parasitisme insectes

Étude des interactions hôte-parasite à travers le système insectes
(Galleria Mellonella ; Tenebrio molitor) – nématodes
(Heterorhabditis bacteriphora ; Steinernema carpocapsae)
Audrey AVRIL, Charlotte CAILLEAU, France ORIS
Le parasitisme est une relation fondamentale dans le monde vivant. En effet, le cycle
vital d'un grand nombre d'organismes dépend, au moins en partie, et parfois intégralement,
d'un organisme hôte.
Un parasite est donc un organisme qui se développe, au plan trophique, aux dépens
d'une autre espèce dénommée espèce hôte.
Il existe deux sortes de parasites en fonction de leur mode de vie par rapport à l'hôte. Les
ectoparasites qui vivent fixés à la surface du corps de leur hôte. Les endoparasites quant à
eux, se développent à l'intérieur de leur hôte, soit dans le tube digestif, soit dans certains
organes ou encore, dans le milieu intérieur (sang, lymphe, ...). Ce sont à ces derniers que nous
allons plus particulièrement nous intéresser dans cette étude.
Le parasitisme peut être défini comme une interaction biotique
interspécifique « négative » (Dictionnaire encyclopédique de l'écologie et des sciences de
l'environnement ; François Ramade ; Ediscience international 1993).
En effet, cette interaction concerne des êtres vivants d'espèces différentes dont l'un des
individus subit une influence défavorable (l'hôte) causée par un autre d'une espèce différente
(le parasite).
La mort de l'hôte n'est pas une conséquence inévitable du parasitisme. Il possède en
effet, une seconde chance pour se délivrer de l'emprise du parasite (car sa première
échappatoire résidait dans le fait même d'éviter le parasite). Il la doit à sa capacité d'attaquer
le parasite envahisseur grâce, notamment, à ses réactions immunitaires (anticorps, ...). Ainsi il
développe une certaine résistance face au parasite.
D'autre part, il existe des parasites strictement spécifiques à un hôte (signalons que
d'autres peuvent se développer au dépens d'hôte différents). Cela se nomme la spécificité
parasitaire, elle mesure l'aptitude du parasite à se développer chez un nombre plus ou moins
grand d'hôtes dont l'ensemble constitue le spectre d'hôte.
Le but de notre travail est donc de mettre en évidence une éventuelle spécificité
parasitaire et/ou la résistance de certains hôtes à l'infestation parasitaire (que l'on définit
comme la prolifération d'un parasite non microbien dans un organisme).
Pour étudier cela, nous nous sommes intéressées aux interactions hôte-parasite à travers le
système insectes-nematodes.
Actuellement il n'existe que deux genres parmi les nématodes entomopathogènes : les
Steinernema et les Heterorhabditis. Par entomopathogène, nous entendons, des nématodes
susceptibles de parasiter les insectes. Le cycle biologique de ces nématodes est relativement
simple. Les oeufs, évacués à l'extérieur avec le fecès se développent et engendrent des larves
dont le développement entrecoupé de mues comporte quatre stades larvaires (numérotés de 1
à 4). Ce sont les larves de 3e stade appelées larves infectieuses (ou forme infestante) qui se
déplacent dans le sol et recherchent un hôte potentiel à infecter. Ces dernières entrent par les
ouvertures naturelles (bouche, anus, ...), les blessures ou directement en brisant la cuticule des
insectes. Une fois dans l'insecte, elle engendre successivement la larve L4 puis le juvénile qui
acquiert les caractéristiques adultes. Ces derniers se reproduisent et pondent dans leur hôte.
Les nématodes issus de la nouvelle génération se transforment alors successivement jusqu'au
stade libre L3 puis se mettent en quête d'un nouvel hôte à infester.
Deux types d'hôte peuvent être facilement utilisés afin de tester la spécificité
parasitaire ainsi que leur résistance à l'infestation.
Une espèce de Coléoptère, du genre Tenebrio. Cette larve d'insecte à la tête bien développée
et munie trois paires de pattes est connue sous le nom de ver de farine.
Puis, une espèce de Lépidoptères, du genre Galleria. Les larves de ces insectes sont pourvues
de fausses pattes sur l'abdomen, ont un corps cylindrique et sont appelées chenilles.
Il s'agit donc d'étudier une éventuelle résistance développée par les insectes face
aux parasites nématodes (qui se traduirait par la survie des hôtes). Auquel cas il
convient de se demander si la taille des hôtes a une quelconque influence. Enfin, existe til une spécificité parasitaire des nématodes Heterorhabditis bacteriphora, Steinernema
carpocapsae sur les larves d'insectes Galleria Mellonella et Tenebrio molitor ?
MATERIEL ET METHODE
Afin d'étudier cette problématique, nous avons mis en place un protocole rigoureux
qui se déroule en deux étapes.
1- Première étape : Parasitisme des larves par les nématodes –
Dans un premier temps, nous avons utilisé pour hôtes 14 larves de Tenebrio molitor
(TM1) et 14 larves de Galleria Mellonella (GM2). Soit un total de 28 larves de deux espèces
d'insectes différents. Elles ont ensuite été placées dans des tubes eppendorfs préalablement
tapissés de papier filtre. Ce dispositif nous a permis par la suite d'y déposer la solution de
nématodes adéquate. De plus, les eppendorfs ont été percés afin de s'assurer de la bonne
oxygénation des larves et des nématodes mais néanmoins d'une taille moindre pour éviter que
les larves ne s'échappent. Ce problème de fuite des larves, ne se pose pas pour les nématodes
car nous avons considéré qu’en stade L3 les nématodes n'ont pour but que de trouver un hôte
afin de se reproduire.
Par la suite, 3 gouttes de solution de nématodes Steinernema carpocapsae (ST1) ont
été déposées dans 7 des eppendorfs contenant des larves TM1 et dans 7 des eppendorfs
contenant des larves GM2. Le même protocole a été suivi avec chacune des 7 larves restantes
de chaque espèce d'insectes et la solution de nématodes Heterorhabditis bacteriphora (HB2)
(voir figure 1). La charge parasitaire de nématodes contenue dans 3 gouttes de solution est
estimée suffisante pour permettre le parasitisme en évitant toutefois de noyer les hôtes.
En parallèle de cette manipulation nous avons placé 7 larves de TM1 et 7 larves de
GM2 dans des eppendorfs (percés d’un trou pour l'oxygénation et tapissés de papier filtre) en
absence de nématodes. Ces larves témoins ont pour but de déterminer si la cause du décès des
larves mises en présence de nématodes est due au parasitisme ou à tout autre facteur de
mortalité indépendant de notre volonté (absence de lumière, manque de nutriments, isolement,
...).
Enfin, nous avons placé ces 42 tubes eppendorfs (28 parasités et 14 témoins) dans des
conditions similaires. En effet, nous les avons mis à l'obscurité car les nématodes sont
extrêmement photosensibles.
Il est bon de noté que nous n'avons installé qu'une seule larve d'insecte par eppendorfs afin
d'étudier les interactions hôte/parasites de manière indépendante. Ceci nous assure le que le
parasitisme n'est du qu'à un premier contact avec les nématodes et non pas suite à une
deuxième infection (nous excluons ainsi le cas où le parasitisme constaté d’une larve pourrait
influencer le parasitisme d’une autre se trouvant à sa proximité).
2- Deuxième étape : Sortie de l’hôte par les nématodes –
Dans un second temps, après l'infestation supposé des larves, soit 3 à 4 jours après le
premier protocole (compte tenu du cycle parasitaire du nématode). Les larves mortes sont
dénombrées et mesurées. Elles sont ensuite placées sur un dispositif permettant la sortie et le
comptage des nématodes issus de la reproduction des parasites.
Ce dispositif est constitué d'une grande boîte de Pétri (Ø 90mm) au centre de laquelle
est placée une plus petite boîte de Pétri (Ø 50mm) retournée afin de créer un relief. Sur cette
dernière est posée une bande de papier filtre (L:100mm; l:35mm) qui déborde dans la grande
boîte. Dans celle ci est introduit du liquide de Ringer (liquide similaire à celui du milieu
interne d'un organisme, pH = 7,2) qui par capillarité humidifie l'intégralité du pont de papier
filtre (voir figure 2).
La larve morte est alors disposée sur le papier filtre (mouillé) recouvrant la petite boîte
de Pétri. Les nématodes au stade L3 peuvent alors s'échapper de leur hôte et migrer dans l'eau
de la grande boîte par l'intermédiaire du pont de papier filtre.
Enfin, le surlendemain de cette deuxième manipulation, nous avons pu quantifier les
nématodes présents en solution. En effet, nous avons estimé suffisante la durée de 2 jours
pour la sortie des nématodes du corps de l'hôte mort. Nous avons alors mesuré la quantité
d'eau présente dans chaque boîte de Pétri (en prenant soin de noter le numéro des boîtes et la
quantité d'eau). Ensuite, 100µL de la solution présente dans la grande boîte de Pétri furent
placés sous lame et lamelle puis observés au microscope (X400). Ainsi la quantité de
nématodes présents dans 100µL pu être déterminée. Cette opération a été faite 2 fois pour
chaque larve, et une moyenne des deux comptages a été réalisée par la suite afin d'avoir une
meilleure appréciation de la quantité totale de nématodes. Puis, connaissant la quantité d'eau
contenue dans la grande boîte de Pétri, nous en avons déduis par un simple produit en croix la
quantité totale de nématodes :
(Volume en mL de la grande boite de Pétri * Nombre de nématodes présents dans 100µL)
(Volume prélevé : 0.1 mL)
Nous avons alors considéré que la quantité de nématodes présents en solution dans la
grande boîte de Pétri était homogène.
A noter qu'il est impératif d'introduire du liquide de ringer tous les jours avant le
comptage des nématodes afin de ne pas avoir de problème de dessiccation.
RESULTATS ET INTERPRETATION
1 - Etude de la mortalité des larves hôtes–
Types de larves et de nématodes
Tenebrio molitor témoins
Galleria mellonella témoins
Pourcentage de mortalité associé
0% => toutes vivantes !
0% => toutes vivantes !
Tenebrio molitor + Heterorhabditis
bacteriphora
Galleria mellonella + Heterorhabditis
bacteriphora
100%
Tenebrio molitor + Steinernema carpocapsae
Galleria mellonella + Steinernema
carpocapsae
0% => toutes vivantes !
85.7% (une seule survivante)
85.7% (une disparue, donc supposée vivante
puisqu’elle a dû s’échapper !)
Figure 3 • Tableau donnant les pourcentages de mortalité des larves témoins ainsi que ceux observés
chez les différentes espèces de larves en fonction du parasitisme des différents nématodes.
_________________
Les larves témoins de Tenebrio Molitor et Galleria mellonella ont toutes survécues à
la période de 5 jours d’isolement dans des tubes eppendorfs.
Les larves de Tenebrio molitor ayant été exposées au nématode Heterorhabditis
bacteriophora ont elles succombé.
Au contraire, les larves de Galleria mellonella en contact avec ce même parasite ont toutes
survécues.
Le nématode Steinernema carpocapsae, a été à l’origine d’un taux de mortalité égal à
85,7% chez les deux types d’espèces hôtes étudiés.
Enfin, il a été remarqué que dans tous les tubes eppendorfs où ont été retrouvées des
larves mortes, le papier filtre y était mouillé (alors que dans les tubes contenant des larves
vivantes ce papier filtre était sec après évaporation de la partie aqueuse de la solution de
nématodes).
2 – Étude de la relation entre le nombre de nématodes (issus de la reproduction de ceux
utilisés comme parasites) et la taille des larves parasitées –
La relation la plus évidente pouvant conditionner l’efficacité parasitaire d’un
nématode apparaît être l’influence de la taille de l’hôte sur le nombre de nématodes issus de la
reproduction de ceux utilisés comme parasites. En effet, nous pourrions nous attendre à
observer d’autant plus de « néo-nématodes » que la larve parasitée est de grande taille (car
initialement, un nombre supérieur de nématodes parasitaires aurait pénétré, donnant ainsi plus
de « néo-parasites » au final).
L’examen du graphique de dispersion de la figure 4, indique qu’il y a une relation
positive entre la variable « nombre total de nématodes Heterorhabditis bacteriophora» et la
variable « taille de la larve Tenebrio molitor ». La moitié des points se trouvent sur la courbe
de régression linéaire (ce qui traduit le coefficient de corrélation égal à 0.537). Le coefficient
de détermination est de 0,288.
Il en est de même pour l’étude du graphique de la figure 5. La relation entre la taille
des larves Tenebrio molitor et le nombre de Steinernema carpocapsae n’est corrélée qu’à
50%). Le coefficient de détermination est égal 0.249.
Enfin sur la figure 6, il est possible de voir que la relation entre la taille des larves de
Galleria mellonella et le nombre de Stenerneima carpocapsae est négative (coefficient de
corrélation égal à -0,49). Cependant, c’est en réalité la valeur absolue de ce coefficient qui
nous intéresse ici pour discuter d’une éventuelle influence entre les deux paramètres. Le
coefficient de détermination n’est égal qu’à 0.202.
DISCUSSION – INTERPRETATION DES RESULTATS
1 - Étude de la mortalité des larves hôtes–
Les résultats des observations effectuées sur les larves témoins montrent une survie
totale. Rappelons que ces larves avaient été placées dans les mêmes conditions expérimentales
que les larves exposées à l’infestation des nématodes. C'est-à-dire à l’obscurité, dans des
tubes munis d’un trou suffisant pour permettre la respiration (sans que les larves s’échappent)
et sans ajout de nourriture pendant la période de l’expérimentation.
Cela nous permet donc d’affirmer que s’il y a mortalité chez les autres larves de
l’étude, elle ne sera due qu’à l’infestation réussie des nématodes.
Pour corroborer cette affirmation, nous pourrons noter que dans tous les tubes
eppendorfs où des larves mortes ont été retrouvées, le papier filtre y était imbibé (alors que
pour les larves vivantes ce papier était sec après évaporation de la partie aqueuse de la
solution de parasites). Or, les nématodes vivent en symbiose avec une bactérie (Xenorhabdus
spp. pour les Steinernema; Photorhabdus spp. pour les Heterorhabditis), laquelle est libérée
dans la cavité abdominale de l'insecte. Cette bactérie tue l’insecte par septicémie et liquéfie
les tissus afin de rendre disponible les nutriments nécessaires au développement du nématode
(Gaugler et Kaya, 1990). Ce phénomène expliquerait cette dernière observation et par la
même constitue un argument supplémentaire dans l’infestation effective des larves par les
nématodes.
Comme cela a été vu dans la partie résultats, Heterorhabditis bacteriphora ne parasite
qu'un seul type d'hôte : les larves de Tenebrio molitor. Un tel parasite est dit « oïoxène », il
présente une spécificité d’hôte dans le cadre de notre étude.
En ce qui concerne l’infestation du nématode Steinernema carpocapsae, les résultats
étaient plus mitigés. En effet, ce nématode ne semblait pas présenter de spécificité d’hôte. Un
tel parasite, qui exploite des espèces d'hôtes non étroitement apparentées est quand à lui dit:
« euryxène ». Ce serait donc le cas pour cette espèce de nématode dans les limites de notre
étude.
De plus, pour les deux espèces larvaires concernées (Tenebrio molitor et Galleria
mellonella), le taux de mortalité ne s’élevait qu’à 85.7% avec ce nématode. Comparativement
avec l’Heterorhabditis bacteriphora (qui avait causé 100% de mortalité chez les Tenebrio
molitor), le Steinernema carpocapsae semblait donc avoir un pouvoir pathogène moindre (par
pouvoir pathogène nous entendons la « capacité à infester et causer la mort »). Les théories de
Garber et de Lewis suggèrent la nécessité pour le parasite d'assurer un équilibre constant entre
les facteurs favorables (nutriments, ...) et les facteurs défavorables (défense de l'hôte) qui
conditionnent son maintien et son efficacité. Une tentative d’explication pourrait être la
suivante. Le Tenebrio molitor serait plus performant dans le maintien de cet équilibre que
l’autre parasite. Ainsi, cela suggérerait que les larves de Tenebrio molitor auraient
développées une plus grande résistance aux nématodes Stenerneima carpocapsae qu’aux
Heterorhabtis bacteriphora.
2 – Étude de la relation entre le nombre de nématodes (issus de la reproduction de ceux
utilisés comme parasites) et la taille des larves parasitées –
Les résultats de la figure 4 démontrent que seulement 29% des variations de la
variable « nombre total de nématodes Heterorhabditis bacteriophora» entre les différentes
larves peuvent être expliquées par l’influence linéaire de la « taille de la larve Tenebrio
molitor » sur le « nombre total de nématodes Heterorhabditis bacteriphora». Ce pourcentage
étant très faible, il ne permet pas de conclure sur une réelle influence de la taille des larves
Tenebrio molitor sur le nombre de nématodes Heterorhabditis bacteriophora « produits ».
L’influence de la taille des larves Tenebrio molitor n’explique que pour 25% les
différences dans le nombre de Steinernema carpocapsae (cf. figure 5). Tandis que la
connaissance de la taille des Galleria mellonella ne nous permettrait de prédire le nombre de
néo-nématodes qu’avec une certitude de seulement 20% (cf. figure 6).
Ainsi, la taille de la larve parasitée ne permet pas d’expliquer à elle seule le nombre de
nématodes issu de la reproduction de ceux qui l’ont parasité. Il parait évident que d’autres
paramètres doivent entrer en jeu…
CRITIQUES
Le but de ces expériences était de nous permettre d'élaborer un raisonnement
scientifique basé sur des observations. Or celles ci peuvent être critiquées.
D'une part, la fiche d'information fournie en introduction à l'expérience par les
professeurs comportait des données erronées. En effet, l'espèce Galleria Mellona se trouve
plus couramment sous le nom de Galleria Mellonella. Il en va de même avec l'espèce
Tenebrio Monitor qui serait Tenebrio Molitor.
Lors de la mise en place du dispositif dans les eppendorfs, les larves choisis l'ont été
au hasard tout en s'assurant qu'elles étaient vivantes.
Il se pourrait aussi qu'il y ait eu des interactions indépendantes de notre volonté
pendant le stockage des boites de Pétri (actions de personnes extérieures, déplacement des
dispositifs expérimentaux, vol de matériel entreposé, ...)
De plus, lors du comptage des nématodes nous nous sommes réparties un certain
nombre de lames à regarder chacune de notre côté. Mais toutes trois ne possédons pas la
même vision. L'appréciation du nombre de nématodes s'en trouve alors faussée. Il a d'ailleurs
été difficile de trouver une méthode de comptage appropriée vu le peu de moyen mis à notre
disposition.
Enfin, nous avons du faire face à un grave problème de dessiccation (malgré le fait que
nous ayons pris soin de remettre quotidiennement du liquide de Ringer dans les boîtes de
Pétri) qui a causé la mort des nématodes. De ce fait, leur quantification a sûrement été
faussée. Cependant, ce fut un mal pour un bien car si les nématodes avaient été vivants il
aurait été encore plus difficile de les suivre dans leur course pour les compter.