Structure-Activity Relationships(SARs) - ETH E-Collection
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Diss. ETH Nr. 16674 Polycationic DendriticVectors for Gene Transfection: Structure-Activity Relationships(SARs) A dissertation submitted to the ETH ZÜRICH for the degree of Doctor of Sciences presentedby Marine NIECKOWSKI Dipl. Ing. E.N.S.C.P., Paris, France born 06.05.1978 citizen of France Accepted on the recommendationof Prof. Dr. Francois Diederich, examiner Prof. Donald Hilvert, co-examiner Prof. Hans P. Merkle, co-examiner Zürich, 2006 Abstract Abstract synthesis and investigation of polycationic dendrimers for gene transfection, that is, the delivery of foreign genetic material into the cell nucleus. The explicit goal of this work is to establish relationships between the branched strueture, the biological activity, and the physicochemical properties ofthe new molecules. In the introduetory chapter, scope and limitations of gene transfection are illustrated by the diversity of dendrimers developed and assayed so far for this purpose. Every optimization strategy based on structuralmodificationis explained in detail. The Erst approach consists of altering the strueture of dendrimers that are currently commercialized as gene-deliveryagents. A number of ingenious examples that render the vectors more flexible, less toxic, or amphiphilic have been reported. The second approach,probably more ambitious, is based on new branch motifs that were specificallydesigned for transfection. More generally, varying the strueture of synthetic DNA carriers has now proved a valuable strategy to complement knowledge gained by extensive biological studies. This clearly supports further development This thesis presents the of more advanced Systems. The second chapterprovides a rationalefor the design of a new dendrimer library. Vector 2 was previously identified systematically varied in promising transfection agent and its strueture was this project. The preparation of dendrimers 5-8, 15, and 17-19 with a as a lipophilic group is described in the third chapter. The fourth chapter presents biological results, namely transfection and toxicity assays in eultured cells (in vitro) with our dendrimers. DNA delivery by lead Compound 2 was compared in a variety of cell lines and rapid cell division seemed necessary to ensure nuclear uptake ofthe foreign gene, as is the case for many synthetic vectors. Human epithelial cancer cells (Heia cells) were thus selected for further evaluating the library of new vectors 5-15 and 17-19. Structural modifications applied to lead Compound 2 improved either the transfection ability or the biocompatibility of the dendritic system. At this stage, correlations to physicochemical properties were clearly required to explain differences in activity among the new core or a new new vectors. Abstract Referencevectors: "A *H3N •H3N- *H3N-^V *H3N^ HN- O *H3N' H NH CFjiCOO- 3 *h3n^tn *H3N f NH3 New -^Ph Q " O , CF,COO 9 rigid core 0 „ 'H,N H,N 3 CFjCOO" fj 5 ° >H,N H,N *H3N X; H 3 CF3COO" Vh1 RH 'H3N fH3N H <^ \/ ON 7 New cationic dendron *H,N-^~X CF3COO" H g 0, *H3N,___ 2CF3COO" fj"~ ^ '^h-^^^f ^ 2CF3COO 13 ^N H.<N Z CF,COO H 'H-V-N H „N N<¦^y. hH3N-VN ,0 -rsX 'H3N_~N>' ^N H ... MS" ~^ ,_NV H NH 4CF3COO New lipophilic group n3tN-- aaB^oh §/=, " 3CF3COO" U /^v 3CF3COO" S; 15 r=> ^g H fj- H-torN D /- *h3n' h 3CF3COO" *H3N-, 'H3N 17 O /=. 3 5h- H " H3N _ ;h3n- CF3COO* 1g Of A bstract Gene delivery assays ¦umtUT J? 80 S IB £ * »I Ulf. ta ,—.—v. in L-^ s El » Li .1S40JL1 Chanjt! £-.«ü*b* {*/-? Cha^ga P>.c*ä* <* j üi e f-" i - Dutrgo £»ctt&* <+M Toxicity assays MLPF Wffi? ¦¦ '2 13 '...•¦ tu & "S 3 3 «¦ 30 SP 10 i *> I i L Oj- ¦10- •so! i b j U i »-: G>;wgi9Eij5*¥*W*& Chanyi Ejk*!k* ;(¦** J biological experiment, RNA instead of DNA molecules were transfected with vector 2. Our lead vector proved superior to a commercial synthetic vector with respect to the In a last transfected, but less efficient in consideration of the amount of RNA delivered to each cell when compared to the widely used cell electroporation technique. This result may be a consequence ofthe relatively small size ofthe DNA/dendrimer complex prior number of cells to transfection. HEK293 cette 100 90 80 1° ¦ * EL s Mo 13 so 30 20 10 0 IH- electroporation technique TM commercial reagent s Transmessenger TM In the fifth and last chapter, differences in the molecular assemblieswith and without DNA large bilayers or multilamellar vesicles could be observed in Solution by cryoTEM microscopy technique. Such superstruetures are charactcristicfor efficient transfection vectors such as cationic lipids. The are analyzed in depth for vectors Langmuir technique allowed 2 and 3. It is further study only for lead vector 2 that of fluid films of dendrimers at the air-water Abstract interface. DNA and HCl biological stages injeetions into the watcr subphase of gene transfection. Sharp differences of vectors 2 and 3: they are linked to the relative were were performed observed between the ¦¦'38 **3ä* * vs ais W& is '! Nfes& £*% Im. ¦. IfisüMä £*• .^w rSÄfti srnmüMi^ EH m Vi i$ sü£* R-.Ä*-..*^ !i&s ^üi ^'"•^Wfc^ £ "KLäa _*** ^ dendrimer2 in Tris-EDTA buffer scale bars 100 The the lead dendrimer2/DNA complexes in Tris-EDTA buffer scale bars 100 nm self-assembling ability Langmuir ofthe new vectors 5-8, 11-15, nm and 17-19 lilms as well. The most active vectors in the library (7, was evaluated in 11-13) bchave shnilarly to Compound 2, that is, they are capable of forming bilayers or üposomes, whereas less active vectors our packing size of their dendrons. v°mm &_.vi...._._ SM mimic to small prcferentially form micelles in aqueous media. The transfection activity of amphiphilic dendrimers was thus clearly related to their packing mode. 60 50 40 i • 11 — - 30 Q. <D 20 12 13 » CO to 4sM \ O 03 H— 10 CO 0 20 40 60 the 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Molecular area [A7] Resume Resume A travers la Synthese et l'etude de nouveaux dendrimeres polycationiques, cette these genique. Nos molecules servent en effet ä transporter efficacement du materiel genetique exogene jusqu'au noyau des cellules. Nous avons plus particulierement tente d'etablirdes relations entre la strueture dendritique (c'est-ädire digitee ou en branches) de nouvelles molecules, leur activite biologique et leurs proprietes physico-chimiques. Dans le chapitre d'introduction,nous illustrons l'etendue et les limites de cette biotechnique en montrant la diversite des dendrimeres developpes et testes jusqu'ä present en transfection genique. Nous passons en revue deux strategies d'optimisation par des modifications contrölees de strueture chimique. (i) Une premiere approche consiste ä changer la stmeture des dendrimeres dejä connus qui sont commercialises comme vecteurs de genes. De nombreuses etudes cherchent ingenieusement ä rendre ces dendrimeres plus flexibles, moins toxiques ou amphiphiles.(ii) Une seconde approche plus fondamentale ambitionne de creer de nouveaux motifs dendritiques, coneus de maniere specifique pour la transfection genique. Plus generalement, faire varier la strueture de ces distributeurs synthetiques d'ADN permet de completer les cormaissances acquises lors de tests biologiques detailles. Les informations collectees ainsi se revelent essentielles pour dcvelopper des vecteurs de plus en plus contribue aux recherches sur la transfection performants. chapitre expose nos motivations pour la definition et la synthesc d'une nouvcllc famille de dendrimeres.Au depart de notre etude, le vecteur 2 etait dejä connu et avait ete precedemment identifie comme prometteur pour la transfection genique. Sa strueture a done ete l'objet des modifications contrölees exposees dans ce travail. La synthese de ses variantes, Le second les dendrimeres 5 ä 8, 15 et 17 ä 19 pourvus d'un nouvel espaceur ou d'un lipophilique, est decrite au troisiemc chapitre. Le quatrieme chapitre presente transfection et les tests de toxicite de distribution d'ADN par le vecteur 2 les resultats nos a ete biologiques, nouveau groupe c'est-ä-dire les essais de molecules sur des cultures de cellules (in comparee pour differentes cellules et vitro). La une division Resume cellulaire rapide semble necessaire pour pcrmettre au materiel noyau, comme il est observe pour de nombreux autres vecteurs epithelialescancereuses (cellules Heia) ont ainsi ete chimique appliquees au synthetiques. generale, dans le Des cellules selectionnees pour l'cvaluationde vecteurs 5 ä 15 et 17 ä 19. De maniere nouveaux genetique d'entrer tous les les modifications de strueture pouvoir de transfection soit la tolerabilite biologique. A ce stade, des rapprochements avec les proprietes physico-chimiques semblaient necessaires pour expliquer les differences d'aetivite entre les compose de reference vecteur 2 ameliorent soit le vecteurs. nouveaux Reference vectors: IJ_/=_ _ j=. ( H3Nv Nn13 .1 I o *H3N-, LI ¦HaN-sl^ W^o H üeffi z;^vk^ ® ^: 0 "°L *H3N •H3N-0-B "' 9 CF3COO" rigid core New *H3N, O ,., w0 *H3N-, -^ TH3N^~ O H /—. >h-N"- H ->°tf ^ H H3N 3CF3COO- 7 \H H *H3N H New cationic dendron i^^^f^ °^^WN ^0*-®-=-©-«" 'H3N PH 2CF,C00- 12 H_0 H lipophilic •H,N. 0 Jj~- ., „ &/-ffi J< *H,N' CF3COO" 14 H 4CF3COO" ^^t^^e^q^rH>¦ H 8 ~r\ H 3 M_^NH HjN-^ *U group _ New ZCFjCOO" " -jM Ja OF-aCOO1 •h^VnH^^: *H3N Resume Tests de transfection genique 100, 90 i £3?*J £ soj im\ El 50 2 40 30 I £ ^Htf^^ j4'" I ! *P ^^¦»^---ä [4 L^-*" Charge Exress (+>} Bö] II 303* •*' - > Crwg« £jtc#*$ $*>} Charge Excess i-F-) Tests de toxicite 80 I ESS32 30 ' « ä SO J ,- 8 *öj 3 & 30 1 .IJül Qwötf f-Hrtüm+frf Charge Excsw (-+A Dans une derniere etude biologique, distribution d'ARN r'"f nous avons C«4f*# ftKC*!» (*/-) teste le vecteur 2 de reference pour la plus actif qu'un produit commercial quant au nombre de cellules transfectees, mais moins efficace que la technique traditionelle d'electroporation si c'est la quantite d'ARN distribuee ä chaque cellule transfectee qui est prisc en compte. Ceci pourrait provenir de la faible taille des complexes ARN/dendrimere au lieu d'ADN. Ce vecteur s'est avere formes avant la transfection. HEKZ93 cells 00 - 30 - 80 „„.T„„, 70 60 - - EL electroporation 50 TM vecteur commercial 40 vecteur 2 Transmessenger" 30 f.j 20 TM Dans le dernier chapitre, les differences d'assemblage moleculaire avec et le vecteur 2 et le vecteur 3 sont analysees en sans detail. La miscroscopie cryoTHM d'observer des Solutions de dendrimeres et seul le vecteur 2 est ADN entre nous a permis capable de former des bicouches ou des vesicules multilamellaires. De telles superstruetures sont caraetcristiques des vecteurs de transfection efficaces, tels les lipides cationiques. La technique de Langmuir a .10 Resume ensuite etc appliquee ä des films de dendrimeres formes ä l'interface air-eau. Des sous-phase aqueuse devaient permettrede modcliser les etapes cles d'ADN et d'HCI dans la transfection m§ m De nettes differences entre les vecteurs 2 et 3 sont observecs pour elles sont liecs ä la taille relative de leurs dendrons. m Y ts l.1bssssä».*j I *-* i'JHti ^-x" '• -IRIN BS SäS de genique. l'assemblage: ica injeetions *&» 38 #'*4cs r m ^«S^üif ssä ms «s !»wv vecteur 2 dans la Solution i ¦M^ iE** «*#*.£ fc-^K-ÄSSI ¦IS ft; v, im mm} Ü6r-*-"3S » tampon Tris-EDTA (echelle 100 nm) 4awa&«ÄJ complexes m"sm entre le vecteur 2 et et l'ADN dans Solution tampon Tris-EDTA (echelle 100 nm) L'aptitudc ä l'auto-assemblagc des nouveaux vecteurs 5 ä 8, 11 ä 15 et 17 ä 19 a aussi ete etudiee avec leurs films de Langmuir. Les vecteurs les plus actifs dans cette famille (7, 11 ä 1.3) sc coinportent liposomes. Les comme le compose de reference plutöt en micelles dans un milieu aqueux. transfection de vecteurs dendrit.iqu.es ont ainsi etc vecteurs moins actifs s'assemblent premiere fois, prop.riet.es de correlees ä leur mode d'assemblage. Pour la 2, pouvant former des bicouches ou des les 60 B 50 0 CO CO s&", i&äs 3^&«up 11 12 40 13 30 (D \~* Cl 20 CD O ro w 10 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Molecular area [Ä2]