Diapositive 1 - Europole Mer

Comparaison des mécanismes de virulence-résistance chez
trois modèles d’interaction vibrions-mollusques. (VIVREM)
(2009-2011)
Jean-Louis Nicolas2 , Christine Paillard1 ,Franck Brulle 1 & 2, Mohamed Houmed Aboubaker
1 & 2, Stéphanie Madec et Masters
LEMAR, IUEM-UBO-CNRS
2 LEMAR IFREMER Laboratoire de physiologie des invertébrés,
Le but de ce projet était de
caractériser les mécanismes
moléculaires qui gouvernent les
Vibrio tapetis interactions mollusques-vibrions en
Ruditapes
privilégiant les stades précoces
philippinarum
(attachements, les facteurs invasifs et
les relations avec les hémocytes)
Vibrions: approche génomique
(génome) et protéomique pour
rechercher les facteurs de
virulence et mutagenèse dirigée
Hôte: Carcatérisation de la réponse
immunitaire par des banques SSH et
sélection de gènes pour des essais en
PCR en temps réels durant l’infection
(Palourde et Ormeau)
Vibrio harveyi Haliotis tuberculata
Vibrio aestuarianus Crassostrea gigas
Quelques caractéristiques
Vibrio tapetis – Palourde
Maladie progressive avec
un attachement sur le
periostracum
Vibrio harveyi - ormeau
Maladie très rapide
(pas ou peu de portage
sain)
Vibrio aestuarianus –
huître creuse
Maladie rapide avec
portage dans
l’hémolymphe action
d’une métalo-protéase
Phagocytose
Formation de
biofilm
Echappement à
la Phagocytose
Echappement à
la Phagocytose
Approche génomique
Séqauençage des génomes
Genome
size (nt)
GC%
CDS
Genomes
Size
GC%
CDS
Ribosomal
operons
Mobile
elements
ME/Mb
Vibrio harveyi
ORM4
5824241
Vibrio tapetis
CECT 4600
5 630 933
Vibrio cholerae el
tor (N16961)
4 033 464
Vibrio aestuarianus
02/041
3 916 050
44,80%
5671
I +II
P1
5,8 Mb
8 Kb
43.64%
5417
I
II
pVT1
3.64 Mb 1.91 Mb 82.27 kb
47.43%
4006
42.91%
3693
44,8
5725
nd
nd
14
nd
43.61
3484
5
43.63
1848
0
45.46
85
0
I
2.96
Mb
47.69
2830
8
18
2
29
57
11
3,1
25
8
30
1375
Publication comparaison des
génomes
II
I
II
1.07 Mb 3.31 Mb 0.61 Mb
46.91
1176
0
43.00
3121
3
42.45
572
0
14
13
67
24
4.7
13
20
39
Projet Vibrioscope
(Génoscope
Les facteurs de virulence
e
Adhésion
flagelle
pilus
type IV, II,
MSHA
OmpU
V. aestuarianus
V. tapetis
V. harveyi
41
23
43
60
62
15
>50
>50
>50
Défense
capsule
antigène
7
11
10
Enzymes
Protéases
lipase
chitinase
31(5)
4(1)
1
19 (3)
15(6)
2
33(9)
6 (2)
8
Toxine
hémolysines
6
10
3
Systèmes de
secrétion
type II
5
38
4
Type III
Type IV
Type V
4
3
6
8
3
Nombre de gènes impliqués
Les systèmes de secrétion
Outer
membrane
periplasmic
Inner membrane
Approche protéomique:
Comparaison des secrétomes
Secrétome: protéines à
l’extérieur de la cellule
sous frme libre ou de
vésicules
90
80
OMP
other enzyme
Lipoprotein
Transporters
flagella
Other
77
70
60
50
Catabolism
Unknown exp
46
40
30
16
20
10
Séparation par
électrophorèe 1D
Publication en cours de
rédaction Stéphanie Madec
0
V. aestu
Protéases
Lipase
Omp
common
OmpU
prc
V. tapetis
Chitinase
Omp
Mutagenèse dirigée
plasmide portant le gène
muté et contenant un
gène suicide
CmR
LGP32
ccdB
ccdB
Zoë
+ Glu
+ Ara
- V. tapetis La souche mutante djlA- a complétement
perdu son activité cytotoxique.
-Transfert du gène de la métalloprotéase de V.
aestuarianus chez V. tasmaniensis les ECPs sont
devenus toxiques
- Conjugaison réussie avec les 3 vibrions pour
transférer le plasmide contenant la GFP (Green
Fluorescent Protein)
- mutagenèse en cours chez V. harveyi
Publication
Mohamed Houmed et coll,
2012 in veterinary
microbiology
Les voies d’entrée du pathogène
Vibrio aestuarianus et V. tapetis chez
l’huître creuse.
V. tapetis palourde
Adhésion
Par les pilis
sur la lame
périostracale
vibrions dans l'hémolymphe de C. gigas
après 1H et 5H
1,E+06
1,E+05
1,E+04
Dépôt de
conchyoline
1H
1,E+03
5H
1,E+02
1,E+01
1,E+00
V. aes 02/41
Affaiblissement baisse
des défenses
pénétration
V. aes 01/308
V. tapetis
Balnéation avec 105 bact/mL
d’eau de mer
Pénétration bord
du manteau ?
Relation hémocytes-bactéries
•
Test de phagocytose par immuno-marquage :V. tapetis
•
Hémocytes avec bactéries
en marquage FITC (vert) et
Phycoérythrine (rouge)
+ Saponine
pourcentage de bacteries
marquées %
Immunomarquage bactérien
100
FL1
80
FL2
60
40
20
0
Cells
Cells
surnageantes adherentes
Publication en cours
hémocyte de palourde
Relation hémocytes-bactéries
•
Test de phagocytose par immuno-marquage :V. tapetis
Persistance de V. tapetis
dans les hémocytes :
perte des pseudopodes,
inhibition de la
production d’oxyde
nitrique, …
Pour V. aestuarianus et V. harveyi
Pas de reconnaissance, pas d’adhésion, pas
de phagocytose
Quel mécanisme actif ou passif?
Expression des gènes
Banque SSH hémocytes
en cours
Palourde
Ormeau
Banque SSH
hémocytes établie
huître creuse
Banque d’EST
Julien de Lorgeril
1) in vitro exposure of Ruditapes philippinarum hemocytes to V. tapetis
( palourde)
Sélection de 20 gènes dont une
partie en commun
puis mise au point qPCR
Coll Arnaud et
2) in vivo exposure of clams by injection of pathogenic V. tapetis strain in their
pallial cavity
Hemolymph collection.
Then 3h exposure to Vibrio tapetis.
To 1 day
14 days
6 weeks
At the end of each exposure period, mantle edge were collected in
control (n=20) and infected clam (n=20) clams
Control : Hemocytes with Sterile sea water
Infected : Hemocytes with V. tapetis
SSH
Identification of differentially expressed genes
SSH
Identification of differentially expressed genes
Expression des gènes
( palourde)
*
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
SSW
Vt
Vt ECP
SSW dead Vt
SSW
Génes liés à la synthèse du cytosquelette et à
l’apoptose
-Activation de la Beta-actin , Beta-cell, thymosin,
translocation cytochome P450,stimulés chez les
hémocytes des palourdes infectés par V. tapetis
- Inhibition de la matrix Metalloproteinase …
Publication F. Brulle et al.
Vs
Bilan
Deux post-docs:
-Franck Brulle (12 mois)
-Stéphanie Madec (6 mois)
Trois doctorants :
-Mohamed Houmed (V. aestuarianus)
-Fanny Jeffroy, (V. tapetis)
-Marie Agnès Travers (V. harveyi)
 des Masters
 Des techniciennes: Nelly le Goïc, Adeline Toffin
5 publications:
Publis
Travers Marie-Agnes; Meistertzheim Anne-Leila; Cardinaud Marion; et al. (2010) Gene
expression patterns of abalone, Haliotis tuberculata, during successive infections by the
pathogen Vibrio harveyi.JOURNAL OF INVERTEBRATE PATHOLOGY Volume: 105 Issue: 3
Pages: 289-297 DOI: :
Erauso, G , Lakhal, F ; Bidault-Toffin, A 3; Le Chevalier,; Bouloc, P; Paillard, C; Jacq.(2011)<.
Evidence for the Role of Horizontal Transfer in Generating pVT1, a Large Mosaic Conjugative
Plasmid from the Clam Pathogen, Vibrio tapetis.PLOS ONE Volume: 6 Issue: 2
Jeffroy Fanny; Paillard Christine.Involvement of nitric oxide in the in vitro interaction
between Manila clam, Ruditapes philippinarum, hemocytes and the bacterium Vibrio tapetis
FISH & SHELLFISH IMMUNOLOGY Volume: 31 Issue: 6 Pages: 1137-1141
Franck Brulle, Fanny Jeffroy, Stéphanie Madec, Jean-Louis Nicolas, Christine Paillard
(2012) Transcriptomic analysis of Ruditapes philippinarum hemocytes reveals
cytoskeletondisruption after in vitro Vibrio tapetis challengeDevelopmental &
Comparative Immunology 10.1016/j.dci.2012.03.003
Mohamed Houmed Aboubaker, Justine Sabrié1, Jean-Louis Nicolas, and Marcel Koken
Establishment of stable GFP-tagged Vibrio aestuarianus strains for the analysis of
bacterial infection-dynamics in the Pacific oyster, Crassostrea gigas. (en révision,
Vétérinary microbiology)
.