Hématologie biologique en 2013
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Hématologie biologique en 2013
Hématologie biologique en 2013: du microscope au séquençage de nouvelle génération à haut‐débit. L.Mauvieux Laboratoire d’Hématologie EA3430 Faculté de Médecine de Strasbourg Pôle de biologie CHRU Strasbourg 42ème Colloque National des Biologistes des Hôpitaux Strasbourg, 1‐4 octobre 2013 ACNBH ODPC N°1495 DECLARATION D’INTERET DANS LE CADRE DE MISSIONS DE FORMATION REALISEES POUR L’ACNBH Pr Laurent Mauvieux Exerçant au CHU de Strasbourg déclare sur l’honneur ne pas avoir d'intérêt, direct ou indirect (financier) avec les entreprises pharmaceutiques, du diagnostic ou d’édition de logiciels susceptible de modifier mon jugement ou mes propos, concernant le DMDIV et/ou le sujet présenté. L’invention de la microscopie Antoni van Leeuwenhoek (1632‐1723) X300, résolution 1,4µm Arcana Natura Detecta, Delphes, 1695 Georges Hayem (1841 ‐1933) • Nombreux travaux de physiologie sanguine • Elabore les principes fondamentaux de l’hématimétrie • Caractérise les anémies • Dr Cholera Les automates d’hématologie Technologies utilisées Focalisation hydrodynamique Impédance Radiofréquence Spectrophotométrie Diffraction laser Fluorescence laser Cytochimie (perox) numération et volumes complexité cellulaire mesure Hb numération, volumes, contenus contenu, ARN, ADN, marqueurs de surface contenu Sysmex XN La cytométrie en flux • développée en 1968 dans l’université de Münster et commercialisé par PhyweTM en 1969 • FACS BD 1974 • EPICS Coulter 1977 • Très forte intégration de analyseurs 10 couleurs, 4 lasers 18 couleurs, 5 lasers Gallios™ BD LSRFortessa ™ La cytométrie en flux en hématologie • Etude des sous-populations lymphocytaires • Onco-hématologie: – Typage des hémopathies • score de Matutes (syndromes lymphoprolifératifs), score EGIL (LA) – Recherche des cibles thérapeutiques: • Rituximab – Mabthera® (anti-CD20) • Alembtuzumab –Campath® (anti-CD52) • Gemtuzumab (anti-CD33) – Contenu en ADN (cycle cellulaire / LAL de l’enfant) – Diagnostic des hémoglobinuries paroxystiques nocturnes (déficit prot Gpi) – Recherche de transporteurs de drogues (P-gp / phénotype MDR) – Fonctions plaquettaires, microparticules membranaires…. 3 applications récentes • Recherche d’anomalies des protéines membranaires du globule rouge • Recherche de l’activation fonctionnelle de p53 • Maladie résiduelle dans les leucémies 1) Sphérocytose héréditaire Test à l’Eosine 5’maléimide (EMA) – anémie hémolytique Protéine Bande 3, Ankyrin, Protéine 4.2, Spectrine chronique – déficit de protéines membranaires du GR => perte membranaire – CCMH augmentée (>36g/dl) – présence de sphérocytes sur le frottis sanguin – Examen de référence: Ektacytométrie (Kremlin‐ Bicêtre) Maladie autosomique dominante dans 75% des cas; 1/5000 naissances Test à l’EMA Sensibilité Sensibilité Conservation pré‐ analytique Sphérocytose Témoin Evènements ‐ Colorant fluorescent se fixant aux protéines Band3 ‐Coloration proportionnelle à la quantité de protéine Band 3, et donc à la surface membranaire ‐Un défaut de 10% de fluorescence est en faveur du diagnostic ‐Quelques faux positifs: elliptocytose et pyropoikilocytose, rares dysplasies congénitales Fluorescence Test à l’EMA 93‐96 % 95‐99 % Résistance Globulaire 66‐74 % 71% Pink test 91% 72 heures 2 heures 2 heures 2) Etude fonctionnelle de la voie p53 dans les LLC Fludarabine • p53: facteur de transcription Incorporation dans l’ADN induisant l’apoptose ou l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à Cassures double brin l’altération de l’ADN • Fréquentes délétions et mutations de Activation de la voie p53 TP53 dans les LLC (FISH; 17p) • Associé à: Apoptose – Une instabilité chromosomique – une résistance à la fludarabine • Confèrent un pronostic défavorable Etude fonctionnelle de TP53 LLC après 24h de culture cellulaire en présence d’Etoposide et de Nutilin ‐3a Profil normal (induction TP53) Profil anormal (haut niveau basal, faible induction) Profil anormal (aucune induction) M Le Garff‐Tavernier et al., Blood Cancer Journal (2011) 3) Maladie résiduelle dans les leucémies aigues myéloïdes par CMF • Virtuellement applicable à tous les patients – Y compris en l’absence de marqueurs moléculaires • Expression des marqueurs d’immaturité (CD34; CD117; CD133) • Expression d’antigènes aberrants: – Lignée – Asynchronisme de maturation – Expression augmentée ou diminuée • Rapide, sensible (seuil 0,1%) 517 patients inclus 27 centres LAM faible risque MRD induction 2 mois LAM risque intermédiaire MRD induction 2 LAM bon risque élevé mois Vers le futur: la cytométrie de masse ? 1 Anticorps couplés à des isotopes stables de métaux Europium Strontium… 2 Dont la masse peut‐être mesurée très précisement par spectrométrie de masse Scott Tanner DVScience TM L’idée: coupler la spectrométrie de masse atomique avec le marquage cellulaire • Cellules marquées introduites dans torche à plasma • Les masses atomiques des ions des métaux sont analysés par spectrométrie de masse • jusqu’à 100 Ac différents analysées simultanément (100,000 cellules en 4 minutes) DVScience Cytof II TM Mass spectrometry analysis • Analyse multidimensionnelle – Immunophénotype – Signalisation cellulaire – Expression de cytokines… L’étude du génome 1) Cytogénétique 2) Biologie moléculaire Etapes de la cytogénétique • 1888: Waldeyer découvre les chromosomes • 1902: Theodor Boveri propose que les tumeurs pourraient être liées à la mauvaise ségrégation des chromosomes • Années 50: Utilisation de techniques de culture cellulaire • Banding en 1969=> identification de la t(9;22) dans la LMC • 1977: essor de la FISH • 2004: premiers CGH‐Array (comparative genomic hybridization) Origine génétique acquise des leucémies: remaniements génomiques Cytogénétique moléculaire Leucémie myéloïde chronique FISH interphasique BCR‐ABL MULTI‐FISH Peinture chromosomique Classification OMS (WHO) 2001/2008 CBF, RARa Caryotype normal Anomalies de MLL, del 5q, del 7 Biologie moléculaire des hémopathies malignes • Approches: PCR, RT‐PCR et séquençage • Diagnostic: – Recherche de transcrits de fusion: ex. BCR‐ABL; – Mutations ex: JAK2 / polyglobulies primitives – Expression anormales de gènes ex: Cycline D1/ LNH du manteau • Pronostic – Mutation du domaine Tyr kinase d’ABL / LMC résistantes au GLIVEC – Mutations de FLT3, CBF dans les LAM classification WHO 2008 • Suivi des patients : maladie résiduelle: – Quantification transcrit BCR‐ABL – Recherche de clonalité lymphoide Les limites de la « biomol » • Onéreux, long • Cibles en augmentation constante (hématologie et tumeurs solides) – Tests compagnons pour les traitements – Marqueurs « théranostiques » • Organisation des plate‐formes ont trouvé leurs limites • Besoin d’approches plus puissantes, plus globales Approche globale le séquençage « génome entier » Next Generation Sequencing (NGS) • Recherche des anomalies génétiques (variants) à l’échelon du génome • Séquençage du génome entier (whole genome sequencing) • Séquençage direct des ARNm (RNA‐seq) • Séquençage des microARN • Séquençage des séquences d’ADN methylées (CHIP‐seq) Séquençage « Sanger » Dideoxynucléotides bloquant l’élongation d’une matrice d’ADN Radiomarqués: P32, P33 Fluorescents prix Nobel de chimie en 1980 Séquençons le Génome Humain Log (prix) 10 8 6 2001: Human Genome Project (HUGO) 3 milliard $, 10 ans James Watson's genome 2008 2007: 454 1M$, 3 months 2008: ABI SOLiD 60K$, 2 weeks 2001: Celera 300M$, 3 years 2010: 6K$, 4 2009: Illumina, Helicos 40-50K$ 2 2000 2014: 1000$?, <24 hrs? 2005 2010 27 Le séquençage Haut‐Débit, c’est quoi? • Approche miniaturisée: – Densité de séquences: ~10.000/ mm2 • Massivement parallèle: – Plusieurs millions de séquençage simultanés possibles, voire plusieurs milliards… • Productions de quantités impressionnantes de données: de 35 millions de bases à 600 Gb par réaction de séquençage (« run ») Taille du génome humain ~3 Gb de paires de nucléotides Approche 454 (Roche Ltd) Etapes principales • Fragments d’ADN capturés sur une bille • PCR en émulsion (huile/eau) • Réaction de pyroséquençage: production de photons capturés par une caméra CCD • Production d’un « flowgram » Solexa/ Illumina • Fragments d’ADN capturés sur une surface solide • Chaque brin est multiplié (clusters) • Chaque cluster correspond à 1 séquence • Capture par caméra CCD Approche semi‐conducteurs Proton /PGM (Life technologies™) Incorporation d’un nucléotide Génération d’un proton H+ 1 proton = 1 base, signal intégré dans un microprocesseur Particularités du NGS • « profondeur » de séquençage • « Etiquettes » des ADN: Multiplexage (=> 96) • Ciblage possible des régions séquencées: – « amplicons » – « Capture » de séquences par sondes biotinylées • Combinaisons pour optimiser la capacité de séquençage: – nombre de cibles – nombre d’ADN différents – Profondeur de séquençage souhaitée Analyses des données • Importance d’une équipe: – Techniciens – Biologistes – Bio‐informaticiens – Informaticiens 1) Données brutes: format “Fastq” + %.7786867:778556858746575058873/347777476035 @HWUSI‐EAS582_157:6:1:1:1606/1 NCTGGCACCTTGATTTTGGACTTCCCAGCCTCCAGAACTGTGAG + Score de qualité Sequence Nom de l’appareil Cellule de séquençage Zone de la cellule de séquençage Coordonnées –x‐ du cluster Coordonnées –y ‐ du cluster Index de multiplexage Simple ou double lecture 2) Alignement des séquences • A partir de séquences de référence du génome humain (Hg19) • algorithmes – Bowtie – Smith‐Waterman – BWA • Production d’un fichier « .bam » 3) Recherche de « variants » génétiques • Ré‐analyse informatique du patient précédent: – identification d’une mutation de l’AA 723 de DNMT3A (DNA methyl transférase 3) – Décalage du cadre de lecture => codon stop prématuré Analyse des mutations de DNMT3A chez 188 patients Survie chez les patients atteints de LAM selon le statut de DNMT3A • 200 patients avec cytogénétique intermédiaire ou favorable étudiés (génomes entiers de leucémies séquencés ou exome) • Séquençage de l’ARNm, de l’ADN méthylé(CHIP Seq) • + contrôle génome constitutionnel Résultats • 2315 variants génétiques identifiés • 270 insertions ou délétions de petite taille • MAIS: ‐Seuls 23 gènes sont le siège de mutations récurrentes (mutations « driver ») ‐En moyenne 3 mutations driver nécessaires pour qu’une LAM surviennent ‐ jusqu’à 3 sous‐clones identifiés (50% avec 1 sous clone) • Autres mutations: « passenger » Catégorisation des anomalies génétiques des LAM 1) Fusions génétiques impliquant des facteurs de transcription 2) Gènes suppresseurs de tumeurs 3) Gènes impliqués dans la méthylation de l’ADN 4) Gènes impliqués dans le transduction du signal 5) Gènes de la différenciation myéloïde 6) Gènes modifiant la chromatine 7) Cohésines 8) Spliceosome Conclusions • L’Hématologie en 2013: – Repose toujours sur une routine de qualité: • Automates performants • Revue raisonnée des frottis sanguins /bonne coloration – Prise en charge en milieu spécialisé des hémopathies malignes • diagnostic: faisceau d’arguments cliniques et biologiques – Orientation affirmée vers une médecine de + en + personnalisée Merci pour votre attention Laboratoire d’Hématologie des HUS Laboratoire de recherche EA3430 A Eischen AC Galoisy L Miguet C Mayeur Rousse L Monier D. Guenot N. Perrusson Plate‐forme hospitalière de séquençage de l’Institut régional du Cancer de Strasbourg