LE RESUME DE LA THESE DE DOCTORAT

LE RESUME DE LA THESE DE DOCTORAT
Contributions a la valorisation de certaines sources vegetales pour la production
de biodiesel par transesterification enzymatique.
Mots-cles: biodiesel, la biocatalyse, transesterification, enzymes lipolytiques,
Yarrowialipolytica, experimentes multifactorielles, Hadamard, Taguchi
L’obtention du Biodiesel d'huiles vegetales par transesterification enzymatique est
l'une des recherches de perspective en biotechnologies, tant en raison des incidences sur
l'industrie des combustibles et aussi en raison de considerations environnementales.
L'utilisation des huiles vegetales comme substrat pour la production de biodiesel
contribue a la production d'energie a partir de sources renouvelables et peut etre l'une des
solutions pour remplacer les carburants traditionnels et de reduire les obstacles causes par
leurs couts de production eleves.
Le concept de l'utilisation des huiles vegetales comme remplacement du carburant
diesel date depuis 1900. Des lors, cette maniere d'utiliser differentes sources de graisses et
d'huiles comme carburant renouvelable a ete repete regulierement, surtout au cours des
dernieres annees en raison de la diminution des ressources petrolieres.
Esters d'acides gras de methyle (FAME), aussi connu comme biodiesel, sont
actuellement d'un grand interet en tant que source alternative de carburant, ayant la valeur
energetique la plus elevee de tous les carburants alternatifs.
Compte tenu de la tendance croissante de l'execution des processus acceptables pour
l'environnement, l'approche enzymatique au detriment de la synthese chimique pour obtenir
du biodiesel est comprehensible. L'utilisation des lipases comme biocatalyseurs dans la
transesterification des triglycerides permet l'utilisation des conditions reactionnelles douces et
augmente le rendement de l’obtention du biodiesel en evitant la formation de savons, le
processus tolerant egalement la teneur en eau de l'huile.
Beaucoup d'enzymes disponibles dans le commerce sont trop cheres pour leurs
applications, meme si elles peuvent etre recuperees et reutilisees apres l'immobilisation. En
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consequence, la reduction des couts de l'enzyme peut fortement augmenter le nombre
d'utilisations pour la catalyse enzymatique dans les installations commerciales de production
de biodiesel a partir des materiaux contenant des lipides.
Les microorganismes sont la source la plus importante d'enzymes. On peut donc
soutenir l'importance des recherches visant l'isolement et la selection des micro-organismes
producteurs de lipase et de la necessite de developper des processus qui conduisent a la
realisation des activites enzymatiques plus elevees, a savoir la necessite d'optimiser les
processus de biosynthese de biodiesel a partir d'huiles vegetales.
L'objectif principal des recherches entreprises afin de completer le travail de la
these etait d'optimiser l ’obtention du biodiesel a partir d'huiles de soja et de palme par
transesterification enzymatique et la selection des lipases des souches de micro-organismes
hautement productives comme biocatalyseurs optimises pour la synthese de biodiesel a partir
d'huiles vegetales.
Pour atteindre ce but ont ete etablis les suivants objectifs:
• le depistage de souches microbiennes appartenant a la collection d'importance
industrielle des micro-organismes de l’Institut National de Recherche et Developpement
chimique et pharmaceutique quant a la possibilite de produire des lipases;
• l’isolation de nouveaux micro-organismes significatifs des sources naturelles et leur
identification;
• l'identification des micro-organismes nouvellement isolees;
• tester les micro-organismes nouvellement isoles sur leur potentiel de production de
lipases;
• la separation et la purification de l'enzyme par ultrafiltration;
• des experimentes de biocatalyse pour l’obtention de biodiesel des huiles de soja et
de palme;
• l’identification de l'influence des parametres de processus tout au long de la
biosynthese du biodiesel;
• optimisation de l’obtention du biodiesel en utilisant trois methodes qui impliquent
l'utilisation de matrices multifactorielle.
La these contient 181 pages avec 52 figures inserees et 68 tableaux (dont 85% sont
originales).
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La premiere partie (Etat de l'art) avec 53 pages represente environ un tiers, tandis que
les propres recherches experimentales couvrent 110 pages, representant les deux tiers.
La these est structuree en quatre chapitres contenus dans les deux parties: etat de l'art
(un chapitre) et des recherches experimentales (trois chapitres, dont l'un des conclusions).
Pour la documentation et l'achevement de la these, ont ete utilises environ 181 titres et
references bibliographiques, dont 50 a partir de ces cinq dernieres annees.
La these commence par une presentation des donnees de la litterature dans le premier
chapitre, a savoir: L 'etat actuel des recherches sur l’obtention de biodiesel par
transesterification enzymatique.
Dans ce premier chapitre on met en evidence les bioprocedes de synthese du biodiesel
a partir d'huiles vegetales catalyse par des lipases de differentes origines et, egalement, l'etat
actuel concernant l'amelioration de la conversion de substrat pour le biodiesel et
l'augmentation de l'obtention de rendements en optimisant les parametres de biosynthese en
utilisant les experimentes de la matrice multifactorielle.
Les donnees presentees mettent en evidence non seulement l’interet que le theme
suscite pour les chercheurs des divers laboratoires et meme des compagnies, mais aussi les
resultats obtenus jusqu’a present.
Le chapitre qui contient l'etude de la litterature comprend les sous-chapitres suivants:
Biodiesel, La biocatalyse enzymatique, Analyses economiques comparatives concernant
l'obtention de biodiesel.
Le II chapitre, intitule M ateriaux et procedes, est divise en trois parties: Le cadre
institutionnel dans lequel les recherches ont eu lieu, Materiaux, Methodes.
Le materiel biologique utilise pour les experimentes a ete forme autant des microorganismes de collection, bacteries, moisissures et levures, que des micro-organismes
nouveaux provenant de l’huile de tournesol ou l’on a garde des olives pour etre conserves.
Egalement, sont presentes les medias de culture employes, les types de substrats
utilises, ainsi que les prepares enzymatiques commerciales employes pour les experimentes.
La methodologie appliquee aux experimentes a vise l’application des techniques
variees: le depistage des micro-organismes pour determiner l'activite lipolytique; techniques
d’identification de nouvelles souches microbiennes; etablir les etapes du travail dans les cas
des deux types de bioprocedes; la surveillance des processus de biosynthese des enzymes
lipolytiques produites par des micro-organismes et de tester l'activite enzymatique de lipases
produites par micro-organismes, le traitement du milieu de culture resultant du bioprocede;
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methodes d'obtention du biodiesel, des techniques chromatographiques pour la determination
des esters methyliques d'acides gras; l'etude de bioprocede parametres d'influence qui a
permis l'application d' optimisation methodes pour la production de biodiesel, en utilisant des
matrices d’Hadamard multifactorielle, CCRD et le type Taguchi.
Le IIIe chapitre contient les resultats des experimentes effectuees pendant
l’elaboration de la these et leur debat par rapport aux realisations au niveau national et
international. Ce chapitre intitule Resultats et discussions se divise en deux sous-sections: la
premiere vise La selection de souches de micro-organismes ă activite lipolytique, tandis que
la seconde vise La biocatalysepour obtenir du biodiesel ăpartir de sources vegetales.
A la suite du depistage des souches microbiennes (3 souches de bacteries, 16 souches
de levure, 14 souches de moisissures) appartenant a la collection des micro-organismes
d'importance industrielle de l'ICCF (CMII - WFCC232), ont ete selectionne 3 souches de
levures, dont la souche Candida paraffinica ICCF 184 presentait la plus elevee activite
enzymatique, 36, 63 ULFIP/ml.
En vue de selecter de nouvelles souches microbiennes au potentiel lipolythique eleve,
ont ete utilisees des boues decantees a partir d'huile de tournesol dans lesquelles les olives ont
ete conservees, dont 23 souches microbiennes ont ete isoles. Apres avoir teste l’activite
lipolythique de ces souches, on vient de mettre en evidence que huit seulement presentaient
une pareille activite, et de celles-ci la souche notee B12 a presente la plus grande activite
(47,24 ULFIP/mL).
Vu que l’utilisation pratique de nouvelles souches isolees exige leur identification, et,
compte tenu du niveau des activites lipolythiques, celles-ci furent soumises a un processus de
caracterisation du point de vue morphologique et culturel, quatre (Yeast 2, Y 1, B 8, B 12)
etant apres identifiees a l’aide du spectrometre de masse MALDI-TOF. Les testes realises ont
permis la conclusion que toutes les quatre souches analisees appartiennent a l’espece
Yarrowia lipolytica.
Ces souches bacteriennes ont ete ulterieurement incluses dans la
collection des micro-organismes d'importance industrielle de l'ICCF (CMII - WFCC232).
Pour l’evaluation du potentiel biotechnologique de biosynthese des enzymes
lipolithyques, toutes les souches selectionnees (les huit isolees et celles choisies parmi les
souches de collection) ont ete soumises a deux types de bioprocedes. Pendant cet exploit on a
fait varier tout d’abord la composition des medias de culture.
Apres avoir determine les variables de bioprocede et l’activite enzymatique, il s’est
eprouve que le bioprocede IIa a fait possible les meilleures resultats: toutes les souches
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microbiennes testees ont mis en evidence des activites enzymatiques (lipolythiques) plus
grandes par rapport au bioprocede I, les microorganismes cultives sur ces types de medias
produisant des lipases aux activites superieurs. De cette fa9 on, le medium de culture liquide
choisi pour l’inoculum et la fermentation c’est le medium YPG modifie, avec ajout de Tween
80 et de chlorure de calcium pour induire la biosynthese de lipases.
Les enzymes bio synthetisees dans ces conditions ont ete separees par centrifugation
du medium de culture, purifiees et concentrees par ultrafiltration sur trois membranes
differentes, presentant une bonne selectivite (plus de 80%) et des rendements relativement
eleves (entre 73,6 % et 79,4 %). Les meilleurs resultats ont ete obtenus avec des membranes
de 10 kDa, ce qui confirme le poids moleculaire superieur de l'enzyme et sa configuration
spatiale favorisant la retention du concentre. Les resultats confirment les donnees de la
litterature de specialite.
En ce qui concerne les experimentes de biocatalyse (en utilisant trois prepares
enzymatiques commerciales: la lipase de pancreas de porc PPL, la lipase d'Aspergillus Niger
Novozyme 435 et de la lipase Thermomyces lanuginosus TLL) en vue d’obtenir du biodiesel a
partir des sources vegetales (l'huile de soja et l'huile de palme), des etudes ont ete menees sur
l'influence des principaux parametres du processus (temps, temperature, enzyme (%), le
rapport molaire de methanol: huile et eau (%) sur le rendement d’obtention de biodiesel. Les
parametres ont ete modifies selon trois types d’experimentes multifactorielles matricielles a
differents niveaux de variation.
Pour optimiser le processus de production de biodiesel, a ete con9 ue une
methodologie impliquant une matrice experimentale Hadamard avec 22 experimentes
contenant des elements correspondant a deux niveaux des facteurs essentiels du processus
designes par +1 et -1. Par l’utilisation de l'huile de palme comme substrat, et comme
biocatalyseur du prepare enzymatique PPL (lipase extraite du pancreas de porc), le rendement
de conversion le plus eleve (98,56 %) a ete obtenu apres 10 heures a 40° C, la concentration
en enzyme de 55%, rapport molaire 03:01 alcool: huile et de 5% d'eau.
L'influence des parametres de bioprocedes a egalement ete etudiee grâce a la
conception d'une matrice experimentale de type CCDR (Central Composite Rotatable
Design) avec 12 experimentes dans lesquelles 5 principaux facteurs-clef du bioprocede ont
ete modifies a un niveau minimum et a un maximum. Comme biocatalyseur a ete utilisee la
lipase de Thermomyces lanuginosus (TLL), tandis que le substrat fut l'huile de soja.
Dans cette serie d'experimentes, la meilleure combinaison de facteurs s’eprouva la
prolongation du temps deu bioprocede (12 heures), une quantite plus elevee d'enzyme (3%) et
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le rapport molaire inferieur (3:1). Au contraire, les plus bas rendements furent obtenus
lorsque le temps du bioprocede a ete plus court (4 heures), une quantite plus elevee de
l'enzyme (3%) et un rapport molaire inferieur (3:1) quoique fut la temperature de bioprocede.
A la suite de l'analyse statistique, la conclusion generale est qu’une plus longue periode de
temps pour le processus a une temperature inferieure, en utilisant des quantites d'enzymes et
d’eau plus elevees et un rapport molaire inferieur de l’alcool: huile fournissent les meilleurs
resultats (le resultat fut estimee a 95,95 %). Au contraire, la combinaison la plus dangereuse
des facteurs (avec un resultat estime de 7,94 %) est representee par temps court pour le
bioprocede, plus basse temperature, une moindre concentration d'eau ajoutee, avec un ajout
plus eleve de l'enzyme et un rapport molaire superieur d'alcool a l'huile.
Pour determiner l’interaction entre les facteurs de bioprocede a ete utilisee une
matrice Taguchi L 1 6 ’ dans laquelle les cinq variables de processus ont ete modifiees a quatre
niveaux. Le substrat utilise a ete l'huile de palme, tandis que la lipase d'Aspergillus Niger
(Novozyme 435) a ete utilisee comme biocatalyseur. Le rendement de conversion le plus
eleve (74,943 %) fut obtenu apres 9 heures a 45° C, la concentration en enzyme de 50%,
rapport molaire 03:01de l'alcool: l'huile, 3% d'eau ajoutee. Les donnees ont ete analysees en
utilisant le critere „larger-the-better” (la plus grande, la meilleure), qui se refere a la valeur de
rendement la plus elevee. La matrice sous forme codee 4 4 4 2 1, correspondant a un
bioprocede de 15 heures a 30° C, la concentration de l'enzyme de 60%, rapport molaire 3:1
d'alcool: huile et 3% d'eau s'est averee etre la moins affectee par les facteurs de bruit,
combinaison des facteurs d’influence qui n'avaient pas ete prevue dans la matrice originaire
de l'experimente.
Le chapitre IV est intitule Conclusions
Au cours de ces recherches, 23 nouvelles souches de microorganismes ont ete isolees
a partir de biotopes specifiques, 6 d'entre eux presentant des activites lipolytiques pertinentes.
Le criblage des souches de collection de l’ICCF a egalement abouti a la selection d’une
souche microbienne lipolytique ayant un potentiel biocatalytique eleve.
Afin d'obtenir du biodiesel, l'optimisation du processus et la determination des
facteurs influen9 ant la reaction de transesterification enzymatique ont ete effectuees en
utilisant trois types de matrices experimentales multifactorielles.
Les resultats obtenus par l'utilisation d'enzymes lipolytiques liees aux activites
enzymatique elevee des prepares enzymatiques derivees des souches selectionnees peuvent
conduire a la realisation des rendements eleves de biodiesel.
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Les contributions originales de la these
1. L’isolement, la caracterisation et l’identification de nouveaux micro-organismes
ayant une valeur bio technologique et la realisation d’une mini-collection specifique.
2. L’utilisation d’une matrice CCDR pour l’optimisation des parametres de
bioprocede visant l’obtention de biodiesel par transesterification enzymatique en partant de
l’huile de soja, resultat tout nouveau a niveau international.
3.
L'utilisation
d'une
matrice
Hadamard
pour
obtenir
le
biodiesel
par
transesterification enzymatique de l'huile de palme, resultat tout nouveau a niveau
international.
4. L’application d'une methode d'optimisation de Taguchi afin de determiner la
qualite du processus d'optimisation pour obtenir du biodiesel a partir de l'huile de palme,
egalement element de nouveaute a niveau international.
5. La selection d’une souche de collection Candida paraffinica comme producteur de
lipases element de nouveaute a niveau international.
Les resultats originaux ont ete concretises en quatre travaux publies in extenso, dont
un dans une revue classifiee ISI (Romanian Biotechnology Letters) et trois dans des revues
indexes BDI, ainsi que deux resumes publies dans les volumes des reunions scientifiques
internationales (dont un publie dans Current Opinion in Biotechnology, facteur d’impact
7,86).
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