fongiscreen® 4h 56504
Transcription
fongiscreen® 4h 56504
FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESTS RAPID IDENTIFICATION OF THE PRINCIPAL YEASTS OF MEDICAL IMPORTANCE IVD 1- CLINICAL VALUE In view of the incresing incidence of fungal infections over recent years, essentially due to the frequent use of topical antibacterial agents, broad spectrum antibiotics and invasive techniques (catheters, parenteral nutrition), microbiology laboratories are increasingly frequently asked to look for yeasts in pathological specimens. A rapid and precise diagnosis is sometimes necessary in order to commence appropriate treatment, especially in immunodepressed subjects. Fongiscreen® 4H, a system based on the study of the enzymatic profile, satisfies this demand as it is able to identify, within 4 hours: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, yeasts which represent about 90% of the isolates and Cryptococcus neoformans. It also guides the diagnosis of other yeasts whose identification is completed by studying sugar utilisation with the AUXACOLOR® 2 kit (code 56513). 2- PRINCIPLE OF THE TEST The test is based on the use of dehydrated substrates by prerformed fungal enzymes, resulting in a colour change either spontaneously or after addition of a revelator reagent. NATURE OF THE TESTS USED • TTZ medium This medium contains Triphenyltetrazolium (TTZ). The reduction of TTZ results in the formation of a more or less intense pink colour, depending on the species. • PAP medium This medium contains an enzymatic substrate allowing detection of proline aminopeptidase activity. • Urea + Trehalose medium (Ur./tre) This medium allows the detection of urease activity, reflected by alkalinisation of the medium with a colour change from green to blue of the pH indicator (Bromothymol Blue). The metabolism of trehalose results in acidification with colour change of the indicator from green to yellow. • BGL medium This medium contains an enzymatic substrate : p. Nitrophenyl-N-Acetyl-BD-Galactosaminide, allowing demonstration of galactosaminidase. This 2 test is more sensitive than the germtube test for the identification of C. albicans (variable sensitivity according to different authors). • AGL medium It allows the detection of a-glucosidase activity. • HAP medium It allows the detection of L-Histidine aminopeptidase activity. The BGL and AGL tests are performed in an acidic medium. Reading of the result requires revelation using an alkaline reagent (BGL/AGL reagent). The HAP test is read after revelation with the HAP reagent. The test is read after incubation for 4 hours at 37°C without CO2. 3- COMPOSITION OF THE KIT FONGISCREEN® 4H includes: • Microplate : 10 individually packaged 6-well microplates (diagram of the microplate is indicated on the label). • Suspension medium : 10 ready for use suspension media (1 ml) • 1 vial of AGL/BGL reagent (3 ml) • 1 vial of HAP reagent (2ml) • 10 micropipettes • 10 adhesive films Each microplate is individually packaged under seal-foiled aluminum bag with an adhesive film and a dessicant. DIAGRAM OF THE MICROPLATE FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : .............................................................. Date : ................................................................. 3 Precautions of use / Health and safety instructions: This kit contains dangerous reagents. • 3 ml vial of AGL/BGL reagent containing 4% of NaOH 1N. R 34 : Causes burns. S 26-37/39-45 : In case of contact with eyes, rinse immediately with plenty of water and seek medical advice. Wear suitable gloves and eye/face protection. In case of C - Corrosive accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show the label where possible). • 2 ml vial of HAP reagent containing 66,5% of 95° ethanol . R 11 : Highly flammable. S 7-16 : Keep container tightly closed. Keep away from sources of ignition - No smoking. 4- STORAGE Reagents, stored at +2 - 8°C, are stable until the expiry date indicated on the label (even once open). ... 5- MATERIAL REQUIRED BUT NOT SUPPLIED .... .... • Opacity control 6 Mac Farland: code 56499 ... • Incubator at 37°C 6- PROCEDURE A)INOCULATION OF THE MICROPLATE • Important : the opacity of the suspension must be Suspension medium 100 µl or 3 drops • Using a pure and fresh culture on Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol, and/or Gentamicin medium with a sufficient quantity of yeasts to obtain an opacity greater than that of the opacity control (code 56499) : in practice, 4 to 5 loops if possible. at least equal to that of the opacity control • which defines the minimum level of turbidity. • Homogenise the suspension using the micropipette (or vortex if necessary), by aspirating and expelling the contents of the vial several times. 4 TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP • Collect the inoculum with the micropipette and distribute 3 drops (100 µl) into each of the wells of the microplate. • Cover the microplate with adhesive and incubate for 4 hours at 37°C. B) READING OF THE RESULTS • Remove the adhesive. • Read the TTZ, PAP, Urea/trehalose results. • Add 2 drops of BGL/AGL reagent into the BGL and AGL wells. - read the BGL test immediately - for the AGL test, the colour develops over 15 to 30 seconds. • Add 2 drops of HAP reagent to the HAP well. The colour develops over 15 to 30 seconds. TABLE OF RESULTS TESTS NEGATIVE TTZ COLOURLESS POSITIVE PROCEDURE PALE PINK or DIRECT READING (without addition of reagents) DARK PINK depending on the species PAP COLOURLESS YELLOW UR./TRE GREEN BLUE (alkalinisation) or YELLOW (acidification) depending on the species BGL COLOURLESS YELLOW Add 2 drops of BGL/AGL reagent. The colour appears immediately (i.e. read immediately) AGL COLOURLESS YELLOW Add 2 drops of BGL/AGL reagent. The colour develops over 15 to 30 seconds. HAP COLOURLESS YELLOW Add 2 drops of HAP reagent. The colour develops over 15 to 30 seconds. * The colour change to blue (alkalinisation of the medium) is associated with metabolism of urea (Urea(+), Trehalose(+) or (-) strains); if a strain is both Urea(+) and Trehalose(+), alkalinisation is predominant (change to blue). The colour change to yellow (acidification of the medium) is associated with the metabolism of Trehalose (Trehalose(+), Urea(-) strains. 5 7- INTERPRETATION OF THE RESULTS • Compare the profile obtained with the specific profiles (cf. Table A); the discriminant features are indicated in bold letters. • If the profile is different, consider the PAP and urea tests and refer to the corresponding paragraphs. a) Legends + +/+(-) -(+) : : : : : positive test negative test variable test positive test in at least 90% of cases negative test in at least 90% of cases b) Specific profiles TABLE A TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Green or Yellow + + +/- Candida albicans + - Yellow (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis +/- - Yellow - - + Candida glabrata +/- - Blue - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Only a frankly positive test (yellow) immediately identifies Candida tropicalis. In the case of a doubtful result (greenish colour) or negative result, the identity of the strain must be confirmed (differential diagnosis with certain strains of AGL + Saccharomyces cerevisiae). (2) A pale yellow discolouration may sometimes be observed. 6 c) Other profiles 1- PAP+ and Urea- yellow species green or yellow TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Green or Yellow - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Green or Yellow - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- PAP- and Species Urea- colourless species green TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Additional observations +/- - Green - - +(-) / +/- - Green - - +(-) Dry appearance of colonies +/- - Green - - +(-) Arthrospores +/- - Green - +/- +(-) / Species Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Candida krusei Geotrichum species Saccharomyces cerevisae 7 3- Urea+ and HAP+ blue TTZ PAP UR./TRE yellow BGL AGL HAP Additional observations capsula - +/- +/- Blue species +/- +/- + { + - - pigment -ation - + - Species arthros -pores - Crypto -coccus species - Rhodo -torula species + Tricho -sporon cutaneum A positive test generally corresponds to a yellow colour on the BGL and AGL tests; an orange or pink colour may be observed with Trichosporon cutaneum, and is specific to this species. In addition, colonies of T. cutaneum have a filamentous appearance. 8- PERFORMANCES According to studies from Pasteur Institut in Paris and Broussais hospital in Paris, FONGISCREEN ® 4H allows identification in four hours of C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. neoformans and orientation of the diagnosis for other yeasts. A retrospective clinical study has been established on a panel of 146 strains, representing 23 species of yeasts. FONGISCREEN® 4H permits to detect 100% of C. albicans strains (18 tested strains), C. glabrata (24 strains), and C. neoformans (11 strains) and 94% of C. tropicalis strains (18 tested strains). For these 4 strains, specificity of the test was 100%. Other yeast species can be classified in 3 groups, according to a distinctive, but not specific, profil of the species (for 99% of the strains). 8 9- LIMITS OF THE PROCEDURE • BGL test sometimes takes a very pale yellow color difficult to interpret, in particular for C. tropicalis strain. • Some rare strains of C. tropicalis Trehalose (-) can be wrongfully identified as S. cerevisiae. 10- QUALITY CONTROL OF THE MANUFACTURER All manufactured reagents are prepared according to our Quality System, starting from reception of raw material to the final commercialization of the product. Each lot is submitted to quality control assessments and is only released to the market, after conforming to pre-defined acceptance criteria. The records relating to production and control of each single lot are kept within Bio-Rad. 11- REFERENCES See French version. 9 10 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESTS IDENTIFICATION RAPIDE DES PRINCIPALES LEVURES D’INTÉRÊT MÉDICAL IVD 1- INTÉRÊT CLINIQUE Etant donné la recrudescence des infections fongiques ces dernières années, dues notamment à l'utilisation fréquente de topiques antibactériens, d'antibiotiques à large spectre et de techniques invasives (cathéters, nutrition parentérale), la recherche des levures dans les produits pathologiques est de plus en plus demandée au laboratoire. Un diagnostic rapide et précis est parfois nécessaire en vue d'instaurer un traitement adapté, surtout chez les sujets immunodéprimés. Fongiscreen® 4H, système fondé sur l'étude d'un profil enzymatique, répond à cette demande puisqu'il permet d'identifier en 4 heures : Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, levures qui représentent environ 90 % des isolements, et Cryptococcus neoformans. Il permet aussi une orientation pour le diagnostic d'autres levures dont l'identification sera alors complétée par l'étude de l'assimilation des sucres avec la galerie AUXACOLOR® 2 (code 56513). 2- PRINCIPE Il repose sur l'utilisation de substrats deshydratés par les enzymes fongiques préformées, ce qui se traduit par un changement de couleur, soit spontanément, soit après addition d'un réactif révélateur. NATURE DES TESTS UTILISÉS • Milieu TTZ Ce milieu contient du Triphényltétrazolium (TTZ). La réduction du TTZ se traduit par l'apparition d'une coloration rose plus ou moins intense en fonction de l'espèce. • Milieu PAP Il contient un substrat enzymatique permettant de détecter l'activité proline aminopeptidase. • Milieu Urée + Tréhalose (Ur. / tre) Ce milieu permet de détecter l'activité uréasique qui se traduit par une alcalinisation du milieu avec virage du vert au bleu de l'indicateur de pH (Bleu de Bromothymol). Le métabolisme du tréhalose entraîne lui, une acidification avec virage de l'indicateur du vert au jaune. 12 • Milieu BGL Il contient un substrat enzymatique : le P.Nitrophényl-N-Acétyl-B-DGalactosaminide permettant la mise en évidence de la galactosaminidase. La sensibilité de ce test est supérieure à celle du test de germination pour l'identification de C. albicans (sensibilité variable selon les auteurs). • Milieu AGL Il permet de détecter l'activité α - glucosidase. • Milieu HAP Il permet de détecter l'activité L-Histidine amino peptidase. Les tests BGL et AGL sont réalisés en milieu acide. La lecture du résultat nécessite une révélation à l'aide d'un réactif alcalin (réactif BGL/AGL). Le test HAP est lu après révélation à l'aide du réactif HAP. La lecture est réalisée après incubation pendant 4 heures à 37°C sans CO2. 3- COMPOSITION DU COFFRET FONGISCREEN® 4H comprend : • Microplate : 10 microplaques de 6 cupules sous emballage individuel (le schéma des 16 cupules est reproduit sur une étiquette). • Suspension medium :10 milieux de suspension de 1 ml • 1 flacon réactif AGL/BGL de 3 ml • 1 flacon réactif HAP de 2 ml • 10 micropipettes • 10 adhésifs Chaque microplaque est conditionnée sous sachet individuel en aluminium avec un adhésif et un sachet déshydratant. Schéma de la microplaque FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : .............................................................. Date : ................................................................. 13 Précautions d’utilisation / Consignes d’hygiène et de sécurité : Ce kit contient des réactifs classés dangereux. • Un flacon de 3 ml de réactif AGL/BGL contenant 4% de NaOH 1N. R 34 : provoque des brûlures. S 26-37/39-45 : En cas de contact avec les yeux, laver immédiatement et abondamment avec de l'eau et consulter un C - Corrosif spécialiste. Porter des gants appropriés et Porter un appareil de protection des yeux/du visage. En cas d'accident ou de malaise consulter immédiatement un médecin (si possible lui montrer l'étiquette). • Un flacon de 2 ml de réactif HAP contenant 66,5% d’éthanol à 95°. R 11 : Facilement inflammable. S 7-16 : Conserver le récipient bien fermé. Conserver à l'écart de toute flamme ou source d'étincelles - Ne pas fumer. 4- CONSERVATION Les réactifs, conservés à +2-8°C, sont stables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le coffret (y compris après ouverture). ... .... 5- MATÉRIEL NÉCESSAIRE NON FOURNI .... ... • Opacity control 6 Mac Farland : code 56499 • Etuve à 37°C. 6- MODE OPÉRATOIRE A) INOCULATION DE LA MICROPLAQUE 14 Milieu de suspension 100 µl ou 3 gouttes • A partir d'une culture pure et fraîche sur milieu Sabouraud, ou Sabouraud Chloramphénicol, et/ou Gentamicine, ensemencer le milieu de suspension avec une quantité de levures suffisante pour obtenir une opacité supérieure au témoin d'opacité (Opacity control 6 Mac Farland, code 56499) en pratique 4 à 5 öses si possible. • Important : L'opacité de la suspension doit être au moins égale à celle du témoin d'opacité qui définit le seuil de turbidité minimum. • Homogénéiser la suspension à l'aide de la micropipette (ou vortexer si nécessaire) en aspirant et en refoulant à plusieurs reprises le contenu du flacon. TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP • Prélever l'inoculum avec la micropipette et distribuer 3 gouttes (100 µl) dans chacune des cupules de la microplaque. • Recouvrir la microplaque avec l'adhésif et incuber 4 heures à 37°C. B) LECTURE DES RÉSULTATS • Décoller l'adhésif • Lire les tests TTZ, PAP, Urée/tréhalose • Ajouter 2 gouttes de réactifs BGL/AGL dans les cupules BGL et AGL. - lire le test BGL immédiatement - pour le test AGL, la coloration se développe en 15 à 30 secondes. • Ajouter 2 gouttes du réactif HAP dans la cupule HAP; la coloration se développe en 15 à 30 secondes. TABLEAU DES RÉSULTATS TESTS NÉGATIFS POSITIFS TTZ INCOLORE rose pale ou rose franc selon l’espèce PROCÉDURE LECTURE DIRECTE (sans addition de réactifs) PAP INCOLORE JAUNE UR./TRE VERT BLEU (alcalinisation) ou JAUNE (acidification) selon espèce BGL INCOLORE JAUNE Ajouter 2 gouttes du réactif BGL/AGL La coloration apparaît immediatement (ne pas différer la lecture) AGL INCOLORE JAUNE Ajouter 2 gouttes du réactif BGL/AGL La coloration se developppe en 15 à 30 secondes. HAP INCOLORE JAUNE Ajouter 2 gouttes du réactif HAP La coloration se developpe en 15 à 30 secondes. * Le virage au bleu (alcalinisation du milieu) est associé au métabolisme de l’urée (souches urée(+), Tréhalose(+) ou (-)); si une souche est à la fois urée(+) et Tréhalose(+), l’alcalinisation se manifeste prioritairement (virage au bleu). Le virage au jaune (acidification du milieu) est associé au métabolisme du Tréhalose (souche Tréhalose(+), urée(-)). 15 7- INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS • Comparer le profil obtenu avec les profils spécifiques (cf. tableau A), les caractères discriminants apparaissant en caractères gras. • Si le profil est différent, considérer les tests PAP et urée et se référer aux paragraphes correspondants. a) Légendes + +/+(-) -(+) : : : : : test test test test test positif négatif variable positif dans au moins 90 % des cas négatif dans au moins 90 % des cas b) Profils spécifiques tableau A TTZ PAP UR./TRE BGL AGL +/- + + - +/+/- HAP Vert ou Jaune + + +/- Candida albicans Jaune (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis - Jaune - - + Candida glabrata - Bleu - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Seul un test franchement positif (jaune) permet de conclure immédiatement à Candida tropicalis. Dans le cas d'un résultat douteux (coloration verdâtre) ou négatif, il est nécessaire de confirmer l'identité de la souche (diagnostic différentiel avec certaines souches de Saccharomyces cerevisiae AGL+). (2) On peut parfois observer un léger voile jaune pâle. 16 c) Autres profils 1- Espèces PAP + et jaune Urée vert ou jaune TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Vert ou Jaune - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Vert ou Jaune - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- Espèces PAP - et jaune Espèces Urée vert ou jaune TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Observations Complément. Espèces +/- - Vert - - +(-) / +/- - Vert - - +(-) Aspect sec des colonies Candida krusei +/- - Vert - - +(-) Arthrospores Geotrichum species +/- - Vert - +/- +(-) / Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Saccharomyces cerevisae 17 3- Espèces Urée + et HAP + bleu TTZ PAP UR./TRE BGL jaune AGL HAP Observations complément. capsule - +/- +/- Bleu +/- +/- + { + - - pigment -ation - + - Espèces arthros -pores - Crypto coccus species - Rhodo -torula species + Tricho sporon cutaneum Un test positif se traduit par une coloration généralement jaune des tests BGL et AGL avec Trichosporon cutaneum, on peut observer une coloration orange ou rose, spécifique de cette espèce. De plus, les colonies de T. cutaneum apparaissent filamenteuses. 8- PERFORMANCES D’après des études réalisées à l’Institut Pasteur de Paris et à l’hôpital Broussais à Paris, la galerie FONGISCREEN® 4H permet d’identifier en 4 heures, C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis et C. neoformans et d’orienter le diagnostic pour d’autres levures. Une étude clinique rétrospective a été réalisée à l’aide d’un panel constitué de 146 souches, représentant 23 espèces de levures. La galerie FONGISCREEN® 4H a permis d’identifier 100% des souches de C. albicans (18 souches testées), C. glabrata (24 souches), et C. neoformans (11 souches) et 94% des souches de C. tropicalis (18 souches testées). Pour ces 4 espèces, la spécificité du test est de 100%. Les autres espèces de levures peuvent être classées en 3 groupes, selon un profil caractéristique de l’espèce (pour 99 % des souches), mais non spécifique. 18 9- LIMITES D'UTILISATION • Le test BGL a parfois une coloration jaune très pâle difficile à interpréter, en particulier pour la souche C. tropicalis. • Quelques rares souches de C. tropicalis Tréhalose (–) peuvent être faussement identifiées comme S. cerevisiae. 10- CONTRÔLE QUALITÉ DU FABRICANT Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un système d'assurance qualité de la réception des matières premières jusqu'à la commercialisation des produits finis. Chaque lot de produit fini fait l'objet d'un contrôle de qualité et n'est commercialisé que s'il est conforme aux critères d'acceptation. La documentation relative à la production et au contrôle de chaque lot est conservée par le fabricant. 11- RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. BH. COOPER, M. SILVA-HUTNER. Yeasts of Medical Importance. Manual of Clinical Microbiology. Fourth edition. 1985, 526-541 2. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. Rapid methods for identification of the most frequent clinical yeasts. Rev. Iberoam. Micol. 1997. 14:85-89 3. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. New developments in yeast and yeast-like organisms identification methods accessible to a clinical microbiology laboratory. (soumis à Clin. Microbiol. Rev.) 4. H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, V. LACASSAGNE, P. KERVROEDAN, P. AMBROISE-THOMAS, AND R. GRILLOT. Identification rapide de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans par Fongiscreen® 4H. Evaluation sur 191 souches de levures. J. Mycol. Med. 1993. 3:103-106. 5. R. GRILLOT. Les mycoses humaines : démarche diagnostique. Elsevier, Paris. 1996. 6. W. KELLEY. Rapid Identification of Candida albicans, abstr. C-337, p.384. Abstr 86th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1986. American Society for Microbiology. Washington D.C. 7. V. LAVARDE, M. COHEN, O. RONIN, P. KERVROEDAN, B. DUPONT. 1991. Abstr.1233, p.105 - 5th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases/Oslo 19 8. J.P. LEPARGNEUR, A. BOUCAYS. M.D. LINAS, J.P. SEGUELA. Profil enzymatique de levures d’intérêt médical - Essais préliminaires. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1985, XIV, N°2, p. 227-230. 9. M. MALLIE, B. MONTES, J.C. LEBECQ, J.M. BASTIDE. Etude du profil enzymatique de quelques levures. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1989, XVIII, N°1, p. 103-108. 20 FONGISCREEN® 4H 56504 10 PRUEBAS IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE LAS PRINCIPALES LEVADURAS DE INTERÉS MEDICO IVD 1- INTERÉS CLINICO Habida cuenta de la recrudescencia de las infecciones fúngicas durante los últimos años, concretamente debidas a la frecuente utilización de tópicos antibacterianos, antibióticos de amplio espectro y técnicas invasivas (catéteres, nutrición parenteral), la búsqueda de levaduras en los productos patológicos es cada vez más solicitada en laboratorio. A veces es necesario un diagnóstico rápido y preciso a fin de instaurar un tratamiento apropiado, sobre todo en los sujetos inmunodeficientes. FONGISCREEN ® 4H, un sistema basado en el estudio de un perfil enzimático, responde a esta demanda ya que permite identificar en 4 horas : Candida albicans, Candida glabrata. Candida tropicalis, levaduras que representan un 90% aproximadamente de los aislamientos y Cryptococcus neoformans. También permite una orientación para el diagnóstico de otras levaduras, cuya identificación se completará mediante el estudio de la asimilación de los azúcares con el estuche AUXACOLOR®2 (56513) 2- PRINCIPIO DELA PRUEBA El prueba se basa en la utilización de sustratos deshidratados por las enzimas fúngicas preformadas lo cual, se manifiesta por un cambio de color ya sea espontáneamente o bien, después de añadir un reactivo revelador. TIPO DE PRUEBAS UTILIZADAS • Medio TTZ Este medio contiene Trifeniltetrazolio (TTZ). La reducción del TTZ se evidencia por la aparición de una coloración rosa mas o menos intensa en función de la especie. • Medio PAP Contiene un sustrato enzimático que permite detectar la actividad prolina amoniopeptidasa. • Medio Urea + Trehalosa (Ur. / tre) Este medio permite detectar la actividad de ureasa que se manifiesta por una alcalinización del medio con viraje del indicador de pH del verde al azul (Azul de Bromotimol). El metabolismo de la trehalosa origina una acidificación con viraje del indicador de verde al amarillo. • Medio BGL Contiene un sustrato enzimático: el p. Nitrofenil-N-Acetil-B-D galactosaminida 22 que permite la puesta en evidencia de la galactosaminidasa. La sensibilidad de esta prueba es superior a la de la prueba de germinación para la identificación de C. albicans (sensibilidad variable según los autores). • Medio AGL Permite detectar la actividad a-glucosidasa. • Medio HAP Permite detectar la actividad L-Histidina aminopeptidasa Las pruebas BGL y AGL se realizan en medio ácido. La lectura del resultado precisa un revelado con un reactivo alcalino (reactivo BGL/AGL). La prueba HAP se lee después de revelado con el reactivo HAP. La lectura se realiza después de la incubación durante 4 horas a 37°C sin CO2. 3- COMPOSICIÓN DE LA CAJA FONGISCREEN® 4H contiene : • Microplate : 10 microplacas de 6 pocillos en embalaje individual (el diagrama de la microplaca está indicado en la etiqueta) • Suspension medium : 10 medios de suspensión, listos para su empleo (1ml) • 1 frasco reactivo AGL/BGL (3 ml) • 1 frasco reactivo HAP (2 ml) • 10 adhesivos • 10 micropipetas Cada microplaca está envasada individualmente en una bolsa sellada de hoja de aluminio con una película adhesiva y un desecante. ESQUEMA DE LA MICROPLACA FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : .............................................................. Date : ................................................................. 23 Precauciones de utilización / Recomendaciones de higiene y seguridad : Este estuche contiene reactivos peligrosos. • 1 frasco reactivo AGL/BGL (3 ml) que contiene 4% de NaOH 1N. R 34 : Provoca quemaduras. S 26-37/39-45 : En caso de contacto con los ojos, lávense inmediata y abundantemente con agua y acúdase a un médico. Úsense guantes adecuados y protección para los ojos/la cara. C - Corrosivo En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). • 1 frasco reactivo HAP (2 ml) que contiene 66,5% de etanol al 95° . R 11 : Fácilmente inflamable. S 7-16 : Manténgase el recipiente bien cerrado. Conservar alejado de toda llama o fuente de chispas - No fumar. 4- CONSERVACIÓN Los reactivos conservados a +2-8°C son estables hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta (incluso una vez abiertos). 5- MATERIAL NECESARIO NON SUMINISTRADO ... .... .... ... • Opacity control 6 Mac Farland: código 56499 • Incubador a 37°C 6- MODO OPERATIVO • A partir de un cultivo puro y fresco en medio de Sabouraud, o Sabouraud + cloranfenicol, y/o Gentamicina, sembrar el medio de suspensión con una cantidad de levaduras suficiente para obtener una opacidad superior al testigo de opacidad (Opacity control 6 Mac Farland, código 56499), en la práctica de 4 a 5 dosis si fuera posible. • Importante : La opacidad de la suspensión debe ser equivalente como múnimo a la del testigo de opacidad que define el umbral mínimo de turbidez. 24 Medio de suspensión 100 µl o 3 gotas A) INOCULACION DE LA MICROPLACA TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP • Homogeneizar la suspensión con la micropipeta (o utilizar el vortex si fuerte necesario) aspirando y expulsando varias veces el contenido del frasco. • Extraer el inóculo con la micropipeta y distribuir 3 gotas (100 µl) en cada una de los pocillos de la microplaca. • Cubrir la microplaca con el adhesivo e incubar 4 horas a 37°C. B) LECTURA DE LOS RESULTADOS Despegar el adhesivo • Leer ls pruebas TTZ, PAP, Urea/trehalosa. • Añadir 2 gotas de reactivos BGL/AGL en los pocillos BGL y AGL. - Leer la prueba BGL inmediatamente - Para la prueba AGL, la coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos. • Añadir 2 gotas del reactivo HAP en la cúpula HAP ; la coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos. TABLA DE RESULTADOS PRUEBA NEGATIVOS TTZ INCOLORO POSITIVOS PROCEDIMIENTO ROSA CLARO o ROSA FUERTE según la especie LECTURA DIRECTA (sin adición de reactivos) PAP INCOLORO AMARILLO UR./TRE VERDE AZUL (alcalinización) o AMARILLO (acidificación) según especie BGL INCOLORO AMARILLO Añadir 2 gotas del reactivo BGL/AGL. La coloración aparece inmediatamente (realizar la lectura inmediatamente) AGL INCOLORO AMARILLO Añadir 2 gotas del reactivo BGL/AGL. La coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos. HAP INCOLORO AMARILLO Añadir 2 gotas del reactivo HAP. La coloración se desarrolla en 15 a 30 segundos. * El viraje al azul (alcalinización del medio) esta asociado con el metabolismo de la urea (cepas urea (+), Trehalosa (+) o (-)), si una cepa es a la vez Urea (+) y Trehalosa (+), la alcalinización se manifiesta prioritariamente (viraje al azul). El viraje al amarillo (acidificación del 25 medio) esta asociado con el metabolismo de la Trehalosa (cepas Trehalosa (+), urea (-)). 7- INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS • Comparar el perfil obtenido con los perfiles específicos (ver cuadro A), los caracteres discriminantes aparecen en negrilla. • Si el perfil es diferente, considerar las pruebas PAP y Urea y remitirse a los apartados correspondientes. a) Textos + + +/+(-) -(+) : : : : : : prueba prueba prueba prueba prueba prueba positiva positiva negativa variable positiva en al menos un 90% de los casos negativa en al menos un 90% de los casos b) Características específicas TABLA A TTZ PAP UR./TRE BGL AGL +/- + + - +/+/- HAP Verde o amarillo + + +/- Candida albicans Amarillo (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis - Amarillo - - + Candida glabrata - Azul - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Sólo una prueba claramente positiva (amarillo) permite concluir inmediatamente en Candida tropicalis. En caso de resultados dudoso (coloración verdosa) o negativo, es necesario confirmar la identidad de la cepa (diagnóstico diferencial con ciertas cepas de Saccharomyces cerevisiae AGL+). (2) A veces puede observarse una ligera coloración amarillo claro. 26 c) Otras características 1- Especies PAP+ y amarillo Ureaverde o amarillo TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP ESPECIES +/- + Verde o amarillo - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Verde o amarillo - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- Especies PAP- y incolora Ureaverde o amarillo TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP OBSERVACIONES COMPLEMENTARIAS ESPECIES +/- - Verde - - +(-) / +/- - Verde - - +(-) Aspecto seco de colonias Candida krusei +/- - Verde - - +(-) Artrosporas Geotrichum species +/- - Verde - +/- +(-) / Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Saccharomyces cerevisae 27 3- ESPECIES UREA + Y HAP + azul TTZ PAP UR./TRE BGL amarillo AGL HAP OBSERVACIONES complementarias cápsula - +/- +/- Azul +/- +/- + { ESPECIES pigment -ación artros -poras + - - - + - Cryptococcus Rhodoorula Trichosporon cutaneum - - + Una prueba positiva también se manifiesta por una coloración amarilla de las pruebas BGL y AGL; con Trichosporon cutaneum, puede observarse una coloración naranja o rosa, específica de esta especie. Además, las colonias de Trichosporon cutaneum aparecen filamentosas. 8- ESPECIFICACIONES Según los estudios del Instituto Pasteur de París y del hospital Broussais de París, FONGISCREEN® 4H permite la identificación en cuatro horas de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. neoformans, así como la orientación diagnóstica de otras levaduras. Un estudio clínico retrospectivo ha establecido un grupo de 146 cepas que representan 23 especies de levaduras. FONGISCREEN® 4H permite detectar el 100% de las cepas de C. albicans (18 cepas sometidas a prueba), C. glabrata (24 cepas), y C. neoformans (11 cepas) y el 94% de C. tropicalis strains (18 cepas sometidas a prueba). La especificidad de la prueba fue del 100% para estas 4 cepas Otras especies de levaduras se pueden clasificar en 3 grupos, de acuerdo con características distintivas, pero no específicas, de las especies (para el 99% de las cepas). 28 9- LÍMITES DE LA PRUEBA • La prueba BGL a veces adquiere un color amarillo claro difícil de interpretar, sobre todo con la cepa C. tropicalis. • Algunas cepas raras de C. tropicalis Trehalosa (-) se pueden identificar erróneamente como S. cerevisiae. 10- CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTE Todos los reactivos fabricados se elaboran conforme a nuestro sistema de calidad, que se extiende desde el momento de recepción de las materias primas hasta la comercialización del producto. Cada lote se somete a exámenes de control de calidad y únicamente se autoriza su introducción en el mercado tras cumplir los criterios de aceptación predefinidos. Bio-Rad conserva los expedientes relativos a la producción y el control de cada uno de los lotes. 11- BIBLIOGRAFIA Véase la versión francesa. 29 30 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESTS TESTKIT FÜR DIE SCHNELLE IDENTIFIZIERUNG DER WICHTIGSTEN, KLINISCH BEDEUTSAMEN HEFEN IVD 1- KLINISCHES INTERESSE Durch die in den letzten Jahren steigende Zahl von Pilzinfektionen, die hauptsächlich auf die häufige Anwendung von lokalen oder BreitbandAntibiotika sowie von invasiven Techniken (Katheter, Parenteralernährung) zurückzuführen ist, müssen in den mikrobiologischen Labors immer häufiger Hefebestimmungen an pathologischem Untersuchungsmaterial durchgeführt werden. In manchen Fällen ist eine schnelle und präzise Diagnose erforderlich, damit, vor allem bei immunsupprimierten Patienten, rasch mit einer geeigneten Therapie begonnen werden kann. FONGISCREEN® 4H ist speziell für diese Fälle geeignet: basierend auf der Untersuchung des Enzymprofils ermöglicht dieser Test innerhalb von 4 Stunden den Nachweis der in 90% aller Fälle isolierten Hefen Candida albicans, Candida glabrata und Candida tropicalis, sowie den Nachweis von Cryptococcus neoformans. Er liefert darüber hinaus eine Orientierungshilfe für die Identifizierung anderer Hefen, die anschließend im Zuckerassimilationstest mit dem AUXACOLOR® 2-System (Code 56513) genauer bestimmt werden können. 2- TESTPRINZIP Das Testprinzip beruht auf der Verwendung dehydrierter Substrate durch die jeweils vorhandenen Pilzenzyme. Spontan oder nach Zusatz eines Entwicklungsreagenzes tritt ein Farbumschlag auf. ENTHALTENE TESTS • TTZ-Nährboden Dieser Nährboden enthält Triphenyltetrazolium (TTZ). Bei Reduktion von TTZ tritt je nach Spezies eine mehr oder weniger intensive Rosafärbung auf. • PAP-Nährboden Enthält ein Enzymsubstrat zum Nachweis der Prolinaminopeptidase-Aktivität. • Harnstoff + Trehalose-Nährboden (Ur./Tre) Ermöglicht den Nachweis der Ureaseaktivität durch die Alkalisierung des Nährbodens mit Farbumschlag des pH-Indikators von grün nach blau (Bromthymolblau). Der Trehalosemetabolismus bewirkt eine Ansäuerung mit Indikatorumschlag von grün nach gelb. • BGL-Nährboden Enthält das Enzymsubstrat p-Nitrophenyl-N-Acetyl-ß-D-Galactosamid zum 32 Nachweis der Galactosamidase. Dieser Test für den Nachweis von C.albicans ist empfindlicher als der Keimschlauchtest (unterschiedliche Empfindlichkeitsangaben je nach Autor). • AGL-Nährboden Zum Nachweis der a-Glucosidase-Aktivität. • HAP-Nährboden Zum Nachweis der L-Histidinaminopeptidase-Aktivität. Die Tests BGL und AGL werden im sauren Bereich durchgeführt. Zur Ablesung der Ergebnisse muss als Farbentwickler ein alkalisches Reagenz (BGL/AGL-Reagenz) zugesetzt werden. Der HAP-Test wird nach Entwicklung durch das HAP-Reagenz abgelesen. Die Testauswertung erfolgt nach 4-stündiger Inkubation bei 37°C (ohne CO2). 3- ZUSAMMENSETZUNG DER TESTPACKUNG FONGISCREEN® 4H enthält : • Microplate : 10 einzeln verpackte Mikroplatten mit je 6 Vertiefungen (Schema der Mikroplatte siehe Etikett). • Suspension medium : 10 gebrauchsfertige Suspensionslösungen (1 ml) • 1 Fläschchen mit AGL/BGL-Reagenz (3 ml) • 1 Fläschchen mit HAP-Reagenz (2 ml) • 10 Mikropipetten • 10 Klebestreifen Jede Mikroplatte ist einzeln in einem versiegelten Aluminiumbeutel mit Klebefolie und Trockenmittel verpackt. SCHEMA DER MIKROPLATTE FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : .............................................................. Date : ................................................................. 33 Vorsichtsmaßnahmen / Gesundheits- und Sicherheitsvorschriften: Diese Testpackung enthält gefährliche Reagenzien. • 3 ml-Fläschchen mit AGL/BGL-Reagenz mit 4% NaOH 1N. R 34: Verursacht Verätzungen. S 26-37/39-45: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser abspülen und Arzt konsultieren. Bei der Arbeit geeignete Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz C - Ätzend tragen. Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt zuziehen (wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen). • 2 ml-Fläschchen HAP-Reagenz mit 66,5% 95° Ethanol. R 11: Leichtentzündlich. S 7-16: Behälter dicht geschlossen halten. Von Zündquellen fernhalten Nicht rauchen. 4- LAGERUNG Alle Reagenzien sind bis zu dem auf dem Etikett angegebenen Verfallsdatum stabil, wenn sie bei +2 - 8°C gelagert werden (selbst nach der Öffnung). ... .... 5- ZUSÄTZLICH WERDEN BENÖTIGT .... ... • Opacity control 6 Mac Farland: Kat. Nr. 56499 • Inkubator bei 37°C 6- ARBEITSANLEITUNG A)BEIMPFUNG DER MIKROPLATTE 34 Suspensionmedium 100 µl oder 3 Tropfen • Ausgehend von einer reinen und frischen Kultur auf Sabouraud-Nährboden bzw, Sabouraud + Chloramphenicol und/oder Gentamycin wird das Suspensionsmedium mit einer Hefemenge beimpft, ausreichend um eine Suspensionsdichte zu erhalten, deren Trübung stärker als die des Trübungsstandards (Opacity control 6 Mac Farland, Kat. Nr. 56499) ist: erfahrungsgemäß entspricht dies etwa 4-5 Impfösen. • WICHTIG : Die Trübung der Suspension muss mindestens der des Trübungsstandards entsprechen, da dieser nur die minimale Trübungsgrenze definiert. TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP • Die Suspension mit der Mikropipette durch mehrmaliges Ansaugen und Zurückfließen des Fläschcheninhalts homogenisieren (wenn nötig, mit dem Vortex mischen). • Das Inoculum mit der Mikropipette entnehmen und 3 Tropfen (100 µl) in jede Vertiefung der Mikroplatte pipettieren. • Die Mikroplatte mit dem Klebestreifen bedecken und 4 Stunden bei 37°C inkubieren. 2. ABLESEN DER ERGEBNISSE • Den Klebestreifen abziehen • Die Tests TTZ, PAP, Harnstoff/Trehalose ablesen. • Jeweils 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz in die Vertiefungen BGL und AGL geben. - den BGL-Test sofort ablesen - bei dem AGL-Test tritt der Farbumschlag nach 15 bis 30 Sekunden auf. • 2 Tropfen HAP-Reagenz in die HAP-Vertiefung geben; der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden auf. ERGEBNISTABELLE TESTS NEGATIV POSITIV DURCHFÜHRUNG TTZ FARBLOS HELLROSA oder KRÄFTIGES ROSA je nach Spezies PAP FARBLOS GELB UR./TRE GRÜN BLAU (Alkalisierung) oder GELB (Säuerung) je nach Spezies BGL FARBLOS GELB 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz zusetzen. Der Farbumschlag tritt sofort ein (sofort ablesen) AGL FARBLOS GELB 2 Tropfen BGL/AGL-Reagenz zusetzen. Der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden ein. HAP FARBLOS GELB 2 Tropfen HAP-Reagenz zusetzen. Der Farbumschlag tritt nach 15 bis 30 Sekunden ein. DIREKT ABLESEN (ohne Reagenzienzusatz) * Der Farbumschlag nach Blau (Alkalisierung des Nährbodens) ist auf den Harnstoffmetabolismus zurückzuführen (Stämme: Harnstoff (+), 35 Trehalose (+) oder (-)); ist ein Stamm gleichzeitig Harnstoff (+) und Trehalose (+), dominiert die Alkalisierung: Farbumschlag nach blau. Eine Gelbfärbung (Ansäuerung des Nährbodens) steht im Zusammenhang mit dem Trehalose-Metabolismus (Stämme: Trehalose (+), Harnstoff (-)). 7- AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE • Vergleich des gefundenen Testprofils mit den spezifischen Profilen der Tabelle A. Die für die Identifizierung entscheidenden Merkmale sind jeweils fett gedruckt. • Lässt sich das ermittelte Testprofil keinem der in der Tabelle A aufgeführten Profile zuordnen, sind für eine orientierende Bestimmung die Testergebnisse des PAP- bzw. Harnstofftests mit den entsprechenden Ergebnissen der unter c) aufgeführten Tabellen zu vergleichen. a) Zeichenerklärung + +/+(-) -(+) : : : : : positiver Test negativer Test variables Testergebnis in mindestens 90% der Fälle positiver Test in mindestens 90% der Fälle negativer Test b) Spezifische Profile TABELLE A TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Grün oder Gelb + + +/- Candida albicans + - Gelb (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis +/- - Gelb - - + Candida glabrata +/- - Blau - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Nur ein deutlich positives (gelb) Testergebnis gestattet den sofortigen Rückschluss auf das Vorhandensein von Candida tropicalis. Wenn das Ergebnis zweifelhaft (grünliche Färbung) oder negativ ist, muss eine Bestätigung der Stammidentität (Differentialdiagnose mit bestimmten AGL + Stämmen von Saccharomyces cerevisiae) vorgenommen werden. (2) Manchmal ist ein leichter, hellgelber Schleier zu beobachten. 36 c) Andere Profile 1- PAP+ und Harnstoff - gelb Spezies grün oder gelb TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + GRÜN ODER GELB - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + GRÜN ODER GELB - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- PAP - und Spezies Harnstoff - farblos Spezies grün TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Zusätzliche BEOBACHTUNGEN Spezies +/- - GRÜN - - +(-) / +/- - GRÜN - - +(-) Trockenes Aussehen Candida krusei der Kolonien +/- - GRÜN - - +(-) Arthrosporen +/- - GRÜN - +/- +(-) / Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Geotrichum-Spezies Saccharomyces cerevisae 37 3- HARNSTOFF + und HAP + SPEZIES blau TTZ PAP UR./TRE gelb BGL AGL HAP Zusätzliche Beobachtungen Kapseln - +/- +/- Blue +/- +/- + { + pigment -rung - Spezies Arthro -sporen - Cryptoc -occus -Spezies Rhodoorula -Spezies - - + - - + Tricho -sporon -cutaneum Ein positiver Test zeichnet sich im Allgemeinen durch Gelbfärbung der Tests BGL und AGL aus. Bei Trichosporon cutaneum kann eine für diese Spezies spezifische orange oder rosa Färbung beobachtet werden. Darüber hinaus sehen die Trichosporon cutaneum Kolonien ”faserig“ aus. 8- TESTEIGENSCHAFTEN Gemäß Studien des Pasteur-Instituts in Paris und im Broussais-Hospital in Paris ermöglicht FONGISCREEN® 4H innerhalb von vier Stunden die Identifizierung von C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis und C. neoformans und gibt eine Orientierungshilfe für die Diagnose anderer Hefen. Eine retrospektive klinische Studie wurde mit einem Panel von 146 Stämmen von 23 Hefespezies durchgeführt. Mit FONGISCREEN® 4H wurden 100% von C. albicans (18 getestete Stämme), C. glabrata (24 Stämme) und C. neoformans (11 Stämme) und 94% von C. tropicalis (18 getestete Stämme) nachgewiesen. Für diese 4 Stämme lag die Spezifität des Tests bei 100%. 38 Andere Hefespezies können nach einem charakteristischen, aber nicht spezifischen Profil der Spezies (für 99% der Stämme) in 3 Gruppen eingeteilt werden. 9- GRENZEN DES TESTS • Der BGL-Test nimmt gelegentlich eine sehr hellgelbe Farbe an, die nur schwer interpretierbar ist, insbesondere für C. tropicalis-Stämme. • Manche seltenen Stämme von C. tropicalis Trehalose (-) können fälschlicherweise als S. cerevisiae identifiziert werden. 10- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERS Alle Reagenzien unterliegen unserem Qualitätssicherungssystem, vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung der Produkte. Jede fertige Produktionscharge wird einer Qualitätskontrolle unterzogen und nur dann für den Markt freigegeben, wenn sie den vorgegebenen Abnahmekriterien entspricht. Die Produkt- und Kontrolldokumentation jeder einzelnen Charge wird bei Bio-Rad aufbewahrt. 11- LITERATUR Siehe Französische Version. 39 40 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TEST IDENTIFICAZIONE RAPIDA DEI PRINCIPALI LIEVITI DI RILEVANZA MEDICA IVD 1- INTERESSE CLINICO A causa dell’aumentata incidenza delle infezioni micotiche nel corso degli ultimi anni, dovute essenzialmente all’impiego frequente di farmaci antibatterici per uso topico, di antibiotici ad ampio spettro e di tecniche invasive (cateteri, alimentazione parenterale), ai laboratori di analisi microbiologiche viene sempre più di frequente richiesto di identificare i lieviti presenti nei campioni patologici. Una diagnosi rapida e precisa si rende talvolta necessaria per avviare un trattamento adeguato, specialmente in soggetti immunodepressi. Fongiscreen® 4H, un metodo basato sullo studio del profilo enzimatico, soddisfa questa richiesta in quanto è in grado di identificare, entro 4 ore : la Candida albicans, la Candida glabrata e la Candida tropicalis, lieviti che rappresentano il 90% circa degli isolati e il Cryptococcus neoformans. Il test consente inoltre di dirigere la diagnosi di altri lieviti che saranno completamente identificabili attraverso lo studio dell’utilizzo degli zuccheri mediante il kit AUXACOLOR® 2 (codice 56513). 2- PRINCIPIO DEL TEST Il test si basa sull’uso di substrati deidratati mediante enzimi fungini preformati, che danno origine a un cambiamento di colore spontaneo o in seguito all’aggiunta di un reagente rivelatore. NATURA DEI TEST IMPIEGATI • Terreno TTZ Questo terreno di coltura contiene trifeniltetrazolio (TTZ). La riduzione di TTZ comporta l’apparizione di un colore rosa più o meno intenso, secondo le specie. • Terreno PAP Questo terreno contiene un substrato enzimatico che consente la rivelazione dell’attività della prolina aminopeptidasi. • Terreno Urea + Trealosio (Ur./tre) Questo terreno consente la rivelazione dell’attività dell’ureasi, riflessa dall’alcalinizzazione del terreno con un cambiamento di colore dal verde al blu dell'indicatore di pH (blu di bromotimolo). Il metabolismo del trealosio causa l'acidificazione con un cambiamento di colore dell’indicatore da verde a giallo. • Terreno BGL Questo terreno di coltura contiene un substrato enzimatico, 42 il p. Nitrofenil-N-acetil-B-D-galattosamina, che consente di dimostrare la presenza di galattosaminidasi. Questo test è più sensibile del test di filamentazione (germ tube test) per l’identificazione della C. albicans (a causa, secondo certi autori, della sensibilità variabile). • Terreno AGL Consente la rivelazione dell’attività dell’á-glucosidasi • Terreno HAP Consente la rivelazione dell’attività della L-istidina aminopeptidasi I test su BGL e AGL sono eseguiti in un terreno acido. Per la lettura dei risultati è necessario procedere alla rivelazione mediante un reagente alcalino (reagente BGL/AGL). La lettura del test HAP è possibile dopo la rivelazione con il reagente HAP. La lettura del test viene eseguita dopo un’incubazione di 4 ore a 37°C in assenza di CO2. 3- COMPOSIZIONE DEL KIT FONGISCREEN® 4H comprende: • Microplate : 10 micropiastre da 6 pozzetti confezionate singolarmente (lo schema di composizione della micropiastra è indicato sull’etichetta). • Suspension medium : 10 mezzi di sospensione pronti per l’uso (1 ml) • 1 fiala di reagente AGL/BGL (3 ml) • 1 fiala di reagente HAP (2ml) • 10 micropipette • 10 pellicole adesive Ciascuna micropiastra è confezionata singolarmente in un sacchetto foderato di alluminio contenente una pellicola adesiva e un essiccante. SCHEMA DI COMPOSIZIONE DELLA MICROPIASTRA FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient: .............................................................. Date: ................................................................. 43 Precauzioni per l’uso / Istruzioni per la salute e la sicurezza: Il presente kit contiene reagenti pericolosi. • Una fiala di reagente AGL/BGL da 3 ml contiene il 4% di NaOH 1 N. R 34: Provoca ustioni. S 26-37/39-45: In caso di contatto con gli occhi, lavare immediatamente e abbondantemente con acqua e consultare C - Corrosivo un medico. Usare guanti adatti e proteggersi gli occhi/la faccia. In caso di incidente o di malessere consultare immediatamente il medico (se possibile, mostrargli l'etichetta). • Una fiala di reagente HAP da 2 ml contiene il 66,5% di etanolo a 95°. R 11: Facilmente infiammabile. S 7-16: Conservare il recipiente ben chiuso. Conservare lontano da fiamme e scintille - Non fumare. 4- CONSERVAZIONE I reagenti, conservati a +2-8°C, sono stabili fino alla data di scadenza indicata sulla targhetta (anche dopo l’apertura) 5- MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO • Opacity control 6 Mac Farland: codice 56499 • Incubatore con termostato a 37°C ... .... .... ... 6- PROCEDURA A)INOCULAZIONE DELLA MICROPIASTRA 44 Mezzi do sospensione 100 µl o 3 gocce • Mediante una coltura pura e fresca su terreno con Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol, e/o Gentamicina e una quantità di lieviti sufficiente a ottenere un'opacità superiore all’opacità di controllo (Opacity control 6 Mac Farland, codice 56499): in pratica 4 - 5 anse, se possibile. • Importante: l’opacità della sospensione deve essere almeno uguale a quella dell’opacità di controllo che definisce il livello minimo di torbidezza. • Omogeneizzare la sospensione mediante la micropipetta (o vortex se necessario), aspirando ed espellendo numerose volte il contenuto della fiala. TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP • Raccogliere l’inoculo con la micropipetta e dispensare 3 gocce (100 µl) in ciascun pozzetto della micropiastra. • Coprire la micropiastra con un foglio adesivo e incubare per 4 ore a 37 °C. B) LETTURA DEI RISULTATI • Rimuovere l’adesivo. • Leggere i risultati del TTZ, PAP e Urea/trealosio. • Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL nei pozzetti BGL e AGL. - leggere immediatamente il test BGL - per il test AGL, il colore si rivela in 15 - 30 secondi. • Aggiungere 2 gocce di reagente HAP nel pozzetto HAP. Il colore si rivela in 15 - 30 secondi. TABELLA DEI RISULTATI TEST NEGATIVO POSITIVO TTZ INCOLORE ROSA CHIARO o ROSA SCURO secondo le specie PROCEDURA LETTURA DIRETTA (senza aggiunta di reagenti) PAP INCOLORE GIALLO UR./TRE VERDE BLU (alcalinizzazione) o GIALLO (acidificazione) secondo la specie BGL INCOLORE GIALLO Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL. Il colore si manifesta immediatamente (cioè lettura immediata) AGL INCOLORE GIALLO Aggiungere 2 gocce di reagente BGL/AGL. Il colore si rivela in 15 - 30 secondi. HAP INCOLORE GIALLO Aggiungere 2 gocce di reagente HAP. Il colore si sviluppa in 15 - 30 secondi. * Il fatto che il colore diventi blu (alcalinizzazione del terreno) è associato con il metabolismo dell’urea (ceppi di Urea (+), Trealosio (+) oppure (-)); se un ceppo è sia Urea (+) sia Trealosio (+), l’alcalinizzazione è predominante (colorazione blu). Il fatto che il colore diventi giallo (acidificazione del terreno) è associato con il metabolismo del Trealosio (ceppi di Trealosio (+), Urea (-)). 45 7- INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI • Confrontare il profilo ottenuto con i profili specifici (vedere Tabella A); gli aspetti discriminanti sono indicati in grassetto. • Se il profilo è diverso, considerare i test PAP e urea e fare riferimento ai relativi paragrafi. a) Legende + +/+(-) -(+) : : : : : test test test test test positivo negativo variabile positivo in almeno il 90% dei casi negativo in almeno il 90% dei casi b) Profili specifici TABELLA A TTZ PAP UR./TRE BGL AGL +/- + + - +/+/- HAP Verde o giallo + + +/- Candida albicans Giallo (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis - Giallo - - + Candida glabrata - Blu - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Soltanto un test chiaramente positivo (giallo) consente di identificare immediatamente la Candida tropicalis In caso di risultato dubbio (colore verdastro) o negativo, si dovrà procedere alla conferma dell’identità del ceppo (diagnosi differenziale con certi ceppi di AGL + Saccharomyces cerevisiae). (2) A volte è possibile osservare una scoloritura giallo pallido. 46 c) Altri profili 1- SPECIE PAP+ E giallo UREA verde o giallo TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Verde o giallo - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Verde o giallo - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- SPECIE PAP- E incolore Specie UREA verde TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Osservazioni aggiuntive +/- - verde - - +(-) / +/- - verde - - +(-) Apparizione di colonie a secco +/- - verde - - +(-) Artrospore +/- - verde - +/- +(-) / Specie Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Candida krusei specie Geotrichum Saccharomyces cerevisae 47 3- SPECIE UREA+ E HAP+ blu TTZ PAP UR./TRE BGL giallo AGL HAP Osservazioni capsula - +/- +/- Blu +/- +/- + { + pigment -azione - Specie Artros -pore - Specie Cryptococ -cus Specie Rhodoorula - + Trichosporo n cutaneum - - + Un test positivo corrisponde generalmente a una colorazione gialla sui test BGL e AGL; una colorazione arancione o rosa si può osservare per il Trichosporon cutaneum ed è specifica di questa specie. Inoltre, le colonie di T. cutaneum hanno un aspetto filamentoso. 8- PRESTAZIONI In base agli studi condotti dall’Istituto Pasteur di Parigi e dall’ospedale Broussais di Parigi, il FONGISCREEN® 4H consente in quattro ore di identificare la C. albicans, la C. glabrata, la C. tropicalis e la C. neoformans e di orientare la diagnosi di altri lieviti. Uno studio clinico retrospettivo è stato condotto su un panel di 146 ceppi rappresentanti di 23 specie di lieviti. FONGISCREEN® 4H consente di rivelare il 100% dei ceppi di C. albicans (18 ceppi testati), C. glabrata (24 ceppi) e C. neoformans (11 ceppi) e il 94% di ceppi di C. tropicalis (18 ceppi testati). Per questi 4 ceppi, la specificità dei test è risultata del 100%. Altre specie di lievito possono essere classificate in 3 gruppi, secondo un profilo distintivo, ma non specifico, delle specie (per il 99% delle specie). 48 9- LIMITI DELLA PROCEDURA • Il test BGL assume a volte una colorazione gialla molto chiara difficile da interpretare, in particolare per il ceppo di C. tropicalis. • Alcuni rari ceppi di C. tropicalis Trealosio (-) possono essere erroneamente interpretati come S. cerevisiae 10- CONTROLLO DI QUALITA DEL PRODUTTORE Tutti i reagenti sono prodotti in base al nostro sistema di assicurazione di qualità a cominciare dal ricevimento delle materie prime fino alla distribuzione del prodotto finito. Ciascun lotto è sottoposto a controllo di qualità ed è immesso sul mercato solo quando è conforme ai criteri di accettazione. I dati relativi alla produzione e al controllo di ogni singolo lotto sono conservati negli archivi Bio-Rad. 11- BIBLIOGRAFIA Vedere la versione francese. 49 50 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESTS IDENTIFICAÇÃO RAPIDA DOS PRINCIPAIS FUNGOS CLINICAMENTE IMPORTANTES IVD 1- IMPORTANCIA CLINICA Perante a crescente incidência de infecções a fungos nos últimos anos, essencialmente devida à utilização frequente de agentes antibacterianos de aplicação tópica, antibióticos de largo espectro e técnicas invasivas (cateteres, alimentação por via parentérica), os laboratórios de microbiologia são cada vez mais solicitados para detectar a presença de fungos em amostras patológicas. Um diagnóstico rápido e preciso torna-se, por vezes, necessário, para dar início ao tratamento apropriado, em especial no caso de indivíduos imunodeprimidos. Fongiscreen® 4H, um sistema baseado no estudo do perfil enzimático, vem satisfazer esta necessidade, visto ser capaz de identificar, no prazo de 4 horas: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, fungos que representam cerca de 90% dos isolados, e Cryptococcus neoformans. Este sistema permite ainda orientar o diagnóstico de outros fungos cuja identificação será completada pela análise da utilização de açúcar, com o dispositivo AUXACOLOR® 2 (ref. 56513). 2- PRINCIPIO DO TESTE O teste baseia-se na utilização de substratos desidratados por enzimas fúngicos pré-formados, o que resulta numa alteração de cor espontânea ou mediante adição de um reagente de revelação. NATUREZA DOS TESTES UTILIZADOS • Meio TTZ Este meio contém Trifeniltetrazólio (TTZ). A redução de TTZ resulta na formação de uma coloração rosa mais ou menos intensa, consoante as espécies. • Meio PAP Este meio contém um substrato enzimático que permite a detecção da actividade prolina aminopeptidase. • Meio Ureia + Trealose (Ur./tre) Este meio permite a detecção da actividade urease, reflectida pela alcalinização do meio, com uma alteração da cor verde para azul no indicador de pH (Azul de Bromotimol). O metabolismo da trealose resulta em acidificação, com alteração de cor do indicador, de verde para amarelo. • Meio BGL Este meio contém um substrato enzimático: p. Nitrofenil-N-Acetil-B-D52 Galactosaminide, que permite a demonstração da galactosaminidase. Este teste é mais sensível do que o teste de tubo germinativo para identificação de C. albicans (sensibilidade variável, de acordo com diferentes autores). • Meio AGL Permite a detecção da actividade a-glucosidase. • Meio HAP Permite a detecção da actividade L-Histidina aminopeptidase. Os testes BGL e AGL são realizados em meio acídico. A leitura do resultado requer revelação, utilizando um reagente alcalino (reagente BGL/AGL). O teste HAP é lido após revelação com o reagente HAP. O teste é lido após incubação durante 4 horas a 37°C sem CO2. 3- COMPOSIÇÃO DO DISPOSITIVO FONGISCREEN® 4H inclui: • Microplate : 10 microplacas de 6 poços, em embalagem individual (o diagrama da microplaca está indicado na etiqueta). • Suspension medium : 10 meios de suspensão prontos a utilizar (1 ml). • 1 frasco de reagente AGL/BGL (3 ml) • 1 frasco de reagente HAP (2ml) • 10 micropipetas • 10 fitas adesivas Cada microplaca é apresentada em embalagem individual, num saco de alumínio hermeticamente fechado, com uma fita adesiva e um dessecante. DIAGRAMA DA MICROPLACA FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : ............................................................. date : .................................................................. 53 Precauções / Advertências e Instruções de segurança: Este dispositivo contém reagentes perigosos. • Frasco de 3 ml de reagente AGL/BGL contendo 4% de NaOH 1N. R 34: Provoca queimaduras. S 26-37/39-45: Em caso de contacto com os olhos, lavar imediata e abundantemente com água e consultar um especialista. Usar luvas e equipamento protector para os C - Corrosivo olhos/face adequados. Em caso de acidente ou de indisposição, consultar imediatamente um médico (se possível, mostrar-lhe o rótulo). • Frasco de 2 ml de reagente HAP contendo 66,5% de etanol a 95°. R 11: Facilmente inflamável. S 7-16: Manter o recipiente bem fechado. Manter afastado de qualquer chama ou fonte de ignição – Não fumar. 4- ARMAZENAMENTO Conservados à temperatura de +2 - 8°C, os reagentes mantêm-se estáveis até ao termo do prazo de validade indicado na etiqueta (mesmo depois de abertos). 5- MATERIAL NECESSARIO NÃO FORNECIDO ... .... .... ... • Opacity control 6 Mac Farland: código 56499 • Incubadora a 37°C 6- PROCEDIMENTO A)INOCULAÇÃO DA MICROPLACA 54 meio de suspensão 100 µl ou 3 gotas • Utilizar uma cultura pura e fresca em meio Sabouraud, Sabouraud Cloramfenicol, e/ou Gentamicina, com uma quantidade de fungos suficiente para se obter uma opacidade superior à do controlo de opacidade (Opacity control 6 Mac Farland, código 56499): na prática, 4 a 5 arcos, se possível. • Importante: a opacidade da suspensão deverá ser, pelo menos, igual à do controlo de opacidade que define o nível mínimo de turvação. TTZ PAP Ur/Tre. BGL AGL HAP • Homogeneizar a suspensão utilizando a micropipeta (ou vortex, se necessário), aspirando e expelindo o conteúdo do frasco, várias vezes. • Recolher o inóculo com a micropipeta e distribuir 3 gotas (100 µl) em cada um dos poços da microplaca. • Cobrir a microplaca com fita adesiva e incubar durante 4 horas a 37°C. B) LEITURA DOS RESULTADOS • Retirar a fita adesiva. • Ler os resultados de TTZ, PAP, Ureia/trealose. • Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL nos poços de BGL e AGL. - proceder imediatamente à leitura do teste BGL - quanto ao teste AGL, a cor é revelada nos próximos 15 a 30 segundos. • Adicionar 2 gotas de reagente HAP no poço HAP. A cor é revelada nos próximos 15 a 30 segundos. TABELA DE RESULTADOS TESTES NEGATIVO TTZ INCOLOR POSITIVO PROCEDIMENTO ROSA PÁLIDO ou ROSA ESCURO, consoante as espécies LEITURA DIRECTA (sem adição de reagentes) PAP INCOLOR AMARELO UR./TRE VERDE AZUL (alcalinização) ou AMARELO (acidificação), consoante as espécies BGL INCOLOR AMARELO Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL. A cor surge imediatamente (ou seja, leitura imediata). AGL INCOLOR AMARELO Adicionar 2 gotas de reagente BGL/AGL. A cor revela-se nos próximos 15 a 30 segundos. HAP INCOLOR AMARELO Adicionar 2 gotas de reagente HAP. A cor revela-se nos próximos 15 a 30 segundos. * A alteração de cor para azul (alcalinização do meio) está associada ao metabolismo da ureia (estirpes Ureia(+), Trealose(+) ou (-); se uma 55 estirpe for simultaneamente Ureia(+) e Trealose(+), predomina a alcalinização (alteração para azul). A alteração de cor para amarelo (acidificação do meio) está associada ao metabolismo da Trealose (estirpes Trealose(+), Ureia(-) ). 7- INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS • Comparar o perfil obtido com os perfis específicos (ver Tabela A); os valores discrepantes são indicados a cheio. • Se o perfil for diferente, proceder aos testes de PAP e ureia e reportarse aos parágrafos correspondentes. a) Legendas + +/+(-) -(+) : : : : : teste teste teste teste teste positivo negativo variável positivo em pelo menos 90% dos casos negativo em pelo menos 90% dos casos b) Perfis específicos TABELA A TTZ +/- PAP UR./TRE + Verde ou Amarelo BGL AGL + + HAP +/- Candida albicans + +(-) Candida tropicalis + - Amarelo (1) -(+)(2) +/- - Amarelo - - + Candida glabrata +/- - Azul - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Só um teste francamente positivo (amarelo) permite identificar imediatamente Candida tropicalis. No caso de um resultado duvidoso (cor esverdeada) ou de um resultado negativo, a identidade da estirpe deverá ser confirmada (diagnóstico diferencial com certas estirpes de AGL + Saccharomyces cerevisiae). (2) Por vezes, pode observar-se uma descoloração para amarelo pálido. 56 c) Outros perfis 1- Amostras PAP+ e amarelo Ureiaverde ou amarelo TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Verde ou Amarelo - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Verde ou Amarelo - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- Amostras PAP- e incolor Espécies Ureiaverde TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Observações adicionais Espécies +/- - Verde - - +(-) / +/- - Verde - - +(-) Aspecto seco das colónias Candida krusei +/- - Verde - - +(-) Artrosporos Espécies Geotrichum +/- - Verde - +/- +(-) / Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Saccharomyces cerevisae 57 3- Amostra Ureia+ e HAP+ azul TTZ PAP UR./TRE BGL amarelo AGL HAP Observações Adicionais cápsula - +/- +/- Azul +/- +/- + { + - - pigment -ação - + - Espécies artros -poros - Espécies Crypto -coccus - Espécies Rhodo -orula + Tricho -sporon cutaneum Um teste positivo corresponde geralmente a uma coloração amarela nos testes BGL e AGL; poderá observar-se uma coloração laranja ou rosa com Trichosporon cutaneum, e é específica desta espécie. Além disso, as colónias de T. cutaneum apresentam um aspecto filamentoso. 8- DESEMPENHOS De acordo com os estudos realizados pelo Instituto Pasteur em Paris e pelo Hospital Broussais em Paris, FONGISCREEN® 4H permite a identificação, em quatro horas, de C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. neoformans, bem como a orientação do diagnóstico de outros fungos. Um estudo clínico retrospectivo foi realizado num painel de 146 estirpes, representando 23 espécies de fungos. FONGISCREEN® 4H permite detectar 100% das estirpes de C. albicans (18 estirpes testadas), C. glabrata (24 estirpes) e C. neoformans (11 estirpes) e 94% das estirpes de C. tropicalis (18 estirpes testadas). Para estas 4 estirpes, a especificidade do teste foi de 100%. As outras espécies de fungos podem ser classificadas em 3 grupos, de acordo com um perfil distintivo, mas não específico das espécies (para 99% das estirpes). 58 9- LIMITES DO METODO • O teste BGL adquire, por vezes, uma coloração amarela muito clara que se torna difícil de interpretar, em particular no caso da estirpe C. tropicalis . • Algumas estirpes raras de C. tropicalis Trealose (-) podem ser erradamente identificadas como S. cerevisiae. 10- CONTROLO DA QUALIDADE DE FABRICO Todos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nosso Sistema de Qualidade, desde a recepção das matérias primas até à comercialização final do produto. Cada lote é submetido a um controlo de qualidade, sendo lançado no mercado apenas quando em conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos relativos à produção e controlo de cada lote são arquivados pela BioRad. 11- REFERENCIA BIBLIOGRAFICAS Veja a versão francesa. 59 60 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TEST SNABB IDENTIFIERING AV HUVUDSAKLIGA JÄSTSVAMPAR AV MEDICINSK BETYDELSE IVD 1- KLINISK BETYDELSE Mot bakgrund av den ökade förekomsten av svampinfektioner de senaste åren, främst pga. den frekventa användningen av topiska antibakteriella medel, antibiotika med brett spektrum samt invasiva tekniker (katetrar, parenteral nutrition), ombeds allt oftare mikrobiologiska laboratorier att söka efter jästsvampar i patologiska prover. En snabb och precis diagnos är ibland nödvändig för att kunna påbörja en lämplig behandling, särskilt hos patienter med nedsatt immunförsvar. Fongiscreen® 4H, ett system baserat på studien av den enzymatiska profilen, tillgodoser det här behovet då systemet inom 4 timmar kan identifiera Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, jästsvampar som representerar cirka 90 % av isolaten och Cryptococcus neoformans. Systemet är även till hjälp vid diagnos av andra jästsvampar, vars identifiering slutförs genom att studera sockerintag med AUXACOLOR® 2-kitet (kod 56513). 2- TESTPRINCIP Testet är baserat på användningen av dehydrerade substrat av utförda svampenzymer, vilket resulterar i en färgändring, spontant eller efter tillsats av ett framkallningsreagens. TYPER AV TEST SOM ANVÄNDS • TTZ-medium Detta medium innehåller trifenyltetrazolium (TTZ). Minskningen av TTZ resulterar i bildandet av en mer eller mindre intensiv rosa färg, beroende på proverna. • PAP-medium Detta medium innehåller ett enzymatiskt substrat som möjliggör detektion av aktivitet hos prolin-aminopeptidas. • Urea + Trehalos-medium (Ur./tre) Detta medium möjliggör detektion av ureasaktivitet, reflekterat av alkalisering av mediet med en färgändring från grönt till blått på pHindikatorn (bromtymolblått). Metabolismen av trehalos resulterar i försurning med färgändring av indikatorn från grönt till gult. • BGL-medium Detta medium innehåller ett enzymatiskt substrat: p. nitrofenyl-N-acetyl-B62 D-galactosaminid, och möjliggör påvisande av galaktosaminidas. Testet är mer sensitivt än germtube-testet för identifiering av C. albicans (varierande sensitivitet enligt olika författare). • AGL-medium Detta medium möjliggör detektion av aktivitet hos a-glukosidas. • HAP-medium Detta medium möjliggör detektion av aktivitet hos L-histidinaminopeptidas. BGL- och AGL-test utförs i ett surt medium. Avläsning av resultatet kräver framkallning med hjälp av ett alkaliskt reagens (BGL-/AGL-reagens). HAP-testet avläses efter framkallning med HAP-reagens. Testet avläses efter inkubering i 4 timmar i 37 °C utan CO2. 3- TESTETS BESTÅNDSDELAR FONGISCREEN® 4H omfattar: • Microplate : 10 separat förpackade mikroplattor med vardera 6 brunnar (diagram för mikroplattan visas på etiketten). • Suspension medium : 10 suspensionsmedel, färdiga att använda (1 ml) • 1 vial med AGL/BGL-reagens (3 ml) • 1 vial med HAP-reagens (2ml) • 10 mikropipetter • 10 självhäftande folier Varje mikroplatta är separat förpackad i en försluten foliebelagd aluminiumpåse med självhäftande folie och torkmedel. DIAGRAM FÖR MIKROPLATTAN FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : .............................................................. Date : ................................................................. 63 Försiktighetsåtgärder/hälso- och säkerhetsinstruktioner: Detta test innehåller farliga reagenser. • Vial med 3 ml AGL/BGL-reagens innehållande 4 % NaOH 1N. R 34: Frätende. S 26-37/39-45: Vid kontakt med ögonen, spola genast med mycket vatten och kontakta läkare. Använd lämpliga C - Frätende skyddshandskar samt skyddsglasögon eller ansiktsskydd. Vid olycksfall, illamående eller annan påverkan kontakta omedelbart läkare. Visa om möjligt etiketten. • Vial med 2 ml HAP-reagens innehållande 66,5 % 95-procentig etanol. R 11: Mycket brandfarligt. S 7-16: Förpackningen förvaras väl tillsluten. Förvaras åtskilt från antändningskällor - Rökning förbjuden. 4- FÖRVARING Reagenserna är stabila till angivet utgångsdatum på etiketten, om de förvaras vid +2-8°C (gäller även öppnad förpackning). 5- NÖDVÄNDIGT MATERIAL SOM EJ INGÅR • Opacity control 6 Mac Farland: kod 56499 • Inkubator, 37°C ... .... .... ... 6- FÖRFARANDE A) INOKULERING AV MIKROPLATTAN 64 suspensionsmedel 100 µl eller 3 droppar • Använd en ren och färsk odling på Sabouraud, Sabouraud kloramfenikol och/eller Gentamicinmedium med en tillräcklig kvantitet av jästsvampar för att erhålla en opacitet större än opacitetskontrollen (Opacity control 6 Mac Farland, kod 56499): i praktiken 4 till 5 öglor om möjligt. • Viktigt: opaciteten hos suspensionen måste vara minst lika med opacitetkontrollen • vilket definierar lägsta nivån av grumlighet. • Homogenisera suspensionen med mikropipetten (eller vortexa om det behövs) genom att suga upp och tömma vialens innehåll upprepade gånger. TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP • Samla upp inokulatet med mikropipetten och fördela 3 droppar (100 µl) i varje brunn på mikroplattan. • Täck mikroplattan med självhäftande folie och inkubera i 4 timmar i 37 °C. B) AVLÄSA RESULTATEN • Ta bort den självhäftande folien. • Läs resultaten för TTZ, PAP, Urea/trehalos. • Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens i BGL- och AGL-brunnarna. - BGL-testet avläses omedelbart - hos AGL-testet utvecklas färgen under 15 till 30 sekunder. • Tillsätt 2 droppar HAP-reagens till HAP-brunnen. Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder. RESULTATTABELL TEST NEGATIVT POSITIVT TTZ FÄRGLÖST LJUST ROSA eller MÖRK ROSA beroende på proverna FÖRFARANDE DIREKT AVLÄSNING (utan tillsats av reagenser) PAP FÄRGLÖST GULT UR./TRE GRÖNT BLÅTT (alkalisering) eller GULT (försurning) beroende på proverna BGL FÄRGLÖST GULT Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens. Färgen visas omedelbart (dvs. läs av omedelbart) AGL FÄRGLÖST GULT Tillsätt 2 droppar BGL/AGL-reagens. Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder. HAP FÄRGLÖST GULT Tillsätt 2 droppar HAP-reagens. Färgen utvecklas under 15 till 30 sekunder. * Färgändringen till blått (alkalisering av mediet) är associerad med metabolism av urea (urea(+), trehalos(+) eller (-)-stammar). Om en stam är både urea(+) och trehalos(+) är alkalisering dominerande (ändring till blått). Färgändringen till gult (försurning av mediet) är associerad med metabolism av trehalos (trehalos(+), urea(-)-stammar. 65 7- UTVÄRDERING AV RESULTATEN • Jämför den erhållna profilen med de specifika profilerna (tabell A). De utmärkande punkterna anges med fetstil. • Om profilen är annorlunda ska du ta hänsyn till PAP- och ureatesten och referera till motsvarande avsnitt. a) Teckenförklaring + +/+(-) -(+) : : : : : positivt test negativt test variabelt test positivt test i minst 90 % av fallen negativt test i minst 90 % av fallen b) Specifika profiler TABELL A TTZ PAP UR./TRE BGL AGL +/- + + - +/+/- HAP Grönt eller gult + + +/- Candida albicans Gult (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis - Gult - - + Candida glabrata - Blått - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Endast ett klart positivt test (gult) identifierar omedelbart Candida tropicalis. Vid ett tveksamt resultat (grönaktig färg) eller ett negativt resultat måste stammens identitet bekräftas (differentialdiagnos med särkilda stammar av AGL + Saccharomyces cerevisiae). (2) En svagt gul missfärgning kan ibland observeras. 66 c) Övriga profiler 1- PAP+ och ureaprover gult grönt eller gult TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Grönt eller gult - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Grönt eller gult - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- PAP- och Prover ureaprover färglöst grönt TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Övriga observationer +/- - Grönt - - +(-) / +/- - Grönt - - +(-) Kolonier med torrt utseende +/- - Grönt - - +(-) Artrosporer +/- - Grönt - +/- +(-) / Prover Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Candida krusei Geotrichum species Saccharomyces cerevisae 67 3- Urea+ och HAP+ blått TTZ PAP UR./TRE gult BGL AGL HAP Övriga observationer kapsel - +/- +/- Blått -prover +/- +/- + { + - - pigment -aering - + - Prover artros -porer - Crypto coccus -prover - Rhodo -orula -prover + Tricho sporon cutaneum Ett positivt test motsvarar vanligtvis en gul färg på BGL- och AGL-test. En orange eller rosa färg kan observeras med Trichosporon cutaneum, och är specifikt för dessa prover. Vidare har kolonier av T. cutaneum ett trådlikt utseende. 8- TESTRESULTAT Enligt studier från Pasteur Institut i Paris och Broussais-sjukhuset i Paris möjliggör FONGISCREEN ® 4H identifiering inom fyra timmar av C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis och C. neoformans samt en orientering av diagnosen för andra jästsvampar. En retrospektiv klinisk studie har utförts på en panel bestående av 146 stammar som representerar 23 prover av jästsvampar. FONGISCREEN® 4H gör det möjligt att upptäcka 100 % av C. albicans (18 testade stammar), C. albicans (24 stammar) och C. albicans (11 stammar) samt 94 % av C. albicans (18 testade stammar). För dessa fyra stammar var specificiteten för testet 100 %. Övriga jästprover kan klassificeras i tre grupper enligt en distinkt, dock ej specifik, profil hos proverna (för 99 % av stammarna). 68 9- TESTETS BEGRÄNSNINGAR • BGL-testet antar ibland en mycket ljust gul färg som är svårtolkad, särskilt för C. tropicalis-stam. • Vissa sällsynta stammar av C. tropicalis-trehalos (-) kan felaktigt identifieras som S. cerevisiae 10- TILLVERKARENS KVALITETSKONTROLL Alla reagenser tillverkas och prepareras i enlighet med vårt kvalitetssystem, från mottagandet av råmaterial till den slutliga marknadsföringen av produkten. Varje parti genomgår en kvalitetskontroll och släpps endast ut på marknaden om det överensstämmer med fördefinierade acceptanskriterier. Handlingar som beskriver produktion och kontroll av varje enskilt parti sparas hos Bio-Rad. 11- REFERENSER Se den franska versionen. 69 70 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESTS HURTIG IDENTIFIKATION AF PRIMÆRE GÆRARTER AF MEDICINSK VIGTIGHED IVD 1- KLINISK VÆRDI I betragtning af den øgede udbredelse af svampeinfektioner i løbet af de seneste år, grundlæggende på grund af den hyppige brug af aktuelle antibakterielle stoffer, bredspektrede antibiotika og invasive teknikker (katetre, parenteral ernæring), bliver mikrobiologiske laboratorier stadigt oftere bedt om at lede efter gærarter i patologiske prøver. En hurtig og præcis diagnose er ofte nødvendig for at iværksætte den rette behandling, især hos personer med nedsat immunforsvar. Fongiscreen® 4H er et system, der er baseret på undersøgelsen af den enzymatiske profil, og som opfylder dette behov, idet testen kan idenficere følgende inden for 4 timer: Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, gærarter, der repræsenterer ca. 90 % af isolaterne og Cryptococcus neoformans. Det styrer også diagnosen for andre gærarter, hvis identifikation opnås ved at studere sukkerforbruget med AUXACOLOR® 2-sættet (kode 56513). 2- ANALYSEPRINCIP Testen er baseret på brugen af dehydrerede substrater ved hjælp af præformede svampeenzymer, hvilket resulterer i en farveændring enten spontant eller efter tilsætning af en afsløringsreagens. KARAKTERISTIKA FOR DE ANVENDTE TESTS • TTZ-medium Dette medium indeholder Triphenyltetrazolium (TTZ). Reduktionen af TTZ resulterer i dannelsen af en mere eller mindre lyserød farve, afhængigt af arterne. • PAP-medium Dette medium indeholder et enzymatisk substrat, der muliggør konstatering af prolin aminopeptidase-aktivitet. • Urea + Trehalose-medium (Ur./tre) Dette medium muliggør konstatering af urea-aktivitet, som afspejles i alkalinisering af mediet med en farveændring fra grøn til blå i pHindikatoren (Bromothymolblå). Metabolismen i trehalose resulterer i syredannelse med en farveændring af indikatoren fra grøn til gul. • BGL-medium Dette medium indeholder et enzymatisk substrat: p. Nitrophenyl-N-AcetylB-D-Galactosaminid som muliggør påvisning af galactosaminidase. 72 Denne test er mere sensitiv end bakterierørtesten til identifikation af C. albicans (variabel sensitivitet ifølge forskellige forfattere). • AGL-medium Det muliggør konstatering af a-glucosidaseaktivitet. • HAP-medium Det muliggør konstatering af L-Histidin aminopeptidaseaktivitet. BGL- og AGL-testene udføres i et surt medium. Aflæsning af resultaterne kræver afsløring ved hjælp af en alkalisk reagens (BGL/AGL-reagens). HAP-testen aflæses efter afsløring med HAP-reagensen. Testen aflæses efter inkbation i 4 timer ved 37°C uden CO2. 3- SÆTTETS SAMMENSÆTNING FONGISCREEN® 4H indeholder: • Microplate : 10 enkeltpakkede mikroplader med 6 brønde (mikropladens diagram er angivet på etiketten). • Suspension medium : 10 brugsklare suspensionsmidler (1 ml) • 1 flaske AGL/BGL-reagens (3 ml) • 1 flaske HAP-reagens (2 ml) • 10 mikropipetter • 10 selvklæbende film Hver mikroplade er pakket for sig i en forseglet aluminiumspose med selvklæbende film og tørremiddel. MIKROPLADENS DIAGRAM FONGISCREEN® 4H TTZ PAP Ur./tre BGL AGL HAP Patient : .............................................................. Date : ................................................................. 73 Forholdsregler for brug/Sundheds- og sikkerhedsmæssige instruktioner: Dette sæt indeholder farlige reagenser. • 3 ml flaske med AGL/BGL-reagens, der indeholder 4% NaOH 1N. R 34: Ætsningsfare. S 26-37/39-45: Kommer stoffet i øjnene, skylles straks grundigt med vand og læge kontaktes. Brug egnede C - Ætsende beskyttelseshandsker og briller/ansigtsskærm under arbejdet. Ved ulykkestilfælde eller ved ildebefindende er omgående lægebehandling nødvendig. Vis etiketten, hvis det er muligt. • 2 ml flaske HAP-reagens, der indeholder 66,5 % 95° ethanol. R 11: Meget brandfarlig. S 7-16: Emballagen skal holdes tæt lukket. Holdes væk fra antændingskilder – Rygning forbudt. 4- OPBEVARING Reagenserne er stabile indtil udløbsdatoen på etiketten, hvis de opbevares ved +2 – 8°C (også når de har været åbnet en enkelt gang). 5- KRÆVET MATERIALE, DER IKKE MEDFØLGER ... .... .... ... • Opacity control 6 Mac Farland: kode 56499 • Inkubator ved 37°C 6- PROCEDURE • Brug af en ren og frisk kultur på medierne Sabouraud, Sabouraud Chloramphenicol og/eller Gentamicin med en tilstrækkelig mængde gær til at opnå en opacitet, der ligger over resultatet fra opacitetskontrollen (Opacity control 6 Mac Farland, kode 56499): i praksis 4 – 5 udstrygningsløkker, hvis det er muligt. • Vigtigt: suspensionens opacitet skal mindst svare til resultatet i opacitetskontrollen, som definerer det minimale niveau for turbiditeten. 74 suspensionsmidler 100 µl eller 3 dråber A) INOKULATION AF MIKROPLADEN TTZ PAP Ur/Tre. BGL AGL HAP • Homogenisér suspensionen ved hjælp af mikropipetten (eller bland den i Vortex-mixeren, hvis det er nødvendigt) ved at suge indholdet af flasken op og presse det ud flere gange. • Indsaml podestoffet med mikropipetten og fordel 3 dråber (100 µl) i de enkelte brønde på mikropladen. • Tildæk mikropladen med selvklæbende film, og inkubér i 4 timer ved 37°C. B) AFLÆSNING AF RESULTATERNE • Fjern den selvklæbende film. • Aflæs resultaterne for TTZ, PAP, Urea/trehalose. • Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens i BGL- og AGL-brøndene. - aflæs straks BGL-testen - for AGL-testen udvikles farven i løbet af 15 – 30 sekunder. • Tilsæt 2 dråber HAP-reagens i HAP-brønden. Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder. TABEL OVER RESULTATER TESTS NEGATIV POSITIV TTZ FARVELØS LYSERØD eller PINK, afhængigt af arterne. PROCEDURE DIREKTE AFLÆSNING (uden tilsætning af reagenser) PAP FARVELØS GUL UR./TRE GRØN BLÅ (alkalinisering) eller GUL (syredannelse), afhængigt af arterne. BGL FARVELØS GUL Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens. Farven vises straks (dvs. aflæses straks). AGL FARVELØS GUL Tilsæt 2 dråber BGL/AGL-reagens. Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder. HAP FARVELØS GUL Tilsæt 2 dråber HAP-reagens. Farven udvikles i løbet af 15 – 30 sekunder. * Når farven ændres til blå (alkalinisering af mediet), er det forbundet med metabolismen i urea (stammerne Urea (+), Trehalose (+) eller (-)). Hvis en stamme er både Urea (+) og Trehalose (+), er alkalinisering fremherskende (ændring til blåt). Når farven ændres til gul (syredannelse 75 i mediet), er det forbundet med metabolismen i Trehalose (stammerne Trehalose (+) og Urea (-)). 7- FORTOLKNING AF RESULTATERNE • Sammenlign den opnåede profil med de specifikke profiler (jf. Tabel A). De varierende karakteristiska er angivet med fed skrift. • Hvis profilen er forskellig, skal du overveje PAP- og ureatests. Læs de tilsvarende afsnit. a) Forklaringer + +/+(-) -(+) : : : : : positiv test negativ test variabel test positiv test i mindst 90 % af tilfældene negativ test i mindst 90 % af tilfældene b) Specifikke profiler TTZ PAP UR./TRE BGL AGL +/- + + - +/+/- HAP Grøn eller gul + + +/- Candida albicans Gul (1) -(+)(2) + +(-) Candida tropicalis - Gul - - + Candida glabrata - Blå - +(-) - Cryptococcus neoformans (1) Kun en udelukkende positiv test (gul) identificerer straks Candida tropicalis. I tilfælde af et tvivlsomt resultat (grønlig farve) eller et negativt resultat, skal stammens identitet bekræftes (forskellige diagnoser for bestemte stammer af AGL + Saccharomyces cerevisiae). (2) Af og til kan der observeres en lysegul affarvning. 76 c) Andre profiler 1- PAP+ og Urea- gul arter grøn eller gul TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Grøn eller gul - +/- +/- Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata +/- + Grøn eller gul - - +/- Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- PAP- og Arter Urea- farveløs arter grøn TTZ PAP UR./TRE BGL AGL HAP Supplerende observationer Arter +/- - Grøn - - +(-) / +/- - Grøn - - +(-) Kolonierne virker tørre Candida krusei +/- - Grøn - - +(-) Arthrosporer Geotrichum-arter +/- - Grøn - +/- +(-) / Saccharomyces cerevisae Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa 77 3- Urea+ og HAP+ blå TTZ PAP UR./TRE gul BGL AGL HAP Supplerende observationer kapsel -formet - +/- +/- Blå -arter +/- +/- + { + - - pigment -ering - + - Arter arthros -porer - Crypto coccus -arter - Rhodo -orula -arter + Tricho -sporon cutaneum En positiv test svarer generelt til en gul farve ved BGL- og AGL-tests. Der kan observeres en orange eller pink farve ved Trichosporon cutaneum, hvilket kun gælder for disse arter. Derudover kan kolonier af T. cutaneum have et filamentøst udseende. 8- YDEEVNE Ifølge undersøgelser fra Pasteur Institut i Paris og Broussais-hospitalet i Paris muliggør FONGISCREEN ® 4H identifikation på fire timer af C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis og C. neoformans og orientering af diagnosen for andre gærarter. Der blev udført en retrospektiv, klinisk undersøgelse på et panel af 146 stammer, som repræsenterede 23 gærarter. FONGISCREEN® 4H gør det muligt at konstatere 100 % af stammerne for C. albicans (18 testede stammer), C. glabrata (24 stammer) og C. neoformans (11 stammer) og 94 % af C. tropicalis-stammerne (18 testede stammer). For disse 4 stammer var testens specificitet 100 %. Andre gærarter kan klassificeres i 3 grupper ifølge en særskilt, men ikke specifik, profil for arterne (for 99 % af stammerne). 78 9- PROCEDURENS BEGRÆNSLINGER • BGL-testen får af og til en meget lys gul farve, som er svær at fortolke, især for C. tropicalis-stammen. • Nogle sjældne stammer for C. tropicalis Trehalose (-) kan blive identificeret forkert som S. cerevisiae. 10- PRODUCENTENS KVALITETSKONTROL Alle producerede reagenser fremstilles ifølge vores kvalitetssikringssystem, lige fra modtagelsen af råmaterialerne til markedsføringen af slutproduktet. Hvert parti gennemgår kvalitetskontrol og markedsføres kun, hvis det opfylder de foruddefinerede kvalitetskriterier. Dokumentation vedrørende produktion og kontrol af hvert parti opbevares inden for virksomheden. 11- REFERENCER Se den franske version. 79 80 81 FONGISCREEN® 4H 56504 10 TESZT GYORSTESZT PATOGÉN ÉLESZTŐGOMBÁK AZONOSÍTÁSÁRA 1- KLINIKAI JELENTŐSÉG A gombás fertőzések utóbbi években tapasztalható felszaporodására való tekintettel, amely szükségképpen az éppen divatos antibakteriális szerek, széles spektrumú antibiotikumok és invazív technikák (katéterek, parenteralis táplálás) gyakori használatával függ össze, a mikrobiológiai laboratóriumoknak egyre gyakrabban kell élesztőkre vizsgálnia a klinikai mintákat. A gyors és pontos diagnózis olykor éppen azért szükséges, hogy meg lehessen kezdeni a megfelelő kezelést, különösen akkor, ha immunszupprimált betegről van szó. A Fongiscreen® 4H, egy, az enzimprofil vizsgálatára alapuló rendszer eleget tesz ennek a követelménynek, mivel 4 órán belül képes identifikálni a Candida albicans-t, a Candida glabrata-t, a Candida tropicalis-t, olyan élesztőket, amelyek az izolátumok nagyjából 90%-át teszik ki, valamint a Cryptococcus neoformans-t. Egyéb élesztők diagnózisát is elősegíti, amelyek identifikálásához még cukorhasznosítást is kell vizsgálni AUXACOLOR® 2 kittel (kódszám 56513). 2- A TESZT ALAPELVE A teszt dehidrált szubsztrátok prerformált gombaenzimekkel történő bontásán alapul, ami vagy spontán, vagy valamely előhívó anyaggal történő kezelés után színváltozást okoz. A TESZT ÖSSZETEVŐI • TTZ közeg Ez a közeg trifenil-tetrazóliumot (TTZ) tartalmaz. A TTZ redukálása erősebb vagy gyengébb rózsaszínt eredményez, a kérdéses fajtól függően. • PAP közeg Ez a közeg enzim szubsztrátot tartalmaz, s detektálható vele a prolin-aminopeptidáz aktivitás. • Urea + trehalóz közeg (Ur./tre) Ezzel a közeggel detektálható az ureáz aktivitás. A közeg lúgossá válik, s a pH-indikátor (brómtimolkék) zöldből kékbe csap át. A trehalóz átalakulása savasodást okoz, s az indikátor zöldből sárga színűre vált át. • BGL közeg Ez a közeg enzim szubsztrátot tartalmaz, a p-nitrofenil-N-acetil-B-D-galaktózaminidot, amellyel kimutatható a galaktózaminidáz. Ez a teszt érzékenyebb, mint a C.albicans identifikálására használt csíratömlő teszt (amelynek a különböző szerzők szerint változó az érzékenysége). • AGL közeg Ezzel kimutatható az -glükozidáz aktivitás. • HAP közeg Ezzel kimutatható az L-hisztidin-aminopeptidáz aktivitás. A BGL és az AGL tesztet savas közegben végezzük. Az eredmény leolvasásához lúgos előhívószert kell használnunk (BGL/AGL reagens). A HAP tesztet a HAP reagenssel történő előhívás után olvassuk le. A tesztet 4 órán át tartó, 37°C-os, CO2.-mentes atmoszférában végzett inkubálás után olvassuk le. 3- A KIT ÖSSZETÉTELE A FONGISCREEN® 4H az alábbiakat tartalmazza: • 10 külön-külön csomagolt, 6-tesztlyukas mikrolemez (a mikrolemez kiosztása a címkén látható). • 10 felhasználásra kész szuszpendáló közeg (1 ml) • 1 fiola AGL/BGL reagens (3 ml) • 1 fiola HAP reagens (2ml) • 10 mikropipetta • 10 öntapadó fólia. Mindegyik mikrolemeznek önálló csomagolása van a hegesztett alufólia csomagoláson belül, saját öntapadó fóliával, és nedvszívóval. A MIKROLEMEZ KIOSZTÁSA Kezelési és munkavédelmi előírások: A kit veszélyes reagenseket tartalmaz. • A 3 ml-es, AGL/BGL reagenst tartalmazó fiola 66,5%-ban 95°-os etanolt tartalmaz. R 34 : Égési sérüléseket okoz. S 26-37/39-45 : Ha szembe kerül, azonnal mossuk ki bő vízzel, és forduljunk orvoshoz. Viseljünk megfelelő védőkesztyűt, védőszemüveget vagy arcmaszkot. Balesetkor, vagy ha rosszul érezzük magunkat, azonnal forduljunk orvoshoz (ha lehetséges, mutassuk fel az anyag címkéjét). • A 2 ml-es, HAP reagenst tartalmazó fiola 4%-ban 1N nátrium-hidroxidot tartalmaz. R 11 : Erősen tűzveszélyes. S 7-16 : Tartsuk szorosan lezárva az edényt. Tartsuk távol tüzet veszélyforrásoktól. Tilos a dohányzás. okozó 4- TÁROLÁS A +2 - 8°C között tárolt reagensek a címként feltüntetett szavatossági ideig stabilak (felbontás után is). 5- A VIZSGÁLATHOZ SZÜKSÉGES, DE NEM SZÁLLÍTOTT ESZKÖZÖK • • 1 MacFarland egységnek megfelelő denzitású standard: kódszám 56499 37°C-os inkubátor 6- HASZNÁLATI ÚTMUTATÓ A) A MIKROLEMEZ BEOLTÁSA • Egy Sabouraud, chloramphenicolos és/vagy gentamicines Sabouraud táptalajon tenyésztett tiszta, friss kultúrából vegyünk elegendő mennyiségű élesztőt, hogy a denzitási kontrollnál (kódszám 56499) nagyobb denzitású szuszpenziót kapjunk. A gyakorlatban ez legyen 4 - 5 kacsnyi, ha lehetséges. Fontos: a szuszpenzió denzitása legyen legalább akkora, mint a kontrollé, amely a minimális turbiditást adja meg. • Egy mikropipettával (vagy vortex keverővel, ha szükséges) homogenizáljuk a szuszpenziót a fiola tartalmának többszöri fölszívásával és visszaengedésével. • Mikropipettával szívjuk fel az inokulumot, és 3-3 cseppnyit (100 µl) mérjünk be a mikrolemez mindegyik tesztlyukába. • Öntapadó fóliával fedjük le a mikrolemezt, és inkubáljuk 4 órán át, 37°C-on. B) AZ EREDMÉNYEK LEOLVASÁSA • Vegyük le az öntapadó fóliát. • Olvassuk le a TTZ, PAP, Urea/trehalóz eredményeket. • Adjunk 2 cseppnyi BGL/AGL reagenst a BGL és AGL tesztlyukakhoz. - a BGL tesztet azonnal olvassuk le, - az AGL teszt esetében 15 -- 30 másodpercet kell várni a szín kifejlődéséig. • Adjunk 2 cseppnyi HAP reagenst a HAP tesztlyukhoz. A szín 15 -- 30 másodperc múlva fejlődik ki. EREDMÉNYTÁBLÁZAT TESZTEK NEGATÍV TTZ SZÍNTELEN PAP SZÍNTELEN ÚR./TRE ZÖLD BGL SZÍNTELEN AGL SZÍNTELEN HAP SZÍNTELEN POZITÍV ELJÁRÁS HALVÁNY RÓZSASZÍN, vagy SÖTÉT RÓZSASZÍN, a speciestől függően KÖZVETLEN LEOLVASÁS SÁRGA (reagens hozzáadása nélkül) KÉK (lúgosodás) vagy SÁRGA (savasodás), a speciestől függően(*) Adjunk hozzá 2 csepp BGL/AGL reagenst. SÁRGA A szín azonnal megjelenik (vagyis azonnal leolvasható) Adjunk hozzá 2 csepp BGL/AGL reagenst. SÁRGA A szín 15 -- 30 másodperc múlva jelenik meg. Adjunk hozzá 2 csepp HAP reagenst. SÁRGA A szín 15 -- 30 másodperc múlva jelenik meg. * Az átcsapás kékbe (a közeg lúgosodása) a karbamid átalakításával függ össze (Urea(+), Trehalóz(+) vagy (-) törzsek); ha egy törzs egyszerre Urea(+) és Trehalóz(+), akkor a lúgosodás dominál (átcsapás kékbe). Az átcsapás sárgába (a közeg savasodása) a trehalóz átalakításával függ össze (Trehalóz(+), Urea(-) törzsek). 7- AZ EREDMÉNYEK KIÉRTÉKELÉSE • • Hasonlítsuk össze a kapott profilt a specifikus profilokkal (l. A táblázat); a megkülönböztető tulajdonságokat félkövér betűkkel szedtük Ha a profil ettől különbözik, akkor vizsgáljuk meg a PAP és urea tesztet, és nézzük át a megfelelő bekezdéseket. a) Jelmagyarázat + : pozitív teszt - : negatív teszt +/- : változó teszt +(-) : pozitív teszt az esetek legalább 90%-ában -(+) : negatív teszt az esetek legalább 90%-ában b) Specifikus profilok A TÁBLÁZAT TTZ +/+ +/+/- PAP + - UR./TRE Zöld vagy sárga Sárga (1) Sárga Kék BGL + - (+) (2) - AGL + + +(-) HAP +/(-) + - Species Candida albicans Candida tropicalis Candida glabrata Cryptococcus neoformans (1) Csak egyértelműen pozitív teszt (határozott sárga szín) identifikálja azonnal a Candida tropicalis-t. Ha kétséges az eredmény (zöldes szín), vagy negatív, akkor a törzs azonosságát konfirmálni kell (differenciáldiagnózis AGL + Saccharomyces cerevisiae egyes törzseivel). (2) Halványsárga elszíneződést is meg lehet olykor figyelni. c) Egyéb profilok 1- PAP+ és sárga TTZ Urea- fajok zöld vagy sárga PAP UR./TRE BGL AGL HAP +/- + Zöld vagy sárga - +/- +/- +/- + Zöld vagy sárga - - +/- Species Candida parapsilosis Candida lusitaniae Candida guilliermondii Candida famata Candida zeylanoides Candida inconspicua 2- PAP- és Urea- faj színtelen zöld TTZ +/- PAP - UR./TRE Zöld BGL - AGL - HAP +(-) +/+/+/- - Zöld Zöld Zöld - +/- +(-) +(-) +(-) 3- TTZ Urea+ és HAP+ kék sárga PAP UR./TRE BGL faj AGL HAP +/- +/- Kék +/- További megfigyelések Species / Candida pseudotropicalis Candida inconspicua Candida rugosa Száraz kinézetű telepek Candida krusei Arthrospórák Geotrichum spp / Saccharomyces cerevisae +/- + További megfigyelések Species tok pigmentáció arthrospórák + - - Cryptococcus spp - + - Rhodoorula spp - - + Trichosporon cutaneum A pozitív eredmény általában azt jelenti, hogy sárga színt kapunk a BGL és az AGL tesztben, narancssárga vagy rózsaszín figyelhető meg a Trichosporon cutaneum-nál, és ez specifikus erre a fajra. Ráadásul a T.cutaneum telepeinek fonalas a szerkezetük. 8- MINŐSÉG A párizsi Pasteur Intézet és a Broussais kórház vizsgálatai szerint a FONGISCREEN® 4H-val négy óra alatt identifikálható a C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis és a C. neoformans, és egyéb élesztőkre nézve is tájékoztató adatokat nyerhetünk ennyi idő alatt. Egy 146 törzsből álló, 23 élesztő speciest reprezentáló panelen retrospektív klinikai vizsgálatot végeztek. A FONGISCREEN® 4H-val ki lehet mutatni az összes C. albicans törzset (18 vizsgált törzs), az összes C. glabrata-t (24 törzs), és az összes C. neoformans-t (11 törzs), valamint a C. tropicalis törzsek 94%-át (18 vizsgált törzs). E négy törzsre nézve 100%-os volt a teszt specificitása. A többi élesztőfajt 3 csoportba sorolhatjuk egy jól megkülönböztethető, de nem specifikus species profil szerint (ez a törzsek 99%-ára érvényes). 9- AZ ALKALMAZÁS KORLÁTAI • • A BGL teszt olykor nagyon halvány sárga színt produkál, amely nehezen értelmezhető, különösen a C. tropicalis törzs esetében. A C. tropicalis egyes, ritkán előforduló törzseinél a Trehalose (-) eredményt tévesen, S. cerevisiae–ként lehet identifikálni. 10- A GYÁRTÓNÁL FOLYÓ MINŐSÉGELLENŐRZÉS Az összes termékünk a saját minőségellenőrző rendszerünk szerint készült, a nyersanyag átvételétől kezdve a termék forgalmazásáig. Minden egyes gyártási sorozat minőségét ellenőrizzük, és csak akkor hozzuk forgalomba, ha az megfelel az előre felállított kritériumoknak. Minden sorozat gyártási és minőségellenőrzési jegyzőkönyve megtalálható a Bio-Radnál. 11- HIVATKOZÁSOK 1. BH. COOPER, M. SILVA-HUTNER. Yeasts of Medical Importance. Manual of Clinical Microbiology. Fourth edition. 1985, 526-541 2. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. Rapid methods for identification of the most frequent clinical yeasts. Rev. Iberoam. Micol. 1997. 14:85-89 3. A.M. FREYDIERE AND R. GUINET. New developments in yeast and yeast-like organisms identification methods accessible to a clinical microbiology laboratory. (soumis à Clin. Microbiol. Rev.) 4. H. FRICKER-HIDALGO, B. LEBEAU, V. LACASSAGNE, P. KERVROEDAN, P. AMBROISE-THOMAS, AND R. GRILLOT. Identification rapide de Candida albicans, Candida tropicalis, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans par Fongiscreen® 4H. Evaluation sur 191 souches de levures. J. Mycol. Med. 1993. 3:103-106. 5. R. GRILLOT. Les mycoses humaines : démarche diagnostique. Elsevier, Paris. 1996. 6. W. KELLEY. Rapid Identification of Candida albicans, abstr. C-337, p.384. Abstr 86th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1986. American Society for Microbiology. Washington D.C. 7. V. LAVARDE, M. COHEN, O. RONIN, P. KERVROEDAN, B. DUPONT. 1991. Abstr.1233, p.105 - 5th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases/Oslo 8. J.P. LEPARGNEUR, A. BOUCAYS. M.D. LINAS, J.P. SEGUELA. Profil enzymatique de levures d’intérêt médical - Essais préliminaires. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1985, XIV, N°2, p. 227-230. 9. M. MALLIE, B. MONTES, J.C. LEBECQ, J.M. BASTIDE. Etude du profil enzymatique de quelques levures. Bull. Soc. Fr. Mycol. Méd., 1989, XVIII, N°1, p. 103-108. - CE jelzés (Európai direktíva 98/79/CE az in vitro diagnosztikai célú orvosi eszközökről) - Csak in vitro diagnosztikai felhasználásra! - Katalógusszám - Gyártó - Meghatalmazott Képviselet - Gyártási szám - Szavatossági idő - Tárolási hőmérsékleti határok - Lásd a használati utasítást A tesztleírás az Európai Direktíva által előírt egyéb idegen nyelveken a Bio-Rad helyi képviseleteinél megtalálható. - CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices) - Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnostic in vitro) - Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro) - EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika) - Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro) - Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnóstico in vitro) - CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik) - CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik) IVD - For in vitro diagnostic use - Pour diagnostic in vitro - Para diagnóstico in vitro - In vitro-Diagnostikum - Per uso diagnostico in vitro - Para uso em diagnóstico in vitro - In vitro diagnostik - In vitro diagnose - Manufacturer - Fabricant - Fabricante - Hersteller - Produttore - Fabricante - Tillverkad av - Fremstillet af LOT EC REP - Batch code - Code du lot - Código de lote - Chargen-Bezeichnung - Codice del lotto - Código do lote - Batch nr. - Batchkoden - Storage temperature limitation - Limites de températures de stockage - Temperatura limite - Lagerungstemperatur - Limiti di temperatura di conservazione - Limites de temperatura de armazenamento - Temperaturbegränsning - Temperaturbegrænsning 82 REF - Catalogue number - Référence catalogue - Número de catálogo - Bestellnummer - Numero di catalogo - Número de catálogo - Katalognummer - Katalognummer - Authorised Representative - Représentant agréé - Representante autorizado - Bevollmächtigter - Distributore autorizzato - Representante Autorizado - Auktoriserad representant - Autoriseret repræsentant - Expiry date YYYY/MM/DD - Date de peremption AAAA/MM/JJ - Estable hasta AAAA/MM/DD - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG - Data de expiração AAAA/MM/DD - Utgångsdatum År/Månad/Dag - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD i - Consult Instruction for use - Consulter le mode d'emploi - Consulte la instrucción para el uso - Siehe Gebrauchsanweisung - Consultare le istruzioni per uso - Consulte o folheto informativo - Se instruktionsanvisning vid användning - Se instruktion før brug The other languages which are required in conformity to the European Directive can be obtained from your local Bio-Rad agent. Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponibles auprès de votre représentant Bio-Rad local. Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la Directiva Europea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad. Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVD Direktive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-Rad Niederlassung. Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europee possono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad. As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a Directiva Europeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próxima de si. Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från din lokala Bio-Rad-representant. De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås ved henvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør. 83 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré 92430 Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 84 10/2003 code: 8xxxxxx