Elucidation ofPax and Wnt gene functions during - ETH E

Diss. ETH No. 15014
Elucidation ofPax and Wnt gene functions during
pronephric kidney development in Xenopus
A dissertation submitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY (ETH) ZURICH
for the degree of
Doctor ofNatural Seiences
presented by
Hedyeh GHANBARI
Diploma ofBiochemistry
Universire de Fribourg
Born July 20,1974
Citizen of Saint-Aubin, Fribourg
Accepted on recommendation of
Prof. Dr. Andre Brändli, examiner
Prof. Dr. lJeli Suter, co-examiner
February 2003
Summary
Summary
The amphibian pronephric kidney is a convenient model system for studies on renal
development. It constitutes a simple and functional embryonie excretory organ. Moreover, its
development involves similar molecular and cellular processes as the more complex
metanephric kidney ofhigher vertebrates. The central objective ofthis thesis was to investigate
the functions of two transcription factors, Pax2 and Pax8, during pronephric organogenesis in
the frogXenopus laevis. Separate projects were devoted to studying the embryonie expression
of Six genes and the function ofWnt4 in the developing pronephric kidney.
Xenopus embryos express at least nine distinct Pax2 splice variants. Comparative structure-
function studies were first performed to dissect differences among the Pax2 splice variants.
While all splice variants bound to target DNA sequences, only a subset was able to activate the
expression of a reporter gene. In vivo, Pax2 overexpression resulted in strong enlargement of
~
the pronephric kidney and abnormal expression of marker genes at the midbrain-hindbrain
boundary (MHB). Interestingly, all Pax2 splice forms could induce pronephric hyperplasia,
whereas the MHB phenotype was restricted to embryos overexpressing splice forms that
harbored transactivation potential. Ectopic Pax2 expression did not interfere with the
development of other celllineages within the intermediate mesoderm, but led to a failure in the
terminal differentiation of pronephric structures. In summary, these experiments establish the
existence of distinct biological activities among Pax2 splice variants.
In aseparate study, loss-of-function experiments were performed to assess the requirement
for Pax2 and Pax8 gene functions during early Xenopus pronephric development. Morpholino
antisense oligonucleotides (MDs) were used as gene knockdown agents. Pax2 gene disruption
did not overtly affect early pronephric development. In contrast, inhibition of Pax8 function
led to reduced or absent expression of several pronephric genes. Development of the
pronephric kidney was affected from early stages onwards, often resulting in the complete
absence of pronephric tubule and duct epithelia. Impaired kidney function was confirmed by
the severe formation of edemas in tadpoles and was eventually lethal for embryos. These
results provide evidence that Pax8, but not Pax2 function is essential for pronephric
development in Xenopus.
Six genes are vertebrate homologues of the sine oculis gene, which is essential for
compound eye development in Drosophila. In the third study ofthis thesis, Xenopus Six family
genes were identified and their embryonie expression patterns were characterized. Xenopus
4
Summary
cDNAs of eight genes belonging to three distinct Six gene subfamilies were isolated: Sixl and
Six2 (Six2 subfamily); Six3.1, Six3.2, Six6.1 and Six6.2 (Six3 subfamily); and Six4.1 and
Six4.2 (Six4 subfamily). Sixl and Six2 showed very similar expression patterns in cranial
ganglia, otic placodes, eye, mesodermal head mesenchyme, as weIl as in somites and their
derivatives. Interestingly, Six2 was also expressed within the mesenchyme associated with the
developing stomach and pronephric kidney. Six3 subfamily gene expression was observed in
the eye, optic stalk, hypothalamus and pituitary gland. Expression of Six4.1 and Six4.2 was
detected in the visceral arches, placodal derivatives, head mesenchyme and eye. Taken
together, these findings indicate that Six genes play important roles in the development of
numerous organs and tissues outside the visual system. Most importantly, Six2 is the only Six
gene family member that could have a role in pronephric development.
Wnt4 is a secreted glycoprotein, which functions in a complex signaling pathway and is
essential for tubulogenesis in the mouse metanephric kidney. In the final project presented
here.Tparticipated in studies aimed at investigating the function of Wnt4 during pronephric
kidney development. In Xenopus, Wnt4 expression was associated with developing pronephric
tubules. Wnt4 overexpression caused abnormal morphogenesis of pronephric tubules as seen
by molecular and histological analysis. On the other hand, inhibition ofWnt4 gene function by
injection of MOs led to a complete absence of pronephric tubules. These findings show that
Wnt4 function is essential in controlling pronephric tubulogenesis and that this function is
evolutionarily conserved between the pronephric and metanephric kidneys.
5
Resurne
Resurne
Le rein pronephrique amphibien est un modele pratique pour I' etude du developpement
renal. Il constitue un organe excretoire embryonnaire simple et fonctionnel. Par ailleurs, son
developpement implique des processus moleculaires et cellulaires similaires
a ceux du rein
metanephrique chez les vertebres superieurs. Le principal objectif de cette these etait
d'examiner les fonctions de deux facteurs de transcription, Pax2 et Pax8, durant
l'organogenese pronephrique chez la grenouille xenope (Xenopus laevis). D'autres projets ont
ete consacres
a I'etude de I'expression embryonnaire des genes de la famille Six, ainsi qu'ä
l'analyse de la fonction de Wnt4 pendant le developpement du rein pronephrique.
Les embryons de xenope expriment au moins neuf formes distinctes de transcrits de Pax2
par epissage altematif. Afin de dissequer les differences entre ces neuf formes de la proteine
Pax2, nous avons effectue des etudes comparatives structure-fonction. Alors que toutes les
~
variantes de la proteine forment des complexes avec des sequences-cibles d'ADN, seulement
un sous-groupe est en me sure d'activer l'expression d'un gene rapporteur. In vivo, la
surexpression de Pax2 cause un important agrandissement du rein pronephrique, ainsi que
l' expression anormale de genes marqueurs au niveau de la region isthmique du cerveau. Une
caracteristique interessante est que toutes les formes de transcrits altematifs de Pax2 peuvent
induire I'hyperplasie du pronephros, alors que le phenotype isthmique se limite uniquement
aux embryons surexprimant des formes de Pax2 qui ont un potentiel de transactivation.
L'expression ectopique de Pax2 ninterfere pas avec le developpement d'autres lignees
cellulaires au sein du mesoderme intermediaire, mais provoque la perte de la differentiation
terminale des structures pronephriques, En resume, ces experiences etablissent I' existence
d'activites biologiques distinctes parmi les differentes formes de Pax2.
Dans le cadre d'une autre etude, nous avons effectue des experiences de suppression de
fonction, afin d' examiner la necessite des genes Pax2 et Pax8 pendant le developpement
pronephrique chez le xenope. Comme approche pour la suppression, nous avons utilise des
oligonucleotides de type morpholino (MO). La suppression de Pax2 n'affecte pas ouvertement
le developpement pronephrique. Par contre, I'inhibition de la fonction de Pax8 cause la
reduction ou l'absence d'expression de plusieurs genes pronephriques. Le developpement du
rein pronephrique est altere apartir de stades precoces, resultant frequemment en une complete
absence des epithelia de tubule et conduit pronephriques, L'affection de la fonction renale est
confirmee par la formation d'oedemes importants dans les tetards et est frnalement letale pour
6
Resurne
les embryons. Ces resultats prouvent que la fonction de Pax8, mais non celle de Pax2, est
essentielle pour le developpement pronephrique chez le xenope,
Les genes de la famille Six sont les homologues chez les vertebres du gene sine oculis, qui
est indispensable :pour le developpement de I' oeil chez la drosophile. Dans une troisieme etude
de cette these, les genes de la familIe Six de xenope ont ete identifies et leur expression
embryonnaire caracterisee. Nous avons isole des ADN complementaires de huit genes de
xenope appartenant trois sous-familles distinctes de Six: Sixl et Six2 (sous-famille de Six2),
ä
Six3.l, Six3.2, Six6.1 et Six6.2 (sous-famille de Six3); et enfin, Six4.1 et Six4.2 (sous-famille
de Six4). Sixl et Six2 montrent une expression tres similaire dans les ganglions cräniens, les
placodes auriculaires, l'oeil, le mesenchyme mesodermal de la tete, ainsi que dans les somites
et tissus derives. Six2 est egalement exprime dans le mesenchyme associe cl l'estomac et au
rein. L'expression des genes de la sous-famille Six3 se trouve dans l'oeil, la tige optique,
I'hypothalamus et I'hypophyse. L' expression de Six4.1 et Six4.2 est detectee dans les arcs
visceraux, les derives placodaux, le mesenchyme de la töte et I' oeil. Dans leur ensemble, ces
resultats indiquent que les genes de la familIe Six jouent des röles importants dans le
developpement de nombreux organes et tissus en dehors du systeme visuel. En particulier,
Six2 est le seul gene de la famille Six qui pourrait avoir une fonction dans le developpement
pronephrique.
Wnt4 est une glycoproteine secretee, qui agit dans une cascade complexe de signalisation et
est indispensable pour la tubulogenese dans le rein metanephrique de la souris. Dans le cadre
d'un demier projet presente ici, j' ai participe cl des etudes dont le but etait d'etudier la fonction
de Wnt4 pendant le developpement pronephrique. Chez le xenope, l'expression de Wnt4 est
associee aux tubules pronephriques en developpement, La surexpression de Wnt4 cause une
morphegenese anormale des tubules pronephriques, comme dementre par des analyses
moleculaires et histologiques. D'autre part, l'inhibition de la fonction de Wnt4 par injection de
MO provoque une complete absence de tubules pronephriques. Ces resultats demontrent que la
fonction de Wnt4 est essentielle pour le contröle de la tubulogenese pronephrique et que cette
fonction est conservee au cours de I'evolution entre les reins pronephriques et metanephriques,
7