Illumina - McGill University and Génome Québec Innovation Centre

2016-11-30
SERVICES DE SÉQUENÇAGE DE NOUVELLE GÉNÉRATION
Centre d’innovation Génome Québec et Université McGill
Guide de l’utilisateur:
Technologies de séquençage
Illumina
Version 5.8
© Copyright 2015 Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill
Tous droits réservés.
Table des matières
TABLE DES MATIÈRES ...................................................................................................... 2
DIRECTIVES GÉNÉRALES POUR LA PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS D’ADN ................ 3
CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES .................................................................................................... 3
QUANTITÉ D'ÉCHANTILLONS D'ADN À FOURNIR ................................................................................ 4
FORMATS REQUIS POUR L’ENVOI DES ÉCHANTILLONS D’ADN ................................................................ 5
LIBRAIRIES PRÊTES-À-SÉQUENCER/AMPLICONS ET DIVERSITÉ DES LIBRAIRIES ............................................ 5
DIRECTIVES GÉNÉRALES POUR LA PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS D’ARN ................ 6
CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES .................................................................................................... 6
QUANTITÉ D'ÉCHANTILLONS D'ARN À FOURNIR ................................................................................ 7
SOUMISSION D’ÉCHANTILLONS ........................................ ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.
CONSIDÉRATIONS GÉNÉRALES .................................................................................................... 8
PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR ENVOI ................................................................................ 8
ADRESSES POUR LES ENVOIS DES ÉCHANTILLONS ............................................................................. 9
2
Directives générales pour la préparation des
échantillons d’ADN
Considérations générales
Les recommandations indiquées dans ce document ont pour but de faciliter l’obtention
de résultats de séquençage de la plus haute qualité possible dans les meilleurs délais.
Tous les échantillons qui ne se conforment pas à ces recommandations pourraient être
refusés sans compensation.
Lorsque vous soumettez des échantillons, il est recommandé de:

fournir des échantillons de la plus grande qualité et pureté possible
o
les ratios densité optique 260/280 entre 1,8 et 2,0
o
les ratios densité optique 260/230 > 2,0
o
ne doivent pas contenir de matériel insoluble, d’ARN, d’agents
chélatants (ex. EDTA), des cations divalents, des détergents ou des
contaminants provenant du matériel de départ (organisme ou tissu)

extraire l’ADN avec des trousses commerciales plutôt que des solutions
maison,

nettoyer l’ADN avant de soumettre les échantillons à la plateforme

resuspendre l'ADN dans du 10 mM Tris-HCl pH 8.0; 0,1 mM EDTA (une
concentration plus élevée d’EDTA peut inhiber certaines réactions
enzymatiques),

mesurer la concentration d’ADN en utilisant une méthode fluorométrique
plutôt que spectrophotométrique (ex. Nanodrop) qui ont tendance à
surestimer la concentration des échantillons, rendant la quantité de matériel
de départ inadéquate,

s’assurer de l’intégrité des échantillons sur gels d’agarose,

s'assurer que la quantité correspond aux valeurs spécifiées dans la section
Quantité d'échantillons d'ADN à fournir,

mesurer précisément le volume de chaque échantillon et consigner ces
valeurs dans le Formulaire de demande de service.
L'identification de chaque échantillon doit correspondre exactement à ce qui est indiqué dans le
formulaire de demande de service.
3
Quantité d'échantillons d'ADN à fournir
Si le volume d'échantillon est inférieur au minimum indiqué, le Centre d'innovation se réserve le
droit de diluer l'échantillon au volume requis ou de refuser l'échantillon.
La concentration des échantillons ne doit pas être supérieure à 150 ng/L.
Un volume de 3 μL est d’abord utilisé pour le contrôle de qualité (QC) d'ADN.
Tableau 1. Sommaire de la quantité d'échantillons d'ADN requise
Source
d'acide
nucléique
Quantité
requise
Volume
Requis
(ng)
(µL)
150
25-50
‘shotgun’ sans PCR
2000
25-50
Extrémités pairées 3-10 kb
5000
25-50
WGBS
2000
25-50
Capture (SureSelect)
500
25-50
Capture (Roche Nimblegen)
500
25-50
Methyl-Capture (Roche
Nimblegen)
2000
25-50
ChIP-Seq
15
25-50
≥ 75
25 à 75
Type de librairie
‘shotgun’ ADN
(fragments courts)
ADN ChIP
Librairie Prête-à-séquencer
¶

L’intervalle de tailles acceptables des fragments pour des échantillons ChIP ou amplicons se
situe entre 100 et 500 pb.
¶
Les résultats de séquençage seront fournis tels quels. Le CI ne peut être tenu responsable de
problèmes liés au design, à la qualité ou à la complexité de séquence des librairies. Pour
évaluer la taille de la librairie, on doit prendre en considération: 1) Les adaptateurs ajoutent
environ 120pb; 2) le nombre the cycles de séquençage devant être effectués
Les échantillons de remplacement doivent avoir la quantité totale requise. Les remplacements
partiels (« top-ups ») seront refusés.
Des frais supplémentaires de QC s'appliqueront à chaque échantillon de remplacement.
Un volume de 10-15 μL est requis pour des projets de contrôle de qualité (QC) d'ADN seulement.
4
Formats requis pour l’envoi des échantillons d’ADN
Les échantillons/librairies doivent être envoyées en plaques 96 puits, peu importe le nombre.
Il doit y avoir un échantillon par puits, par type de librairie.
Deux types de plaques sont acceptés:

Eppendorf twin.tec, Full Skirt, Cat# 951020401
← PREMIER CHOIX

Corning Thermowell GOLD, Full Skirt, Cat# 3752
← SECOND CHOIX
Nous recommandons les films adhésifs suivants:

Life Technologies MicroAmp® Clear Adhesive Film, Cat# 4306311

VWR Aluminum Foils for PCR and Cold Storage, Cat# 60941-074
Les procédures ont été optimisées afin de traiter un haut débit d'échantillons. Tout autre format de
plaques pourrait endommager les robots utilisés pendant ces procédures. Par conséquent, les
échantillons soumis dans des contenants ne se conformant pas aux exigences seront transférés dans
une plaque acceptable. Des frais seront facturés à l’usager.
Chaque plaque ne doit contenir que des échantillons appartenant à un seul projet.
Les directives décrites ci-haut s’appliquent aussi pour des projets de contrôle qualité d’ADN.
Librairies prêtes-à-séquencer/amplicons et diversité des librairies
Le logiciel d'Illumina qui identifie les regroupements de fragments d'ADN et effectue l'assignement
des bases est dépendant de la complexité des séquences, principalement des premières douze bases
qui sont séquencées de chaque côté du fragment.
Pour cette raison, tout type de librairie qui ne contient pas une distribution de bases aléatoire (ou
quasi-aléatoire) doit être amenée à notre attention sans quoi les données de séquences pourraient
être sous-optimales. Ce type de librairie inclut les amplicons (PCR), les librairies RAD (restriction siteassociated DNA) et les librairies avec complexité réduite telles que les librairies converties par le
bisulfite. Pour compenser la faible complexité, une librairie contrôle, tel que le phiX174 fournie par
Illumina, pourrait être ajoutée jusqu'à un niveau de 50%.
Cette note s'applique également à la diversité des index lorsque des librairies sont multiplexés. Afin
d'obtenir les meilleurs résultats, il est recommandé de combiner au moins trois (3) librairies indexées
par ligne de séquençage.
Il est à noter que le séquençage en ‘Rapid Mode’ est effectué par défaut avec l’option ‘flow cell’
unique. Ceci signifie que toutes les librairies devant être séquencée sur la ‘run’ doivent
obligatoirement avoir des code-barres distincts. Si, pour une raison ou pour une autre, il n’est pas
possible de s’y conformer, l’option 2 ‘flow cells’ est faisable. Cependant, ceci requiert d’ajouter à la
soumission/commande l’item ‘Offboard flowcell prep addon’.
5
Directives générales pour la préparation des
échantillons d’ARN
Considérations générales
Les échantillons biologiques qui sont destinés à être soumis à la définition du profil de mRNA (c’est-àdire : transcriptomique ou ARN-Seq), il est recommandé de:

porter des gants neufs et garder les échantillons sur la glace.

resuspendre les échantillons dans de l’eau commerciale sans RNase.

éviter l’eau traitée au DEPC.

si le Trizol est utilisé pour extraire les échantillons d’ARN, il est recommandé de
procéder à un nettoyage final (ex. avec le kit de nettoyage Qiagen mRNA) avant la
soumission.
Les échantillons doivent être acheminés dans des tubes Eppendorf 1,5 ml.
L’identification des échantillons sur les tubes doit correspondre exactement avec ce qui est écrit dans le
formulaire de demande de service.
6
Quantité d'échantillons d'ARN à fournir
L’ARN total est utilisé comme matériel de départ pour les protocoles.
Un volume de 2-4 μL est d’abord utilisé pour le contrôle de qualité (QC) d'ARN.
Le QC est fait sur l’ARN total et ce, même pour les échantillons destinés à des librairies de petits
transcrits. Par conséquent, la plateforme ne peut garantir de pouvoir générer des librairies de petits
transcrits.
Il est préférable de diluer des échantillons concentrés (ex. 1 ug/µL à 100 ng/µL) et de fournir le
volume minimal requis plutôt que de soumettre des échantillons concentrés mais en trop petit
volume.
Tableau 2. Sommaire des conditions à remplir pour la soumission d’échantillons d’ARN
Application
Quantité
minimale
(ng)
Concentration
minimale
(ng/µL)
Volume
minimal
(µL)
RIN*
Expression génique eucaryotes
(transcrits codants)
500
50
~ 10-15
>6.5
Expression génique procaryotes
1500
100
~ 20-25
>6.5
Méta-transcriptomique
(plusieurs espèces)
2000
100
~ 20-25
>6.5
Profilage transcrits codants et
longs transcrits non codants
800
75
~ 15-20
>6.5
1500
200
~ 10-15
>6.5
Profilage petits ARNs
(<200 nt)**
*RIN = RNA Integrity Number
**Le protocol permet la ligation d’adapteurs sur des molécules ayant les mêmes extrémités 5’ et 3’
que les miRNA matures. La présence/absence de d’autres types de petits transcrits dans la librairie
est difficile à prévoir.
7
Demande de service et soumission des échantillons
Formulaire de demande de service et soumission des échantillons (création
d’une nouvelle requête)
L’option « nouvelle requête » est utilisée uniquement pour les nouveaux projets.
Ouvrir une session dans le compte Nanuq ici.
Cliquer sur « ajouter une nouvelle requête » dans la section « Requête » et suivre les instructions.
Ne pas utiliser le bouton « retour » de votre navigateur pour revenir en arrière. Utiliser les choix de
pages à gauche.
La requête demeure un brouillon jusqu’à ce qu’elle soit soumise. Les brouillons sont accessibles via
l’option « liste des requêtes ».
Le travail dans le laboratoire ne débutera qu’une fois toute la documentation fournie.
Formulaire de demande de service et soumission des échantillons (requête
existante)
Ouvrir une session dans le compte Nanuq ici.
Cliquer sur « liste des requêtes » dans la section « Requête ».
Les requêtes existantes sont ré-ouvertes afin de 1) soumettre de nouveaux échantillons ou des
échantillons de remplacement à un projet en cours ou 2) continuer à remplir un brouillon.
Pour soumettre de nouveaux échantillons, aller à la section « soumission d’échantillons » afin de :

télécharger le gabarit pour la soumission des échantillons

revisiter des fichiers déjà remplis et soumis

ajouter des commentaires à des échantillons
Ne pas ajouter de nouveaux échantillons à un fichier déjà soumis.
Ne pas se servir du bouton « retour » de votre navigateur pour revenir en arrière.
Veuillez noter que les échantillons seront entrés dans notre base de données et traités dans le
même ordre que celui indiqué dans le formulaire de soumission d’échantillons. Ainsi, pour les
projets ARN-Seq, Methyl-Seq et ChIP-Seq, il est fortement recommandé de disposer les
échantillons de manière à minimiser la variabilité technique engendrée par le séquençage en
randomisant les échantillons selon le groupe expérimental auquel ils appartiennent.
Par ailleurs, il n’est pas garanti que des demandes particulières quant au mélange des librairies
pour le séquençage soient honorées et ce, afin de maximiser la capacité sur les instruments. La
plateforme se réserve le droit de modifier les schémas de multiplexage sans en aviser l’usager. Les
demandes particulières doivent être indiquées dans la colonne des commentaires du formulaire de
soumission des échantillons.
8
Préparation des échantillons pour envoi
Les envois doivent inclure une copie complétée et signée du Formulaire de Demande de service.
Les échantillons d'ADN et d'ARN ainsi que les librairies prêtes-à-séquencer devraient être envoyés sur
glace sèche.
Les tubes (ARN) ou les plaques (ADN et prêtes-à-séquencer) devraient être scellées dans un sac de
type Ziploc.
Les tubes (ARN) devraient êtres ordonnés dans une boîte si la soumission comprend > 24 tubes.
Les échantillons peuvent être amenés directement au Centre, mais ces envois doivent être
coordonnés avec le personnel autorisé avant la livraison.
Les échantillons devant traverser la frontière canadienne devraient être envoyés en début de
semaine. L'utilisation de phrases claires telles ques: “Non-biohazardous biological sample”, “Purified
DNA from [species]”, “For research use only”, et “Of no commercial value” aidera à accélérer le
dédouanement.
N'envoyez que des aliquots de vos échantillons. Ceux-ci seront conservés pendant environ 1 mois
après que le service demandé ait été complété et seront détruits par la suite a moins que le client ait
mentionne au Bureau de Gestion des Clients son désir de les ravoir.
Les librairies seront conservées au moins un an.
Adresses pour les envois des échantillons
L'adresse complète de l'envoi selon le type d'acide nucléique est indiquée ci-dessous:
Échantillons d'ADN
Services MPS a/s Sylvie LaBoissière
Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill, Local 5300
740, Avenue Dr-Penfield
Montréal (Québec) Canada, H3A 0G1
Échantillons d'ARN
Services MPS a/s Sylvie LaBoissière
Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill, Local 6300
740, Avenue Dr-Penfield
Montréal (Québec) Canada, H3A 0G1
Librairies prêtes-à-séquencer:
Services MPS a/s Alexandre Montpetit
Centre d'innovation Génome Québec et Université McGill, Local 5400
740, Avenue Dr-Penfield
Montréal (Québec) Canada, H3A 0G1
9