Fécondation in vitro d`ovocytes de poules ovulés in vitro

FECONDATION IN VITRO D’OVOCYTES DE POULES OVULES IN VITRO
Batellier Florence1, Couty Isabelle1, Olszanska Bozenna2, Stepinska Ursula2 et Brillard Jean Pierre1
1
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INRA SRA, Equipe qualité des gamètes et des embryons - 37380 Nouzilly-FRANCE
Institute of Genetics and animal breeding of Polish Academy of Sciences, Jastrzebiec- POLAND
Résumé
Chez les oiseaux, malgré un énorme potentiel biologique et économique, les méthodes de fécondation et
d’ovulation in vitro sont encore très peu explorées. L’objectif de notre travail a été d’adapter une méthode de
maturation et d’ovulation in vitro et de l’associer à la fécondation in vitro et à la culture in vitro des embryons
(24 heures). Nous avons utilisé 57 poules Isabrown et nous avons recueilli 52 follicules péri-ovulatoires dont 27
(52%) pré-ovulatoires. Trente six ovocytes ont été inséminés après ovulation (16 ovocytes pré-ovulatoires n’ont
pas ovulé in vitro). Trente et un (86%) embryons ont pu être observés à la loupe binoculaire, mais seuls 18
(58%) d’entre eux ont révélé la présence de noyaux dans les cellules. Les autres embryons qui semblaient avoir
un développement normal ne contenaient que des cellules sans noyau. En conclusion, nous avons obtenu 50%
(18/36) d’embryons nucléés à partir des ovocytes inséminés après ovulation. Ce résultat encourageant constitue
une première étape vers la maîtrise des stades qui séparent l’ovulation de la production ex ovo d’un poussin.
Introduction
1. Matériels et méthodes
L’amélioration de la connaissance des mécanismes de
fécondation et de développement embryonnaire
précoce ainsi que du contrôle de la reproduction des
animaux d’élevage ont largement contribué au
développement des biotechnologies et de leurs
applications.
Dans les espèces avicoles, malgré un énorme potentiel
biologique et économique, les méthodes de
fécondation et d’ovulation in vitro restent encore très
peu explorées.
Plusieurs étapes doivent être distinguées au cours de
la reproduction des oiseaux : ovogenèse, maturation
ovocytaire, ovulation, fécondation, développement
embryonnaire (précoce puis tardif) et éclosion. La
maîtrise in vitro de ces différentes étapes doit
permettre l’étude de leurs mécanismes. Parmi ces
étapes, la culture in vitro des embryons à partir du
stade « une cellule » jusqu’à l’éclosion est possible
(Perry 1988), la maturation et l’ovulation in vitro ont
été mises au point chez la caille par Olszanska et al
(1996) et la fécondation in vitro réalisée par
Nakanishi et al (1991).
Plus récemment, la combinaison de ces différentes
étapes : maturation, ovulation, fécondation et
développement précoce in vitro a également été
réalisée intégralement par Olszanska et al (1999,
2002) toujours chez la caille.
L’objectif de notre travail a été l’adaptation de la
combinaison des mêmes techniques chez la poule afin
de disposer du matériel biologique nécessaire à
l’étude des différents mécanismes qui accompagnent
la fécondation.
Nous avons utilisé 57 poules Isabrown âgées de 45
semaines et logées en cages individuelles munies d’un
dispositif d’enregistrement de l’heure de ponte. Les
poules ont été sacrifiées 10 à 15 minutes après la
ponte.
Nous avons alors prélevé l’ovocyte « périovulatoire », c’est à dire que nous avons recueilli
l’ovocyte soit juste avant l’ovulation (sur l’ovaire),
soit juste après l’ovulation (au niveau de
l’infundibulum).
Les ovocytes ovulés in vivo ont été recueillis
directement dans le récipient décrit ci après.
Pour les ovocytes pré-ovulatoires, nous avons ligaturé
le follicule au niveau du pédoncule qui le relie à
l’ovaire avant l’ovulation. Les ovocytes préovulatoires ont été maintenus en suspension (attachés
au couvercle par leur pédoncule) dans un verre à pied
à fond conique contenant du milieu de Dulbecco
supplémenté par de la BSA (fraction V) et des
antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Les verres
à pied ont ensuite été placés dans un incubateur à
41°C.
Après ovulation in vitro, une insémination a été
réalisée par dépôt de 20 µl de sperme dilué au 1/600
(soit
une
dose
totale
d’environ 200.106
spermatozoïdes) sur le disque germinal. Après 10
minutes d’incubation à 41°C, les ovocytes inséminés
ont été rincés pour retirer les spermatozoïdes
excédentaires puis placés 20 à 24 heures dans un
incubateur à 41°C.
Le jour suivant, les blastodermes ont été disséqués et
observés sous une loupe binoculaire pour déterminer
Cinquièmes Journées de la Recherche Avicole, Tours, 26 et 27 mars 2003
leur stade de développement selon la classification de
Eyal Giladi et Kochav (1976).
Les blastodermes ont ensuite été colorés par du
Hoechst 342 sans fixation préalable puis observés en
microscopie optique à fluorescence pour visualiser les
noyaux.
2. Résultats
Sur les 57 poules sacrifiées, nous avons recueilli 52
follicules dits « F1 ». Quatre ont été cassés lors du
prélèvement et un a été confondu avec un follicule
« F2 ». Nous avons donc obtenu un taux de collecte
de 91.2%.
Sur les 52 follicules « F1 » péri-ovulatoires : 27
(52%) ont été des follicules pré ovulatoires, 9 (17.3%)
ont ovulé au moment de la dissection, 8 (15.4%) ont
ovulé avant la dissection et ont été retrouvés avant
leur entrée dans l’infundibulum, 7 (13.5%) ont été
retrouvés dans l’infundibulum et 1 (2%) a été retrouvé
dans le magnum.
Sur les 27 follicules « F1 » pré-ovulatoires mis à
maturer et ovuler in vitro, 11 (41%) ont ovulé alors
que 16 (59%) n’ont pas ovulé.
Les résultats concernant le pourcentage de
développement embryonnaire et la présence de
noyaux dans les blastodermes observés sont présentés
dans le Tableau 1. Sur 11 ovocytes « ovulés in vitro »
et inséminés, nous avons obtenu 9 développements
embryonnaires (observés à la loupe binoculaire), un
œuf cassé et un sans aucun développement. Sur 9
ovocytes ayant ovulé « juste au moment de leur
prélèvement », nous avons obtenu 8 développements
embryonnaires (observés à la loupe binoculaire) et un
œuf sans aucun développement. Sur 8 ovocytes ayant
déjà ovulé « au moment de la collecte » mais n’étant
pas encore engagés dans l’infundibulum, nous avons
obtenu 7 développements embryonnaires (observés à
la loupe binoculaire), et un œuf cassé. Sur 7 ovocytes
ayant déjà ovulé « au moment de la collecte » et
recueillis dans l’infundibulum, nous avons obtenu 6
développements embryonnaires (observés à la loupe
binoculaire), et un œuf cassé. Un seul ovocyte ayant
pourtant été collecté 10 minutes après l’heure de
ponte a été retrouvé dans le magnum. Nous n’avons
pas observé de développement embryonnaire à partir
de cet ovocyte. Enfin, le seul follicule F2 collecté, n’a
pas ovulé in vitro et n’a pas été inséminé.
Le Tableau 2 reprend les résultats du développement
embryonnaire et de la présence des noyaux révélés par
marquage au Hoechst 342. Trente six ovocytes ont été
« inséminés » in vitro. Trente et un ont montré un
développement embryonnaire après observation à la
loupe binoculaire. Les stades de développement
observés ont été : stade IX (1 embryon, sans présence
de noyaux), stades IV à VI (22 embryons dont 15 ont
présenté des noyaux par marquage au Hoechst 342),
stade II (8 embryons dont 3 ont présenté des noyaux
par marquage au Hoechst 342).
Nos résultats sont très différents de ceux
précédemment publiés par Olszanska et al (1999 et
2002). Nous confirmons ici des observations faites par
Olszanska et al chez la caille, qui indiquent un retard
quasi systématique du développement du jeune
embryon issu de fécondation in vitro. En effet, le
stade le plus avancé observé ici 24 heures après la
fécondation est un stade IX (un seul cas sur 31
embryons), la majorité des embryons observés ayant
seulement atteint le stade IV à VI. In vivo, 24 heures
après la fécondation, les embryons ont atteint le stade
X. Le pourcentage d’embryons se développant avec
une apparence normale après fécondation et/ou
ovulation in vitro est plus élevé dans notre travail que
dans l’étude effectuée chez la caille (86% versus 35%
respectivement). Le pourcentage d’embryons
présentant effectivement des noyaux après marquage
au Hoechst 342 est également plus élevé dans notre
travail (58% versus 32% respectivement).
Plusieurs différences sont à noter : notre travail a été
réalisé sur l’espèce poule alors que le travail
précédant a été réalisé sur la caille. Chez la poule,
dans notre étude, le taux d’ovocytes ovulés au
moment de la collecte des ovocytes et donc avant la
mise en maturation in vitro a été plus élevé que dans
le travail cité. Nous avons néanmoins utilisé tous ces
ovocytes après ovulation in vivo afin de disposer d’un
maximum de matériel à inséminer. Nous avons obtenu
un résultat plus faible concernant le taux d’ovulation
in vitro, sans doute dû en partie à notre manque
d’expérience et en partie à un manque d’adaptation de
la technique à l’espèce poule.
Conclusion
En conclusion, nous avons obtenu 50% (18/36)
d’embryons nucléés à partir des ovocytes inséminés
après ovulation. Ce résultat encourageant constitue
une première étape vers la maîtrise des différents
stades qui séparent l’ovulation de la production ex ovo
d’un poussin.
Références bibliographiques
Eyal Giladi H. et Kochav S., 1976. Dev. Biol., 49.,
321-337.
Nakanishi A. et al, 1991. Mol. Repr. Dev., 28., 131135.
Olszanska B. et al, 1996. British Poultry Sci., 37, 929935.
Olszanska B. et al, 1999. Conférence Internationale
sur la Reproduction des oiseaux, Tours, 22-24
septembre 1999.
Olszanska B. et al, 2002. J. Exp. Zool., 292, 580-586.
Perry M.M., 1988. Nature. 331, 70-72.
TABLEAU 1 : Devenir des ovocytes à chaque étape expérimentale
Réussite
collecte
Ovulation à la collecte
11 ⊕
(41%)
27 F1
(52%)
57 poules
53
ovocytes
collectés
(93%)
MIV
Cellules
Noyaux
1 stade IX
5 stades IV
3 stades II
1 (-)
1 cassé
(-)
3⊕
(-)
(-)
5 stades IV
3 stades II
1 (-)
6 stades IV
1 stade II
1 cassé
5 stades IV
1 stade II
1 cassé
1 stade IV
0
4⊕
1⊕
(-)
5⊕
1⊕
F1
52
Follicules
F1
(98%)
16 (-)
9 ovulent à
la collecte
(17.3%)
8 ont ovulé
à la collecte
(15.4%)
7 retrouvés dans
l’infundibulum
(13.5%)
1 dans le magnum (2%)
1 F2
0
4 perdus
MIV : maturation in vitro
F1 : follicule 1 (le plus gros sur la grappe ovarienne)
TABLEAU 2 : Développement embryonnaire et présence de noyaux dans les embryons
36
inséminations
réalisées
Développement
1 embryon
stade IX
(2.7%)
22 embryons
stades IV à VI
(61.1%)
8 embryons
stade II
(22.2%)
2 sans
développement
(5%)
3 cassés (8.3%)
Présence de noyaux
(-)
15 (68%) ⊕
7 (-)
3 (37.5%) ⊕
5 (-)
(-)
2⊕
1⊕
1⊕
ovocyte