apport de l`immunophenotypage dans le diagnostic et le
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apport de l`immunophenotypage dans le diagnostic et le
12 J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2 - 2013, pp. 12-18 © EDUCI 2013 N’GUESSAN-BLAO AR1* AFFI-ABOLI R1 MAHAWA SANGARE1 INWOLEY KA1,2 DUNI SAWADOGO1 APPORT DE L’IMMUNOPHENOTYPAGE DANS LE DIAGNOSTIC ET LE PRONOSTIC DES LEUCEMIES LYMPHOIDES B A ABIDJAN (CÔTE D’IVOIRE) RÉSUMÉ La cytométrie en flux est un outil indispensable au diagnostic des leucémies. Elle permet de définir la nature de la prolifération, de préciser les critères pronostiques liés à l’expression d’antigènes de surface. L’objectif de cette étude était de montrer l’intérêt de l’immunophénotypage dans le diagnostic et le pronostic des leucémies lymphoïdes. Il s’agit d’une étude transversale portant sur 26 sujets atteints de leucémies dont 15 cas de leucémies aigues (LA) et 11 cas de leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) diagnostiqués par la cytologie. L’immunophénotypage a été réalisé à l’aide d’anticorps monoclonaux lié aux fluorochromes et caractéristiques des lignées cellulaires : la lignée T (CD3, CD4), la lignée B (CD19, CD20, CD22, HLA-DR) et des marqueurs d’immaturité (CD34, CD38).La cytologie a permis d’identifier pour les LA, 12 cas de Leucémies aigues lymphoblastiques (LAL) et 3 cas de Leucémies aigues non classables. L’immunophénotypage a permis d’affiner le diagnostic cytologique en mettant en évidence 12 cas de LAL B, 1 cas de LALT, 1 LA indifférenciée et 1 LA biphénotypique. L’expression du CD34+/CD38- associé à un mauvais pronostic a été retrouvé chez trois patients. Pour les LL, il a été identifié 10 cas de LL B et 1 cas de LL B/T. La mise en évidence du CD38+ a modifié le pronostic d’un patient. L’immunophénotypage par cytométrie en flux est d’un apport certain dans le diagnostic des leucémies, car permet de confirmer et/ou affiner le diagnostic cytologique et d’identifier des éléments de pronostic. Mots-clés : Immunophénotypage, leucémie lymphoïde, Abidjan ABSTRACT Flow cytometry is an essential tool in the diagnosis of leukemia. It defines the nature of proliferation, specify the prognostic criteria linked to the expression of surface antigens. The objective of this study was to show the interest of immunophenotyping in the diagnosis and prognosis of lymphoid leukemias. This is a transversal study of 26 patients with leukemia, including 15 cases of acute leukemia (AL) and 11 cases of chronic lymphocytic leukemia (CLL) diagnosed by cytology. Immunophenotyping was performed using monoclonal antibodies bound to dyes and characteristics of cell lines: for T lymphoid lineage (CD3, CD4), for 1- Département Hématologie, Immunologie, Biologie générale, UFR des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques, Université Félix Houphouët Boigny 2- Centre de Diagnostic et de Recherche sur le Sida et les autres maladies infectieuses, CHU de Treichville, Abidjan, Côte d’Ivoire - Correspondance : N’Guessan-Blao Amoin Rebecca ; Tel : 225 05312813, Email : [email protected] J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013. 13 B lymphoid lineage (CD19, CD20, CD22, HLA-DR) and for immaturity markers (CD34, CD38). Cytology identified for AL, 12 cases of leukemia acute lymphoblastic (ALL) and 3 cases of acute leukemia unclassifiable. Immunophenotyping helped refine the cytological diagnosis highlighting 12 cases of ALL B, 1 case of ALL T, 1 undifferentiated AL and 1 AL Biphenotypic. Expression of CD34 + / CD38- associated with a poor prognosis was found in three patients. For LL, he identified 10 cases of LL B and 1 case of LL B/T. The identification of CD38 + changed the prognosis of a patient. Immunophenotyping by flow cytometry bring contribution in the diagnosis of leukemia, as to confirm and / or refine the cytological diagnosis and to identify prognostic factors. Keywords: Immunophenotyping, lymphocytic leukemia, Abidjan INTRODUCTION Les hémopathies malignes sont des proliférations anormales et anarchiques de cellules hématopoïétiques d’origine médullaire et/ou ganglionnaire. Ces cancers constituent à l’échelle planétaire une préoccupation de santé publique sans cesse croissante [Ly A, 2011]. En Côte d’ivoire, l’incidence annuelle est de 7,44 nouveaux cas pour 100 000 habitants chez les hommes et de 5,43 nouveaux cas chez les femmes [Sawadogo, 2009]. Ces affections représentent 14,05% des cancers [Echimane, 2000] et regroupent plusieurs entités nosologiques selon la nature de la cellule proliférante. Les leucémies lymphoïdes chroniques (LLC) appartiennent au groupe des syndromes lymphoprolifératifs (SLP) et les leucémies aigues Lymphoïdes (LAL) à celui des leucémies aigues (LA). Le diagnostic des leucémies lymphoïdes repose essentiellement sur l’étude cytologique associée quelquefois à la cytochimie en Côte d’Ivoire, .Ces techniques de diagnostic ne permettent pas toujours de caractériser les lignées proliférantes avec précision, et restent insuffisantes face à certaines formes de leucémies [Delmer, 1994]. Elles ont connu une avancée technologique avec l’avènement de l’immunophénotypage par cytométrie en flux et l’étude du caryotype [Drenou, 2002 ; Inwoley, 2004]. L’étude immunophénotypique permet de caractériser le composant cellulaire dont dérive la prolifération et de préciser les critères pronostics grâce à l’expression de certains antigènes de surface [Drenou, 2002]. Afin d’améliorer le diagnostic des leucémies lymphoïdes et d’identifier des facteurs pronostics permettant une meilleure prise en charge des patients atteints de LAL et de LLC, nous nous sommes proposés de montrer l’apport de l’immunophénotypage dans le diagnostic et le pronostic des patients présentant une leucémie lymphoïde. MATÉRIEL ET MÉTHODES Une étude transversale a été réalisée de juillet 2005 à juillet 2006 à l’unité d’hématologie du laboratoire du Centre Hospitalier et Universitaire de Yopougon et au Centre de Diagnostic et de Recherche sur le Sida et les autres maladies infectieuses sis au Centre Hospitalier et Universitaire de Treichville. Ont été inclus 26 patients ambulatoires ou hospitalisés. L’étude cytologique basée sur la morphologie et le comptage des cellules médullaires s’est faite à partir de frottis de suc médullaire colorée au May Grundwald Giemsa. L’étude immunophénotypique a été réalisée à partir de suc médullaire et /ou de sang périphérique recueilli sur tube contenant de l’éthylène diamine tétra acétique. Nous avons utilisé les kits BD TritestTM (BD Biosciences, San Jose, California, USA). Les kits tritests étaient constitués d’anticorps monoclonaux caractéristiques d’une lignée cellulaire et couplés chacun aux fluorochromes suivants : phycoérythrine, isothiocyanate de fluorescéine et la péridine chlorophylle J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013. 14 protéine. Les anticorps utilisés étaient les suivants : CD103/CD22/CD20 et CD38/ CD56/CD19 pour la lignée lymphoïde B, les CD3/CD4/CD45 pour la lignée lymphoïde T, CD45/GlyA/CD41 pour les lignées érythrocytaire et mégacaryocytaire et le HLADR/CD34 pour les cellules immatures. L’analyse des données a été possible grâce a des masques constitués de cytogrammes dont l’un en fonction de la taille et de la granularité permettant de sélectionner la population lymphocytaire à analyser et les autres cytogrammes étaient fonction des antigènes recherchés permettant de caractériser les cellules. Ainsi, les cellules de la lignée B et T étaient respectivement CD19+/CD20+/CD22+ et CD3+/CD4+. Les cellules immatures exprimaient le HLADR/CD34 et le CD38. Pour la classification immunologique, le score de l’European group for the immunological characterization of leukemias (EGIL) a été utilisé comme référentiel. L’appartenance à une lignée selon EGIL nécessite un score de deux points dans une lignée. Dans les LA biphénotypiques, les cellules portaient à la fois les antigènes spécifiques des lignées lymphoïdes B et T. Le score était supérieur à 2 dans les deux lignées. Dans les LA indifférenciées, il n’y avait aucun marqueur permettant de les classer dans les LAL-T ou LAL-B. Ces LA indifférenciées sont généralement HLA-DR+, CD34+, CD38+, parfois TdT+ et CD7+ [Bene MC, 1995]. Pour faire une sous classification des LAL B, il a été pris en compte l’expression du CD20 qui était variable d’un type à l’autre. L’affiliation à la lignée B ou T a pris en compte les mêmes marqueurs des lignées utilisées pour les LAL. L’analyse de nos données a été possible grâce au logiciel CellQuest (BD Pharmingen) du cytomètre de flux FACSCalibur® et le logiciel WinMDI 2.8 RÉSULTATS Grâce à la classification FrenchAmerican-British (FAB), la cytologie orientait 11 cas vers une LLC et 15 cas vers une LAL. Les 26 sujets atteints de LA et LLC avaient une moyenne d’âge respectivement de 30 ans et de 67 ans. Dans les LA, les patients étaient retrouvés à tous les âges contrairement aux LLC où l’âge minimum étaient de 40 ans. Une prédominance féminine a été observée avec un sex- ratio de 0,54, dans les LLC contrairement aux LA. L’altération de l’état général était observée indépendamment du type de leucémies. Les sujets atteints de LA présentaient une adénopathie dans 40% des cas et une splénomégalie dans 33,3% des cas. Dans les LLC, la splénomégalie était présente dans 63,6% des cas. Dans les LAL, l’ensemble des sujets présentaient des facteurs de mauvais pronostic (Tableau I): l’âge (86,7%), la blastose médullaire (83,8%), le syndrome tumoral (86,7%). Tableau I : Caractéristiques sociodémographiques et cliniques des patients (n=26) Patients (effectif) Age (moyenne [min-max]) Sexe (effectif) Homme Femme Altération de l’état général Syndrome tumoral Syndrome d’insuffisance médullaire Blastose médullaire ( moy±ET) Lymphocytose médullaire ( moy±ET) LAL 15 30 [5-66 ans] LLC 11 67 [54-75 ans] 9 6 12 (80%) 13(86,7%) 6 (40%) 83,8 ± 14,9% 4 7 11 (100%) 7 (63,6%) 4 (36,4%) 77.36±8.34% LAL : Leucémie Aigue Lymphoblastique ; LLC : Leucémie Lymphoïde Chronique J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013. 15 Le diagnostic cytologique basé sur la classification FAB a mis en évidence 3 cas de leucémies aiguës non classables (LANC), 3 cas de LAL1, 8 cas de LAL2 et 3 cas de LAL3. L’immunophénotypage a permis d’identifier la lignée cellulaire impliquée. Ainsi 1 cas de LAL T exprimant le CD3+, 1 cas de LAL biphénotypique avec expression des marqueurs T et B et 1 cas de LA indifférenciée dont les blastes portaient les marqueurs HLADR, CD34 et CD38 ont été déterminés. La comparaison des résultats de l’immunophénotypage avec ceux de la cytologie montrent que les 3 LANC par la cytologie ont pu être typés par l’immunophénotypage en LALBIV (Tableau II). L’immunophénotypage des LLC a permis d’identifier la lignée cellulaire impliquée. Les cellules exprimaient fortement le CD45, ce qui confirmait la maturité des cellules. .Un cas de LLC portant les marqueurs B et T a été mis en évidence. La positivité des marqueurs CD3 et CD4 confirme la maturité des cellules observée au cours des LLC .les marqueurs d’immaturité CD34 et CD38 étaient présents respectivement chez 66,7% et 40% des sujets. L’expression du CD34+/CD38- associée à un mauvais pronostic a été retrouvée chez 3 patients dont 2 ont présenté un syndrome tumoral. Le pronostic dans les LLC est apprécié par la classification de BINET, déterminante dans les décisions de traitement. Dans les LLC, 36,4% des patients étaient au stade A de la classification de BINET et 63,6% des patients étaient au stade B et C. Parmi les 4 patients selon la classification de BINET, L’expression du CD38 chez un des patients a modifié le pronostic de celui-ci où le traitement s’est avéré nécessaire. Tableau II: Comparaison des résultats de l’immunophénotypage et de la cytologie IMMUNOPHÉNOTYPAGE LALBI LAL1 Cytologie Cytologie LAL2 2 LALBIV LALT 1 1 5 LAL3 1 LANC 3 LLC LALB/T LAL I 1 1 LLCB LLCB/CD56+ LLCB/T 9 1 1 DISCUSSION Les patients atteints de LAL étaient retrouvés à tous les âges et présentaient pour la plupart une altération de l’état général, un syndrome tumoral, une insuffisance médullaire. Ces éléments cliniques et épidémiologiques sont également décrits dans la littérature [Vilmer E ,2002 et Elloumi M ,2002]. Les études de Sawadogo [2013] et Koffi [1997] ont trouvé respectivement une moyenne d’âge de 33 ans et de 28 ans pour toutes les leucémies aigues confondues. Les LLC constituent une pathologie du sujet d’âge mûr [Leporrier M,2000 et Hallek M ,2002]. L’altération de l’état général dans les LLC est un signe d’évolution de la maladie, aussi la splénomégalie est un signe majeur de la LLC [N’Dhatz 2007 ; Koffi 2009]. La LLC est une pathologie qui évolue lentement, les patients restent asymptomatiques J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013. 16 pendant de nombreuses années et leur arrivée dans les services de soins se fait alors tardivement généralement lorsque le patient ressent une fatigue liée à l’anémie. La blastose médullaire et la lymphocytose médullaire ont été retrouvées à des taux élevés témoignant de la prolifération tumorale et de l’insuffisance médullaire associés à des signes de mauvais pronostic. La classification FAB tient compte de la morphologie des cellules et le myélogramme dans certains cas ne permet pas de caractériser les cellules blastiques surtout lorsque les caractéristiques morphologiques entrainent un doute pour l’observateur. Les trois cas de LANC qui n’ont pu être typés par la cytologie, grâce à l’immunophénotypage, ont été identifiés en LAL BIV pour lesquelles les cellules portaient les marqueurs spécifiques CD19 et CD20 de la lignée B selon le score proposé par EGIL [Bene MC ,1995]. L’immunophénotypage s’est avérée nécessaire pour l’identification de ces leucémies grâce aux antigènes présents sur les cellules. Plusieurs auteurs affirment que l’immunophénotypage est un outil nécessaire au diagnostic des LA [Inwoley 2004 ; Bene MC 1991]. Il est important de déterminer la nature de la lignée proliférante et de typer les LA afin de choisir le protocole thérapeutique adéquat [Jouault H ,2002]. L’expression des marqueurs HLADR/CD34/CD38 est associée à un mauvais pronostic [Sawadogo D, 2013]. Les études d’Inwoley [2004] et Sawadogo [2013] ont retrouvé deux cas de leucémies biphénotypiques. Un cas de LALT a été également retrouvé par l’expression de marqueurs CD3+ et CD4+. L’immunophénotypage a donc permis d’affiner le diagnostic des LAL. Le diagnostic cytologique était relativement aisé pour la LLC, qui est caractérisée par une population monomorphe, constituée de petits lymphocytes matures. Cependant, l’expression du marqueur CD56 observée sur les cellules contraste avec l’étude de Drenou qui avait montré que la présence de ce marqueur n’avait pas de valeur diagnostic au cours des LLC [Drenou B ,2002]. Mais, sa présence pourrait orienter vers le diagnostic d’un lymphome à cellules NK ou une prolifération à grands lymphocytes. L’absence de certains marqueurs du score de Matutes n’a pas permis d’affiner le diagnostic de la LLC et de mettre en évidence un lymphome [Matutes E, 1994]. Le coût des réactifs a limité l’utilisation d’un plus grand panel d’anticorps ne permettant pas de faire un diagnostic différentiel entre les LLC et les autres SLPC. Cependant, l’immunophenotypage a permis d’identifier la nature de la cellule proliférante. L’expression du CD34 est un facteur de mauvais pronostic dans les LA contrairement au CD38 [Vergez et Witte KE ,2011]. Ces cellules immatures CD34+ sont plus résistantes aux traitements et à la chimiothérapie constituant ainsi un obstacle majeur à la réussite des traitements au cours des leucémies aigues [Ebinger, 2010]. Dans cette étude, la majorité des patients LLC était aux stades B et C contrairement à l’étude de Koffi qui a retrouvé 52% des sujets au stade A pendant laquelle l’abstention thérapeutique est observée sauf en cas de signe de progression de la maladie [Delmer,1999]. Dans l’étude de Koffi, certains patients bien qu’au stade A ont été traités. L’absence de données de l’immunophénotypage n’a pas permis de voir si le traitement était lié a la progression ou à l’expression de marqueurs de mauvais pronostic. Un des patients au stade A avait exprimé le CD38. Selon During, ce marqueur est associé à un mauvais pronostic dans les LLC [During,2002 ]. Il témoigne de l’activation et de la maturation des cellules et est associé à une concentration importante de lymphocytes dans le sang rendant le pronostic défavorable [ Véronèse ,2008]. La présence de ce marqueur a modifié le pronostic du sujet au stade A. J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013. 17 Cette étude a présenté des limites : l’utilisation d’un panel d’anticorps restreint et l’absence de la biologie moléculaire. En effet, l’absence de certains marqueurs notamment le CD5 et le CD23 n’a pas permis d’affiner le diagnostic des LLC et de faire le diagnostic différentiel avec les autres types de syndromes lymphoprolifératifs chroniques. CONCLUSION Dans cette étude, l’immunophénotypage a permis d’affiner le diagnostic de 3 cas de leucémies aigues non classables par la cytologie et de relever des marqueurs pronostic (CD34 et CD38). Elle a été d’un apport certain à la cytologie qui reste limitée face à certaines formes de leucémies. Ainsi, L’utilisation d’un large panel d’anticorps permettrait un diagnostic précis des syndromes lymphoprolifératifs chroniques et de mettre en évidence les formes leucémiques des lymphomes. RÉFÉRENCES -Bene MC, Castoldi G, Knapp W et al. (1995) European group for the immunological characterization of leukemias (EGIL): Proposals for the classification of acute leukaemia. Leukemia; 9:783-1786 -Bene MC, LESS O, Faure G et GEIL. (1991) Immunophénotypage des leucémies recommandations. Revue française des laboratoires ; 267 :47-52. -Delmer. (1999) Leucémie lymphoïde chronique, diagnostic, évolution, pronostic et principe du traitement. PU-PH service hématologie clinique hôtel Dieu, Paris impact internat ;305 :87-89. -Drenou B,Fandel O,Fauchet R,Amiot L.la cytometrie en flux. (2002) Intérêt dans le diagnostic phénotypique et le suivi des hémopathies malignes. Ann.biol.Clin ; 66 :663-672. -Durig J,Naschar M,Schmucker U,Renzing-Kohler K.( 2002) CD38 expression is an important prognostic marker in chronic lymphocytic leukeamia. leukemia ;16 :30-35. -Ebinger M, Witte K-E, Ahlers J et al. (2010) High frequency of immature cells at diagnosis predicts high minimal residual disease level in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia research; 34: 1139 - 1142. - Echimane AK, Ahnoux AA, Adoubi I, Hien S, M’Bras K, D’Horpok A, Diomandé M, Anongba D, Mensah-Adoh I, Parkin DM. (2000) Cancer incidence in Abidjan, Ivory Coast. First results from the registry. Cancer; 89: 653-663. - Elloumi M, Hafsia R, EL Omri et al. (2002) Caractéristiques épidémiologiques, cliniques et cytohématologiques des leucémies aiguës lymphoblastiques de l’adulte en Tunisie. Tunis Médical; 80:199-202. - Hallek M, Bergmann M, Brittinger G, Döhner H, Dreger P, Herold M, et al. (2002)Chronic lymphatic leukemia. Curr Ther Concepts ; 43 : 1245-54. - Inwoley KA, Sawadogo D, Mizero L, et al. (2004) Apport de l’immunophénotypage dans le diagnostic et le pronostic des leucémies aigues à Abidjan, Côte d’Ivoire. Bulletin de la société de pathologie exotique; 97:319-322. - Jouault H. (2002) Place de la cytométrie en flux dans le diagnostic et le suivi des leucémies aiguës. Revue française des laboratoires;344:25-30. - Koffi K.G,. Nanho D.C, Tolo A., N’Dathz E. et al. (2009) La leucémie lymphoïde chronique du Noir en Afrique subsaharienne :caractéristiques cliniques thérapeutiques et pronostiques (cas de la Côte d’Ivoire) .Bulletin du cancer ;l96 (9) : 901-906 - Koffi KG, Emmou AS, Diop S.et al. (1997) Résultats et complications du traitement d’induction des leucémies aigues chez l’africain noir. Expérience du service d’hématologie clinique du CHU de Yopougon (Abidjan). Médecine d’Afrique Noire; 44 : 642-645. - Leporrier M. (2000) Leucémie lymphoïde chronique .Presse médicale ; 50 :2-5. - Ly A. (2011) Enjeux et perspectives de la prévention des cancers dans les pays en développement. J. Afr. Cancer ; 3: 268-272. - Matutes E,Morilla, Owusu-A, K,Houlilam A, Meeus P , Catovsky D. (1994) The immunophenotype of hairy cell leukemia(HLC) proposal of scoring systeme to distinguish HCL from B cell disorders with hairy or villous lymphocytes. leuk lymphoma;14:57-61. J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013. 18 - N’Dhatz CE, Koffi KG, Sidibé M, Nanho DC, Tolo A.(2007)La leucémie lymphoïde chronique dans sa forme splénomégalique, profil épidémiologique, clinique, biologique et évolutif. IV congrès de la Société Africaine d’Hématologie (SAFHEMA) :103p - Sawadogo D, Tolo A, Kassi H, et al.( 2013) Interest in Determining the CD34+ CD38- Phenotype in the Diagnosis and Prognosis of Acute Leukemia in Abidjan – Côte d’Ivoire. Mediterr J Hematol Infect Dis; 5(1). - Sawadogo D, Yapo VDP, Sangaré M, Tolo A, YayoAyé M. (2009) Caractéristiques épidémiologiques des patients atteints d’hémopathies malignes à Abidjan au cours de la décennie 1995-2004. J Afr Cancer; 1: 4-10. - Vergez F, Green AS, Tamburini J, Sarry JE et al. (2011)High levels of CD 34+CD38 low/- CD123+ blasts are predictive of an adverse outcome in acute myeloid leukemia: a groupe ouestest des leucémies aigues et maladies du sang (GOELAMS) study. Hematologica; 96:1792-1798. - Véronèse L, Tchirkov A, Gouas L. (2008) Pronostic de la leucémie lymphoïde chronique : mise au point sur les facteurs biologiques récents. Ann Biol Clin ; 66 (4) : 371-7 - Vilmer E, Dhedin N. (2002) Leucémie aigue lymphoblastique. Rev du prat. paris ; 52 :213-217. - Witte KE, Ahlers J, Schäfer I, Andre M, Kerst G et al. (2011) High proportion of leukemic stem cells at the diagnosis is correlated with unfavorable prognosis in childhood acute myeloid leukemia. Pediatr Hematol Oncol; 28: 91-99. J. sci. pharm. biol., Vol.14, n°2- 2013 N’GUESSAN-BLAO AR & al. : Immunophenotypage des leucémies lymphoides B © EDUCI 2013.