test de détection des contaminants fongiques des grains de riz en fin

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Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 2004, 143, 39-50
TEST DE DÉTECTION DES CONTAMINANTS
FONGIQUES DES GRAINS DE RIZ EN FIN DE
CYCLE VÉGÉTATIF(*)
L. GNANCADJA-ANDRÉ ( 1 ) , A. OUAZZANI TOUHAMI
A. BADOC ( 2 ) , A. DOUIRA ( 1 )
(1)
,
Les méthodes du buvard et du buvard modifiée ne permettent
pas la détection de toutes les espèces contaminant les grains de
Riz récoltés en fin de cycle végétatif des plants. Les espèces
dominantes gênent la visualisation des espèces qui sporulent
faiblement. De plus, même en disposant d’un microscope
stéréoscopique, l’identification n’est pas évidente entre Pyricularia
oryzae et Cladosporium.
C’est pourquoi la méthode du buvard a été complétée d’une
observation des spores, grain par grain, après agitation dans de
l’eau distillée. Ainsi, la mycoflore des cultivars de Riz ‘Arco’ et
‘Thaibonnet’ a pu être précisément définie. Les espèces les plus
fréquentes sont Alternaria alternata, Fusarium moniliforme et
Epicoccum nigrum.
(*)
(1)
(2)
Manuscrit reçu le 24 septembre 2004.
Laboratoire de Botanique et de Protection des Plantes, Département de Biologie,
Faculté des Sciences, BP 133, Université Ibn Tofaïl, 14000 Kénitra, Maroc.
[email protected], [email protected], [email protected]
Laboratoire de Mycologie et Biotechnologie végétale, GESVAB – EA 3675,
Faculté des Sciences pharmaceutiques, Université Victor-Segalen Bordeaux 2,
146, rue Léo-Saignat, 33076 Bordeaux Cedex. [email protected]
40
INTRODUCTION
Le Riz est affecté par plusieurs maladies fongiques comme le
gigantisme (Fusarium moniliforme), la maladie des taches brunes
(helminthosporiose), la pyriculariose, la décoloration des grains (complexe
de champignons) et la maladie des chaumes (complexe de champignons
imparfaits) [4].
La plupart des agents pathogènes sont capables de provoquer de
sévères dégâts en plein champ après le semis [21]. Certains d’entre eux
affectent la qualité des semences [18]. Les parasites trouvent un refuge
favorable dans les grains, qui deviennent un vecteur des maladies.
Pour lutter efficacement contre ces microorganismes, il faut prendre
en compte l’état initial des grains à conserver ou consommer,
l’identification des contaminants et leurs particularités biologiques.
Deux méthodes complémentaires sont utilisées pour étudier la
mycoflore du Riz, celle du buvard et celle du buvard modifiée [8,16].
La méthode du buvard consiste à tester 200 grains à raison de 25
grains par boîte de Petri, régulièrement placés sur trois rondelles de papier
filtre humidifié avec de l’eau distillée stérile [32]. Après incubation 8 jours à
22°C avec une alternance de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité,
les grains sont examinés au microscope optique.
La méthode du buvard modifiée consiste à compléter la méthode
précédente en repiquant après l’incubation de 8 jours les grains sur milieu
PDA (Potato Dextrose Agar) et en incubant 6 jours à 28°C et à l’obscurité.
Les champignons qui se sont développés sont alors observés [9].
Lorsque les grains de Riz sont colonisés par les helminthosporiums
et les champignons saprophytes, ces méthodes ne permettent pas d’observer
et d’isoler Pyricularia oryzae.
Pyricularia oryzae se signale par de petites taches grises ou
verdâtres sur les glumelles, correspondant à des conidiophores courts
portant de petits amas de conidies [16]. Sous microscope, ce champignon
peut être confondu avec Cladosporium et sur milieu de culture, il est
toujours dominé par certains saprophytes.
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Afin d’améliorer la distinction entre les espèces, la méthode du
buvard a été doublée d’une observation des spores après agitation des grains
un à un dans l’eau distillée.
MATÉRIEL ET MÉTHODES
Matériel végétal
Des pieds de Riz de deux variétés, ‘Arco’ et ‘Thaibonnet’, ont été
prélevés dans les rizières de la région de Larache, au Nord du Maroc en
2000, entre fin août et septembre, époque correspondant au stade de
maturation. Les prélèvements sont réalisés au hasard selon la technique
d’échantillonnage en diagonale décrite par Matsushima [22].
Les caryopses infectés naturellement, présentant à leur base ou à leur
sommet des taches brunes à brun foncé, ont été retenus.
Méthode du buvard non modifiée
La méthode du buvard non modifiée, recommandée dans le cadre des
règles internationales pour l’analyse des semences [3], a été appliquée. Elle
consiste à tester 400 grains à raison de 25 grains par boîte de Petri de 90 mm
de diamètre. Les grains, qui n’ont subi aucun traitement préliminaire, sont
répartis sur deux rondelles de papier filtre de 90 mm de diamètre déposées
les unes sur les autres et humidifiées avec de l’eau distillée stérile après le
dépôt des grains. Ces derniers sont placés sur trois cercles, à raison de 15 à
la périphérie, puis 9, et 1 au centre. Après huit jours d’incubation à 22°C
sous une photopériode de 12 heures, les grains sont examinés à l’aide d’un
microscope stéréoscopique pour observer la présence des champignons. Il
s’agit de microscopes conçus pour une utilisation en continu avec un grand
champ de vision et une excellente qualité d'image. Les microscopes de la
série E, modèles EP, ES et EL, par exemple, sont pourvus d'une tourelle
avec quatre objectifs achromatiques (permettant une correction des
couleurs), d’une tête binoculaire inclinée à 45° tournant sur 360° et munie
d'un réglage dioptrique. L'écart interpupillaire est réglable de 52 à 75 mm.
Les oculaires ont un grand champ (10 x /23). La détermination se fait par
observation des spores, individuelles ou groupées, sans coloration
particulière.
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Test d’observation des spores
Pour compléter la méthode du buvard non modifiée et mettre en
évidence toutes les conidies qui se développent sur un grain infecté donné,
chaque grain, pris individuellement, a été placé dans un tube à essai
contenant 1 ml d’eau distillée stérile. Ces tubes sont agités au vortex de
manière à détacher les spores. La richesse de la suspension sporale ainsi
obtenue est observée sous microscope optique (grossissement x 100) après
dépôt d’une ou deux gouttes de cette suspension entre lame et lamelle.
Toutes les spores susceptibles de se trouver sur les grains sont observées
minutieusement et identifiées. Les spores apparaissent bien détachées et
peuvent présenter des caractéristiques permettant de les différencier (spores
opaques, hyalines, etc.). Cette technique permet aussi d’observer des
bactéries, des nématodes, des acariens… Quatre répétitions sont réalisées
pour chaque variété de Riz testée.
Calculs
Le taux de contamination est calculé selon la procédure décrite par
Ponchet [27]. Ce taux représente le nombre de chaque microorganisme isolé
par 100 grains pour chaque variété, établi par la méthode du buvard
complétée par l’observation grain par grain des spores.
L’évaluation statistique des données a porté sur l’analyse de la
variance et le test de Newman-Keuls (SNK) au seuil de 5 %.
RÉSULTATS
La récupération des spores dans de l’eau distillée stérile et leur
observation au microscope permet de détecter facilement certains
champignons qui prêtent confusion ou qui n’arrivent pas à sporuler en
présence d’autres sur le milieu de culture.
Le test d’observation des spores est efficace pour la détection de
Pyricularia oryzae, qui peut se confondre sous microscope stéréoscopique
avec Cladosporium herbarum, un saprophyte commun. Chez Cladosporium,
les conidies sont groupées en structures en forme de brosse sur des
conidiophores plus longs et foncés, tandis que chez Pyricularia oryzae,
chaque conidie a un apex rétréci qui se distingue clairement à un
grossissement de 50 ou plus [5].
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Le test d’observation des spores des cultivars ‘Arco’ et ‘Thaibonnet’
a permis de distinguer treize espèces fongiques (Tableau I). Aucune
différence n’a été observée entre les deux variétés en ce qui concerne les
champignons hébergés.
Les espèces les plus fréquemment rencontrées sont Alternaria
alternata et Fusarium moniliforme. Pyricularia oryzae et Curvularia lunata,
sont significativement les moins fréquentes.
Tableau I :
Pourcentages moyens de contamination des grains de deux variétés de
Riz par différentes espèces fongiques suite au test d’observation des
spores.
Cultivars
‘Arco’
‘Thaibonnet’
Espèces
Alternaria alternata
100a
98a
Fusarium moniliforme
100a
94a
Epicoccum nigrum
72b
65b
Trichothecium sp.
48c
53c
Nigrospora oryzae
45c
35d
Helminthosporium oryzae
31d
27d
Helminthosporium spiciferum
23e
18e
Helminthosporium australiensis
15f
19e
Cladosporium herbarum
13f
17e
Helminthosporium sativum
12f
15e
Penicillium sp.
12f
3f
Curvularia lunata
7g
4f
Pyricularia oryzae
6g
2f
Deux résultats lus sur la même colonne sont significatifs s’ils ne sont affectés d’aucune
lettre en commun.
44
DISCUSSION ET CONCLUSION
Fusarium moniliforme, transmis régulièrement par les semences
provoque une décoloration des grains du Riz [7,30]. Sa fréquence
d’isolement importante indique qu’il peut contribuer à la réduction de la
qualité des grains [29]. Son action s’exerce pendant la germination,
l’émergence et la croissance des plantules [33]. Il a un fort pouvoir de
compétition et s’implante principalement dans l’embryon, mais aussi dans
les glumes, les glumelles et les pédicelles [20].
[25-26,28],
Selon Christensen [11], la prédominance inégale de certaines espèces
sur ou dans les grains dépendrait de l’interaction de facteurs écologiques.
Pour Delhate [12], le premier champignon ayant colonisé les grains prend la
position dominante et les espèces mineures ont une courte durée de vie. La
dominance d’Alternaria alternata et Fusarium moniliforme observée sur les
deux variétés de Riz pourrait s’expliquer de cette manière.
Les champignons isolés fréquemment à partir des grains de Riz
peuvent être des pathogènes mineurs ou majeurs [15] selon leur impact
économique.
Certains champignons détectés chez les deux variétés testées peuvent
s’attaquer aux parties aériennes. Des travaux ont montré que Curvularia
lunata [17], Helminthosporium spiciferum [14], H. australiensis [24] sont
capables de provoquer des symptômes foliaires typiques sur différentes
variétés de Riz.
Les maladies maculaires des feuilles sont non seulement provoquées
par des helminthosporiums mais également par d’autres champignons tels
qu’Alternaria, Trichothetium, Curvularia lunata [2]. Tous produisent des
altérations comparables et peuvent infecter non seulement les organes
foliaires, mais également, lors de la floraison, les pièces florales (glumes,
glumelles) d’où la contamination des grains. Curvularia lunata [24], espèce
présente dans les grains de plusieurs céréales, peut entraîner non seulement
une décoloration des caryopses de Riz, mais aussi des anomalies au niveau
de la germination, des brunissements et des dépérissements des plantules
issues des grains malades pré-germés. Nigrospora oryzae [2], très répandu
dans les pays rizicoles, peut attaquer les organes aériens. Il provoque chez le
Riz de petites taches brunes, claires ou foncées. Avec les Cladosporiums, il
peut conduire à la formation d’enduits foncés et noirs sur les limbes des
feuilles.
45
Les maladies maculaires des enveloppes sont extrêmement
communes et plusieurs champignons sont associés au syndrome de la
décoloration des glumes [2]. Un groupe de microorganismes responsables
comprend des champignons champêtres parasites infectant les grains avant
la récolte. Il comprend Alternaria alternata, A. padwikii, Fusarium
moniliforme,
Epicoccum
nigrum,
Nigrospora
sp.,
le
genre
Helminthosporium, Curvularia lunata, Pyricularia oryzae, Phoma sorghina,
etc. Les champignons agissent superficiellement et altèrent l’aspect du
paddy (caryopse enveloppé des glumes et glumelles), sans pour autant
intervenir sur le caryopse : Epicoccum nigrum, Nigrospora oryzae, etc.
D’autres pénètrent plus ou moins au travers des enveloppes et
arrivent à parvenir au contact des grains : Curvularia lunata, Alternaria
padwickii. Si les dommages enregistrés sur les grains sont souvent légers,
les grains attaqués deviennent néanmoins des vecteurs de champignons
parasites.
On trouve parmi les diverses espèces responsables de l’accentuation
de la décoloration des grains Fusarium moniliforme, Nigrospora oryzae,
Helminthosporium oryzae et Curvularia lunata. La décoloration aboutit à
une altération de leur qualité [13]. Le taux de germination se trouve ainsi
affecté et on observe une diminution de la vigueur des plantes ou leur
dépérissement [6]. Aluko [1] a signalé un taux d’infection dépassant 81 %
pour Helminthosporium oryzae, plus élevé que ce qui a été observé pour les
deux variétés de Riz testées.
Les champignons facteurs de décoloration peuvent prendre une
importance plus ou moins grande selon les conditions locales. Le
changement de coloration des grains serait dû soit à une haute activité
métabolique de l’organisme pathogène [31], soit à l’action directe ou
indirecte d’une ou plusieurs espèces ou de combinaisons de diverses
espèces ; cette action peut être directe lorsque les espèces cryptogamiques
font elles mêmes la synthèse des pigments. Avec ou sans élévation de
température, les pigments formés diffusent dans l’albumen du grain.
La détérioration des semences augmente quand les conditions
d’humidité et de température sont favorables au développement des microorganismes [10-11,19]. Lorsque les grains sont exposés à certains
microorganismes, les réactions de dégradation des lipides, source
importante d’énergie pour la germination des semences, peuvent avoir lieu.
Pyricularia oryzae profite de cette dégradation. Ce champignon est
bien connu par son attaque des grains dans les rizières marocaines. Sa
46
dissémination se fait par transport aérien de conidies formées sur les lésions
foliaires ou par l’eau d’irrigation. Neergaard [23] a démontré la transmission
de l’agent pathogène des feuilles aux plantes et observé qu’une infection
modérée au champ pouvait se traduire par 7 à 8 % d’infection des semences.
De même, Aluko [1] a signalé un taux d’infection des grains de Riz par
Pyricularia oryzae de l’ordre de 8 %, pourcentage similaire à nos résultats.
Pyricularia oryzae est une espèce difficilement détectable par la
méthode du buvard ou du buvard modifiée lorsque les grains sont infectés
par d’autres champignons [8,16]. La récupération des spores formées sur les
grains dans de l’eau distillée stérile et leur observation au microscope
permet de distinguer facilement cette espèce de Cladosporium herbarum,
dont les colonies ont un aspect similaire sous microscope stéréoscopique.
Plusieurs champignons peuvent se révéler utiles pour la lutte contre
certains parasites hébergés par les grains. En effet, Alternaria alternata,
Rhizopus nigricans, Penicillium expansum et Trichoderma viride participent
à la réduction de la contamination des grains du Riz par des
microorganismes et améliorent aussi leur pourcentage de germination
[24,28].
Plusieurs champignons isolés à partir des grains de Riz des deux
cultivars tels qu’Alternaria alternata, Epicoccum nigrum, Nigrospora
oryzae n’ont pas été encore suffisamment bien étudiés au Maroc par rapport
à Fusarium moniliforme, Helminthosporium oryzae, H. spiciferum, H.
australiensis, H. sativum, Curvularia lunata, Pyricularia oryzae, considérés
comme des pathogènes foliaires du Riz. Même si on suppose qu’ils ne
provoquent pas de dégâts importants au niveau des parties aériennes, ces
espèces sont connues comme des agents de décoloration des semences et
peuvent également affecter leur pouvoir germinatif.
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50
ABSTRACT
Test for detecting fungal contaminants of rice grains at the end of the
vegetative cycle
The blotting or modified blotting methods do not allow the detection
of all species contaminating rice grains harvested at the end of the
vegetative plant cycle. Visualisation of the weakly sporulating species is
impeded by the predominance of the dominant species. Even with a
stereoscopic microscope, it is difficult to distinguish between Pyricularia
oryzae and Cladosporium.
For this reason, the blotting method was enhanced by observation of
spores grain by grain after agitation in distilled water. In this way, the
mycoflora of ‘Arco’ and ‘Thaibonnet’ rice cultivars could be precisely
defined. The most frequent species were Alternaria alternata, Fusarium
moniliforme and Epicoccum nigrum.
Key-words: blast disease, mycoflora, Oryza sativa, rice.
__________