Comptage de cellules avec un hémacytomètre

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Note technique - Comptage de cellules avec un hémacytomètre
Comptage de Cellules
avec une Hémacytomètre
Utilisation élémentaire de lÊ hémacytomètre
Introduction
Matériaux
Malgré les développements technologiques qui
ont eu lieu dans les laboratoires scientifiques
durant ces dernières années, le comptage
visuel avec un hémacytomètre reste la méthode
de comptage la plus répandue depuis le 21ème
siècle.
Les éléments nécessaires pour réaliser un
comptage de cellules avec un hémacytomètre
sont les suivants:
a)
b)
Cet article est destiné à aider à lÊutilisation des
compteurs de cellules avec une hémacytomètre
ou plaque de Neubauer aux novices, ainsi
quÊaux techniciens et chercheurs expérimentés
qui souhaitent se remémoriser les bases
dÊutilisation.
c)
d)
e)
f)
PLAQUE DE NEUBAUER OU
HEMACYTOMETRE
HEMACYTOMETRE.
METRE.
Premièrement, nous présenterons les parties et
le fonctionnement de lÊhémacytomètre.
Il sÊagit dÊune grosse lamelle de verre en forme
de porte-objet dÊenviron 30x70 mm et 4 mm
dÊépaisseur.
Deuxièmement, nous décrirons les étapes
dÊutilisation du comptage de cellules avec un
hémacytomètre pour obtenir des résultats
fiables.
a
échantillon à mesurer
hémacytomètre ou plaque de
Neubauer
microscope optique
Couvre-objets
pipette/micropipette avec pointe
buffer-tampon pour dilution / PBS
Dans une plaque simple, la partie centrale, où
se réalise le compte, se divise en 3 zones
c
e
f
b
d
Fig 1. Éléments nécessaires pour numération cellulaire avec hémacytomètre
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Dans la partie centrale se trouve gravée une
réticule.
Dans le cas de plaques doubles, qui sont les
plus communes, ils existent 2 zones de
comptages, une supérieure et une inférieure à
lÊaxe longitudinal de la plaque.
Chambre supérieure
2
La réticule complété mesure 3mm x 3mm de
côté ; divisée en 9 carrés de 1mm de côté
chacun. Fig 4 – 1.
En cas de comptage sanguin, les carrés des
coins/angles sont destinés aux comptages des
leucocytes. En existant en moindre quantité par
rapport aux hématites, il nÊest pas nécessaire
dÊavoir autant de référence pour réaliser le
comptage.
Le carré central est destiné au comptage des
hématites et des plaquettes. Il se divise en 25
carrés moyens de 0.2mm de côté (Fig. 4 -2) et
chacun de ces carrés se divise en 16 carrés plus
petits. Fig 4 – 3.
Le carré central est formé de 400 petits carrés.
COUVRECOUVRE-OBJETS.
OBJETS.
Chambre inférieure
Fig 2. Plaque de Neubauer commerciale
La plaque couvre-objet est une lamelle de verre
dÊenviron 22mm x 22mm. Elle doit se mettre sur
la plaque de comptage de façon à ce quÊelle
recouvre la partie centrale de celle-ci, délimitant
un espace entre la plaque et le couvre-objet de
0.1mm.
Il est normal que le couvre-objet se soulève
légèrement quand nous mettons plus de liquide
que prévu. Pour éviter ce désagrément, il existe
des plaques avec 2 pinces spéciales pour que
le couvre-objet ne se soulève pas et la distance
reste de 0.1mm.
PIPETTE
Fig 3. Pile de couvre-objet et boîte.
Il sÊagit dÊun instrument de laboratoire qui
permet de mesurer une aliquote de liquide avec
précision. Elle est principalement en verre, et
actuellement, et utilisée des micropipettes avec
une pointe stérile jetable. Les plus communes
sont calibrées pour une capacité de 20, 200 et
1000uL.
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Fig 4. Détail de la grille de la plaque de Neubauer Improved.
Comptage de cellules, étapes
par étapes
ETAPE 1. Préparation de lÊéchantillon.
lÊéchantillon
Selon le type dÊéchantillon à mesurer, il faudra
préparer un échantillon avec une concentration
adéquate pour le comptage.
Au-dessous de 250.000 cellules/ml (2.5x105 ),
la quantité de cellules comptées nÊest pas
suffisante pour donner une estimation
suffisamment fiable de la concentration
cellulaire1.
Au-dessus de 2.5 millions (2,5 * 106), la
probabilité dÊerreurs de comptage augmente
considérablement, ainsi que le temps et les
La concentration optimum pour un
Typiquement, la gamme de concentrations du permet le
comptage en hémacytomètre est de 1
comptage dÊhémacytomètre se situe entre 250 000 et 2,5
million de cellules/ml = 106 cellules /ml.
millions de cellules par ml de cellules.
Nous utiliserons un échantillon avec une
concentration de 106 (1 million) appliquant les
dilutions correspondantes.
efforts nécessaires pour réaliser un comptage
Voir
http://www.celeromics.com/fr/resources/docs/Articles/co
nteo-celular-con-concentraciones-bajas.htm, pour une
démonstration statistique de pourquoi cela arrive.
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fiable. Au-delà de cette concentration, il est
convenable de diluer lÊéchantillon pour quÊil
soit optimal.
ETAPE 2. Introduction de lÊéchantillon dans
dans la
plaque de Neubauer.
Mettez le couvre-objet sur la plaque de
Neubauer, et mettez-le en position horizontale
sur la table, à un endroit où il est facile de
manipuler la pipette.
1)
Introduisez une pointe jetable à
lÊextrémité de la micropipette.
2) Ajustez la micropipette pour aspirer
10 uL de liquide. Généralement cet
ajustement se réalise en guidant le
bouton du piston pour sélectionner le
volume souhaité.
3) Introduisez
la
pointe
de
micropipette dans lÊéchantillon.
Fig 5. Introduction de lÊéchantillon sur la plaque de Neubauer.
ETAPE 3. Préparation et réglage du microscope
la
1.
4) Appuyez le piston de la pipette
doucement jusquÊà ce que le piston
arrive à la fin de son parcours.
Mettez la plaque de Neubauer dans
le plateau du microscope. Si le
microscope a des pinces de fixation,
utilisez-les pour fixer la plaque
2.
Allumez la lumière du microscope.
3.
Réglez le microscope jusquÊà ce que
vous puissiez voir nettement les
cellules en regardant par le
binoculaire.
4.
Cherchez le premier cadre où vous
voulez réaliser le comptage. Pour cet
exemple, nous allons compter 5
grands carrés de la plaque de
Neubauer Improved de 0.1 mm de
profondeur. Voir Fig. 8
5) Sortez la pointe de la pipette de
lÊéchantillon, et maintenez-la toujours
en position verticale pour lÊemmener
jusquÊà la plaque de Neubauer.
6) Mettez la pointe de la pipette au bord
du couvre-objet, à lÊextrémité de la
plaque de Neubauer. Il sÊagit de
laisser le liquide pénétré entre la
plaque et le couvre-objet depuis le
côté, par capillarité.
7)
Relâchez le piston doucement
pendant que vous vérifiez que le
liquide entre correctement et de
manière uniforme dans la plaque
(voir Fig 5).
8) Si apparaissent des bulles, ou le
couvre-objet ait bougé ou toute autre
anomalie, répétez lÊopération.
Nous avons la plaque de Neubauer chargée,
prête pour le comptage de cellules.
.
Voir
http://www.celeromics.com/fr/resources/
docs/Articles/easy-formula-for-manualcell-counting.htm, pour voir les formules
appliquées pour chacune des plaques de
comptages les plus communes.
5.
Réalisez le comptage des cellules
dans le premier cadre.
Il existe une convention indiquant que
si les cellules touchent la partie
supérieure ou la partie gauche du
cadre, elles sont comptabilisées mais
si elles touchent la partie inférieure et
droite, elles ne le sont pas.
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Fig. 6. Comptage dÊun grand carré de la
plaque de Neubauer.
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Fig. 8. Comptage de 5 grands carrés de la
plaque de Neubauer Improved.
ETAPE 4. Calcul de la concentration
Nous appliquons la formule de calcul de la
concentration cellulaire.
quantité de cellules
concentration (cel / ml) = ------------------Volume (en ml)
La quantité de cellules est la somme de toutes
les cellules comptées dans toutes les cadres.
Le volume est le volume total de tous les
cadres où nous avons fait le comptage.
Fig. 7. Comptage avec concentration cellulaire
élevée.
Si la concentration cellulaire est très élevée, il
est facile de se perdre dans le comptage, il est
utilisé un ordre de comptage en forme de
zigzag comme décrit dans la Fig. 7.
6.
7.
Notez sur une feuille les résultats de
la quantité de cellules comptées dans
le premier cadre.
Renouvelez le processus pour les
autres cadres que vous souhaitez
compter, notez le résultat de chacun
dÊeux. Plus vous comptez de cadres
et plus la mesure obtenue sera
précise.
Quand le volume dÊun grand cadre est:
0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie
0,01 cm2 * 0,1 mm (profondeur) =
0,01 cm2 * 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml
La formule de comptage avec les grands
cadres de la plaque de Neubauer est
quantité de cellules x 10.000
concentration =
quantité de cadres
Si nous appliquons une dilution, nous devons
transformer la concentration obtenue durant
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le comptage cellulaire en une concentration
de lÊéchantillon original.
Nous devrons diviser le résultat pour la
dilution appliquée.
La formule restera:
quantité de cellules x 10.000
concentration =
quantité de cadres x dilution
Exemple:
Pour une dilution de 1:10, Dilution = 0.1
Pour une dilution de 1:100, Dilution = 0.01
Erreur
Les erreurs entre 20% et 30% sont communes
avec cette méthode de comptage dûe à la
manipulation de la pipette, aux erreurs
statistiques pour avoir un échantillon peu
représentatif, erreurs de volume de
lÊéchantillon réellement introduit sur la plaque,
etc⁄
Pourtant, lÊhémacytomètre reste une des
méthodes la plus largement utilisée dans les
laboratoires dans le monde entier.
Pour accéder à une analyse détaillée de
lÊerreur qui a été commise dans un comptage
déterminé, cliquez :
http://www.celeromics.com/fr/resources/doc
s/Articles/cell-count-error.htm
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