds le circuit
(%)a b
Inspirium b
D Continu/
Externe b
Acorn II
le nébuliseur
(%)a b
5.6 ± 0.4
Chapitre 7
Externe b
a.
Moyenne ± écart-type (n = 5 ), exprimée en % de la dose initiale de salbutamol
sulfate.
b.
Nébuliseurs à une distance de10 cm de la pièce en Y.
c.
Suite à cette étude, seul le nébuliseur Sidestream Durable est utilisé aux SIP. De plus on
observe également une forte diminution de la consomation de Ventolin®, les résultats de
l’étude in vitro montrant le faible rendement d’une telle nébulisation.
Le modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique, développé pour déterminer la
quantité inhalée d'aérosol, représente un moyen simple, sûr et économique. Il présente
néanmoins les limites d'une étude in vitro où les conditions d'expérience sont contrôlées
et idéalisées, ne correspondant pas forcément à la situation clinique. Par conséquent, il est
fondamental de confirmer ces résultats par une étude in vivo.
7.3 Etude actuelle
7.3.1 Les méthodes pharmacocinétiques
La littérature fait part de différents travaux utilisant des études pharmacocinétiques pour
caractériser la déposition pulmonaire des substances médicamenteuses après nébulisation.
On trouve des études plasmatiques et urinaires:
7.3.1.1 Les études plasmatiques:
La mesure de l’aire sous la courbe (AUC) suivant l’inhalation donne une indication de la
quantité totale de médicament délivré dans le corps. Ceci a permis de comparer différents
dispositifs pour inhalation. Newnham [110] a montré que l’AUC suivant l’inhalation de
salbutamol via un aérosol-doseur pressurisé modifié était augmenté de 24,5% par rapport
à un type standard. De même une comparaison entre une dose de budénoside administré
à l’aide d’un aérosol-doseur contenant du CFC a donné une AUC 13,4% plus petite que
lors d’une administration avec un aérosol sans CFC [111]. L’analyse par scintigraphie
gamma a montré que cette différence était due à un dépôt pulmonaire augmenté [112].
Lors de l’inhalation, seul 6-10% de la dose inhalée atteint les poumons [113], le reste étant
avalé et/ou nébulisé dans l’air ambiant. Si l’on se trouve en présence de substances ayant
une absorption gastro-intestinale négligeable, tel le cromoglycate de sodium ou le
propionate de fluticasone, les concentrations plasmatiques de ces médicaments reflètent
entièrement leur absorption pulmonaire, permettant de caractériser de façon précise leur
biodisponibilité pulmonaire[113]. Dans le cas contraire, afin de différencier la proportion
de médicament qui atteint la circulation systémique après un passage transpulmonaire, de
celle qui y parvient par la voie gastro-intestinale[113], deux approches sont utilisées:
Chapitre 7
♦ Certaines études préconisent l’administration de charbon actif avant et après la
nébulisation. Cette méthode a été utilisée lors d’une étude sur l’absorption
pulmonaire de la terbutaline, celle-ci passant de 10% à 0.3% lors de l’emploi de
charbon actif [114]. Cette technique a été reprise afin de déterminer le dépôt
pulmonaire de la terbutaline toujours, à partir de différents dispositifs (MDI, DPI)
et pour d’autres substances tel le budénoside [115]. Le charbon actif est gargarisé
puis avalé 5 minutes avant et 5 minutes après l’administration du médicament
nébulisé, sa dose est de 5 grammes dilués dans 20 ml d’eau [114].
♦ Une autre méthode pour différencier l’absorption orale de l’absorption pulmonaire
est d’exploiter l’intervalle de temps séparant ces deux voies. Les échantillons de
plasma prélevés aux temps 5, 10 et 20 minutes post inhalation ont permis de
comparer la déposition pulmonaire de différents types de nébuliseurs et de
différentes techniques de nébulisation [116], [117], [118], [119], [120], [121], [122].
En effet après administration orale du salbutamol seul 0.18% de la dose est
excrétée dans les trente premières minutes. Plus précisément ces trente premières
minutes représentent le décalage entre l’administration du médicament et son
absorption orale. Si l’on transpose ces résultats à une technique d’inhalation, on
peut admettre qu’un dosage sanguin ou urinaire du salbutamol durant ce laps de
temps est représentatif de la quantité de médicaments ayant atteint sa cible, c’est-àdire les poumons.
7.3.1.2 Les études urinaires:
Les substances polaires sont aisément excrétées dans l’urine avec une faible variabilité
causée par une réabsorption tubulaire passive lorsque le pH urinaire change. Le dosage
des médicaments dans des prélèvements urinaires a donc aussi été réalisé.
Une première étude, mesurant la quantité totale de terbutaline inchangée excrétée dans les
urines après inhalation a été menée par Borgström et Nilsson [114]. L’inhalation a été
précédée de la prise de charbon actif, celui-ci diminuant de 10% à 0.3% la biodisponibilité
orale de la terbutaline selon une étude préalable. Cette méthode utilisée pour quantifier la
déposition pulmonaire a été comparée avec la scintigraphie gamma chez six volontaires.
L’analyse montre une excrétion urinaire de 21.1 ± 3.2% de la dose terbutaline, alors que la
scintigraphie indiqua une déposition pulmonaire de 26.9 ± 3.8%. La différence entre les
deux méthodes est due principalement à la clairance mucociliaire d’une partie de la dose
déposée dans la zone centrale des poumons, ne se retrouvant forcément pas lors de
l’analyse urinaire.
Hindle et Chrystyn [123] ont montré que la quantité de salbutamol excrété dans les 30
premières minutes suivant l’inhalation représente la biodisponibilité pulmonaire du
médicament. En effet, après administration orale de salbutamol, les récoltes urinaires
faites dans la première demi-heure indiquent que seul 0.18 ± 0.14 % de la dose est
excrétée, alors que suite à la nébulisation on trouve une excrétion de 2.06 ± 0.8% de la
dose. Cette méthode permet d’éviter l’administration de charbon actif [124].
Chapitre 7
Il faut être très prudent lorsque l’on veut extrapoler des données obtenues chez des
volontaires sains à des patients asthmatiques. En effet des études [113] montrent que les
données plasmatiques obtenues après inhalation de propionate de fluticasone sont
significativement plus basses chez les patients asthmatiques que chez les volontaires sains
autant du point de vue du pic de concentration plasmatique que de l’aire sous la courbe
concentration-temps. Ces différences semblent indiquer un dépôt pulmonaire moins
important chez les personnes asthmatiques, probablement dû à un rétrécissement des
voies aériennes, ainsi qu’à une capacité réduite à inhaler efficacement, empêchant le
salbutamol d’atteindre le poumon.. Ces résultats concordent avec les changements de
taux de cortisol observés chez des personnes avec un asthme sévère après un traitement
chronique de propionate de fluticasone [Chrystyn, 2000 #232]. En effet suite à un
traitement journalier de 1 mg de propionate de fluticasone durant 6 semaines aucune
diminution des taux de cortisol matinaux dans le sérum n’a été observée. A une posologie
journalière de 2 mg sur une même période, la diminution moyenne est de 12%, nettement
inférieure à celle attendue au regard des résultats obtenus chez les volontaires sains. Ce
même phénomène a été observé avec d’autres glucocorticoïdes inhalés, tels le budénoside
ou le propionate de béclométhasone. Il en va de même pour le salbutamol à une
posologie de 40 μg/kg.[Chrystyn, 2000 #232], [120].
Cette revue de littérature montre que les méthodes pharmacocinétiques utilisant les
dosages urinaires et plasmatiques peuvent être utilisées pour caractériser la déposition
pulmonaire totale.
Si une étude pharmacocinétique est faite pour confirmer les résultats obtenus in vitro, il
sera indispensable, lors de l'étude chez les patients, de tenir compte de critères cliniques
pour déterminer si in vivo un mode de ventilation est effectivement plus efficace que
l'autre. En effet, si une différence de concentration est obtenue entre les deux modes de
nébulisation, il faudra prouver qu’elle a une signification clinique (augmentation du
volume respiratoire par exemple et qu’elle n’est pas limitéequ’à un bénéfice technique.
7.3.2 Buts de l'étude
♦ Développer une méthode analytique permettant l'utilisation d'une quantité
minimale de sang pour le dosage du salbutamol administré par nébulisation.
♦ Montrer une corrélation possible entre le dosage urinaire et le dosage sanguin du
salbutamol dans les mêmes conditions.
♦ Démontrer que la délivrance pulmonaire de la nébulisation en mode expirium est
plus efficace qu'en mode inspirium en déterminant les taux sériques de salbutamol
chez des volontaires sains dans un premier temps puis chez des enfants sous
ventilation mécanique.
♦ Confirmer la différence entre le nébuliseur ayant la délivrance la plus faible dans
l'étude in vitro et celui considéré comme le plus efficace.
Chapitre 7
Un protocole de recherche a été soumis à la commission d’éthique de la recherche
clinique de la faculté de médecine de Lausanne (cf Annexe 1). Ce protocole, qui concerne
l’étude préalable chez le volontaire sain, a été accepté au mois de septembre 2002.
L'absorption des médicaments chez les patients atteints de pathologies respiratoires étant
différente de celle observée chez les volontaires sains, il sera indispensable de confirmer
les résultats de ce premier travail par une étude portant directement sur la population
concernée. Ceci est d'autant plus important, que l'étude préliminaire sera faite sur une
population adulte, car il n’est paséthiquement défendable de mener celle-ci chez des
enfants.Toutefois cette première étude est indispensable afin de confirmer les résultats
obtenus in vitro, justifiant celle chez les patients. De plus, elle permettra de développer
une méthode de dosage la moins invasive possible. Une comparaison des dosages
plasmatique et urinaire sera faite dans le but de réaliser par la suite uniquement des
prélèvements urinaires, si une équivalence peut être établie entre les deux méthodes.
Ce travail de mémoire, qui représente la première partie du travail de thèse a pour but de
mettre au point les méthodes de dosage sanguin et urinaire du salbutamol, ainsi que leur
validation pharmaceutique. Cinq volontaires sains, qui n’étaient pas sous ventilation
mécanique, ont également reçu une nébulisation de salbutamol, afin de préparer l’étude
clinique chez les volontaires sains proprement dite et de contrôler la sensibilité suffisante
des méthodes analytiques. Les buts de ce travail de mémoire sont donc de:
♦ mettre au point une méhode de dosage plasmatique et urinaire du salbutamol et
valider ces dosage .
♦ appliquer ces méthodes sur des échantillons prélevés chez des volontaires sains
afin de les valider et de les comparer aux données obtenues dans la littérature.
Chapitre 8
8
Matériel et Méthode
8.1 Préambule
Ce travail de mémoire représente une étape intermédiaire du
projet de recherche décrit ci-dessus. Il décrit le
développement et la validation des deux méthodes
analytiques développées pour doser dans le plasma et dans
l’urine le salbutamol administré par inhalation. En effet afin
de pouvoir émettre des recommandations sur la manière la
plus efficace d’administrer des médicaments par
nébulisation, il est essentiel de pouvoir s’appuyer sur des
méthodes de dosages sûres et performantes, donnant des
résultats solides. La particularité de ces méthodes analytiques
est que les taux plasmatiques de salbutamol attendus après
nébulisation sont faibles, de l’ordre du ng par ml. De plus la
plupart des études ne tiennent pas compte de l’absorption
gastrique du salbutamol et se font sans l’ingestion de
charbon actif. On peut donc s’attendre en lisant ces travaux
à des taux plasmatiques supérieurs à ceux que nous
rencontrerons.
8.2 Réactifs
Les substances pures utilisées pour la mise au point de la
méthode de dosage sont le salbutamol sulfate et le
baméthane utilisé comme étalon interne.
Une solution stock de salbutamol [1 mg/ml] a été préparée à
partir de 48.2 mg de salbutamol sulfate (Synopharm,
Barsbüttel, Allemagne, art. 701154) dissous ad 20 ml de
MeOH. Un bain à ultrason Branson 5200 a été utilisé pour
faciliter la mise en solution du salbutamol.
85
Chapitre 8
A partir de ces solutions, les solutions de travail ont été préparées par dilution dans du
H3PO4 0.01M.
Les solutions stock de salbutamol ont été aliquotées et conservées à –20°C, où elles sont
stables durant 6 mois [125].
Les solutions stock d’étalon interne [0.2 g/ml] ont été préparées à partir de 24.6 mg de
baméthane sulfate (Sigma Chemical, St Louis, Mo, USA,art. B-0382) dissous ad 100.0 ml
d’eau.
Les solutions stock d’étalon interne ont été aliquotées et conservées au frigo où elles sont
stables durant 1 mois [125].
Les solutions de travail de baméthane [0,5 ng/ml] ont été préparées en diluant
extemporanément la solution stock avec une solution de KHCO3 1%.
La solution de bicarbonate de potassium (KHCO3) à 1% a été préparée par dissolution de
1.0 g de KHCO3 (Hänseler, Herisau, Suisse, art. 6-4704-2) ad 100 ml avec de l’eau.
La solution d’acide phosphorique (H3PO4) 0.01 M a été préparée en diluant 2.3 g de
H3PO4 85% (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.00552) ad 1.0 L avec de l’eau.
L’eau de qualité HPLC (H2O), le méthanol de qualité gradient (MeOH) et l’acétonitrile
(ACN) proviennent de Merck (Darmstadt, Allemagne, art. 1.15333, 1.06007 et 1.80030
respectivement), l’acide acétique glacial (CH3COOH) de Merck (Darmstadt, Allemagne,
art. 1.00066), le tampon de phosphate BPS (NaCl 6.8 g, Na2HPO4 1.48 g, KH2PO4 0.43
g, H2O ad 1L, pH 7.1-7.3) de Bichsel (Interlaken,Suisse, art. 100 0 324), le Low UV Pic
B7 (acide heptano-sulfonique) de Waters (Milford, USA, art. Wat084282), les solutions
d’ammoniaque ont été diluées à partir de l’ammoniaque (NH4OH) 25%( Merck,
Darmstadt, Allemagne art. 1.05432). L’acide chlorhydrique (HCl) 5N provient de Merck,
(Darmstadt, Allemagne, Art. 1.09911), ainsi que l’hydroxyde de sodium (NaOH) 5N
(Merck, Darmstadt, Allemagne, Art. 1.09913).
Les solutions de nébulisation ont été préparées avec la solution concentrée de Ventolin®
0.05% (GlaxoSmithKline, Münchenbuchsee, Suisse, lot 0087675) diluée avec du NaCl
0,9% de B. Braun (B.Braun Medical, Emmenbrücke, Suisse, art. 534534): la concentration
des solutions de salbutamol était de 10 mg/4 ml, pour 2 volontaires sains et de 5 mg/4ml
pour les 3 trois autres.
Les pesées ont été réalisées à l’aide d’une balance analytique Mettler AT 250, reliée à une
imprimante Mettler-Toledo LC-P45 Printer.
8.3 Récolte des échantillons
Cinq volontaires sains ont reçu un aérosol de 10 ou 5 mg de salbutamol durant 15
minutes. La nébulisation s’est faite à l’aide d’un nébuliseur pneumatique à double venturi,
Chapitre 8
le Sidestream® (Medic-Aid Ltd, West Sussex, Royaume-Uni, art. 44455U) connecté à un
embout buccal adapté au nébuliseur fourni par Homedica (Hürenberg, Suisse, art.
1605A), à un débit de 8 L/mn. Les volontaires avaient le nez bouché par un pince-nez.
Durant la nébulisation et l’heure suivante, leur rythme cardiaque a été contrôlé. Une
perfusion de 1000 ml de NaCl 0.9% (B. Braun Medical, Emmenbrücke, Suisse, charge
3362H42) leur a été posée sur 2 heures, assurant une bonne perfusion et permettant des
prélèvements urinaires réguliers.
Les récoltes plasmatiques et urinaires ont été faites de la manière suivante:
Les échantillons sanguins ont été prélevés aux temps t=0, 15, 30, 45, 60 minutes, puis
toutes les heures jusqu’à t= 8 heures.
Les S-Monovettes CPDA1 de 8.5ml (Sarstetdt, Sevelen, Switzerland, art. 04.1910.001) ont
été utilisées pour la récolte du sang. Suite au prélèvement, les échantillons ont été
centrifugés pendant 15 minutes à 4000 g. La centrifugeuse utilisée pour récolter le plasma
des échantillons sanguins est un modèle Hettich Rotanta/RP. Le volume de plasma
récolté se situe entre 4 et 5 ml suivant les prélèvements. Le plasma a été analysé
directement après centrifugation et le surplus congelé à –20°C.
Les urines ont été récoltées aux temps t=0, 30 et 60 minutes, toutes les heures jusqu’à t=
6 heures, puis à t= 10 heures et à t= 24 heures dans des pots en matière plastique de 500
ml, 1L ou 2L.
Ces pots tarés ont été pesés suite à la récolte. Une mesure de la densité et de la masse
volumique des échantillons urinaires a été faite. Avant analyse, l’urine a été centrifugée
avec le même appareil que ci-dessus pendant 15 minutes à 4000 g. Les échantillons ont été
stockés au frigo pendant 24 heures avant d’être analysés, un échantillon de chaque
prélèvement a également été stocké au congélateur à –20°C.
Pour la mise au point de la méthode, 15 plasmas différents ont été utilisés, obtenus auprès
du Centre de Transfusion Sanguine (Lausanne, Suisse)
Les échantillons urinaires pour la mise au point de la méthode proviennent de 5 donneurs
adultes non-asthmatiques.
8.4 Préparation des échantillons
Les échantillons plasmatiques et urinaires ont été acidifiés (200 μl d’H3PO4 0.01M), afin
de libérer le salbutamol des protéines plasmatiques, puis soumis à une extraction en phase
solide (SPE).
L’extraction est la première étape de l’analyse qui permet d’isoler une substance de la
matrice complexe, ici le plasma ou l’urine, dans laquelle elle se trouve et d’éliminer un
maximum de substances parasites contenues dans celle-ci.
Chapitre 8
Il existe différents types d’extraction de milieux biologiques dont les plus courants sont:
♦ L’extraction liquide-liquide: le principe est fondé sur la distribution d’un soluté
donné entre deux solvants non miscibles en fonction de sa solubilité dans chacun
d’eux. Toutefois ces procédures sont longues et fastidieuses.
♦ L'extraction liquide/solide ou en phase solide ou encore SPE (pour Solid Phase
Extraction) est une alternative élégante à l'extraction liquide/liquide. L’extraction
en phase solide permet une procédure d’extraction plus rapide, une utilisation d’un
volume moins important de solvant polluant et une élimination simple des
interférents (par lavage) par rapport à une extraction liquide-liquide. De plus elle
permet dans certains cas une préconcentration ou un enrichissement de
l’échantillon à analyser et peut être facilement automatisée.
8.4.1 Les principes de l’extraction SPE
L’extraction en phase solide ou sur un support solide (SPE = Solid Phase
Extraction) consiste à percoler l’échantillon aqueux sur un support solide pour piéger les
analytes recherchés. La séparation d’un composé n'est pas la seule application possible de
la SPE, puisque celle-ci est utilisée à des fins de concentration et parfois pour le dessalage
de solutions, un changement de solvant ou encore une dérivation en ligne.
Le principe de base de la SPE est celui de la chromatographie en phase liquide poussé à
l'extrême, où l’on freine la migration des diverses familles de molécules en les retenant
sélectivement sur un adsorbant. En SPE on bloque ces mêmes molécules sur cet
adsorbant, puis on les élue brutalement et sélectivement en les décrochant du support par
un solvant spécifique.
Les adsorbants utilisés sont de diverses natures: les plus répandus sont à base de silice
greffée. En SPE la majorité des silices encore utilisées sont de type irrégulières de 45µm
environ. La nature des greffons détermine le mode d'interaction mis en œuvre. Ainsi un
greffage C18 sera foncièrement apolaire et ne retiendra les diverses molécules que par
interactions de type Van Der Waals. La silice activée ne permet que des interactions de
type polaire par pontage hydrogène. Un greffon aminopropyl (NH2) sera tantôt polaire,
tantôt échangeur d'ions (en fonction du pH). Les interactions secondaires dues aux
silanols libres de la silice sont malgré tout à prendre en compte dans le comportement
général de l'adsorbant. Pour minimiser ces interactions secondaires on a souvent recours
au End Capping qui bloque une partie des OH libres à la surface de la silice par une
substitution de l'hydrogène par un Si(CH3)3.Un greffage de type polymérique permet
également de mieux protéger l'accès à ces sites actifs. L'échange d'ions est la technique de
choix lorsque l'on recherche une extrême sélectivité.
Les résines, souvent à base de Styrène Divinyl Benzène, offrent un plus large spectre
d'adsorption en terme de polarités. Pour des applications plus spécifiques, on rencontre
des adsorbants moins courants comme le Florisil®, l'alumine, le carbone graphitisé ou
Chapitre 8
encore des terres de diatomées fossiles (pour l'extraction liquide/liquide sur support
solide).
Une extraction SPE se décompose en un certain nombre d'étapes plus ou moins
nombreuses en fonction de l'adsorbant utilisé et de la complexité de l'échantillon. Le
principe fondamental est le fameux triangle d'équilibre entre le composé d'intérêt, la
matrice et l'adsorbant. En général, la procédure est la suivante (cf Figure 27):
♦ Conditionnement: (ou solvatation) Cette étape sert à conditionner la cartouche en
mouillant la phase solide avec un solvant organique (souvent du méthanol) et, dans
le cas de greffons longs (C18, C8 ...), à les redresser sur la silice, ceci afin que les
interactions puissent avoir lieu.
♦ Equilibration: Il faut éliminer l'excédent de solvant de conditionnement en rinçant
la cartouche avec le solvant de l'échantillon (de l'eau distillée par exemple dans le
cas d'un échantillon aqueux).
♦ Dépôt de l'échantillon
♦ Lavage: il est réalisé avec un solvant permettant d’éliminer certains composés
indésirables de la cartouche tout en maintenant les composés d'intérêt adsorbés.
Cette phase peut être répétée avec divers solvants mais elle est parfois shuntée
pour extraire directement les composés d'intérêt en laissant les interférents bloqués
sur l'adsorbant.
♦ Elution: on récupère les composés d'intérêt avec le solvant approprié.
♦ Concentration: on procède le plus souvent par évaporation, d'où l'intérêt des
cartouches à disque qui nécessitent moins de solvants.
Certaines étapes intermédiaires viennent parfois s’ajouter comme par exemple, un
séchage de la cartouche avant élution pour éviter de récupérer de l'eau dans l'échantillon
pur. L'un des points les plus délicats est probablement le pré-traitement de l'échantillon
quant il s'avère nécessaire: ajuster un pH pour que les composés d'intérêt soient libres ou
diluer pour ramener l'échantillon à une viscosité raisonnable, précipiter ou filtrer les
molécules en suspension.
Chapitre 8
Figure 27
Les différentes étapes d’une extraction SPE
Le salbutamol, appelé aussi 2 –tert-Butylamino-1-(4-hydroxy-3-hydroxymethphenyl)
ethanol, est une base avec deux constantes de dissociation : pKa : 9.3, 10.3
La molécule de salbutamol contient des groupements polaires et non polaires, ainsi
qu’une fonction amine ionisable. Sa structure chimique lui permet donc d’interagir avec
différents types de phases solides. Les mécanismes d’extraction comprennent des
interactions polaires (silice) et non polaires (C18), des interactions avec des polymères avec
des capacités de double rétention des produits polaires et non polaire (Oasis®), ainsi que
des interactions avec une phase combinée permettant des liaisons hydrophobes et des
échanges de cations (Bond-Elut Certify®).
Constante de dissociation : pKa : 9.3, 10.3
Le salbutamol ne se trouve sous forme neutre à aucune valeur de pH.. Cette molécule est
ionisée et donc hydrophile à des valeurs de pH basses et très hautes et relativement
hydrophobe à un pH de 8.5. Cependant même à ce pH seul le 60% du salbutamol se
retrouve sous forme neutre. Par exemple. à pH acide, la fonction phénolique du
salbutamol se trouve sous forme non ionisée, tandis que la fonction amine est protonée.
Lors de l’extraction on cherche à travailler à un pH où la molécule à séparer se trouve en
majorité sous forme neutre. En travaillant avec une phase stationnaire de silice, nous
avons utilisé un tampon phosphate à pH 7.1-7.3, afin d’augmenter la rétention de la
molécule et par là la reproductibilité de nos extractions.
Chapitre 8
8.4.2 Procédure d’extraction en phase solide (SPE):
Les extractions ont été faites avec un système Visy-prep® de 24 positions (Supelco,
Bellefonte, PA, USA, art. 5-7265). Sept différentes cartouches d’extraction SPE ont été
testées (Supelclean® LC-18 1 ml (Supelco, Bellefonte, PA, USA, art. 504270), Oasis®
HLB 1 cc (Waters, Milford, MA, USA, art. Wat094225), Oasis® MCX 60mg/3cc
(Waters, Milford, MA, USA, art. 186000254), SPEC® Si 15 mg/3cc (art. A5320820),
SPEC C18 15 mg/ cc (,art.), Bond Elut Certify I HF (130 mg/10 ml) (Varian, Lake
Forest, CA, USA, art. 1411-3050), Bond-Elut®-Si (100mg/ml et 500mg/3 ml) (Varian,
Lake Forest, CA, USA, art. 12102010 et art. 12102037).
Les tests ont été réalisés avec des blancs d’urine et de plasma ainsi que du plasma et de
l’urine spikés avec respectivement 6.25 ng/ml et 20 ng/ml.
Les résultats des différents tests réalisés se tourvent dans l’annexe 2.
8.4.2.1 Colonne Supelclean® C18
C’est une colonne greffée C18 "end-capped". Il s’agit donc d’une phase apolaire
(octadecyl), avec des interactions secondaires polaires faibles. Cette colonne peut être
utilisée pour des échantillons aqueux, fluides biologiques, avec une large gamme de
polarité des composés retenus. C’est la plus utilisée des phases SPE à cause de son
"universalité" (interactions de types Van der Waals).
L’extraction du plasma avec les colonnes Supelclean® (cf Annexe 2.1) a permis
d’effectuer une prévalidation et une validation de méthode. Cependant le seuil de
quantification déterminé, se situant vers 20 ng/ml, était trop élevé par rapport aux
concentrations plasmatiques attendues après nébulisation du salbutamol. De plus lors
d’un test avec trois volontaires sains, malgré les différents plasmas testés préalablement,
un pic apparaissait au temps t=0 (donc avant la nébulisation), avec le même temps de
rétention que le salbutamol chez l’une des personnes testées.
Les tests réalisés avec l’urine n’ont pas été satisfaisants, ils n’ont pas permis d’obtenir une
chromatogramme propre (cf Annexe 2.1)
8.4.2.2 Colonne Oasis® HLB
Le support copolymérique de phase inverse, Oasis® HLB (Hydrophilic-Lipophilic
Balance) basé sur un équilibre hydrophile-hydrophobe dû à l’association du NVinylpyrrolidone et du Divinylbenzene permet d’éviter tous les désagréments des
supports à base silice: assèchement, limites de pH, interaction silanolique, capacité et
rétention faible des produits polaires.
Les essais réalisés avec ces colonnes ne nous ont pas permis d’obtenir un
chromatogramme propre lors de l’extraction de plasma et d’urine exempts de salbutamol
(cf Annexe 2.2).
Chapitre 8
8.4.2.3 Colonne Oasis® MCX:
Il s’agit d’un nouveau support en mode mixte, qui utilise les propriétés de l’association du
copolymère de phase inverse HLB et de sites échangeurs de cations. Ce support offre une
plus grande sélectivité pour les extractions de molécules basiques.
Les essais réalisés avec ces colonnes ne nous ont pas permis d’obtenir un
chromatogramme propre lors de l’extraction de plasma et d’urine exempts de salbutamol
(cf Annexe 2.3).
8.4.2.4 Colonnes SPEC®
SPEC® est une nouvelle technologie d’extraction liquide/solide. La phase stationnaire est
fixée sur un disque en fibre de verre. Cette conception permet l’utilisation de faibles
volumes d’élution, de réduire le nombre et la durée des étapes de la procédure
d’extraction. Les phases stationnaires greffées sont de même type que pour les autres
colonnes, parmi lesquelles nous avons testé la silice, un mode mixte et une C18. Les
différentes colonnes SPEC® ont été testées uniquement avec l’urine.
Lors de l’extraction urinaire avec la colonne SPEC®-Si ni le salbutamol ni l’étalon interne
ne sont retenus sur la colonne avant l’élution (cf Annexe 2.4.1).
Avec la colonne SPEC®-C18, c’est l’extraction du baméthane qui n’est pas concluante(cf
Annexe 2.4.2).
8.4.2.5 Bon-Elut Certify® I HF
Dans la littérature, la colonne la plus utilisée pour l’extraction urinaire du salbutamol est la
Bon-Elut Certify®.
La colonne Bond-Elut Certify® est de mode mixte C8 non ″endcapped″ et SCX (acide
benzenesulfonique: échangeur de cations forts). Mise au point pour l'extraction de
drogues et médicaments acides des fluides biologiques, elle convient également à un
grand nombre d'extractions de matrices aqueuses. Les conditions de travail sont résumées
à l’Annexe 2.5.
Les résultats obtenus avec cette colonne pourtant souvent citée dans la littérature, ne se
sont pas avérés satisfaisants.
8.4.2.6 Colonne Bond-Elut® Si:
Il s’agit d’une phase polaire à caractère acide. C’est l’adsorbant le plus polaire et le plus
utilisé pour l'extraction de composés plus ou moins polaires dans un solvant apolaire.
Cette colonne a donné les résultats les plus satisfaisant et la meilleure séparation du pic de
salbutamol par rapport aux autres pics présentes dans les deux matrices. Elle a donc été
retenue pour l’extraction plasmatique et urinaire
Chapitre 8
Les tests d’extraction effectués avec les différents types de colonnes, ainsi que les résultats
obtenus se trouve à l’Annexe 2.6.
Après les essais préliminaires, les deux méthodes d’extraction retenues sont les suivantes:
8.4.2.7 Extraction plasmatique
La procédure d’extraction utilisée est celle mise au point par Gupta [125] pour le plasma
avec des cartouches Bond-Elut® Si (100 mg/ml).
Le passage des solutions se fait sans appliquer de vide d’air, les cartouches sont séchées
après le lavage et après l’élution pendant 5 minutes avec un vide de 5 mmHg .
Les cartouches sont conditionnées avec 1 ml de MeOH et 1 ml d’H2O, après le passage
des 2 ml de plasma acidifié, on ajoute 200 μl de solution de travail de l’étalon interne, puis
les cartouches d’extraction sont lavées avec 1 ml d’H2O et 1 ml d’ACN. Le salbutamol et
le baméthane sont élués avec 1 ml de MeOH. Les tubes récoltant l’éluat sont rincés avec
200 μl de MeOH afin de récolter le salbutamol déposé sur les bords supérieurs. L’éluat
est évaporé à sec sous flux d’azote à température ambiante. L’extrait sec est reconstitué
avec 200 μl de phase mobile sans Pic B7 (phase aqueuse: phase organique (85: 15)) et
passé pendant 1 minute au vortex.
8.4.2.8 Extraction urinaire
L’extraction urinaire se fait à l’aide de cartouches Bond-Elut® Si (500 mg/ml).
Préalablement, 2 ml d’urine acidifiée sont mélangés (1: 1) avec le tampon PBS.
Les cartouches sont conditionnées avec 2 ml de MeOH et 2 ml d’H2O, après le passage
des 4 ml du mélange urine-tampon PBS, on ajoute 200 μl de solution de travail de l’étalon
interne. Les cartouches d’extraction sont ensuite lavées avec 2 ml d’H2O et 2 ml d’ACN.
Le salbutamol et l’étalon interne sont élués avec 2 ml de phase mobile organique. Les
tubes récoltant l’éluat sont rincés avec 200 μl de MeOH afin de récolter le salbutamol
déposé sur les bords supérieurs. L’éluat est évaporé à sec sous flux d’azote à température
ambiante. L’extrait sec est reconstitué avec 200 μl de phase mobile entière sans Pic B7
(phase aqueuse: phase organique (83: 17)) et passé pendant 1 minute au vortex.
8.5 Méthodes
Toutes les mesures et analyses ont été réalisées dans le Laboratoire de Contrôle de
Qualité du service de Pharmacie du CHUV, qui est un local climatisé (20 à 22°C).
8.5.1 Détection
Dans la littérature le salbutamol est dosé par différentes méthodes analytiques, telles
l’HPLC à détection UV, l’HPLC à détection fluorimétrique, l’HPLC à détection
électrochimique , l’HPLC couplée à la MS.
Chapitre 8
L’HPLC (high pressure liquid chromatography) est un procédé de séparation et de
quantification de composés présents dans une phase liquide. La chromatographie liquide
est fondée sur des phénomènes d’adsorption, de partage, d’échange d’ions ou
d’exclusion.La séparation est basée sur les équilibres successifs apparaissant entre deux
phases mobile et stationnaire. La phase stationnaire est contenue dans une colonne et
constituée soit d’un support de fine granulométrie. L’appareillage est constitué
généralement par un système de pompe, un injecteur, un détecteur et un enregistreur. Le
système de détection utilisé doit permettre de déterminer les quantités des substances
présentes dans l’effluent.
La méthode de détection retenue, suffisamment sensible et à disposition dans le
laboratoire d’Assurance Qualité du CHUV, est la fluorimétrie.
Dans la détection à fluorescence ou fluorimétrie, l’analyte est excité par des rayons
ultraviolets et émet des radiations à une certaine longueur d’onde. Le fluorimètre Jasco
920 permet de sélectionner la longueur d’onde d’excitation et celle d’émission par la
présence d’un filtre approprié. La fluorescence est un moyen de détection assurant une
sélectivité intéressante. En effet les longueurs d’ondes d’excitation et de détection
retenues donnent une information supplémentaire au temps de rétention. Il n’y a que
quelques substances ayant une fluorescence naturelle forte (par exemple les alcaloïdes de
l’ergot de seigle). Le salbutamol est naturellement fluorescent et nous avons donc pu
l’analyser selon cette méthode. Toutefois on trouve dans la littérature des groupes ayant
eu recours à la dérivatisation pour pouvoir atteindre un seuil de quantification plus bas.
En effet beaucoup de substances peuvent être transformées en dérivés fluorescents. Cette
approche représente cependant une étape supplémentaire lors de la préparation de
l’échantillon et les seuils de quantification mesurés dans la littérature ne sont guère plus
satifaisants que ceux obtenus.
Il est encore à signaler que lors de l’utilisation d’un fluorimètre, les éluents ne doivent pas
être fluorescents ni absorber aux longueurs d’ondes choisies. Le pH est aussi très
important, certaines molécules n’étant fluorescentes que sous forme ionique particulière.
Dans un deuxième temps, il serait possible d’utiliser une LC/MS, cet appareil permettant
d’améliorer la sensibilité de la méthode analytique (750 pg/ml versus 1.0 ng/ml avec
notre méthode fluorimétrique).
Suite a une revue de littérature, Gupta[125]a testé différentes longueurs d’ondes
d’excitation et d’émission il a considéré qu’une excitation à 275 nm et une émission à 310
nm sont les plus performantes, tout en donnant une ligne de base suffisamment stable.
Nous avons donc repris ces mêmes valeurs. Nous avons confirmé ce résultat après avoir
testé les différentes longueurs d’onde proposées dans la littérature.
Les concentrations plasmatiques et urinaires de salbutamol ont été mesurées par
chromatographie liquide à haute performance (HPLC). L’appareil utilisé est un Varian
(Harbor City, CA, USA) (Varian Solvent Delivery System 9012, Autosampler ProStar
Chapitre 8
model 410 Varian LTd, couplé à un fluorimètre Jasco 920 (Jasco, Tokyo, Japon). Cet
appareillage est piloté par le logiciel Star LC Workstation 5.0, installé sur un ordinateur
Compaq Deskpro sous Windows 98.
La colonne utilisée est de type Chromolith® Performance RP-18e (100 x 4.6 mm) (Merck,
Darmstadt, Allemagne, art. 1.02129.0001) et est munie d’un système de pré-colonne
Chromolith® (10 x 4.6 mm) (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.51471.0001). La
composition de cette colonne est basée sur une technologie sol-gel possédant une
structure de pore bimodale. On trouve d’abord une structure macroporeuse, où chaque
macropore possède un diamètre moyen de 2 μm. L’ensemble forme un réseau dense de
pores à travers lequel chaque éluent peut rapidement s’écouler, ce qui réduit
significativement le temps d’analyse. Le deuxième est une structure mésoporeuse, dont les
mésopores forment une structure supplémentaire de fine porosité (13 nm) et créent une
très large surface de contact sur laquelle l’adsorption des composés peut se produire. De
part la grande porosité, les colonnes Chromolith® permettent de travailler à haut débit
tout en conservant des pressions basses.
De type RP-18e, cette colonne est constituée d’une phase de silices greffées avec des
chaînes organiques à 18 atomes de carbone.
Pour l’analyse urinaire, une deuxième colonne a été couplée, la Chromolith Performance
RP-8e (100 x 4.6 mm) (Merck, Darmstadt, Allemagne, art. 1.51468), afin de permettre une
meilleure séparation du pic de salbutamol des autres substances présentes dans l’urine. Il
s’agit d’une colonne de type Chromolith Performance RP-8e. Basée sur la même
technologie que la précédente, cette colonne est constituée d’une phase de silices greffées
avec des chaînes organiques à 8 atomes de carbone.
Les autres paramètres de l’analyse par chromatographie sont décrit dans le tableau cidessous (cf Tableau 12):
Tableau 12
Paramètres de l’analyse chromatographique
Paramètres
Analyse plasmatique
Analyse urinaire
HPLC
Colonne
Phase aqueuse
Chromolith PerformanceRP18e
CH3COOH 1%, Pic B-7 5mM ds H2O
CH3COOH 1% ds MeOH
Phase organique
Phase mobile
Débit
Temps de rétention
Chromolith Performance RP18e couplée à une Chromolith
Performance RP-8e
phase aqueuse: phase organique
85:15
phase aqueuse: phase organique
83:17
2,0 ml/mn
2,5ml/mn
3.8 mn
8.7 mn
Chapitre 8
du salbutamol
Temps de rétention
de l’étalon interne
9.3 mn
20.6 mn
Volume d’injection
50 μl
50 μl
Excitation
275 nm
275 nm
Emission
310 nm
310 nm
Slit position
40 nm
40 nm
100
100
Fluorimètre
Gain
La phase mobile organique à été dégazée pendant 20 minutes dans un bain à ultrason
Branson 5200.
Les mesures de pH ont été réalisées au moyen d’un pH-mètre 713 Metrohm® muni
d’une électrode Solitrode (Metrohm, art. 6.028.000), contenant une solution C(KCL) 3M
(KCL 3M: Merck, Darmstadt, Allemagne art. 1.04817.0250) et d’un agitateur magnétique:
Metrohm, art. 2.728.002). Cet appareil est vérifié avant chaque utilisation au moyen de
solution tampon de calibration (solution étalon de pH=4, pH=7 et de pH=9 (Metrohm,
art. 6.2307.100, art. 6.2307.110, art. 6.2307.120, si la valeur indiquée s’éloigne de plus de
0,05 unités pH, l’appareil est recalibré à l’aide des solutions tampons. Le rinçage de
l’électrode est réalisé avec de l’eau purifiée (qualité Pharmacopée) fournie par le service
technique du CHUV.
8.5.2 Choix de l’étalon interne
La notion d'étalon interne est très répandue en analyse chimique. Elle consiste à ajouter
une quantité connue d'un produit d’une structure chimique proche de celle de l’analyte à
doser, qui subira le même traitement que celui-ci lors de l’extraction; les effets de matrice
seront donc les mêmes sur les deux molécules. Ainsi le rapport des surfaces entre les deux
sera proportionnel à la concentration en salbutamol. Cette notion d’étalon interne permet
de pondérer des différences de rendement lors de l’extraction. En effet si une extraction
est faible pour l’analyte, elle sera également faible pour l’étalon interne et le rapport des
surfaces des deux substances restera le même. Ceci est particulièrement important lorsque
l’on veut déterminer précisément de basses concentrations de produits.
Certains auteurs n’utilisent pas d’étalon interne [126], [127], [128]. On trouve dans la
littérature différents étalons internes utilisés: ethenzamide, fenoterol, atenolol, qui sont de
structure chimique relativement différente du salbutamol. Le fenoterol par exemple
possède deux groupes phénoliques et est donc plus électroattractif que le salbutamol. La
pholedrine [129] et le baméthane [123], [130], [131], utilisés par de nombreux
investigateurs, ont des structures similaires à celles du salbutamol (cf Figure 28). Nous
avons donc retenu le baméthane comme étalon interne.
Chapitre 8
Figure 28
Structure chimique du baméthane
8.6 Procédure de validation
La validation dans le plasma et dans l’urine a été réalisée sur la base du guide publié par la
SFSTP [132] concernant les méthodes de dosage chromatographiques dans les milieux
biologiques. La structure statistique de la validation des deux méthodes a été réalisée à
l’aide de ce document sur un tableur Excel par la responsable du laboratoire d’Assurance
Qualité de la Pharmacie du CHUV, Dr. Lina Berger.
La validation a été faite selon différents critères: spécificité-sélectivité, fonction de
réponse (courbe d’étalonnage), linéarité, fidélité (répétabilité et fidélité intermédiaire),
exactitude, seuil de détection, seuil de quantification, intervalle de dosage, rendement
d’extraction.
8.6.1 Linéarité
La linéarité d’une procédure d’analyse est sa capacité à l’intérieur d’un certain intervalle de
concentration d’obtenir des résultats directement proportionnels à la quantité en analyte
dans l’échantillon.
La linéarité de la méthode a été étudiée sur trois jours. Le rapport entre la surface des pics
salbutamol / étalon interne a été reporté en fonction de la concentration théorique des
solutions de salbutamol.
Huit solutions standards de plasma spiké, préparées en triplicat à partir d’une solution
stock de salbutamol à des concentrations en salbutamol de 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.75, 5.0 et
7.5 ng/ml, ont été analysées
Huit solutions standards d’urine spikée, préparées en triplicat à partir d’une solution stock
de salbutamol à des concentrations en salbutamol de 5.0, 10.0, 15.0, 20.0, 30.0, 40.0, 50.0,
100.0 ng/ml, ont été analysées
L’homogénéité des variances a été vérifiée en utilisant le test de Cochran et de Levene
selon les rapports obtenus chaque jour, ainsi que sur le total des trois jours. En fonction
des résultats obtenus, une analyse de régression linéaire a pu être appliquée. Les valeurs
de la pente, ainsi que de l’ordonnée à l’origine ont été déterminées, un test-t de Student (la
méthode des moindres carrés) avec un intervalle de confiance de 95% les donnant
comme significative.
Chapitre 8
8.6.2 Spécificité-sélectivité
La spécificité d’une procédure analytique est sa capacité à établir de manière univoque
l’existence de la substance à analyser en présence d’autres composants potentiellement
présents. Ces composés comprennent classiquement d’autres substances
médicamenteuses présentes dans la matrice, les produits de dégradation, les impuretés et
la matrice.
8.6.2.1 Influence de la matrice:
Afin d’éliminer au maximum les pics parasites provenant de la matrice, une extraction de
type SPE a été réalisée comme décrit précédemment (8.4.2.7,8.4.2.8). Durant la
prévalidation et la validation 15 plasmas de donneurs anonymes différents ont été utilisés.
Nous n’avions aucune donnée sur l’éventuelle consommation médicamenteuse de ces
personnes.
8.6.2.2 Influence des produits de dégradation:
Afin de mettre en évidence d’éventuelles interférences entre le salbutamol et ses produits
de dégradation, nous avons comparé les chromatogrammes obtenus avec des solutions
contenant uniquement l’analyte et ceux obtenus avec des solutions tests. Les produits de
dégradation ont été générés en soumettant une solution de salbutamol à différentes
conditions de stress.
Quatre conditions différentes ont été testées: milieu acide, milieu basique, chaleur et
oxydation:
♦ Dégradation en milieu acide: la solution de salbutamol est agitée pendant 1 heure
avec une solution d’HCl 5N; une partie de la solution a par la suite encore été
chauffée à reflux pendant 1 heure.
♦ Dégradation en milieu basique: la solution de salbutamol est agitée pendant 1
heure avec une solution de NaOH 5N, une partie de la solution a part la suite
encore été chauffée à reflux pendant 1 heure.
♦ Dégradation par la chaleur: la solution a été chauffée à reflux pendant 1 heure
♦ Dégradation par oxydation: la solution de salbutamol est agitée pendant 1 heure en
présence d’une solution d’eau oxygénée.
Les échantillons soumis aux stress basiques et acides ont été neutralisés avant d’être
analysés.
Les solutions ont été analysées selon les conditions urinaires et plasmatiques, ainsi
qu’avec un gradient allant de 10 à 90%.
Chapitre 8
8.6.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement
Chaque jour, quatre contrôles de qualité, préparés en quatre exemplaires à partir d’une
solution de 0.5 μg/ml de salbutamol à des concentrations de 1.0, 2.0, 3.75, 6.25 ng/ml
pour la méthode plasmatique et des concentrations de 5, 10.0, 25.0, 40.0, 100.0 ng/ml
pour la méthode urinaire, ont été analysés. Chaque valeur obtenue a été recalculée avec la
régression linéaire du jour correspondant.
Le recouvrement est obtenu en divisant le rapport des surfaces salbutamol/étalon interne
recalculé par le rapport théorique des mêmes surfaces et en le multipliant par 100.
8.6.4 Rendement d’extraction
Les rapports de surface salbutamol/étalon interne de la gamme de calibration obtenus
après extraction ont été comparés à ceux obtenus dans les mêmes concentrations
directement dans la phase mobile.
Les analyses ont été réalisées des jours différents avec des opérateurs différents
permettant d’analyser la fidélité intermédiaire
8.6.5 Limite de détection - Limite de quantification
La limite de détection d’une procédure d’analyse est la plus petite quantité de l’analyte
dans un échantillon pouvant être détectée, mais non quantifiée comme une valeur exacte
dans les conditions expérimentales décrites de la procédure.
La limite de quantification est la plus petite quantité de l’analyte dans un échantillon
pouvant être dosée dans les conditions expérimentales décrites avec une exactitude
définie.
Ces critères ont été détermnés durant la prévalidation des deux méthodes.
8.6.6 Etude de stabilité
8.6.6.1 Etude de stabilité du salbutamol dans le plasma:
Des solutions plasmatiques spikées de salbutamol 3.5 ng/ml ont été aliquotées et
conservées à température ambiante, au frigo et au congélateur à –20°C. Des analyses en
triplicat à J0, J1, J3 et J7 ont été réalisées pour déterminer la stabilité de telles solutions.
8.6.6.2 Etude de stabilité du salbutamol dans l’urine:
Des solutions urinaires spikées de salbutamol à 40 ng/ml ont été aliquotées et conservées
au frigo et au congélateur à –20°C. Des analyses en triplicat à J0, J3 et J13 ont été réalisées
pour déterminer la stabilité de telles solutions.
Chapitre 9
9
Résultats et discussion
9.1 Les conditions
analytiques
9.1.1 Extraction
Comme présenté auparavant la colonne Bond-Elut®-Si a été
retenue pour l’extraction du plasma et de l’urine et nous a
permis de valider les méthodes analytiques.
Toutefois les caractéristiques de la colonne d’extraction
Bond Elut®-Si ne la désignent pas comme étant la plus
favorable pour l’extraction d’échantillons aqueux (plasma et
urine). En effet avec ce type de colonne l’interaction avec
l’analyte est polaire, la silice étant chargée négativement et
l’analyte positivement, l’ajout d’eau perturbe donc
l’interaction.
Peu de problèmes ont été rencontrés lors de l’extraction
plasmatique, les chromatogrammes obtenus étant très
épurés. Par contre lors des essais réalisés avec l’urine, si les
chromatogrammes obtenus étaient propres, le rendement
d’extraction était plus faible, mais surtout fluctuant. Les
premiers tests ayant été réalisés avec des colonnes BondElut®- Si 100mg, nous avons augmenté la capacité de la
cartouche, afin d’améliorer la rétention du salbutamol. Nous
arrivions en effet à une linéarité acceptable pour les
concentrations allant jusqu’à 25 ng/ml, les concentrations
plus hautes nous donnant des résultats peu reproductibles.
Cependant ce changement n’a pas permis d’améliorer de
façon satisfaisante l’extraction.
L’ajout d’acide phosphorique aux échantilllons plasmatiques
100
Chapitre 9
et urinaires a permis d’épurer nettement les chromatogrammes et libère le salbutamol de
sa liaison aux protéines. Cet ajout n’a pas perturbé l’extraction plasmatique. Par contre
lors de l’extraction la matrice urinaire, il a fait chuter le pH aux environs de 3. A ce pH la
fonction phénolique du salbutamol se trouve sous forme non ionisée, tandis que la
fonction amine est protonée., ces conditions ne sont pas optimales pour l’extraction.
C’est pourquoi nous avons tamponné les échantillons avec le tampon de PBS CHUV.
Ainsi nous obtenons un rendement d’extraction régulier de plus de 90% également.
Afin d’améliorer l’extraction et de travailler dans des conditions optimales, des tests
d’extraction seront encore faits prochainement avec des colonnes du type Focus®
(Varian, Harbor City, CA, USA, art. ), Extrelut® NT3 (Merck, Darmstadt, Allemagne
art.), et Chromabond XTR (Macerey-Nagel, Düren, Germany, art.)
9.1.1.1 Rendement d’extraction
Les deux méthodes plasmatique et urinaire ont donné un rendement d’extraction
supérieur à 90%, les résultats détaillés se trouvent dans les Annexes 3.2.7 et 4.2.7
9.2 Procédures de validation
Une prévalidation a été effectuée préalablement selon le guide SFSTP. L’homogénéité des
variances a été déterminée selon les tests de Cochane et Levene:
Plasma: test de Cochane: 0.5209 (doit être inférieur à 0.3726)
Test de Levene: 2.92 (doit être inférieur à 2.27)
Urine: test de Cochane: 0.3487 (doit être inférieur à 0.3726)
Test de Levene: 4.77 (doit être inférieur à 2.27)
Les valeurs trouvées sont légèrement supérieures aux valeurs théoriques, mais nous avons
considéré ces valeurs comme acceptables pour valider nos deux méthodes selon le
modèle de regression linéaire.
Les résulats de ces deux validations se trouvent dans les Annexes 3.2.8 et 4.2.8.
9.2.1 Linéarité
La linéarité de la méthode plasmatique a été testée entre 0.8 ng/ml et 100 ng/ml, mais la
validation s’est portée sur un intervalle allant de 1.0 ng/ml à 7.5 ng/ml. La limite
inférieure n’a pu être validée. Un test préliminaire chez trois volontaires sains nous a
montré que les concentrations de salbutamol se trouvaient autour de 1ng/ml et nous
avons donc resserré botre intervalle de dosage.
Afin d’essayer d’abaisser le seuil de quantification, les transformations suivantes ont été
envisagées après pondération: z’ =
z , z’ = 1/z, z’ = ln(z). Bien que le modèle z’ =
z
Chapitre 9
permette d’abaisser légèrement notre seuil de quantification (0.9 ng/ml), nous avons
retenu pour des raisons pratiques le modèle de régression linéaire.
L’adéquation du modèle de regression est ensuite évaluée sur la base du test de manque
d’ajustement (cf Annexes 3.2.2 et 4.2.2).
La régression linéaire calculée donne les équations suivantes:
9.2.1.1 Méthode plasmatique
Courbe de validation:
Vérification de la linéarité (faite à partir
des standards de validation) (cf Figure
29):
Jour 1: y = 0.047 x – 0.003
y = 0.988 x + 0.052
Jour 2: y = 0.043 x +0.008
y= 1.032 x + 0.072
Jour 3: y = 0.044 x + 0.004
y = 0.992 x - 0.03
Figure 29
Vérification de la linéarité de la méthode plasmatique
Les valeurs recalculées donnent un RSD inférieur à 10.9% à chaque niveau de
concentration (cf Annexe 3.2.4).
9.2.1.2 Méthode urinaire
Courbe de validation:
Vérification de la linéarité (faite à partir
des standards de validation) (cf Figure
30):
Jour 1: y = 0.044x + 0.017
y = 0.985 x + 0.491
Jour 2: y = 0.043 x + 0.034
y = 1.009 x – 0.413
Jour 3: y = 0.045 x + 0.01974
y = 0.979 x + 0.304
Figure 30
Vérification de la linéarité de la méthode urinaire
Les valeurs recalculées donnent un RSD inférieur à 5.5% à chaque niveau de
concentration (cf Annexe 4.2.4).
En ce qui concerne la linéarité de la méthode, c’est-à-dire de la relation existant entre les
concentrations calculées avec les standards de validation et les concentratkions
introduites, nous avons vérifié pour les deux méthodes que les limites de confiance de la
pente sont comprises entre 0.85 et 1.15.
Chapitre 9
9.2.2 Spécificité-sélectivité
Après comparaison des chromatogrammes des tests de dégradation et ceux des analyses
plasmatique ou urinaire du salbutamol, aucune interférence générée par les produits de
dégradation ou les différentes matrices pouvant prétériter la qualité des dosages n’a été
mise en évidence.
9.2.3 Répétabilité-fidélité intermédiaire et recouvrement
Le coefficient de répétabilité varie par niveau de concentration entre 2.5% et 10.9 %
L’exactitude de procédure obtenue à partir des standards de validation varie entre 77% et
117%. (cf Figures 9)
Les résultats détaillés se trouvent dans l’Annexe 3.2.5
Le coefficient de répétabilité varie par niveau de concentration entre 2.9% et 5.5 %
L’exactitude de procédure obtenue à partir des standards de validation varie entre 90% et
111%( cf Figures 11).
Les résultats détaillés se trouvent dans l’Annexe 4.2.5.
9.2.4 Seuils de détection et de quantification
Seuil de détection: 0.25 ng/ml
Seuil de quantification: 1.0 ng/ml
Seuil de détection: 0.4 ng/ml
Seuil de quantification: 5.0 ng/ml
Le critère d’exactitude n’a pas permis d’atteindre des valeurs plus basses. La prévalidation
des méthodes plasmatique et urinaire nous a donné un seuil de détection de 0.25 ng/ml,
respectivement de 0.4 ng/ml et comme seuil de quantification 0.7 ng/ml, respectivement
3.4 ng/ml. Cependant nous n’avons pu confirmer ces résultats lors de la validaiton.
9.2.5 Etudes de stabilité
Les études de satbilité ont été réalisées à une seule concentration de salbutamol. Ces
résultats sont donc indicatifs, mais demandent confirmation par une étude plus complète,
intégrant le seuil de quantification et la concentration maximale de l’intervalle de dosage.
Stabilité plasmatique du salbutamol:
Chapitre 9
Les résultats obtenus sont détaillés dans le Tableau 13.
Tableau 13
Données de stabilité du salbutamol dans le plasma.
J0
Conc.
J1
%
J3
Conc.
[ng/ml]
%
[ng/ml]
J7
Conc.
%
[ng/ml]
Conc.
%
[ng/ml]
T° ambiante
3.5
100
3.2
91.9
4.1
116.5
/
/
Frigo
3.5
100
3.2
91.4
4.2
118.9
3.4
96.3
Congélateur
3.5
100
3.3
95.1
3.4
97.5
3.3
95.2
L’analyse des échantillons plasmatiques a été réalisée directement après les prélèvements.
Nous n’avons donc sains pas tenu compte lors du test chez les volontaires des données
de stabilité obtenues(cf Tableau 13).
9.2.5.1 Stabilité urinaire du salbutamol:
Les données dans la littérature sont controversées quant à la stabilité du salbutamol dans
l’urine. En effet la plupart des auteurs récoltent l’urine et la congèlent à –20°C pour
l’analyser plus tard, sans spécifier s’ils ont effectué une étude de stabilité prouvant la
stabilité du salbutamol dans de telles conditions. D’autres études montrent une stabilité
de 45 jours que ce soit à température ambiante, au frigo ou au congélateur. Cependant,
dans le milieu du dopage, où le salbutamol est utilisé afin d’augmenter la masse
musculaire, beaucoup de questions se posent quant à sa stabilité. Les analyses réalisées
dans le milieu sportif doivent permettre de différencier l’administration du salbutamol par
aérosol, utilisation permise en cas d’asthme dû à l’effort, de celle orale, prohibée car
utilisée en vue d’obtenir un effet anabolisant. Lors du 19ème congrès de Cologne sur les
analyses des produits dopants, Henze [133] traitant des réactions du salbutamol et du
reproterol avec la matrice urinaire a étudié la stabilité du salbutamol. Cette étude a montré
(cf Tableau 14) qu’après un mois de conservation à +4°C et –18°C, on ne retrouve dans
les urines que 15% de la dose de départ.
Tableau 14
Données de stabilité du salbutamol dans l’urine.
Jo
J3
J13
Concentration
%
Concentration
%
Concentration
%
Frigo
40.0 ng/ml
100
38.8 ng/ml
96.97
39.2 ng/ml
97.92
Congélateur
40.0 ng/ml
100
39.8 ng/ml
99.58
34.8 ng/ml
87.10
Nous avons analysé les échantillons urinaires des volontaires sains 1 jour après les avoir
conservés au frigo. L’étude de stabilité réalisée nous permettait de le faire tout en restant
dans des valeurs acceptables.
Chapitre 9
L’étude de stabilité urinaire sera poursuivie sur une durée d’un mois.
9.3 Etude chez les volontaires sains
Le but de cette étude était de tester les méthodes mises au point afin de s’assurer que leur
sensibilité soit suffisante et que les valeurs obtenues correspondent à celles trouvées dans
la littérature.
Le protocole soumis à la commission d’éthique concernait la nébulisation mécanique.
Dans ce test nous avons simplement nébulisé le salbutamol à l’aide d’un nébuliseur
pneumatique à double venturi avec embout buccal sans essayer de simuler la ventilation
mécanique.
Nous n’avons effectué aucun calcul de pharmacocinétique sur ces résultats, cette étude
n’y étant pas destinée.
Les résultats obtenus lors du dosage plasmatique du salbutamol sont présentés dans le
dans la Figure 31:
Figure 31
Dosage plasmatique du salbutamol chez cinq volontaires sains
Chez les deux volontaires sains ayant reçu 10 mg de salbutamol, le dosage plasmatique
montre que nous sommes dans l’intervalle de linéarité jusqu’à 4 heures, puis les taux
descendent en dessous de 1 ng/ml. Chez les trois autres volontaires sains, la limite de
quantification de notre méthode ne nous permet d’effectuer des dosages validés que
jusqu’à 60 minutes post inhalation. La dose de 10 mg de salbutamol n’étant pas la dose
recommandée de traitement (2.5 et 5 mg), elle ne sera par conséquent pas utilisée lors des
travaux ultérieurs chez les volontaires sains.
Chapitre 9
Il est à relever que cette étude porte sur la nébulisation avec respiration spontanée. Lors
de ventilation mécanique, le dépôt pulmonaire sera certainement inférieur. La méthode de
dosage plasmatique doit donc encore être affinée, surtout son extraction afin d’obtenir un
seuil de quantification plus bas.
Les résultats obtenus lors du dosage plasmatique du salbutamol sont présentés dans la
Figure 32
Figure 32
Dosage urinaire du salbutamol chez cinq volontaires sains
Les concentrations urinaires obtenues, sont dans le domaine de linéarité de la méthode
développée. En effet, seul le t = 24 h est légèrment inférieur à 5 ng/ml chez les patients
ayant reçu 5 mg de salbutamol. Cette méthode semble donc appropriée pour une étude
pharmacocinétique de nébulisation du salbutamol. Cependant la stabilité controversée du
salbutamol dans l’urine implique un dosage dans les 3 jours suivant la récolte urinaire
selon les résultats de notre étude de stabilité. Ceci est une contrainte quant à l’utilisation
de cette méthode pour déterminer les taux de salbutamol après nébulisation.
Les résultats obtenus concordent avec ceux de la littérature dans les mêmes conditions.
Le résultat de l’analyse pharmacocinétique des données obtenues chez les volontaires
sains sera également très important pour faire un choix entre la méthode urinaire et la
méthode plasmatique.
9.4 Conclusion
Ce mémoire consittuanttant la première partie du travail de thèse, il nous a permis de
nous familiariser avec les extractions de matrices biologiques et de nous plonger dans la
Chapitre 9
problèmatique plus particulière du salbutamol. Nous avons pu valider deux méthodes,
l’une pour l’analyse plasmatique du salbutamol et l’autre pour son analyse urinaire. Cette
validation a été réalisée selon les recommandations de la SFSTP dans le but de travailler
avec une méthode fiable donnant des résultats sûrs.
L’étude réalisée sur un nombre restreint de volontaires sains servant à tester ces deux
méthodes d’analyse a montré que si la méthode urinaire pouvait être utilisée, la méthode
plasmatique doit encore être améliorée afin de mieux rendre compte des concentrations
obtenues lors de la nébulisation. L’amélioration touchera principalement le mode
d’extraction. En effet la matrice utilisée pour l’extraction SPE du plasma et de l’urine, ne
fait pas partie des matrices recommandées. Elle serait même plutôt déconseillée pour les
matrices aqueuses. Les prochains mois seront consacrés encore certaienemt à compléter
ces essais d’extraction afin de consolider la méthode de dosage.
Ce travail a également permis de tester le protocole qui sera appliqué chez les volontaires
sains sous ventilation mécanique et d’en optimiser son déroulement. Ceci sera utilisé pour
confirmer les résultats obtenus dans l’étude préliminaire in vitro sur la nébulisation du
salbutamol lors de ventilation mécanique réalisée par Ermindo Di Paolo [29].
Chapitre 10
10
Conclusion générale
La ventilation mécanique (VM) ou artificielle a pris une place
de plus en plus importante dans le traitement des patients en
défaillance respiratoire. Il est possible d’administrer des
aérosols médicamenteux chez les patients sous ventilation
mécanique. Cependant il y a encore peu de
recommandations concernant ce mode d’administration des
médicaments. Le pharmacien, responsable de la bonne
administration des médicaments, a un rôle à jouer dans
l’investigation d’une telle pratique.
Nous nous sommes tout d’abord attachés à analyser
l’influence de la nébulisation sur les paramètres physicochimiques des solutions de salbutamol durant la nébulisation,
ainsi qu’à évaluer la délivrance pulmonaire d’aérosols de
salbutamol dans un modèle in vitro de ventilation mécanique
pédiatrique selon trois modes d’administration différents.
Les résultats obtenus contredisant les recommandations
américaines, il était important de passer à des études in vivo,
afin de confirmer ces résultats.
Il faut souligner que cette première étude in vitro a déjà fait
évoluer les pratiques aux Soins I(ntensifs de Pédiatrie
puisque l’utilisation de salbutamol, largement répandu
auparavant chez les jeunes patients sous ventilation
mécanique, a sensiblement diminué.
Ce travail de mémoire constitue la première étape d’un
travail de thèse dont le but est de confirmer que
l’administration en mode inspirium est plus efficace qu’en
mode expirium chez des enfants sous ventilation mécanique.
Cette première phase a permis de se familiariser avec
l’administraton des aérosols en général et sous ventilation
108
Chapitre 10
Conclusion générale 109
mécanique en particulier.
Après l’acceptation par la commission d’éthique du CHUV d’un protocole d’étude chez
les volontaires sains, dont les résultats ont pour but de justifier une étude chez l’enfant
malade, deux méthodes d’analyse du salbutamol dans le plasma et l’urine ont été
développées et validées. Ces deux méthodes ont également été testées in vivo chez cinq
volontaires sains afin de s’assurer de leur adéquation au but recherché. Si la méthode
urinaire peut être utilisée telle quelle, la méthode plasmatique devra encore être améliorée
notamment dans son étape d’extraction, amélioration qu constituera l’objectif prioritaire
ces prochains mois.
Chapitre 11
11
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Chapitre 12
12
Annexes
119
Annexe 1
1 Protocole volontaires sains
Protocole de recherche soumis à la commission d'éthique de la recherche clinique de la
faculté de médecine
Optimisation de la nébulisation du
salbutamol chez l'enfant sous
ventilation mécanique :
Etude préalable chez le volontaire
sain
Après correction selon la Commission d’Ethique de la recherche clinique du 9 septembre
2002
Annexe 1
Protocole volontaires sains 2
1.1 Date de l'envoi du protocole à la
commission d'éthique
19 août 2002
1.2 Date prévue pour le début de l'étude
Dès acceptation du protocole
1.3 Investigateurs
1.3.1 Investigateurs responsables :
♦ Dr. J. Cotting, médecin associé, Unité des Soins intensifs de Pédiatrie, CHUV.
♦ Pr. A. Pannatier, pharmacien chef, Service de Pharmacie, CHUV.
1.3.2 Investigateur principal :
♦ A.-L. Sidler-Moix, pharmacienne, Service de Pharmacie, CHUV.
1.3.3 Co-investigateurs :
♦ Dr. M. Berger, pharmacienne, Service de Pharmacie, CHUV.
♦ Dr. E. Di Paolo, pharmacien d'hôpital FPH, Service de Pharmacie, CHUV.
1.3.4 Lieu de l'étude :
♦ Soins intensifs médico-chirurgicaux de Pédiatrie, CHUV, Lausanne
1.4 Mise en perspective de l'étude :
1.4.1 Etat des connaissances :
1.4.1.1 La nébulisation
Les nébulisateurs pneumatiques sont des dispositifs médicaux souvent utilisés pour
l’administration de médicaments en inhalation chez des patients hospitalisés dans les
unités de soins intensifs1-3.
En Suisse différentes molécules sont commercialisées pour la nébulisation en
pneumologie : six β2-sympathomimétiques, un anticholinergique, deux antiallergiques,
quatre corticoïdes, quatre mucolytiques, la DNase recombinante humaine (rhDNase)
pour les complications respiratoires de la mucoviscidose, un antibiotique polypeptidique
utilisé en cas d’infection à Pseudomonas aeruginosa chez les patients mucoviscidosiques,
un inhibiteur de la neuraminidase utilisé dans le traitement de la grippe A ou B et
finalement la pentamidine un agent chimiothérapeutique utilisé lors d’infections causées
par le Pneumocystis carinii4.
Annexe 1
Peu de données concernant la posologie de ces médicaments chez l’enfant sont
disponibles. De plus les données précises concernant le dépôt pulmonaire chez l’enfant
sont rares5. En clinique, la déposition pulmonaire peut être estimée directement par le
marquage radioactif d’une substance nébulisée, plus rarement par son dosage dans les
sécrétions bronchiques, le lavage broncho-alvéolaire, ou indirectement par le dosage de la
substance dans le sérum ou les urines, reflétant l’absorption systémique5.
Actuellement les nébulisateurs pneumatiques sont encore les dispositifs les plus
couramment utilisés pour l’administration de β2-adrénergiques lors de bronchospasmes
sévères. Le problème de leur utilisation chez les enfants est essentiellement liée à
l’incoordination due à l’âge entre la phase de déclenchement et celle de l’inspiration6.
Chez les adultes, la littérature promeut de plus en plus l’utilisation des aérosols-doseurs
pressurisés7-9 et des inhalateurs de poudre multidoseurs10 ; leur utilisation chez les enfants
est sujette à controverse dans le traitement des bronchospasmes sévères pour la raison
évoquée précédemment.
Chez les enfants comme chez les adultes, le succès d’une thérapie par aérosols dépend de
la capacité à délivrer une dose suffisante de médicament au niveau du site actif avec le
moins d’effets secondaires possible. Les avantages de l’utilisation d’aérosols en
comparaison à d’autres formes de thérapie sont la facilité d’utilisation, l’efficacité avec des
doses plus petites que celles nécessaires lors de l’administration intraveineuse et la rapidité
de réponse au traitement6.
Il est à noter cependant que chez l’enfant en bas âge et le jeune enfant, les paramètres
respiratoires sont de première importance pour déterminer la quantité d’aérosol inhalé au
niveau des poumons. Les enfants ayant des volumes inspiratoires plus bas, ceci se traduit
par une délivrance réduite des principes actifs6,11,12. Aujourd’hui, l’aérosolisation des
médicaments est encore effectuée de manière relativement empirique, car de nombreux
facteurs, susceptibles d’influencer l’efficacité du traitement, sont mal maîtrisés4.
1.4.1.2 Le salbutamol
Parmi les bronchodilatateurs nébulisés, le salbutamol est le plus utilisé13 pour traiter les
adultes ainsi que les enfants ventilés artificiellement et atteints d’asthme aigu grave ou de
bronchospasme post-opératoire sévère. Un traitement bronchodilatateur par voie
pulmonaire permet d’améliorer rapidement la fonction respiratoire des enfants et d’éviter,
la plupart du temps, le recours à la voie parentérale, dont le rapport risque/bénéfice est
moins favorable14,15.
Le salbutamol est un agoniste des récepteurs β2-adrénergiques. Via le complexe des
protéines G, il active une enzyme membranaire, l'adénylate cyclase, qui augmente le taux
intracellulaire d'AMP cyclique. Ceci conduit à une stimulation de la protéine kinase A, qui
catalyse la phosphorylation, à partir de l'ATP, de différents substrats et enzymes propres
aux cellules du tissu-cible14,16-18. Son action principale est la relaxation des muscles lisses
bronchiques14. Le salbutamol semble également exercer un effet inhibiteur sur la
libération des médiateurs de l'inflammation, stimuler la fonction mucociliaire, diminuer la
perméabilité microvasculaire et probablement inhiber la phospholipase A214,16.
Annexe 1
Le salbutamol, qui est un agoniste de courte durée d'action (4 à 6 heures), atteint son effet
maximum en 60 minutes, dont 80% après 5 minutes19. Les effets indésirables sont
essentiellement liés à l'absorption systémique. Ils s'observent donc principalement lors
d'inhalation de doses importantes ou lors d'utilisation par voie orale : tremor (surtout des
mains), tachyphylaxie, tachycardie, arythmie. Maux de gorge, enrouement, céphalées,
nausées se manifestent parfois lors de l'inhalation de doses normales14,20. L'utilisation à
long terme pourrait induire une tolérance et aboutir à une diminution de l'intensité et de
la durée de l'effet21,22.
1.4.1.3 La ventilation mécanique
Un petit nombre des études cliniques réalisées en matière de nébulisation concerne des
patients sous ventilation mécanique. Les études réalisées dans ce domaine se sont
principalement intéressées à la nébulisation de bronchodilatateurs. Toutefois il n’existe
que peu de données montrant un bénéfice des traitements par inhalation chez des
patients sous ventilation mécanique en terme de morbidité ou de mortalité. Dans une
étude évaluant le niveau de pertinence scientifique des recommandations sur la
nébulisation lors de ventilation mécanique23, seule la nébulisation de β2–agonistes ou
d’anticholinergiques en cas de bronchospasme atteint le niveau d’utilité probable, les
autres indications que sont l’infection à VRS (virus respiratoire syncytial et la dysplasie
broncho-pulmonaire de l’enfant, l’ARDS (syndrome de détresse respiratoire aiguë),
l’infection broncho-pulmonaire et l’HTAP (hypertension artérielle pulmonaire)
n’obtiennent que le grade d’utilité possible, c’est-à-dire qu’elles ne reposent que sur des
opinions d’experts.
Alors que l’utilisation thérapeutique de l’aérosol est largement pratiquée en pneumologie,
la nébulisation sous ventilation mécanique est globalement peu utilisée et de façon très
hétérogène24, du fait sans doute d’une connaissance imparfaite de ses modalités
techniques, et des limites des études cliniques.
La nébulisation, qu’elle soit en ventilation mécanique ou non, a pour objectif de déposer
une grande quantité de principe actif au site à traiter en minimisant sa diffusion
systémique et donc ses effets secondaires. De nombreux facteurs peuvent influencer ce
dépôt pulmonaire lors de la ventilation mécanique25,26, liés au ventilateur, au système de
nébulisation, au circuit et au patient. La ventilation mécanique a pour but de corriger
l’acidose respiratoire et l’hypoxémie de l’enfant intubé2. Les pressions produites doivent
être suffisantes pour assurer une entrée d’air acceptable. Le mode de ventilation peut être
volumétrique ou barométrique selon l’âge du patient et les écoles. Aucun mode
ventilatoire n’a fait la preuve de sa supériorité sur un autre3. Chez l’adulte, le mode
volumétrique est recommandé1, tandis que chez le nouveau-né, les ventilateurs sont
barométriques27, car des changements de pression peuvent être délétères chez des
nourrissons de 1 an avec bronchospasme très sévère (risque de barotraumatisme). Chez
un enfant intubé, un aérosol peut être administré en utilisant soit le mode de propulsion
du ventilateur lui-même, soit un flux de gaz continu externe pour actionner le nébuliseur
pneumatique. Selon les dernières recommandations américaines28,29 les nébuliseurs
doivent être placés sur le tuyau inspiratoire du circuit de ventilation à une distance de 10 à
30 cm du tube endotrachéal et être actionnés uniquement durant l’inspiration.
Annexe 1
Une étude sur un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique30-32 conduite
dernièrement au CHUV, a abouti à des résultats opposés aux recommandations
américaines et britanniques. Réalisée entre 1996 et 2000, cette étude poursuivait les buts
suivants, comparant in vitro les performances de six modèles de nébulisateurs
pneumatiques : 1) tester différents paramètres physico-chimiques, comme les variations
d’osmolalité, de taille des particules, de concentration en principe actif, de température et
de pH de solutions de salbutamol au cours de la nébulisation32; 2) évaluer la délivrance
pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un modèle in vitro de ventilation mécanique
pédiatrique selon trois modes d’administration différents : durant l’inspiration, l’expiration
ou en continu (figure 1). Les résultats obtenus contredisent les recommandations citées
précédemment, puisque le mode standard (nébulisation pendant l’inspiration) est le moins
efficace. Le mode de nébulisation durant l’expirium (activité durant la phase inspiratoire
du cycle ventilatoire) est celui ayant donné les meilleurs résultats (environ 300x plus
efficace suivant le modèle de nébulisateur). Ceci peut s’expliquer par le fait que durant
l’expiration, le nébuliseur est activé et le tuyau inspiratoire se remplit de l’aérosol. Ensuite,
pendant l’inspiration suivante, l’aérosol atteint le bout du tube endotrachéal.
Figure 1
Annexe 1
Tableau 1
Le tableau suivant résume quelques résultats obtenus lors de cette étude, montrant clairement la supériorité
de la distribution de l’aérosol en mode expirium : Délivrance pulmonaire d’aérosols de salbutamol dans un
modèle pédiatrique in vitro
Nébuliseur Mode de Nébulisation
Proportion Proportion Proportion Proportion
de PA
de PA
de PA
de PA
inhalé (%)a b expiré (%)a b restant dans déposé
ailleurs
le
nébuliseur ds le circuit
(%)a b
(%)a b
Microneb
Sidestream
Acorn II
Cirrus
Upmist
Micro Mist
A Intermittent/Inspirium b
0.3 ± 0.1
7.2 ± 0.8
85.3 ± 0.7
7.2 ± 0.9
B Continu b
1.5 ± 0.2
19.1 ± 2.4
71.3 ± 3.5
8.1 ± 1.8
C Intermittent/Expirium c
2.7 ± 0.9
10.0 ± 2.8
81.6 ± 3.3
5.7 ± 3.5
D Continu/Externe b
1.9 ± 0.2
11.9 ± 1.6
77.6 ± 2.4
8.6 ± 3.0
2.7 ± 0.6
31.8 ± 4.1
50.0 ± 7.8
15.5 ± 3.3
B Continu b
5.0 ± 0.7
44.2 ± 0.7
32.4 ± 1.6
18.4 ± 2.5
9.0 ± 1.9
39.8 ± 4.7
32.3 ± 2.5
18.9 ± 6.4
D Continu/Externe b
5.4 ± 0.5
46.5 ± 1.2
31.9 ± 2.5
16.2 ± 2.9
0.8 ± 0.1
17.4 ± 1.5
72.4 ± 5.2
9.4 ± 3.8
B Continu b
5.8 ± 0.6
47.4 ± 2.9
28.9 ± 2.9
17.9 ± 0.9
7.2 ± 2.0
28.7 ± 7.9
37.3 ± 5.0
26.8 ± 12.7
D Continu/Externe b
4.6 ± 0.8
35.8 ± 6.9
36.0 ± 6.1
23.6 ± 12.7
1.8 ± 0.3
29.1 ± 5.0
55.3 ± 7.1
13.8 ± 5.0
B Continu b
3.5 ± 0.7
28.9 ± 7.8
26.8 ± 7.4
40.8 ± 14.5
4.7 ± 1.2
23.6 ± 10.9 42.6 ± 9.8
29.1 ± 16.7
D Continu/Externe b
3.4 ± 0.7
30.4 ± 9.3
30.9 ± 3.7
35.3 ± 7.8
3.4 ± 0.6
30.4 ± 3.0
51.4 ± 8.1
14.8 ± 4.8
B Continu b
3.8 ± 0.7
33.7 ± 4.7
46.6 ± 7.0
15.9 ± 3.5
7.1 ± 1.3
30.1 ± 7.4
43.2 ± 8.0
19.6 ± 10.0
D Continu/Externe b
4.0 ± 0.5
37.5 ± 2.2
43.0 ± 2.2
15.5 ± 2.3
2.6 ± 0.3
31.7 ± 2.4
51.4 ± 3.2
14.3 ± 2.5
B Continu b
4.7 ± 0.2
39.1 ± 2.4
41.9 ± 2.1
14.3 ± 1.7
8.3 ± 0.6
34.9 ± 2.6
43.1 ± 3.7
13.7 ± 1.7
D Continu/Externe b
5.6 ± 0.4
45.6 ± 3.6
33.9 ± 3.0
14.9 ± 1.6
a.
Moyenne ± écart-type (n = 5 ), exprimée en % de la dose initiale de salbutamol
sulfate.
b.
c.
Annexe 1
1.4.2 Buts de l'étude :
♦ Démontrer que la délivrance pulmonaire de la nébulisation en mode expirium est
plus efficace qu’en mode inspirium en déterminant les taux sériques de salbutamol
chez des volontaires sains dans un premier temps (objet de ce protocole), puis chez
des enfants sous ventilation mécanique. Pour cette seconde phase, un nouveau
protocole sera soumis.
♦ Confirmer la différence entre le nébulisateur ayant la délivrance la plus faible dans
l’étude in vitro et celui considéré comme le plus efficace.
♦ Développer une méthode analytique permettant l’utilisation d’une quantité
minimale de sang pour le dosage du salbutamol administré par nébulisation.
♦ Montrer une corrélation possible entre le dosage urinaire et le dosage sanguin du
salbutamol dans les mêmes conditions.
1.4.3 Justification :
Nous avons réalisé une étude in vitro sur l'optimisation de la nébulisation entre 1996 et
l’année 2000. Dans cette étude un modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique a
été développé permettant de déterminer la délivrance d'aérosols de salbutamol dans des
conditions standardisées. Trois modes d'administration des aérosols avec propulsion des
nébulisateurs par le ventilateur ont été étudiés : nébulisation durant l'inspirium, continue
et durant l'expirium. Le quatrième mode décrit est une simulation des anciens ventilateurs
n’ayant pas de modalité de ventilation et dont le flux d’air provenait d’une bouteille de
gaz. Cette étude a montré que le mode standard de nébulisation (nébulisation pendant
l'inspiration) est le moins efficace. Ces résultats contredisent les dernières
recommandations américaines28,29.
Le modèle in vitro de ventilation mécanique pédiatrique, développé pour déterminer la
quantité inhalée d'aérosol, représente un moyen simple, sûr et économique. Il présente
néanmoins les limites d'une étude in vitro où les conditions d’expérience sont contrôlées
et idéalisées, ne correspondant pas forcément à la situation clinique. Par conséquent, il est
fondamental de confirmer ces résultats par une étude in vivo.
L’absorption des médicaments chez les patients atteints de pathologies respiratoires étant
différente de celle observée chez les volontaires sains, il sera indispensable de confirmer
les résultats de ce premier travail par une étude portant directement sur la population
concernée. Cette première étude est indispensable en vue de celle à effectuer sur les
patients qui ne sera initiée que si les résultats obtenus chez les volontaires sains le
justifient. De plus, elle permettra de développer une méthode de dosage la moins invasive
possible. Une comparaison des dosages plasmatique et urinaire sera ainsi faite dans le but
de réaliser par la suite, si une équivalence peut être établie entre les deux méthodes,
uniquement des prélèvements urinaires.
Annexe 1
1.4.4 Méthodes
Pour l’analyse des prélèvements sanguins deux techniques seront utilisées :
HPLC (high pressure liquid chromatography) : c’est un procédé de séparation avec une
phase mobile liquide et une phase stationnaire, contenue dans une colonne, constituée par
un solide de fine granulométrie ou par un solide imprégné d’un liquide ou par un solide
sur lequel des groupes organiques ont été greffés. La chromatographie liquide est fondée
sur des phénomènes d’adsorption, de partage, d’échange d’ions ou d’exclusion.
L’appareillage est constitué généralement par un système de pompe, un injecteur, un
détecteur et un enregistreur. Le système de détection utilisé doit permettre de déterminer
les quantités des substances présentes dans l’effluent. Dans notre étude nous utiliserons
un détecteur UV-visible, détecteur le plus utilisé en HPLC.
LC-MS : il s’agit d’un procédé de séparation qui couple la spectrométrie de masse (voir cidessous) et la chromatographie en phase liquide (voir ci-dessus).
La spectrométrie de masse (MS) est une méthode permettant de déterminer la
composition, la structure et la masse moléculaire des composés. Son principe repose sur
l’ionisation des molécules et leur déplacement dans un champ électrique et/ou
magnétique, puis de leur détection au moyen d’un analyseur approprié. La grande quantité
d’énergie fournie à la molécule lors de l’ionisation peut provoquer la rupture des liaisons
inter-atomiques et donner ainsi naissance à des fragments chargés caractérisés par le
rapport de leur masse sur leur charge. Les fragments sont ensuite séparés puis détectés
pour donner le spectre de masse de l’élément. Cette fragmentation étant caractéristique
d’un composé et reproductible, il sera alors possible, par comparaison avec les spectres de
masse de composés de référence, de déterminer la structure de la molécule analysée. En
résumé, cette technique suit un processus en chaîne composé des étapes suivantes :
ionisation des molécules, accélération des ions chargés, séparation des ions suivant leur
rapport masse/charge, détection des ions, puis interprétation du spectre de masse obtenu.
Lors d’une analyse par LC-MS, la chromatographie permet de séparer un mélange de
substances, avant leur analyse par spectrométrie de masse. Il est de plus en plus courant
de coupler ces deux techniques pour les déterminations quantitatives de substances
pharmaceutiques.
L’analyse par LC-MS a pour but de confirmer les résultats obtenus par HPLC. Etant une
méthode très sensible, elle devrait permettre de diminuer le volume des échantillons
sanguins au cas où les résultats des dosages urinaires n’étaient pas interprétables.
1.5 Plan général :
Il s'agit d'une étude clinique, prospective, monocentrique, de type cross-over, stratifiée en
2 groupes, avec randomisation du mode d'administration (mode inspirium versus
expirium), chez des adultes volontaires sains.
Durée estimée :
Annexe 1
1 an
1.6 Sélection des sujets :
1.6.1 Nombre de sujets :
♦ 16 sujets sains : 8 volontaires testeront un modèle de nébuliseur selon les deux
modes d’administration (inspirium, expirium) et les 8 autres le deuxième modèle de
nébuliseur selon les deux mêmes modes
1.6.2 Critères de sélection :
♦ Sujets masculins/féminins, âgés de 18 à 40 ans et capables de donner un
consentement éclairé
♦ Ils recevront une information complète et objective par l’un des investigateurs et
un formulaire de consentement éclairé leur sera alors remis, qu’ils devront signer.
1.6.3 Critères d'exclusion :
♦ Personne traitée pour un asthme ou recevant quotidiennement du salbutamol.
♦ Personne présentant une pathologie cardiaque à risque d'arythmie.
♦ Femme enceinte.
♦ Personne ayant participé à une étude clinique dans les 2 mois précédents le début
de l’étude.
♦ Personne ayant fait un don de sang dans les 2 mois précédents le début de l’étude.
♦ Personne souffrant d’une insuffisance rénale
Les volontaires seront recrutés suite à un interview réalisé par l’investigateur principal.
1.7 Méthode d’investigation
Les volontaires sains seront accueillis dans un box d’isolement aux Soins Intensifs de
Pédiatrie (SIP) à 7h45 du matin. Ils seront à jeun. Une légère collation leur sera donnée le
matin et à midi.
Avant de débuter la nébulisation, les volontaires seront équipés d’un cathéter veineux
périphérique dans l’avant-bras permettant les différents prélèvements sanguins. Une
perfusion de NaCl leur sera administrée pour permettre une hydratation suffisante en vue
des prélèvements urinaires.
Annexe 1
1.7.1 Nébulisation
La nébulisation sera effectuée à l’aide d’un ventilateur Galiléo, Hamilton Medical LTD,
Rhäzuns, Suisse, utilisé régulièrement aux SIP, qui sera programmé en mode de
ventilation par pression contrôlée et adaptée au sujet.
Chaque volontaire testera deux modes d’administration des aérosols : la nébulisation
durant l’inspirium et celle durant l’expirium. Ces 2 tests se feront avec un intervalle d’au
moins 48 heures.
Durant ces nébulisations chaque volontaire testera 1 type de nébuliseur : soit le
Sidestream Durable, Medic-Aid Ltd, Royaume-Uni, ayant montré la meilleure efficacité
lors de l’étude in vitro, soit le Microneb NA420, Europe Medical, France, ayant la
délivrance la plus faible lors de cette étude. Chaque volontaire utilisera le même
nébuliseur durant les différentes phases de l’étude. Les différents nébuliseurs de même
marque seront issus d’un même lot. La marque de nébuliseur testé par chaque volontaire
sera déterminée par randomisation.
La solution nébulisée sera une solution contenant 5 mg de salbutamol préparée avec du
Ventolin® 0.5% (Glaxo-Wellcome, Suisse) et du NaCl 0.9% (Braun, Suisse)15. Le volume
de départ sera de 4 ml33. La solution de nébulisation sera pesée avant et après
nébulisation.
La durée de la nébulisation est de 15 minutes.
1.7.2 Embout buccal
Le volontaire sera connecté au ventilateur grâce à un embout buccal (du même type que
ceux utilisés pour les fonctions pulmonaires) avec un pince-nez pour éviter une
respiration nasale.
1.7.3 Suspension de charbon
Afin d’éviter une absorption gastro-intestinale du salbutamol, 5 g de charbon activé sous
forme de suspension (Carbomix® 40 ml) seront pris par le volontaire 5 minutes avant et
5 minutes après la nébulisation34-36.
1.7.4 Hydratation
Chaque volontaire sain recevra une perfusion de 1L de NaCl isotonique sur une période
de 2 heures, afin de procurer une hydratation suffisante en vue des prélèvements
urinaires.
1.7.5 Analyses sanguines
Une courbe d'évolution des concentrations plasmatiques sera réalisée. Dans ce but des
prélèvements sanguins de 10 ml seront effectués aux temps t = 0, 15, 30, 45, 60 minutes
pendant la première heure, puis chaque heure pendant 8 heures37.
Annexe 1
Chez chaque volontaire, le volume total du prélèvement sanguin pour les deux jours
d’étude sera de 360 ml (2 fois 180 ml : 120 ml de prélèvement et 60 ml de rinçage).
1.7.6 Analyses urinaires
En parallèle, dans le but d’établir une corrélation possible entre les concentrations
urinaire et plasmatique, les urines seront récoltées aux temps t = 0, 30, 60 minutes durant
la première heure puis chaque heure jusqu’à la sixième heure, puis à t = 10 heures et à t =
24 heures38.
1.7.7 Analytique
Les différents prélèvements seront aliquotés de façon à permettre une première analyse
conventionnelle par HPLC, puis une analyse par LC-MS pour tester la fiabilité de la
première méthode analytique et pour déterminer le volume de prélèvement minimal
possible.
1.8 Surveillance médicale :
Les volontaires sains seront pris en charge aux SIP pendant le période de la nébulisation
et les deux heures suivantes. Ils seront monitorés et suivis par l’un des médecins cadres de
l’unité ainsi que par l’investigateur principal.
A la fin de l’hydratation, c’est-à-dire 2 heures après la nébulisation, les volontaires
pourront quitter les SIP. Ils devront cependant y retourner chaque heure pour les
différents prélèvements (sanguin et urinaire).
1.9 Rôle du personnel infirmier
Aucun
1.10 Médicaments
1.10.1 Salbutamol
Chaque volontaire sain recevra 5 mg de salbutamol par nébulisation durant 15 minutes.
Le salbutamol est un sympathomimétique d'action relativement sélective sur les
récepteurs β2. Il provoque une bronchodilatation plus prononcée avec moins d'effets
cardiovasculaires que les autres sympathomimétiques. Le salbutamol est le principe actif
le plus utilisé aux SIP et pour lequel il existe une solide expérience clinique. Son
métabolisme est bien connu : le salbutamol est métabolisé essentiellement par
conjugaison au niveau hépatique, le métabolite principal étant le dérivé 4’-O-sulfate18, qui
est facilement dosable.
1.10.2 Charbon activé
Chaque volontaire sain recevra 5 g de charbon activé par voie orale sous forme de
suspension (40 ml) 5 minutes avant la nébulisation et 5 minutes après, dans le but d’éviter
Annexe 1
la résorption gastro-intestinale d’une partie du salbutamol qui serait avalé et non inhalé3436.
1.10.3 Solution de NaCl isotonique
Chaque volontaire sain recevra une perfusion d’1 litre de NaCl isotonique sur 2 heures lui
fournissant une hydratation suffisante pour les prélèvements urinaires. L’administration
parentérale de NaCl se fera via le cathéter veineux périphérique déjà en place pour les
prélèvements sanguins.
1.11 Evaluation des risques
1.11.1 Salbutamol
Les effets indésirables du salbutamol sont essentiellement liés à l'absorption systémique. Il
s'observent donc principalement lors d'inhalation de doses importantes ou lors
d’utilisation par voie orale : tremor (surtout des mains), tachyphylaxie, tachycardie,
arythmies. Maux de gorge, enrouement, céphalées, nausées se manifestent parfois lors de
l'inhalation de doses normales. L'utilisation à long terme peut induire une tolérance et
aboutir à une diminution de l'intensité et de la durée de l'effet14. Dans notre étude une
seule dose étant administrée et celle-ci étant faible, les risques d’arythmie sont minimes.
De plus chaque volontaire sera monitoré durant la nébulisation et les deux heures qui
suivent.
1.11.2 Charbon activé
Le seul risque lié à l’administration du charbon activé est la constipation. Dans le but de
réduire au maximum ce désagrément, les volontaires recevront une hydratation durant 2
heures, et par la suite la recommandation de bien boire durant la journée leur sera
donnée.
1.11.3 La ventilation artificielle
Durant les 15 minutes que dure la nébulisation, un médecin sera présent au côté du
volontaire et ce dernier pourra à tout moment se déconnecter du ventilateur, s’il en
ressent le besoin.
1.11.4 Prise de sang
Le volume total de sang prélevé durant toute l’étude pour chaque volontaire sera de 360
ml, soit environ 100 ml de moins que le volume prélevé en une demi-heure par le Centre
de Transfusion lors d’un don de sang.
1.12 Information et consentement
Cf annexes
Annexe 1
1.13 Financement
Aucune rétribution ne sera accordée aux volontaires sains. Les frais liés à l’utilisation des
médicaments et aux analyses sont à la charge des services de Pharmacie et des Soins
Intensifs de Pédiatrie.
1.14 Confidentialité des données
Les sujets seront anonymisés et les investigateurs assurent la confidentialité des données
recueillies pour l’étude. Seules les données scientifiques recueillies pourront être publiées
dans un journal médical et de manière à ne pas permettre une quelconque identification
des sujets.
1.15 Informations au personnel soignant
médical et paramédical
Avant le début de l’étude le personnel infirmier sera informé lors du colloque régulier des
Soins Intensifs de Pédiatrie. Cette information se fera par oral et permettra au personnel
soignant de poser toutes les questions qu’il souhaite.
1.16 Assurance
Pour les volontaires participant à cet essai clinique, les dommages éventuels en relation
avec l’étude sont couverts par l’assurance en responsabilité civile du CHUV. La copie de
l’attestation se trouve en annexe.
1.17 Références
1.
Diehl JL & Brochard L. Asthme aigu grave. Laaban,J.P. (ed.), pp. 113-126
(Masson, Paris,1996).
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l'Université de Montréal-Doin, Paris,1994).
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Leteurtre S, Deschildre A, Cremer R & et al. Asthme aigu grave de l'enfant :
évaluation de la gravité et traitement. Réanim. Urgences 8, 661-671 (1999).
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Paris (2000).
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Annexe 1
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respirateurs de l'Assistance publique-Hôpitaux de Paris. Rean. Urg. 5, 79-85
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25. Manthous CA & Hall JB. Administration of therapeutic aerosols to mechanically
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30. Di Paolo ER. Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l'enfant sous
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Université de Lausanne.
Ref Type: Thesis/Dissertation
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mode, and humidification. Soumis pour publication. (2002).
32. Di Paolo ER, Cotting J & Pannatier A. Physicochemical aspects of nebulization :
Comparaison of five models of jet nebulizers. EHP 6, 83-87 (2000).
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Annexe 1
34. Borgstrom L & Nilsson M. A method for determination of the absolute
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34, 311-315 (1992).
Annexe 2
2 Essais d’extraction
2.1 Colonne Supelclean® C18
Tableau 2
Tests d’extraction réalisés avec la colonne Supelclean® C18 dans le plasma et dans l’urine
Plasma
1
2
3
4
5
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml
H3PO40.01
M
2 ml H2O
2 ml H2O
2 ml Pic B-7
2 ml
H3PO40.01
M
2 ml de
plasma
2 ml de
plasma
2 ml de
plasma
2 ml de
plasma
2 ml de
plasma
1 ml H20
1 ml H20
1 ml de
MeOH 5%
ds H2O
1 ml Pic B-7
1 ml H20
1 ml ACN
1 ml ACN
1 ml ACN
1 ml ACN
5% ds H2O
1 ml MeOH
1 ml MeOH
1 ml MeOH
1 ml MeOH
Conditionnement
Echantillon
Lavage
Elution
Urine
6
Conditionnement
2 ml MeOH
2 ml H3PO40.01M
Echantillon
1 ml d’urine
Lavage
1 ml H20
1 ml ACN
Elution
1 ml MeOH
1 ml MeOH
Annexe 2
Essais d’extraction 18
Figure 2
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Supelclean® C18 de
plasma (en haut) et d’urine (en bas) avec des blancs et des matrices spikées
2.2 Colonne Oasis® HLB
Tableau 3
Tests d’extraction réalisés avec la colonne Oasis® HLB dans le plasma et dans l’urine
Plasma
Urine
1
2
3
4
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml H20
2 ml H20
2 ml H20
2 ml H20
1 ml de plasma
1 ml d’urine
1 ml d’urine
Conditionnement
1 ml tampon
ammoniacal RS
pH 10
Echantillon
1 ml de plasma
Lavage
Annexe 2
1 ml H20
1 ml de MeOH
5% ds H20
1 ml de
MeOH 5% ds
H2 0
1 ml de MeOH
5% ds H20 avec
2% ac. acétique
1 ml de MeOH
5% ds H20 avec
2% NH4OH
1 ml de MeOH
65% ds H20
avec 2%
NH4OH
Elution
1 ml MeOH
1 ml MeOH
1 ml MeOH
1 ml MeOH
65% ds H20
avec 2% d’ac.
acétique
Plasma
5
6
7
1 ml MeOH
1 ml MeOH
1 ml MeOH
1 ml ACN
1 ml ACN
1 ml tampon
phosphate 0.1 M pH
7.2
2 ml H20
2 ml H20
2 ml H20
2 ml de plasma
2 ml de plasma
2 ml de plasma
2 ml de MeOH 5% ds
H20
2 ml de MeOH 5% ds
H20
2 ml de MeOH 5% ds
H20
1 ml de MeOH 15%
ds H20
1 ml de MeOH 15%
ds H20
1 ml de MeOH 15% ds
H20
1 ml MeOH 10% ds
CH3CN
1 ml MeOH 20% ds
CH3CN
1 ml MeOH 20% ds
CH3CN
Conditionnement
Echantillon
Lavage
Elution
Annexe 2
Figure 3
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Oasis® HLB de
plasma (figure p. 94) et d’urine (en haut) avec des blancs et des matrices spikées.
2.3 Colonne Oasis® MCX
Tableau 4
Tests d’extraction réalisés avec la colonne Oasis® MCX dans le plasma et dans l’urine
Plasma
1
2
3
4
5
2 ml
MeOH
2 ml
MeOH
2 ml
MeOH
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml H2O
2 ml H2O
2 ml H2O
2 ml
H3PO40.01M
2 ml
H3PO40.01M
1 ml de
plasma
1 ml de
plasma
1 ml de
plasma
1 ml de
plasma
1 ml de
plasma
2 ml
H3PO4
2 ml
H3PO4
2 ml
H3PO4
2 ml H3PO4
0.01M
2 ml H2O
Conditionnement
Echantillon
Lavage
Annexe 2
0.01M
0.01M
2 ml ACN
5% ds
H2 O
2 ml
MeOH
2 ml
NH4OH
5% ds
MeOH
2 ml
NH4OH
5% ds
MeOH
0.01M
2 ml MeOH
5% ds H2O
2 ml ACN
2 ml NH4OH
5% ds MeOH
2 ml MeOH
Elution
2 ml
NH4OH
5% ds
MeOH
Urine
6
Conditionnement
2 ml MeOH
2 ml H3PO40.01M
Echantillon
1 ml d’urine
Lavage
2 ml HCl 0.1N
2 ml MeOH
Elution
2 ml NH4OH 5% ds MeOH
Annexe 2
Figure 4
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Oasis® MCX de
plasma (en haut) et d’urine (en bas) avec des blancs et des matrices spikées.
2.4 Colonne SPEC
2.4.1 Colonne SPEC® Si
Tableau 5
Tests d’extraction réalisés avec la colonne SPEC® Si dans l’urine
Urine
1
2
250 μl MeOH
250 μl MeOH
250 μl H3PO4
0.01M
250 μl d’ac. acétique 0.1M
2 ml de plasma
1 ml d’urine diluée 1 :1 avec ac acétique 0.1M
250 μl H2O
250 μl d’ac. acétique 0.1M 50% ds MeOH
250 μl ACN
1 ml MeOH
1 ml MeOH
Conditionnement
Echantillon
Lavage
Elution
Annexe 2
Figure 5
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne SPEC® Si d’urine
avec des blancs et des matrices spikées.
2.4.2 Colonne SPEC® C18
Tableau 6
Tests d’extraction réalisés avec la colonne SPEC® C18 dans l’urine
Urine
1
2
250 μl MeOH
250 μl MeOH
250 μl H3PO4 0.01M
250 μl H2O
2 ml de plasma
1 ml d’urine diluée 1 :1 avec H2O
250 μl H2O
250 μl d’ac. acétique 0.1M 50% ds
MeOH
Conditionnement
Echantillon
Lavage
250 μl ACN
Elution
1 ml MeOH
Annexe 2
Figure 6
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne SPEC® C18 d’urine
avec des blancs et des matrices spikées.
2.5 Bon-Elut Certify® I HF
Tableau 7
Tests d’extraction réalisés avec la colonne Bond ELut Certify® dans l’urine
Urine
1
2
Conditionnement
2 ml MeOH
2 ml MeOH
2 ml H3PO4 0.01M
2 ml H3PO40.01M
2 ml de plasma
1 ml d’urine + 1 ml d’ACN
1 ml H2O
1 ml H2O
1 ml ACN
1 ml ACN
1 ml MeOH
Echantillon
Lavage
Elution
Annexe 2
Figure 7
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Bond ELut Certify® I
HF d’urine (gauche) avec des blancs et des matrices spikées.
2.6 Colonne Bond-Elut® Si
Tableau 8
Tests d’extraction réalisés avec la colonne Bond-Elut®-Si dans le plasma et l’urine
Plasma
Urine
1
2
3
2 ml MeOH
2 ml MeOH
3 ml MeOH
2 ml H3PO4 0.01M
2 ml H3PO40.01M
2 ml H2O
2 ml de plasma
1 ml d’urine + 1 ml
d’ACN
2 ml de plasma + 2
ml de tampon PBS
Conditionnement
Echantillon
Lavage
1 ml H2O
1 ml H2O
2 ml H2O
1 ml ACN
1 ml ACN
2 ml ACN
1 ml MeOH
1 ml NH4OH 5% ds
MeOH
2 ml de phase
mobile organique
Elution
Annexe 2
Figure 8
Exemples de chromatogrammes obtenus lors d’extraction avec la colonne Bond Elut® Si de
plasma (en haut) et d’urine (en bas) avec des blancs et des matrices spikées.
Annexe 3
3 Validation du dosage du
salbutamol dans le plasma
3.1 Protocole expérimental
3.1.1 Points de la gamme de calibration
Les six points de la gamme de calibration qui ont été retenus pour la phase de validation
sont présentés dans le Tableau 9. Chaque point de gamme a été traité à deux reprises
durant trois jours consécutifs.
3.1.2 Standards de validation
Quatre standards de validation (cf Tableau 9) ont également été choisis et chacun a été
traité à quatre reprises durant les trois jours consacrés à la phase de validation afin de
déterminer la fidélité intermédiaire et de connaître l’exactitude de la méthode.
Tableau 9
Concentration des points de la gamme de calibration et des standards de validation
Type d’échantillon
Niveau de
concentration
Concentration sélectionnée
1
0.75
2
0.75
3
1
4
1
5
2
6
2
1
1
2
2
3
3.75
4
6.25
(ng/ml)
Points de gamme
Standards de validation
Annexe 3
Validation du dosage du salbutamol dans le plasma 28
3.2 Analyse des résultats
3.2.1 Ensemble des réponses obtenues lors de l'étape de
validation
Les réponses générées lors de la validation sont des rapports de surface de pics
correspondant au salbutamol et à son étalon interne, la baméthane
Tableau 10
Ensemble des réponses obtenues à partir des points de la gamme
0.75
0.0353
0.03530
0.04150
0.75
0.0352
0.04020
0.04110
1
0.0430
0.53200
0.04840
1
0.0465
0.05720
0.04440
2
0.0916
0.09330
0.09260
2
0.0909
0.08900
0.08790
3.75
0.1745
0.17800
0.17650
3.75
0.1616
0.15610
0.16890
5
0.2373
0.23660
0.22070
5
0.2397
0.22550
0.22850
7.5
0.3446
0.31850
0.34040
7.5
0.3591
0.33730
0.33380
Tableau 11
Ensemble des réponses obtenues à partir des standards de validation
Concentration
(xijk; ng/ml)
1
2
3.75
6.25
Rapport des surfaces (yijk)
Série 1
Série 2
Série 3
0.04850
0.04300
0.04330
0.04720
0.04610
0.04510
0.04830
0.04870
0.04630
0.04930
0.04540
0.05160
0.09780
0.08620
0.08790
0.09560
0.09030
0.09430
0.08870
0.08760
0.08650
0.09170
0.09190
0.09080
0.16570
0.16800
0.16650
0.17890
0.17260
0.17460
0.17320
0.17360
0.16620
0.16570
0.16630
0.17540
0.29910
0.27420
0.27820
Annexe 3
0.29450
0.27700
0.28830
0.29830
0.28100
0.27700
0.29560
0.28290
0.26290
3.2.2 Ajustement des courbes de calibration
L’estimation des paramètres de la régression pour chaque série d’analyse est présentée
dans les tableaux suivants:
3.2.2.1 Pour la série 1
Tableau 12
Estimation des paramètres de la régression de la série 1
xijk
yi
xiyi
xi2
yi2
n
yimoy
yi prédit
0.75
0.0353
0.0265
0.5625
0.0012
1
0.75
0.0352
0.0264
0.5625
0.0012
1
1
0.0430
0.0430
1.0000
0.0018
1
1
0.0465
0.0465
1.0000
0.0022
1
2
0.0916
0.1832
4.0000
0.0084
1
2
0.0909
0.1818
4.0000
0.0083
1
3.75
0.1745
0.6544
14.0625
0.0305
1
3.75
0.1616
0.6060
14.0625
0.0261
1
5
0.2373
1.1865
25.0000
0.0563
1
5
0.2397
1.1985
25.0000
0.0575
1
7.5
0.3446
2.5845
56.2500
0.1187
1
7.5
0.3591
2.6933
56.2500
0.1290
1
40
1.8593
9.4305
201.75
0.44
12
3.3333
0.1549
1600
3.456996
∑xi
∑xi2
∑yi
∑yi2
∑xy
SSPE1
njk
40.00
201.75
1.85930
1.8593
9.4305
0.0001976
12
b1:pente
a1:ordonée
SSE1
ddl1
MSE1
SSTot1
r12
0.047252
-0.002565
0.00034
10
3.426E-05
0.1531
0.9978
0.032874
0.0353
0.032874
0.0448
0.044687
0.044687
0.091939
0.0913
0.091939
0.174630
0.1681
0.174630
0.2385
0.233695
0.233695
0.351826
0.3519
0.351826
Tableau 13
xijk
yij2
xiyi
xi2
yi2
ni yimoy
yi prédit
0.75
0.03530
0.026475
0.56
0.0012
1
0.04044
0.75
0.04020
0.030150
0.56
0.0016
1
1
0.05320
0.053200
1.00
0.0028
1
0.03775
0.04044
0.05121
Annexe 3
1
0.05720
0.057200
1.00
0.0033
1
2
0.09330
0.186600
4.00
0.0087
1
0.05520
0.05121
0.09427
2
0.08900
0.178000
4.00
0.0079
1
3.75
0.17800
0.667500
14.06
0.0317
1
0.09115
3.75
0.15610
0.585375
14.06
0.0244
1
5
0.23660
1.183000
25.00
0.056
1
5
0.22550
1.127500
25.00
0.0509
1
7.5
0.31850
2.388750
56.25
0.1014
1
7.5
0.33730
2.529750
56.25
0.1138
1
40
1.8202
9.013500
201.75
0.4037
12
3.33333
0.1517
0.751125
0.09427
0.16963
0.16705
0.16963
0.22345
0.23105
0.22345
0.33111
0.32790
0.33111
1.8202
∑xi
∑ixi2
∑yi
∑yi2
∑xy
SSPE2
njk
40.00
201.75
1.82020
0.403685
9.0135
0.0005074
12
b2:pente
a2:ordonée
SSE2
ddl2
MSE2
SSTot2
r22
0.043062
0.00814
0.00072
10
7E-05
0.1276
0.9943
Tableau 14
xijk
yij3
xiyi
xi2
yi2
ni yimoy
yi prédit
0.8
0.04150
0.031125
0.56
0.8
0.04110
0.030825
0.56
0.0017
1
0.03761
0.0017
1
1
0.04840
0.048400
1.00
0.0023
1
1
0.04440
0.044400
1.00
0.002
1
2
0.09260
0.185200
4.00
0.0086
1
2
0.08790
0.175800
4.00
0.0077
1
3.8
0.17650
0.661875
14.06
0.0312
1
3.8
0.16890
0.633375
14.06
0.0285
1
5
0.22070
1.103500
25.00
0.0487
1
5
0.22850
1.142500
25.00
0.0522
1
7.5
0.34040
2.553000
56.25
0.1159
1
7.5
0.33380
2.503500
56.25
0.1114
1
40
1.8247
9.113500
201.75
0.4119
12
3.33
0.1521
0.759458
0.04130
0.03761
0.04868
0.04640
0.04868
0.09299
0.09025
0.09299
0.17052
0.17270
0.17052
0.2259
0.22460
0.2259
0.33666
0.33710
0.33666
1.8247
∑xi
∑xi2
∑yi
∑yi2
∑xy
SSPE3
njk
40.00
201.75
1.82470
0.4119
9.1135
0.0001002
12
Annexe 3
b3:pente
a3:ordonée
SSE3
ddl3
MSE3
SSTot3
r32
0.044305
0.00438
0.00017
10
2E-05
0.1345
0.9988
3.2.3 Estimation des concentrations
Après l’établissement des courbes de calibration, les concentrations des standards de
validation ont été calculées sur la base des réponses obtenues
Tableau 15
Estimation des concentrations des standards de validation
xijk
série
1
1
2
3
2
1
2
3
3.75
1
2
rapport des surfaces
u*ijk
0.04850
1.0807
0.04720
1.0532
0.04830
1.0765
0.04930
1.0976
0.04545
0.8664
0.04610
0.8814
0.04870
0.9418
0.04540
0.8652
0.04330
0.8785
0.04510
0.9192
0.04630
0.9463
0.05160
1.0659
0.09780
2.1240
0.09560
2.0775
0.08870
1.9315
0.09170
1.9949
0.08620
1.8127
0.09030
1.9079
0.08760
1.8452
0.09190
1.9450
0.08790
1.8852
0.09430
2.0297
0.08650
1.8536
0.09080
1.9507
0.16570
3.5610
0.17890
3.8404
0.17320
3.7197
0.16570
3.5610
0.16800
3.6097
Annexe 3
3
6.25
1
2
3
0.17260
3.8191
0.17360
3.8423
0.16630
3.6728
0.16650
3.6593
0.17460
3.8421
0.16620
3.6525
0.17540
3.8602
0.29910
6.3842
0.29450
6.2868
0.28900
6.1704
0.29240
6.2424
0.27420
6.1784
0.27700
6.2435
0.28100
6.3364
0.28290
6.3805
0.27820
6.1805
0.28830
6.4085
0.27700
6.1534
0.26290
5.8351
3.2.4 Vérification de la linéarité
La linéarité de la relation existant entre les concentrations estimées et les concentrations
introduite a été vérifiée. Sur la base des résultats obtenus, l’application d’un modèle de
régression linéaire a abouti pour chaque série aux équations suivantes, où x représente les
concentrations introduites et y, les concentrations estimées pour les standards de
validation:
Série 1 : y = 0.988 x + 0.052
Série 2 : y= 1.032 x + 0.072
Série 3 : y = 0.992 x - 0.03
Calcul de la variance de la pente moyenne pour les séries ainsi que les limites de confiance
à 90% de ce paramètre:
Tableau 16
Vérification de la linéarité
b1
b2
b3
moyenne
Var(b)
LCIb
LCSb
p
0.988024
1.032326
0.992416
1.004255
5.95793E-04
0.932981
1.075529
3
Les limites d'acceptation au seuil d’incertitude de 5 % sont comprises entre 0.85 à 1.15
Annexe 3
3.2.5 Détermination de la fidélité à partir des standards
de validation
Tableau 17
Fidélité de la procédure
xijk
U
Variance de
(conc.) moy* répétabilitéS2r
CVr S2(g)Variance
(%) inter-série
S2(FI)Variance de
fidélité
CVFI(%)
1
1.0
0.003
5.4
0.0085
0.011
10.9
2
1.9
0.006
3.9
0.0047
0.010
5.2
3.75
3.7
0.015
3.3
0.0
0.013
3.1
6.25
6.2
0.024
2.5
0.00
0.024
2.5
Figure 9
Profil de linéarité
3.2.6 Détermination de l’exactitude
Tableau 18
Calcul des pourcentages de recouvrement, des biais absolus et des biais relatifs
xijk (conc.)
Série
u*ijk
R%ijk
Bijk
Pbijk
1
1
1.1
108.07
0.1
8.1
1.1
105.32
0.1
5.3
1.1
107.65
0.1
7.6
1.1
109.76
0.1
9.8
0.9
86.64
-0.1
-13.4
0.9
88.14
-0.1
-11.9
2
Annexe 3
3
2
1
2
3
3.75
1
2
3
6.25
1
2
3
0.9
94.18
-0.1
-5.8
0.9
86.52
-0.1
-13.5
0.9
87.85
-0.1
-12.1
0.9
91.92
-0.1
-8.1
0.9
94.63
-0.1
-5.4
1.1
106.59
0.1
6.6
2.1
106.20
0.1
6.2
2.1
103.87
0.1
3.9
1.9
96.57
-0.1
-3.4
2.0
99.75
0.0
-0.3
1.8
90.63
-0.2
-9.4
1.9
95.39
-0.1
-4.6
1.8
92.26
-0.2
-7.7
1.9
97.25
-0.1
-2.7
1.9
94.26
-0.1
-5.7
2.0
101.48
0.0
1.5
1.9
92.68
-0.1
-7.3
2.0
97.53
0.0
-2.5
3.6
94.96
-0.2
-5.0
3.8
102.41
0.1
2.4
3.7
99.19
0.0
-0.8
3.6
94.96
-0.2
-5.0
3.7
98.99
0.0
-1.0
3.8
101.84
0.1
1.8
3.8
102.46
0.1
2.5
3.7
97.94
-0.1
-2.1
3.7
97.58
-0.1
-2.4
3.8
102.46
0.1
2.5
3.7
97.40
-0.1
-2.6
3.9
102.94
0.1
2.9
6.4
102.15
0.1
2.1
6.3
100.59
0.0
0.6
6.2
98.73
-0.1
-1.3
6.2
99.88
0.0
-0.1
6.2
98.86
-0.1
-1.1
6.2
99.90
0.0
-0.1
6.3
101.38
0.1
1.4
6.4
102.09
0.1
2.1
6.2
98.89
-0.1
-1.1
6.4
102.54
0.2
2.5
Annexe 3
6.2
98.45
-0.1
-1.5
5.8
93.36
-0.4
-6.6
Tableau 19
Exactitude de la procédure
xijk (conc.)
umoyijk
R%j
S(FI)
LCI(R%)
LCS(R%)
1.0
1.0
97.3
0.106
77.86
116.68
2.0
1.9
97.3
0.102
87.97
106.67
3.75
3.73
99.4
0.114
93.88
104.98
6.25
6.23
99.7
0.155
95.19
104.27
Les limites de confiance unilatérales à 95% du pourcentage de recouvrement sont
comprises entre les limites fixées à 80% et 120%.
Figure 10
Profil d’exactitude
3.2.7 Détermination du rendement d’extraction
Tableau 20
Détermination du rendement d'extraction (voir p. Commission SFSTP Methodes Chromatoghraphiques de
dosage dans les milieux biologiques:Exemple d'application de la stratégie de la validation
xijk
yijk
(gamme biologique) ymoy* (gamme
aqueuse)
2
190983
Rendement d'extraction %
Annexe 3
187500
171421
164711
200406
162532
195074
167288
188686
5
142329
336690
339833
340884
339984
364465
358464
363813
367911
356275
10
360927
747260
683494
697734
680772
706734
688854
717765
643909
616754
20
706107
1E+06
1E+06
1E+06
1E+06
1E+06
1E+06
1E+06
1E+06
1E+06
30
2E+06
2E+06
2E+06
2E+06
2E+06
1414866
Annexe 3
2E+06
2E+06
2E+06
2E+06
40
2153162
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
50
2856842
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3E+06
3528997
moyenne
102.6
ecart-type
11.12
3.2.8 Estimation statistique de l’homogénéité des
variances
3.2.8.1 Test de Cochane
Tableau 21
Estimation de la variance par niveau de concentration
xijk
1
série k yijk
rapport
des
surfaces
1
yijk2
0.00301
0.0555
0.00308
0.1611
0.00257
0.0473
0.00224
0.0562
0.00315
0.0546
∑yijk2
Sj2
(∑yijk)2/nj ∑yijk2k
(∑yijk)2/nj
k
0.0549
0.0507
2
∑yijk
0.1581
0.00298
0.00866
0.00865
0.00001
0.00838
0.00834
0.00004
Annexe 3
3
0.0503
0.00253
0.0497
0.00247
0.0494
1.5
1
0.00686
0.0799
0.00638
1
0.0706
0.00499
0.0738
0.00545
1
0.1007
0.01014
1
0.0959
0.00920
0.2883
0.00798
0.0996
0.00992
0.0903
0.00815
0.2834
0.00874
0.1255
0.01575
0.1164
0.01354
0.3652
0.01521
0.1172
0.01373
0.1185
0.01405
0.3535
0.01388
0.1208
0.01459
0.1217
0.01481
0.3564
0.01297
0.1424
0.02027
0.1423
0.02025
0.1550
2
0.00937
0.01063
0.1139
3
0.2951
0.1031
0.1178
3
0.00484
0.00952
0.1233
2
0.2166
0.0976
0.0935
2.5
0.00671
0.00536
0.0893
3
0.2260
0.0732
0.0968
2
0.00518
0.00540
0.0696
2
0.2347
0.0735
0.0819
3
0.00244
0.0828
0.0720
2
0.1494
0.4397
0.02403
0.1435
0.02058
0.1427
0.02035
0.1369
0.4230
0.01873
0.00744
0.00744
0.00000
Sj2
0.00006
9.712E-06
0.01842
0.01836
0.00006
0.01709
0.01703
0.00007
0.01565
0.01564
0.00001
Sj2
0.00014
2.3655E-05
0.02903
0.02903
0.00001
0.02781
0.02771
0.00009
0.02682
0.02677
0.00004
Sj2
0.00015
2.4616E-05
0.04450
0.04446
0.00005
0.04166
0.04166
0.00000
0.04238
0.04234
0.00004
Sj2
0.00008
1.3821E-05
0.06455
0.06445
0.00011
0.05966
0.05964
0.00003
Annexe 3
3
0.1376
0.01893
0.1350
0.01823
0.1358
5
1
0.05161
0.2276
0.05182
0.6818
0.05152
0.2258
0.05099
0.2368
0.05607
0.2302
3
0.01844
0.2272
0.2270
2
0.4084
0.6928
0.05297
0.2230
0.04973
0.2193
0.04809
0.2275
0.6698
0.05176
0.05560
0.05560
0.00000
Sj2
0.00014
2.2786E-05
0.15495
0.15495
0.00000
0.16003
0.15997
0.00006
0.14958
0.14954
0.00003
Sj2
0.00010
1.5846E-05
Tableau 22
Test de Cochrane
Test de Cochrane
Sj2max
ΣSj2
Ccalc
C(0.05;m,(p(n-1))
0.00012007
0.000230505
0.5209
0.3726
Si C≤C[(0.05,m,p(n-1)]
3.2.8.2 Test de Levene
Tableau 23
Test de Levene: calcul des déviations absolues des réponses
xijk série
yijk rapport des surfaces
1
1
dijk=¦yijk-yimoy¦
dijk2
0.0549
0.00119
1.417E-06
0.0555
0.00179
3.201E-06
0.00298
8.877E-06
0.0473
0.00537
2.879E-05
0.0562
0.00345
1.189E-05
0.00192
3.677E-06
0.0503
0.00050
2.5E-07
0.0497
0.00010
1E-08
0.00040
1.6E-07
0.0828
0.00459
2.11E-05
0.0799
0.00166
2.766E-06
0.00626
3.915E-05
0.0735
0.00184
3.379E-06
0.0706
0.00472
2.224E-05
0.0507
2
0.0546
3
0.0494
1.5 1
0.0720
2
yimoy
0.05369
0.05271
0.04980
0.07822
Annexe 3
0.0819
3
0.00655
4.297E-05
0.0732
0.00100
0.000001
0.0738
0.00160
2.56E-06
0.00260
6.76E-06
0.0976
0.00081
6.494E-07
0.1007
0.00236
5.555E-06
0.00155
2.405E-06
0.1031
0.00697
4.862E-05
0.0959
0.00021
4.277E-08
0.00677
4.578E-05
0.0996
0.00513
2.635E-05
0.0903
0.00417
1.736E-05
0.00097
9.344E-07
0.1255
0.00377
1.422E-05
0.1164
0.00537
2.881E-05
0.00160
2.55E-06
0.1172
0.00066
4.356E-07
0.1185
0.00070
4.856E-07
0.00004
1.356E-09
0.1208
0.00200
4E-06
0.1217
0.00290
8.41E-06
0.00490
2.401E-05
0.1424
0.00419
1.754E-05
0.1423
0.00427
1.824E-05
0.00846
7.154E-05
0.1435
0.00246
6.046E-06
0.1427
0.00167
2.781E-06
0.00413
1.703E-05
0.1376
0.00147
2.151E-06
0.1350
0.00113
1.284E-06
0.00033
1.111E-07
0.2272
0.00008
7.128E-09
0.2276
0.00037
1.359E-07
0.00028
8.08E-08
0.2258
0.00511
2.607E-05
0.2368
0.00587
3.447E-05
0.00077
5.868E-07
0.2230
0.00027
7.111E-08
0.2193
0.00397
1.573E-05
0.00423
1.792E-05
0.0696
2
1
0.0968
2
0.0893
3
0.0935
2.5 1
0.1233
2
0.1178
3
0.1139
3
1
0.1550
2
0.1369
3
0.1358
5
1
0.2270
2
0.2302
3
0.2275
0.07534
0.07220
0.09836
0.09611
0.09447
0.12173
0.11785
0.11880
0.14657
0.14099
0.13613
0.22726
0.23092
0.22327
Annexe 3
7.5 1
0.3497
0.00863
7.452E-05
0.3603
0.00194
3.758E-06
0.00669
4.481E-05
0.3651
2
0.35837
0.3641
0.01935
0.0003745
0.3327
0.01201
0.0001443
0.00734
5.385E-05
0.3465
0.00383
1.469E-05
0.3419
0.00077
5.878E-07
0.00307
9.404E-06
0.3374
3
0.34474
0.3396
0.34267
Tableau 24
Test de Levene: table d'analyse de variance
Xijk (conc) Σ(dijk2) Σ(dijk)=d.j.
d.j.2
1
5.83E-05 0.01769
0.000313 3.477E-05 63
1.5
1.42E-04 0.03082
0.000950 1.056E-04
2
1.48E-04 0.02893
0.000837 9.297E-05
2.5
0.000083 0.02193
0.000481 5.343E-05
3
0.000137 0.02810
0.000790 8.775E-05
5
0.000095 0.02095
0.000439 4.875E-05
7.5
0.000720 0.06363
0.004049 4.499E-04
Total
1.38E-03 0.2121
0.0079
SS(1):
1.38E-03 SS(2)
8.732E-04 SS(3)
Source
SSinter
Conc.
0.00016 6
ddl inter((m-1)), intra ([Σmj(Σpknjk-1)] MS
d.j.2/(Σnjk) N=k*m*ni
8.732E-04
Fcalc
0.00071
F(0.05,m-1:Σμϕ(Σπκnjk-1))
0.000027
SSintra
Erreur
0.00051 56
0.0000091 2.92
2.27
Annexe 4
4 Validation du dosage du
salbutamol dans l’urine
4.1 Protocole expérimental
4.1.1 Points de la gamme de calibration
Les six points de la gamme de calibration qui ont été retenus pour la phase de validation
sont présentés dans le Tableau 9. Chaque point de gamme a été traité à deux reprises
durant trois jours consécutifs.
4.1.2 Standards de validation
Quatre standards de validation (cf Tableau 9) ont également été choisis et chacun a été
traité à quatre reprises durant les trois jours consacrés à la phase de validation afin de
déterminer la fidélité intermédiaire et de connaître l’exactitude de la méthode.
Tableau 25
Concentration des points de la gamme de calibration et des standards de validation
Type d’échantillon
Niveau de concentration
Concentration sélectionnée
(ng/ml)
Points de gamme
1
5
2
10
3
20
4
30
5
50
6
100
1
5
2
25
3
40
4
100
Standards de validation
Annexe 4
Validation du dosage du salbutamol dans l’urine 43
4.2 Analyse des résultats
4.2.1 Ensemble des réponses obtenues lors de l'étape de
validation
Les réponses générées lors de la validation sont des rapports de surface de pics
correspondant au salbutamol et à son étalon interne, la baméthane
Tableau 26
Ensemble des réponses obtenues à partir des points de la gamme
Concentration
(xijk; ng/ml)
Série 1
Série 2
Série 3
5
0.2514
0.24200
0.25600
5
0.2561
0.25040
0.26480
10
0.4671
0.46430
0.51560
10
0.4588
0.44410
0.49990
20
0.9433
0.91280
0.94010
20
0.9023
0.92350
0.90150
30
1.2772
1.34480
1.41420
30
1.3384
1.32310
1.37560
50
2.1260
2.21440
2.13800
50
2.1057
2.16250
2.12840
100
4.3534
4.49820
4.56240
100
4.4821
4.21840
4.58630
Tableau 27
Ensemble des réponses obtenues à partir des standards de validation
Concentration (xijk; ng/ml)
5
25
40
Série 1
Série 2
Série 3
0.2420
0.2561
0.2560
0.2504
0.2457
0.2468
0.2547
0.2571
0.2520
0.2538
0.2462
0.2604
1.1396
1.0915
1.1365
1.1992
1.0938
1.1364
1.1631
1.0759
1.0951
1.2073
1.0699
1.1135
1.708
1.82150
1.8611
1.6702
1.7321
1.8292
1.664
1.6967
1.8121
Annexe 4
100
1.6872
1.8072
1.7422
4.5102
4.4771
4.5013
4.2004
4.4864
4.2930
4.2447
4.2282
4.4019
4.4538
4.3457
4.5347
4.2.2 Ajustement des courbes de calibration
L’estimation des paramètres de la régression pour chaque série d’analyse est présentée
dans les tableaux suivants:
Tableau 28
xijk
yi
xiyi
xi2
yi2
n yimoy
yi prédit
5
0.2514
1.2570
25.0000
0.0632
1
0.234843
5
0.2561
1.2805
25.0000
0.0656
1 0.2538
0.234843
10
0.4671
4.6710
100.0000
0.2182
1
0.453000
10
0.4588
4.5880
100.0000
0.2105
1 0.4630
0.453000
20
0.9433
18.8660
400.0000
0.8898
1
0.889315
20
0.9023
18.0450
400.0000
0.8141
1 0.9228
0.889315
30
1.2772
38.3160
900.0000
1.6312
1
1.325629
30
1.3384
40.1520
900.0000
1.7913
1 1.3078
1.325629
50
2.1260
106.3000
2500.0000
4.5199
1
2.198258
50
2.1057
105.2850
2500.0000
4.4340
1 2.1159
2.198258
100
4.3534
435.3400
10000.0000
18.9521
1
4.379830
100
4.4821
448.2100
10000.0000
20.0892
1 4.4178
4.379830
430
18.9618
1222.3105
27850.00
53.68
12
35.8333
1.5801
184900
359.548
∑xi
∑xi2
∑yi
∑yi2
∑xy
SSPE1
njk
430.00
27850.00
18.96175
18.9618
1222.3105
0.0112487
12
b1:pente
a1:ordonée
SSE1
ddl1
MSE1
SSTot1
r12
0.043631
0.016686
0.03149
10
0.003149451
23.7167
0.9987
Tableau 29
xijk
yij2
xiyi
xi2
yi2
ni
5
0.24200
1.210000
25.00
0.058564
1
yimoy
yi prédit
0.2498344
Annexe 4
5
0.25040
1.252000
25.00
0.06270016
1
0.24620 0.2498344
10
0.46430
4.643000
100.00
0.21557449
1
0.4660572
10
0.44410
4.441000
100.00
0.19722481
1
0.45420 0.4660572
20
0.91280
18.256000
400.00
0.83320384
1
0.8985028
20
0.92350
18.470000
400.00
0.85285225
1
0.91815 0.8985028
30
1.34480
40.344000
900.00
1.80848704
1
1.3309484
30
1.32310
39.693000
900.00
1.75059361
1
1.33395 1.3309484
50
2.21440
110.720000
2500.00
4.90356736
1
2.1958396
50
2.16250
108.125000
2500.00
4.67640625
1
2.18845 2.1958396
100
4.49820
449.820000
10000.00 20.2338032
1
4.3580677
100
4.21840
421.840000
10000.00 17.7948986
1
4.35830 4.3580677
430
18.9985
1218.814000
27850.00 53.3878756
12
35.83333
1.5832
101.567833
184900
360.943
18.9985
∑xi
∑ixi2
∑yi
∑yi2
∑xy
SSPE2
njk
430.00
27850.00
18.99850
53.387876
1218.8140
0.0410228
12
b2:pente
a2:ordonnée
SSE2
ddl2
MSE2
SSTot2
r22
0.043245
0.03361
0.04223
10
0.00422298
23.3093
0.9982
Tableau 30
Série 3
xijk
yij3
xiyi
xi2
yi2
ni yimoy
yi prédit
5
0.25600
1.280000
25.00
0.065536
1
0.24469
5
0.26480
1.324000
25.00
0.07011904
1 0.26040
0.24469
10
0.51560
5.156000
100.00
0.26584336
1
0.4696429
10
0.49990
4.999000
100.00
0.24990001
1 0.50775
0.4696429
20
0.94010
18.802000
400.00
0.88378801
1
0.9195489
20
0.90150
18.030000
400.00
0.81270225
1 0.92080
0.9195489
30
1.41420
42.426000
900.00
1.99996164
1
1.3694549
30
1.37560
41.268000
900.00
1.89227536
1 1.39490
1.3694549
50
2.13800
106.900000
2500.00
4.571044
1
2.2692668
50
2.12840
106.420000
2500.00
4.53008656
1 2.13320
2.2692668
100
4.56240
456.240000
10000.00
20.8154938
1
4.5187966
100
4.58630
458.630000
10000.00
21.0341477
1 4.57435
4.5187966
430
19.5828
1261.475000
27850.00
57.1908977
12
19.5828
35.83
1.6319
105.122917
184900
383.4861
Annexe 4
∑xi
∑xi2
∑yi
∑yi2
∑xy
430.00
27850.00
19.58280
57.190898
1261.4750 0.0019836 12
b3:pente
a3:ordonée
SSE3
ddl3
MSE3
0.044991
0.01974
0.04988
10
0.00498803 25.2337
SSPE3
SSTot3
njk
r32
0.9980
4.2.3 Estimation des concentrations
Après l’établissement des courbes de calibration, les concentrations des standards de
validation ont été calculées sur la base des réponses obtenues
Tableau 31
Estimation des concentrations des standards de validation
xijk
série
rapport des surfaces
u*ijk
5
1
0.2420
5.1640
0.2504
5.3566
0.2547
5.4551
0.2538
5.4345
0.2561
5.1449
0.2457
4.9044
0.2571
5.1680
0.2462
4.9160
2
3
25
1
2
3
40
1
0.2560
5.2514
0.2468
5.0469
0.2520
5.1625
0.2604
5.3492
1.1396
25.7364
1.19920
27.1023
1.1631
26.2750
1.2073
27.2880
1.0915
24.4629
1.09380
24.5161
1.0759
24.1022
1.0699
23.9634
1.1365
24.8221
1.1364
24.8199
1.0951
23.9020
1.1135
24.3109
1.708
38.7637
1.6702
37.8973
1.664
37.7552
Annexe 4
2
3
100
1
2
3
1.6872
38.2869
1.8215
41.3650
1.7321
39.2763
1.6967
38.4577
1.8072
41.0130
1.8611
40.9277
1.8292
40.2187
1.8121
39.8386
1.7422
38.2850
4.5102
102.9880
4.2004
95.8876
4.2447
96.9029
4.4538
101.6953
4.4771
102.7525
4.4864
102.9676
4.2282
96.9969
4.3457
99.7140
4.5013
99.6111
4.2930
94.9812
4.4019
97.4018
4.5347
100.3535
4.2.4 Vérification de la linéarité
La linéarité de la relation existant entre les concentrations estimées et les concentrations
introduite a été vérifiée. Sur la base des résultats obtenus, l’application d’un modèle de
régression linéaire a abouti pour chaque série aux équations suivantes, où x représente les
concentrations introduites et y, les concentrations estimées pour les standards de
validation:
Série 1 : y = 0.985 x + 0.491
Série 2 : y = 1.009 x – 0.413
Série 3 : y = 0.979 x + 0.304
Calcul de la variance de la pente moyenne pour les séries ainsi que les limites de confiance
à 90% de ce paramètre:
Tableau 32
Vérification de la linéarité
b1
0.985477
b2
1.009268
b3
moyenne
Var(b)
LCIb
LCSb
0.978556
0.991100
2.59518E-04
0.944060
1.038140
Annexe 4
Les limites d'acceptation au seuil d’incertitude de 5 % sont comprises entre 0.85 à 1.15
4.2.5 Détermination de la fidélité à partir des standards
de validation
Tableau 33
Fidélité de la procédure
xijk
(conc.)
umoy* Variance de
CVr (%)
répétabilité S2r
Variance inter- Variance de CVFI(%)
série S2g
fidélité
intermédiaire
S2FI
5
5.2
0.0210
0.018
2.6
0.039
3.8
25
25.1
0.266
2.1
1.6133
1.879
5.5
40
39.3
1.127
2.7
0.7
1.874
3.5
100
99.4
8.699
3.0
-0.59
8.113
2.9
Figure 11
Profil de fidélité
4.2.6 Détermination de l’exactitude
Tableau 34
Calcul des pourcentages de recouvrement, des biais absolus et des biais relatifs
xijk (conc.)
Série
u*ijk
R%ijk
Bijk
Pbijk
5
1
5.2
103.28
0.2
3.3
5.4
107.13
0.4
7.1
Annexe 4
2
3
25
1
2
3
40
1
2
3
100
1
2
5.5
109.10
0.5
9.1
5.4
108.69
0.4
8.7
5.1
102.90
0.1
2.9
4.9
98.09
-0.1
-1.9
5.2
103.36
0.2
3.4
4.9
98.32
-0.1
-1.7
5.3
105.03
0.3
5.0
5.0
100.94
0.0
0.9
5.2
103.25
0.2
3.2
5.3
106.98
0.3
7.0
25.7
102.95
0.7
2.9
27.1
108.41
2.1
8.4
26.3
105.10
1.3
5.1
27.3
109.15
2.3
9.2
24.5
97.85
-0.5
-2.1
24.5
98.06
-0.5
-1.9
24.1
96.41
-0.9
-3.6
24.0
95.85
-1.0
-4.1
24.8
99.29
-0.2
-0.7
24.8
99.28
-0.2
-0.7
23.9
95.61
-1.1
-4.4
24.3
97.24
-0.7
-2.8
38.8
96.91
-1.2
-3.1
37.9
94.74
-2.1
-5.3
37.8
94.39
-2.2
-5.6
38.3
95.72
-1.7
-4.3
41.3
103.36
1.3
3.4
39.3
98.19
-0.7
-1.8
38.5
96.14
-1.5
-3.9
41.0
102.53
1.0
2.5
40.9
102.32
0.9
2.3
40.2
100.55
0.2
0.5
39.8
99.60
-0.2
-0.4
38.3
95.71
-1.7
-4.3
103.0
102.99
3.0
3.0
95.9
95.89
-4.1
-4.1
96.9
96.90
-3.1
-3.1
101.7
101.70
1.7
1.7
102.8
102.75
2.8
2.8
103.0
102.97
3.0
3.0
Annexe 4
3
97.0
97.00
-3.0
-3.0
99.7
99.71
-0.3
-0.3
99.6
99.61
-0.4
-0.4
95.0
94.98
-5.0
-5.0
97.4
97.40
-2.6
-2.6
100.4
100.35
0.4
0.4
Tableau 35
Exactitude de la procédure
xijk (conc.)
umoyijk
R%j
S(FI)
LCI(R%)
LCS(R%)
5.0
5.2
103.9
0.198
96.67
111.18
25.0
25.1
100.4
1.371
90.38
110.48
40.0
39.34
98.3
1.369
92.07
104.62
100.00
99.35
99.4
2.848
94.13
104.58
Figure 12
Profil d’exactitude
Les limites de confiance unilatérales à 95% du pourcentage de recouvrement sont
comprises entre les limites fixées à 80% et 120%.
Annexe 4
4.2.7 Rendement d’extraction
Tableau 36
xijk
yijk
(gamme biologique) ymoy* (gamme aqueuse) Rendement d'extraction %
2
190983
187500
171421
164711
200406
162532
195074
167288
188686
5
142329
127.1394
360927
99.3236
706107
97.2984
1414866
103.6977
336690
339833
340884
339984
364465
358464
363813
367911
356275
10
747260
683494
697734
680772
706734
688854
717765
643909
616754
20
1499886
1495744
1445872
1406690
1467077
1447886
1499886
1495744
1445872
Annexe 4
30
2117397
2150624
2100527
2075482
2139454
2132158
2117397
2150624
2100527
40
2153162
98.4815
2856842
96.4134
3528997
95.9350
2745761
2766066
2757360
2700906
2767674
2748144
2702026
2859493
2741981
50
3395439
3378142
3380276
3322088
3473246
3425024
3395439
3378142
3322088
moyenne
102.6
ecart-type
11.12
CF%
10.84
4.2.8 Evaluation statistique de l’homogénéité des
variances
4.2.8.1 Test de Cochran
Tableau 37
Estimation de la variance par niveau de concentration
xijk
série k
yijk rapport ∑yijk
des
surfaces
yijk2
5
1
0.2420
0.05856
∑yijk2
∑(yijk)2/njk
∑yijk2(∑yijk)2/njk
Sj2
Annexe 4
0.2504
0.2547
2
1
0.06559
0.06037
0.2648
0.07012
0.7728
0.4493
0.20187
0.22354
1.3706
0.20995
0.4536
0.20575
1.3649
0.4641
30
1
0.85285
2.7588
0.9401
0.81451
2.8226
1.3448
1
0.95414
0.00008
0.19916
0.19907
0.00009
Sj2
0.00025
4.149E-05
0.62656
0.62618
0.00038
0.62100
0.62098
0.00002
0.63080
0.63048
0.00031
Sj2
0.00071
0.000118
2.53706
2.53699
0.00007
2.53958
2.53883
0.00075
2.65846
2.65569
0.00277
Sj2
0.00359
0.000598
1.75059
4.0000
1.77449
1.3384
1.79131
1.3137
1.72581
3.9737
1.2772
1.7721
0.19198
1.80849
1.74663
5.33357
5.33333
0.00024
5.26375
5.26343
0.00032
5.13597
5.13390
0.00207
Sj2
0.00262
0.000437
1.63124
1.3059
40
0.84309
0.9025
1.3414
0.19206
0.81270
2.7598
0.88981
1.3216
3
0.85101
0.9433
1.3321
0.00008
0.88379
1.3231
2
0.21818
0.9235
0.9768
0.18605
0.19722
1.3753
0.83320
0.9182
0.18614
0.21539
0.9015
3
0.20530
0.9128
0.9225
2
0.20115
0.4582
0.4671
1
0.06350
0.4728
0.4441
20
0.06610
0.06554
0.4531
3
0.7589
0.2560
0.4485
2
0.06487
0.2561
0.2520
10
0.7471
0.2457
0.2571
3
0.06270
1.70537
3.9245
1.79935
3.14034
Annexe 4
1.7090
1.7160
2
1
3.02690
3.11417
1.7311
2.99671
5.1842
2.2144
4.90357
4.67641
6.5029
4.57104
2.1284
4.53009
2.2924
6.4351
5.25510
4.4821
20.08922
13.3337
0.00239
9.17076
9.17036
0.00040
8.95998
8.95864
0.00134
Sj2
0.00413
0.000689
14.09985 14.09590
0.00395
13.80439 13.80350
0.00089
14.59042 14.57285
0.01758
Sj2
0.02241
0.003735
20.23380 59.27512 59.26252
0.01260
20.26170
4.5624
20.81549
13.6500
21.03415 62.11134 62.10750
4.5102
20.34190
4.4538
19.83633
4.4771
9.00328
4.43397
6.6120
18.95209
4.5863
9.00568
4.90135
4.5013
3
4.70326
4.3534
4.4982
2
4.51988
2.1380
2.2139
1
3.07056
2.1625
2.1057
100
3.02969
2.89272
2.1687
3
5.2451
1.7008
2.1260
2
2.94466
1.7398
1.7523
50
5.1971
1.7647
1.7406
3
2.92068
13.4411
20.04442 60.22266 60.22106
0.00384
0.00161
Sj2
0.01805
0.003008
Test de Cochran
Sj2max ΣSj2
Ccalc
0.003 0.008627 0.3487
C(0.05;m,(p(n-1))
0.3726
Si C≤C[(0.05,m,p(n-1)]
4.2.8.2 Test de Levene
Tableau 38
Test de Levene: calcul des déviations absolues des réponses
xijk
série
yijk rapport des surfaces
5
1
yimoy
dijk=¦yijk-yimoy¦
dijk2
0.2420
0.00703
4.95E-05
0.2504
0.00137
1.87E-06
Annexe 4
0.2547
2
0.00567
3.21E-05
0.2561
0.00313
9.82E-06
0.2457
0.00727
5.28E-05
0.00413
1.71E-05
0.2560
0.00160
2.56E-06
0.2648
0.00720
5.18E-05
0.00560
3.14E-05
0.4493
0.00757
5.73E-05
0.4728
0.01593
0.000254
0.00837
7E-05
0.4582
0.00323
1.05E-05
0.4536
0.00137
1.87E-06
0.00187
3.48E-06
0.4641
0.00567
3.21E-05
0.4441
0.01433
0.000205
0.00867
7.51E-05
0.9128
0.00680
4.62E-05
0.9235
0.00390
1.52E-05
0.00290
8.41E-06
0.9401
0.02017
0.000407
0.9015
0.01843
0.00034
0.00173
3E-06
0.00243
5.92E-06
0.03837
0.001472
0.03593
0.001291
1.3448
0.01147
0.000131
1.3231
0.01023
0.000105
0.00123
1.52E-06
1.3384
0.01383
0.000191
1.3137
0.01087
0.000118
0.00297
8.8E-06
1.2772
0.03097
0.000959
1.3059
0.00227
5.14E-06
0.03323
0.001104
1.7721
0.03973
0.001579
1.7090
0.02337
0.000546
0.01637
0.000268
1.7398
0.00857
7.34E-05
1.7647
0.01633
0.000267
0.00777
6.03E-05
0.2571
3
0.2520
10
1
0.4485
2
0.4531
3
0.4671
20
1
0.9225
2
0.9182
3
0.24903
0.25297
0.25760
0.45687
0.45497
0.45843
0.91960
0.91993
0.9433
0.9025
0.9768
30
1
1.3321
2
1.3216
3
1.3414
40
1
1.7160
2
1.7406
0.94087
1.33333
1.32457
1.30817
1.73237
1.74837
Annexe 4
3
1.7008
0.02727
0.000743
1.7311
0.00303
9.2E-06
0.02423
0.000587
1.7523
50
1
1.72807
2.2144
0.04677
2.1625
0.00513
2.1260
2
2.16763
2.1380
0.00703
4.95E-05
2.1284
0.01663
0.000277
0.02367
0.00056
2.2139
0.00990
9.8E-05
2.1057
0.09830
0.009663
0.08840
0.007815
4.3534
0.09117
0.008311
4.4821
0.03753
0.001409
0.05363
0.002877
0.04870
0.002372
0.01240
0.000154
0.03630
0.001318
4.5102
0.02983
0.00089
4.4538
0.02657
0.000706
0.00327
1.07E-05
2.1687
3
2.14503
2.2924
100
1
2.20400
4.4982
2
4.44457
4.5013
4.5624
4.5863
3
0.04163
4.55000
4.4771
4.48037
Tableau 39
Test de Levene: table d'analyse de variance
Xijk (conc) Σ(dijk2)
Σ(dijk)=d.j.
d.j.2
d.j.2/(Σnjk) N=k*m*ni
5
2.49E-04 0.04300
0.001849 2.054E-04 63
15
7.10E-04 0.06700
0.004489 4.988E-04
20
3.59E-03 0.13067
0.017074 1.897E-03
30
0.002625 0.11707
0.013705 1.523E-03
40
0.004133 0.16667
0.027778 3.086E-03
50
0.022409 0.33747
0.113884 1.265E-02
100
0.018046 0.33940
0.115192 1.280E-02
Total
5.18E-02 1.2013
0.2940
SS(1):
5.18E-02 SS(2)
Source
SSinter
Conc.
0.00976 6
ddl inter((m-1)), intra ([Σmj(Σpknjk-1)]
MS
3.266E-02
SS(3)
0.02291
Fcalc
F(0.05,m-1:Σμϕ(Σπκnjk-1))
4.77
2.27
0.001626
SSintra
Erreur
0.01910 56

Optimisation de la nébulisation du salbutamol chez l`enfant

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