Comparaison de la microscopie à fluorescence avec la technique

INT J TUBERC LUNG DIS 3 (12): 1101-1105
© 1999 IUATLD
Comparaison de la microscopie à fluorescence avec la
technique de Ziehl-Neelsen pour la bacilloscopie de
l'expectoration
F. Ba,* H. L. Rieder†
*Laboratoire National de Référence pour la Tuberculose, Programme National de lutte contre la Tuberculose,
†
Dakar, Sénégal, Division de la Tuberculose, Union Internationale contre la Tuberculose et les Maladies
Respiratoires, Paris, France
_______________________________________________________________________RESUME
CADRE : Laboratoire National de Référence pour la Tuberculose à Dakar au Sénégal.
OBJECTIFS : Comparaison des résultats obtenus par microscopie à fluorescence ou à lumière blanche pour la
recherche des bacilles acido-résistants.
METHODOLOGIE : Entre janvier 1996 et juin 1998, deux frottis provenant de 2630 échantillons consécutifs
d'expectoration ont été préparés pour une examen à l'aveugle d'un frottis soit par la technique de Ziehl-Neelsen,
soit par microscopie à fluorescence avec un agrandissement de 1000 fois. La durée nécessaire pour déclarer une
lame négative a été déterminée pour les deux techniques sur un échantillon de 68 lames.
RESULTATS : La concordance fut respectivement de 96,9% et de 92,3% pour les examens de diagnostic ou de
suivi. Le rendement fut similaire pour les deux techniques pour les échantillons comportant au moins 10 bacilles
pour 100 champs, mais meilleur pour la microscopie à fluorescence chez ceux ayant moins de 10 bacilles pour
100 champs. La durée moyenne exigée par la microscopie à fluorescence avant de déclarer une lame négative
avec le même agrandissement est de 3 minutes 34 secondes par comparaison à 7 minutes 44 secondes avec la
technique de Ziehl-Neelsen.
CONCLUSIONS : Les résultats obtenus avec une technique sont hautement reproductibles avec l'autre. La
microscopie à fluorescence semble plus apte que la microscopie à lumière blanche à détecter les bacilles dans les
cas paucibacillaires, et elle réduit de plus de moitié le temps nécessaire à l'examen.
MOTS CLEFS : tuberculose ; bacilles acido-résistants ; auramine O ; fluorescence ; microscopie ; Ziehl-Neelsen
LA TECHNIQUE DE COLORATION des bacilles
acido-résistants (BAAR) actuellement attribuée à
Ziehl et Neelsen a évolué grâce à la contribution de
nombreux chercheurs.1 Une standardisation de
cette technique a été recommandée par l'Union
Internationale contre la Tuberculose et les
Maladies Respiratoires (UICTMR) en 1978.2
L'utilisation de l'auramine O, un colorant
fluorescent au lieu de la carbolfuchsine a été
proposée pour la première fois dans les années
1930,3 mais n'a connu une large application dans
les pays industrialisés que quelques 30 ans après,
après une réévaluation approfondie de la technique
et l'emploi d'une combinaison d'auramine O et de
rhodamine.4
Une étude provenant du Kenya a montré une
sensibilité supérieure de la microscopie à
fluorescence par comparaison avec la microscopie
à lumière blanche pour les lames de faible densité,5
et la microscopie à fluorescence s'est avérée au
moins aussi fiable que la microscopie à lumière
blanche.6 L'avantage le plus communément cité en
faveur de la microscopie à fluorescence est la
possibilité d'examiner un frottis d'expectoration à
un agrandissement de 250x plutôt que de 1000x, ce
qui permet une réduction théorique du temps
d'examen de la même zone à un seizième puisque
la surface augmente par le carré du diamètre.
Pratiquement, le temps d'examen est réduit
d'environ 10 fois avec la fluorescence comparée à
la microscopie à lumière blanche, utilisant un
agrandissement quatre fois supérieur (250x vs.
1000x).7 Les désavantages incluent les coûts plus
élevés d'investissement et d'entretien et la moindre
robustesse du microscope à fluorescence comparés
au microscope à lumière blanche.8 Ceci peut
expliquer en partie la sous-utilisation de la
microscopie à fluorescence dans beaucoup de
situations.
Auteur pour correspondance : Dr Fatoumata Ba, Programme National de Lutte contre la Tuberculose, BP 5899, Dakar-Fann,
Senegal.
[Traduction de l'article "A comparison of fluorescence microscopy with the Ziehl-Neelsen technique in the examination of
sputum for acid-fast bacilli" Int J Tuberc Lung Dis 1999 ; 3 (12): 1101-1105.]
2
The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease
Malgré
l'équivalence
supposée
des
caractéristiques
opérationnelles
des
deux
méthodes, lorsque la méthode de fluorescence est
introduite, il est souvent recommandé que tout
résultat positif soit reconfirmé par réexamen de la
même lame selon la technique de ZiehlNeelsen.6,7,9
Dans l'étude actuelle, nous avons choisi une
approche d'évaluation indirecte des caractéristiques
opérationnelles des deux méthodes et la
comparaison du temps nécessaire pour examiner
un frottis par l'emploi des deux méthodes, en
utilisant le même agrandissement, avant de
déclarer le frottis négatif.
MATERIEL ET METHODES
Le Laboratoire National de Référence pour la
Tuberculose à Dakar, Sénégal, reçoit des
échantillons d'expectoration pour bacilloscopie de
routine. Les examens sont exécutés dans le cadre
du diagnostic et du suivi de la réponse
bactériologique
à
une
chimiothérapie
antituberculeuse chez les patients initialement
positifs à l'examen direct et réexaminés après 2
mois, 5 mois et à la fin d'un régime de traitement
de 8 ou de 12 mois. La définition d'une tuberculose
pulmonaire bactériologiquement confirmée est
basée au Sénégal sur deux échantillons consécutifs
spontanément produits et positifs à l'examen direct
par la méthode standard de Ziehl-Neelsen.
Entre janvier 1996 et juin 1998, deux lames ont
été préparées à partir de chaque échantillon reçu au
laboratoire, une pour l'examen par la technique de
Ziehl-Neelsen et l'autre pour l'examen par
microscopie à fluorescence. On a utilisé pour la
technique de Ziehl-Neelsen, la fuchsine (basique)
pour
coloration
microscopique
« Gurr »
« Certistain »® avec un contenu minimum de
colorant de 88% (BDH, Dorset, GB) et le bleu de
méthylène pour coloration microscopique « Gurr »
« Certistain »® avec un contenu minimum de
colorant de 82% (BDH).2 La décoloration a été
réalisée par la méthode à l'acide sulfurique de
l'UICTMR. Pour la microscopie à fluorescence,
l'on a utilisé l'auramine O (Merck, Darmstadt,
Allemagne) selon la méthode proposée par
Chadwick avec une contre coloration par du
permanganate de potassium à 0,5% avec un
contenu minimum de 99% (Merck). Le microscope
à fluorescence a utilisé comme source de lumière
un brûleur à vapeur de mercure.
Seul le résultat obtenu par la technique de
Ziehl-Neelsen dans l'examen de l'échantillon a été
fourni au clinicien prescripteur. Trois techniciens
ont fait une tournante de lecture des lames
préparées pour l'une ou l'autre méthode (lumière
blanche ou fluorescence), en prenant soin qu'aucun
d'entre eux ne lise au moyen des deux méthodes les
lames provenant du même échantillon. Les
techniciens ignoraient le résultat obtenu par l'autre
technique. Le registre spécial pour la microscopie à
fluorescence a été complété sur une base régulière
par les résultats obtenus au moyen de la technique
de Ziehl-Neelsen enregistrés dans le registre de
laboratoire de la microscopie de routine. A la fin
de la période d'étude, toutes les données ont été
informatisées et analysées par EPI Info (US
Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, GA, Version 6.04b, 1997).
L'examen et l'enregistrement du résultat de
chaque lame ont été exécutés exactement de la
même manière pour les deux techniques. Avec les
deux microscopes, on a employé de l'huile à
immersion, avec un oculaire 10x et un objectif
100x. Exactement 200 champs ont été examinés
avant qu'une lame ne soit déclarée négative ou
douteuse. Une centaine de champs ont été
examinés pour les échantillons qui s'avéraient
positifs 1+, environ 50 champs pour les lames
cotées comme positives 2+ et environ 20 champs
pour les lames qui s'avéraient positives 3+. La
codification du nombre de bacilles observés était
enregistrée selon les recommandations de
l'UICTMR.2,11
Pour évaluer le temps nécessaire à l'examen,
une étude complémentaire a été conduite après
l'étude principale lorsque 68 lames qui avaient été
trouvées négatives par la méthode de fluorescence
furent recolorées et relues par la méthode de ZiehlNeelsen. Le temps nécessaire pour l'examen était
enregistré pour les deux méthodes et les deux
lectures étaient assurées par le même technicien
expérimenté.
RESULTATS
Des 1687 patients consécutifs envoyés pour
examen bacilloscopique des expectorations
pendant la période d'étude, 1678 ont eu un ou
plusieurs résultats appariés de lecture. De ceux-ci,
un total de 2630 résultats appariés ont été
disponibles (Tableau 1). De ces paires, 1491
étaient des échantillons de diagnostic provenant de
549 patients et 1139 étaient des examens de suivi
provenant de 1129 patients. Pour ces derniers, on
n'a pas tenté d'identifier la période à laquelle
l'échantillon avait été recueilli pendant le
traitement. La directive classique recommande que
l'on pratique trois examens dans le cadre du
diagnostic et un seul examen pour l'appréciation
des améliorations bactériologiques. Donc, le
nombre de patients ayant plus d'une lame lors d’un
contrôle au cours du traitement fut très faible.
La microscopie à fluorescence et la tuberculose
Tableau 1 Résumé d'une comparaison des résultats
obtenus avec la microscopie à fluorescence et la
microscopie utilisant la technique de coloration de ZiehlNeelsen
ZiehlNeelsen
Microscopie à fluorescence
Neg
1-3 4-9 +
++
Neg
1-3
4-9
+
++
+++
Total
1165
4
1
2
0
0
1172
Neg
1-3
4-9
+
++
+++
Total
Neg
1-3
4-9
+
++
+++
Total
+++ Total
Diagnostic
1
0
0
2
1
0
6
0
0
34
6
1
8
43
7
2
23 122
53
73 130
Suivi
861
48
19
5
0
0
9
9
9
3
0
0
6
4
9
17
0
0
1
5
6
71
12
0
0
0
0
9
20
1
0
0
0
0
4
11
877
66
43 105
36
12
Total des diagnostics et des suivis
2026
83
22
6
0
0
13
19
10
5
1
0
7
6
13
23
0
0
3
8
9 105
18
1
0
1
1
17
63
8
0
0
0
2
27 133
2049 117
55 158 109 142
35
10
2
3
1
0
51
3
1
4
3
1
0
12
1204
18
13
49
60
147
1491
933
30
36
95
30
15
1139
2137
48
49
144
90
162
2630
Neg = Négatif ; 1-3 = 1-3 BAAR/100 champs ; 4-9 = 4-9 BAAR/
100 champs ; + = 10-99 BAAR/100 champs ; ++ = 1-10
BAAR/champ ; +++ = plus de 10 BAAR/champ.2,11
Une analyse par patient a montré que le taux de
concordance des résultats positifs (au moins un
BAAR dans tout examen) ou négatifs (pas un seul
BAAR) fut de 96,0% pour les examens de
diagnostic et de 91,9% pour les examens de suivi.
Une étude plus détaillée par spécimen a montré
que la concordance globale des deux méthodes,
appliquées chacune sur une lame différente
quoique provenant du même échantillon, était pour
la décision de positivité ou de négativité de 96,9%
pour le diagnostic et de 92,3% pour les examens de
suivi (Tableau 2). Comme la concordance diminue
pour les décomptes bacillaires plus bas, la
concordance a été déterminée pour les lames où au
moins quatre bacilles sur 100 champs avaient été
décelés par les deux méthodes. Les concordances
Tableau 2 Concordance entre fluorescence et
microscopie selon Ziehl-Neelsen
Groupe
Tous les résultats
Après exclusion des très
faiblement positifs*
Après exclusion de tous les
faiblement positifs†
Diagnostic
Suivi
Total
0,969
0,995
0,923
0,971
0,949
0,985
0,998
0,994
0,996
* Très faiblement positifs = 1-3 BAAR/100 champs
†
Faiblement positif = 1-9 BAAR/100 champs
3
respectives pour les examens de diagnostic et de
suivi furent alors de 99,5% et de 97,1%. Si la
comparaison se limite aux lames comportant au
moins 10 bacilles sur 100 champs, les taux de
concordance augmentent à 99,8% et 99,4%
respectivement pour les deux catégories de cas.
La distribution proportionnelle des lames
positives par richesse bacillaire, catégorie de cas et
technique est reprise au Tableau 3. Pour les
examens de diagnostic, chaque technique a
identifié exactement le même nombre de cas où au
moins 10 bacilles avaient été décelés sur 100
champs. Une proportion considérable des lames
positives ont montré des résultats faiblement
positifs (un à neuf bacilles sur 100 champs). Une
grande différence a été observée entre les résultats
obtenus par les deux techniques pour ces lames à
résultats paucibacillaires. La différence était plus
faible pour les cas où au moins 10 bacilles étaient
décelés sur 100 champs. La différence entre les
techniques est particulièrement prononcée dans les
résultats très paucibacillaires (un à trois bacilles
sur 100 champs). Si l'on considère exclusivement
les échantillons ayant au moins quatre BAAR par
champ, alors les différences en faveur de la
microscopie à fluorescence se retrouvent
exclusivement dans les examens de suivi.
Trente-cinq des 48 cas dont les résultats très
paucibacillaires avaient été identifiés par la
méthode de Ziehl-Neelsen ont été confirmés par la
microscopie à fluorescence sur la seconde lame
provenant du même échantillon et à l'inverse,
seulement 34 des 117 résultats trouvés très
paucibacillaires par la microscopie à fluorescence
ont été confirmés par la microscopie à lumière
blanche. Il faut donc considérer que les autres
résultats non confirmés pourraient indiquer pour la
microscopie à fluorescence une plus haute
sensibilité ou une plus basse spécificité (entraînant
plus de résultats faussement positifs). Globalement
la microscopie à fluorescence a obtenu
virtuellement les mêmes résultats que la technique
de Ziehl-Neelsen, mais a identifié nettement plus
d'échantillons positifs où les bacilles étaient rares
et surtout très rares.
Le temps moyen exigé pour examiner 200
champs sur 68 lames avant de les déclarer
négatives a été de 3 minutes 34 secondes par la
microscopie à fluorescence et de 7 minutes 44
secondes par la technique de Ziehl-Neelsen (où
dans un des cas un bacille a été trouvé dans une
seconde centaine de champs).
DISCUSSION
Une étude antérieure, réexaminant par la technique
de Ziehl-Neelsen à l'endroit des lames où des
4
The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease
Tableau 3 Distribution des lames positives par quantification, par catégorie de cas et par technique
Résultat quantifié
1-3 BAAR/100 ch.
4-9 BAAR/100 ch.
Tous les faiblement
positifs
1+
2+
3+
Tous les positifs de 1+
à 3+
Tous les positifs
Diagnostic
Ziehl-Neelsen
Fluorescence
n
(fraction) n
(fraction)
18
0,063
51
0,160
13
0,045
12
0,038
0,108
63
0,197
31
Suivi
Ziehl-Neelsen
N
(fraction)
30
0,146
36
0,175
66
0,320
n
Fluorescence
(fraction)
66
0,252
43
0,164
109
0,416
49
60
147
256
0,171
0,209
0,512
0,892
53
0,166
73
0,229
130 0,408
256
0,803
95
30
15
140
0,461
0,146
0,073
0,680
105
36
12
153
0,401
0,137
0,046
0,584
287
1,000
319
206
1,000
262
1,000
1,000
BAAR = Bacilles acido-résistants; 1+ = 10-99 BAAR/100 champs; 2+ = 1-10 BAAR/champ; 3+ = plus de 10 BAAR/champ 2,11
BAAR avaient été trouvés par la microscopie à
fluorescence, avait montré qu’on ne retrouve plus
certains bacilles.12 Cette observation pourrait
refléter soit une diminution de spécificité, soit une
augmentation de sensibilité de la microscopie à
fluorescence. Une étude, conduite peu de temps
après la première description de la microscopie à
fluorescence avait suggéré une plus forte affinité
de la carbol-auramine que de la carbol-fuchsine à
l'égard de l'acide mycolique,13 ce qui plaiderait en
faveur de la notion d'une augmentation de
sensibilité plutôt que d'une diminution de
spécificité de la microscopie à fluorescence pour
les BAAR.
Dans beaucoup de pays à faibles revenus, il
n'est pas possible d'établir la validité des résultats
obtenus par la microscopie à fluorescence en
utilisant comme gold standard la positivité de la
culture d'une espèce pathogène du complexe
Mycobacterium tuberculosis. Ceci était également
le cas au laboratoire de référence du Sénégal, où la
technique de culture n'avait pas encore été
introduite au moment où cette étude a été menée.
Les résultats de cette étude suggèrent qu'il n'est pas
nécessaire de recourir à la culture comme gold
standard vu la forte cohérence entre les résultats
obtenus par les deux techniques sur deux lames
différentes provenant du même échantillon. En fait,
cette approche au moyen de deux lames différentes
démontre l'équivalence des techniques au
laboratoire national de référence. La haute
cohérence des deux méthodes résout une question
essentielle de contrôle de qualité, en utilisant un
système de contrôle de qualité interne sans recours
à la culture ou à des tests de compétence externe.
Néanmoins, le recours à la culture pourrait être
valable, particulièrement pour les résultats très
faiblement positifs avec très rares bacilles à
l'examen microscopique, à la fois pour confirmer
les données microscopiques et pour le contrôle
interne de qualité.
La mise en évidence de BAAR au cours du
traitement n'est pas nécessairement significative du
point de vue clinique puisque les bacilles trouvés à
l'examen microscopique peuvent ne pas être
viables.14-18 Toutefois, les BAAR observés au
cours du traitement d'un patient dont la
bacilloscopie initiale était positive sont très
vraisemblablement des bacilles tuberculeux, soit
vivants, soit morts puisque la prévalence de faits
de ce type est élevée. Donc, le fait de trouver des
BAAR à une fréquence plus élevée au moyen de la
microscopie à fluorescence indiquerait une plus
grande sensibilité plutôt qu'une plus faible
spécificité de la technique pour l'identification des
bacilles tuberculeux. D'autre part, l'identification
des rares bacilles non viables au cours du
traitement peut poser un problème de gestion,
puisqu'on recommande habituellement que la mise
en évidence tardive de BAAR au cours du
traitement devrait entraîner le passage à un régime
de traitement de seconde ligne,10 ce qui soumettrait
ce type de patients à un traitement inutile.
Les résultats de cette étude ne permettent pas de
tirer une conclusion définitive concernant une
sensibilité plus grande de la microscopie à
fluorescence car, quoiqu'il y ait eu rotation des
techniciens, celle-ci n'a pas été systématique. Il est
dès lors possible qu'un technicien qui était plus
efficace dans l'identification des résultats très
faiblement positifs ait travaillé par hasard de façon
plus fréquente à la fluorescence plutôt qu'à la
microscopie à lumière blanche. D'autre part, dans
le cas de l'examen cyto-morphologique des
échantillons habituellement très paucibacillaires
provenant de patients atteints de tuberculose
ganglionnaire et obtenus par ponction-aspiration à
l'aiguille fine, la microscopie à fluorescence a, par
comparaison avec les observations histopathologiques et morphologiques, une sensibilité
supérieure à la microscopie à lumière blanche
utilisant la technique de Ziehl-Neelsen.19
La microscopie à fluorescence et la tuberculose
De nombreuses données sur la sensibilité et la
spécificité de la microscopie à lumière blanche et à
fluorescence comparées à la culture ont été
rassemblées et analysées par Kubica.6 Dans cette
étude, il a été démontré que pour les deux
méthodes, les correspondances avec la culture
diminuaient avec la décroissance du nombre de
bacilles. Les résultats douteux (bacilles très rares) à
la microscopie à fluorescence étaient plus
piètrement corrélés avec la culture que les résultats
douteux obtenus par la technique de Ziehl-Neelsen.
Toutefois, les agrandissements utilisés pour les
deux techniques n'étaient pas comparables.
Lorsque l'on stratifie selon l'agrandissement au
microscope à fluorescence, à l'agrandissement de
450 X (le plus puissant étudié), la correspondance
avec la culture de la présence de 3 à 6 bacilles sur
100 champs était en fait supérieure à celle de 3 à 6
bacilles sur 100 champs avec un agrandissement de
1000X par la technique de Ziehl-Neelsen.6 Il est
vraisemblable que l'utilisation d'un agrandissement
de 1000X au microscope à fluorescence, tel que
celui utilisé dans notre étude, pourrait encore
augmenter davantage la spécificité du test. Aucune
recommandation spécifique concernant les limites
de positivité ne devrait être faite à partir de l'étude
en cours et les techniciens de laboratoire devraient
signaler tous les BAAR qu'ils observent,11 alors
que les directeurs du programme de tuberculose
devraient se décider au sujet d'une tactique pour la
façon de traiter les résultats douteux dans chacune
des deux techniques. Ceux-ci entraîneront
habituellement
la
demande
d'échantillons
complémentaires pour examen.
Cette étude démontre également que la
microscopie à fluorescence, même avec l'emploi
d'huile à immersion, permet d'épargner encore plus
de deux fois le temps d'examen nécessaire par
rapport au microscope à lumière blanche. Ceci
résulte probablement du fait que le contraste
fluorescent causé par les BAAR est remarqué
beaucoup plus vite que le rouge du BAAR contre
un fond bleu à la microscopie à lumière blanche. Il
en résulte que les laboratoires introduisant la
microscopie à fluorescence pourraient bien
examiner dans la phase initiale les lames sous huile
à immersion jusqu'à ce qu'ils aient une confiance
suffisante dans la technique pour procéder à
l'examen avec un plus faible agrandissement. Une
fois que l'agrandissement plus faible est utilisé en
routine, les résultats douteux peuvent alors être
examinés par passage à l'huile à immersion plutôt
que par recoloration de la lame au moyen de la
technique de Ziehl-Neelsen.
La microscopie à fluorescence est un outil utile,
rapide et fiable pour l'examen des échantillons à la
5
recherche de BAAR. Elle devrait être prise en
considération sérieusement pour une utilisation
supplémentaire dans les laboratoires qui traitent de
grands nombres de spécimens. Les coûts initiaux
d'investissement en capital, en entretien et les
fluctuations du courant électrique empêcheront
néanmoins son utilisation sur une large échelle au
niveau périphérique (provincial ou régional) dans
beaucoup de pays à faibles revenus, mais elle
devrait clairement être disponible dans chaque
laboratoire national de référence qui traite en
routine de grands nombres de spécimens. 11
Remerciements
Les auteurs ont apprécié le soutien technique de Ms Andrée
Mendy et Ms Maguette Diop Ndiaye et leur diligence dans la
préparation des lames, l'examen microscopique et
l'enregistrement méticuleux des résultats. Les auteurs sont
également reconnaissants au Dr Armand Van Deun pour les
commentaires critiques du manuscrit.
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