1ère Journée Scientifique du Médicament

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1ère Journée Scientifique du
Médicament :
Nouvelles Stratégies
Thérapeutiques
Grenoble, le 23 Juin 2011
Thématique :
Vectorisation et transfert de matériel génétique
1ère Journée Scientifique du Médicament – 23 Juin 2010
1
ION CHANNEL CELL LINES: TOOLS FOR ASSESSMENT OF
PRE-CLINICAL CARDIAC RISK
Anne-Laure Filiputti-Gilquin,1 Pierre-Yves Perche1
1
CreaCell company, Biopolis bld, 5 avenue du Grand Sablon, La Tronche
Contact : [email protected]
Contraction and relaxation of the heart are stimulated by ventricular depolarization and
repolarization, respectively. For each step of the cardiac action potential, flow of ions takes
place in the myocytes. And for each movement of a specific ion, ion channels are implicated.
When the movement of ions across the channels is disturbed, a prolongation of the QT
interval may be observed on ECG. Then, ventricular arrhythmias may develop and they can
be lethal if untreated.
Among cardiac ion channel, hERG encodes the pore-forming subunit that conducts the rapid
component of the delayed rectifier potassium current (IKr) in the heart. Drug-induced
blockade of hERG may result in increase susceptibility to QT-interval prolongation, leading
to ventricular tachycardia and sudden cardiac death. Such findings have led to a
recommendation from the ICH (International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use) that all new drugs be
tested in assays to assess hERG block involvement before they are administered to humans.
Assays include the patch-clamp analysis of "ion channel cell lines", heterologous expression
systems where human ion channel proteins are expressed in noncardiac cell lines after stable
gene transfer.
Efficient ion channel cell lines expressing the hERG channel are a very sensitive way to assay
hERG channel activity and predict cardiac risk early and accurately in the drug development
process. And besides hERG, key ion channels implicated in the cardiac action potential can
be tested. CreaCell team has developed such cellular models that will be presented.
2
IDENTIFICATION D’UN INHIBITEUR SELECTIF DE PP1 QUI
DETRUIT LES VAISSEAUX TUMORAUX
Aurélie Juhem1*, Chi-Hung N’Guyen2, Boudewijn Van Der Sanden3, Cyril
Zenga1, Jean-Claude Florent 2 et Andrei Popov1
1
Ecrins Therapeutics, 2 UMR 176 Institut Curie, 3 INSERM U836 Equipe 7 GIN
* Contact : [email protected]
La chimiothérapie, avec la chirurgie et la radiothérapie, reste une des approches les
plus utilisées pour le traitement du cancer. Bien qu'il existe de nombreuses molécules anticancéreuses, il demeure un besoin constant de nouvelles thérapeutiques plus efficaces et
moins toxiques.
Au début des années 70, émerge l’idée de cibler le système vasculaire tumoral.
D’abord avec des stratégies d’inhibition de l’angiogénèse tumorale (Folkman J 1971), puis en
1982, le professeur Denekamp propose une autre approche : la destruction des néovaisseaux
tumoraux (Denekamp J 1982). Cette idée a donné naissance à une nouvelle classe de
molécules anticancéreuses : les « VDAs » pour Vascular Disrupting Agents. Ces molécules
agissent sur les cellules endothéliales constituant les néovaisseaux tumoraux et provoquent un
collapsus du système vasculaire qui produit un arrêt du flux sanguin conduisant à une nécrose
de la masse tumorale.
En recherchant des molécules antiprolifératives par un criblage phénotypique, nous
avons identifié un nouvel agent VDA, la molécule D5. Par rapport aux autres VDA existants,
D5 présente une structure chimique originale, une nouvelle cible thérapeutique et est
administrable per os.
Dans un premier temps, l’effet anti-prolifératif de D5 a été évalué in vitro sur un panel
d’une dizaine de lignées cancéreuses humaines, montrant une efficacité particulière sur les
lignées de cancers du poumon et du rein.
Puis, les tests in vivo sur des modèles de xénogreffes avec une lignée de carcinome
pulmonaire humain (HTB 177) et un modèle de cancer du rein (786-O), ont montré que la
molécule est efficace per os chez la souris, provoquant une diminution de la masse tumorale
par un phénomène de nécrose.
Ensuite, les études en microscopie biphotonique ont permis de montrer que la nécrose
massive était due à l’arrêt du flux sanguin dans les tumeurs, immédiatement après
l’administration de D5, et ont permis de classer D5 parmi les VDA.
De plus, les études de toxicité chronique sur des souris nude ont montré que D5 était
bien tolérée in vivo.
L'ensemble de ces résultats met donc en évidence le potentiel de D5 en tant que
candidat médicament. Le brevet d’application de D5 pour le traitement du cancer, fournit la
base pour son entrée dans des essais pré-cliniques et cliniques dans le cadre d’une start-up
récemment créée, Ecrins Therapeutics.
3
DIAGNOSIS, TREATMENT AND FOLLOW-UP OF DIABETES
USING ZNT8-DIRECTED TECHNOLOGIES
Yann de Boysson1*, Fabrice Chimienti1
1
MELLITECH SAS
Mellitech est une société de R&D bio-pharmaceutique dans le domaine du diabète, créée à
Grenoble en Octobre 2005 pour valoriser une technologie CEA/Université Joseph Fourier.
La société compte actuellement 7 personnes et a obtenu des fonds publics (Oséo, ANR, ..) et
privés pour un montant > 2MEuros depuis sa création. Son activité s’articule autour du
développement de technologies ciblant un bio-marqueur majeur du diabète, la protéine ZnT8.
ZnT8 est un transporteur du zinc très majoritairement exprimé dans la cellule beta
pancréatique -sécrétrice d’insuline-, et a un rôle critique dans le processus de maturation et de
sécrétion de l’insuline, qui est co-cristallisée avec le zinc intracellulaire. ZnT8 est une
protéine encodée par slc30a8, un gène majeur du diabète de type II (Nature, Science, Nature
Genetics 2007), et, en tant qu’auto-antigène majeur, est très fortement impliquée dans le
processus de destruction auto-immun des cellules beta dans le diabète de type I (PNAS 2007).
C’est à ce jour, avec l’insuline, la seule molécule impliquée dans les 2 types de diabète.
Le diabète, en particulier le type II lié au manque d’activité physique et à l’obésité/la
mauvaise alimentation, est la principale cause de cécité, de maladie rénales, d’amputations
des membres chez l’adulte, et accroit considérablement le risque des complications
cardiovasculaires. Prévalence mondiale 2010 : 285 millions de patients / 2030 : 440 millions.
Les 3 projets de R&D menés au sein de Mellitech ou en collaboration sont :
Le screening, la découverte et le développement de candidats-médicaments agonistes
de ZnT8 pour le traitement du diabète de type II : l’activation de ZnT8 permet
l’augmentation du stock d’insuline disponible via un accroissement modéré des
niveaux de zinc intra-vésiculaire. Cible industrielle : industrie (bio-) pharmaceutique.
Le développement de candidats-médicaments analogues de ZnT8 pour le traitement
précoce du diabète de type I : l’injection de la protéine ZnT8 ou de peptides issus de
ZnT8 va servir de leurre pour que le système auto-immun n’attaque pas les cellules
beta en ciblant la protéine endogène. Cible industrielle : industrie (bio-)
pharmaceutique.
Le développement d’anticorps dirigés contre ZnT8 pour l’imagerie in vivo de la
cellule sécrétrice d’insuline, visant à optimiser le diagnostic et le suivi du diabète : ces
agents, en s’accrochant spécifiquement à la protéine ZnT8, permettront de visualiser
in vivo les cellules beta fonctionnelles. Cible industrielle : industrie (bio-)
pharmaceutique, industriels de l’imagerie, recherche académique et clinique.
4
NOUVEAUX AGENTS DE TRANSFECTION A PARTIR
D’AMINOGLYCOSIDES : SYNTHESES ET PROPRIETES DE
TRANSFECTION DE DERIVES DE NEAMINE LIPOPHILES
Baussanne, I.1; Le Gall, T. 2; Halder, S.1, Lehn, P. 2 et Décout, J.-L.1
1
DPM UMR5063, Université de Grenoble/CNRS, ICMG FR 2607, BP 53 F-38041 Grenoble
cedex 9 et 2INSERM U613, IFR 148 ScInBIoS, Université de Bretagne Occidentale, C.S.
2653, F-29275 Brest cedex.
Dans les 20 dernières années, les recherches sur l’utilisation de la thérapie génique
pour le traitement de maladies génétiques telles que la mucoviscidose et la maladie de
Parkinson ainsi que comme méthode alternative dans les traitements anticancéreux
traditionnels, se sont considérablement développées. Les études initiales se sont concentrées
sur l’utilisation de transporteurs viraux. Mais, bien qu’efficaces, les problèmes associés à
l’utilisation de ce type de vecteurs (immunogénicité, toxicité …) ont orienté les recherches
vers le développement de vecteurs non-viraux tels que lipides cationiques, polymères,
dendrimères et peptides.1
Les aminoglycosides naturels (antibiotiques polycationiques) sont connus pour
interagir avec l’ARN et dans une moindre mesure avec l’ADN. Des conjugués de néomycine
et de kanamycine avec des groupements hydrophobes (cholestérol, chaines grasses) ont été
développés comme vecteur de gène et se sont révélés très efficaces.2
Afin de développer de nouveaux vecteurs non-viraux, de petite taille, moins toxiques
et bio-inspirés, une série de lipides cationiques comportant comme tête polaire cationique la
néamine, a été synthétisée et leur capacité de transfection évaluée. Une étude de relations
structure-activité (RSA) nous a permis de déterminer les paramètres essentiels
(lipophilie/charge, position de substitution) et d’identifier une formulation 1,2-dioléoyl-snglycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE)/dérivé de néamine 1, afin d’obtenir une préparation
très stable et efficace comme vecteur de gène.3
NH2
O
N
NH
O
HO
H2N
NH2
O HO
NH2
OH
1
1) M. A. Mintzer, E. E. Simanek. Nonviral Vectors for Gene Delivery. Chem. Rev. 2009, 109, 259-302.
2) par exemple : M. Sainlos, M. Hauchecorne, N. Oudrhiri, S. Zertal-Zidani, A. Aissaoui, J.-P. Vigneron, J.-M.
Lehn. Kanamycin A-derived cationic lipids as vectors for gene transfection. ChemBioChem 2005, 6, 10231033
3) T. Le Gall, I. Baussanne, S. Halder, N. Carmoy, T. Montier, P. Lehn, J.-L. Décout. Synthesis and
Transfection Properties of a Series of Lipidic Neamine Derivatives. Bioconjugate Chem. 2009, 20, 20322046.
5
CATHODAL IONTOPHORESIS OF TREPROSTINIL INDUCES A
SUSTAINED INCREASE IN CUTANEOUS BLOOD FLUX IN
HEALTHY VOLUNTEERS
S.Blaise1,2,3, M.Roustit1,3,4*, M Hellmann1*, C.Millet1, J.L. Cracowski1,3,4
1
Clinical Pharmacology Department, Inserm CIC3, University Hospital, Grenoble
2
Vascular Medicine Department, University Hospital, Grenoble
3
Inserm U1042, Grenoble
4
Joseph Fourier University, Grenoble
Objective. Prostacyclin analogues are the most effective drugs to treat sclerodermic digital
ulcers, but their systemic use is limited by their frequent side effects. Topical administration
of these drugs may be a way of getting around the toxicity of systemic treatments.
Iontophoresis, a non invasive controlled transdermal delivery system using a low-intensity
electric current, could be an interesting alternative to ointments. Some authors suggest
vasodilator iontophoresis as potentially interesting in the treatment of digital ulcerations in
scleroderma. However, a commonly used vasodilator such as sodium nitroprusside is not a
good candidate given its short half-life and transient effect. We recently showed that cathodal
iontophoresis of iloprost and treprostinil increased cutaneous vascular conductance (CVC) on
the hindquarter skin of rats. We tested whether the prostacyclin analogues treprostinil and
iloprost, delivered by cutaneous iontophoresis, induce sustained vasodilatation in healthy
volunteers.
Methods. Twenty healthy volunteers received treprostinil by cathodal iontophoresis on the
forearm. Skin blood flux was quantified using laser Doppler imaging.
Results. Treprostinil at 250 µM induced an increase in cutaneous vascular conductance
AUC80min (31897 +/- 24390 %BL.min) compared to NaCl 0.9% (P<0.005), treprostinil 2.5
µM (P<0.005) and treprostinil 25 µM (P<0.005). This was confirmed when flux was recorded
for up to 10 h. Systemic and skin tolerance of treprostinil were good. Iloprost was stopped
early because of local toxicity.
Conclusions. Cutaneous cathodal iontophoresis of 250 µM treprostinil induced a large and
sustained increase in cutaneous blood flow in healthy volunteers, without systemic or topical
side-effects. The kinetics of the increased CVC following iontophoresis of treprostinil would
be compatible with intermittent iontophoresis of the drug. Therefore, topical delivery of
treprostinil via iontophoresis could be considered as an alternative method of administration
to increase the drug concentration locally avoiding its major systemic adverse effects.
Treprostinil cathodal iontophoresis should be further investigated as a new local therapy for
digital ulcers in patients with scleroderma.
Clinicaltrials.gov (NCT01082484)
6
SYNTHESIS AND EVALUATION OF INHIBITORS OF PROTEINPROTEIN INTERACTION THROUGH PDZ DOMAINS
Boucherle B,1 Vogrig A,1 Bouzidi N,1 Deokar H,1 Ripoche I,1 Thomas I,1 Marin P,2
Ducki S1*
1
Clermont Université, ENSCCF, EA987, LCHG, BP10448, F-63000 Clermont-Ferrand et 2
IGF, Universités Montpellier 1 & 2, CNRS UMR 5203 – INSERM U661, F-34094 Montpellier
PDZ domains are important protein–protein interactions domains; they are almost always
associated with the cell membrane where they play an essential role in the clustering of
proteins and signal transduction. Disrupting interaction between PDZ-containing protein
PSD-95, and its natural ligand 5-HT2A receptor, was found to reduce hyperalgesia in a rodent
model of neuropathic pain. Thus, inhibiting this interaction could lead to the development of a
novel class of analgesic agents.
Interaction of natural ligands with PDZ domains can be divided into a conserved generic site
(S0) and an adjacent specificity-determining site (S1). Our strategy is to design bidentate
ligands constituted by: one generic ligand interacting with S0, linked by a spacer to a specific
ligand interacting with S1. These bidentate ligands are designed to inhibit PDZ interaction
with specificity.
A molecular docking study allowed us to design a generic S0 ligand, to which was attached a
variable size diamine linker, itself linked to an amino acid aimed to interact with the S1 site of
PDZ domains. A series of 15 novel bidentate ligands was prepared in 6 to 11 steps in good
overall yields (24-43%). Some of these ligands showed an inhibitory activity against 5HT2A
serotonin receptor/PSD-95 interaction, as assessed by pull down assay using a synthetic
peptide corresponding to the 10 C-terminal residues of the receptor as a bait.
O
O
H2N
N
H
H
R
n N
H
O
HN
OH
7
REAL-TIME MONITORING OF BACTERIAL GROWTH USING
LABEL FREE BIOSENSORS. A NEW TOOL FOR FAST
BACTERIAL DIAGNOSIS
Sihem Bouguelia1*, Y.Roupioz1, C.Durmort2, T.Vernet2 and T.Livache1
1
Laboratoire Groupe de Chimie de la Reconnaissance et l’Etude d’Assemblages
Biologiques. SPrAM, UMR CEA / CNRS / Grenoble 1 University, INAC, Grenoble, F-38054,
France
2
Laboratoire d'Ingénierie des Macromolécules IBS, Grenoble F-38054, France
The standard diagnostic protocol for bacterial diagnosis in the medical and agronomic fields
remains microbial culture, which takes days to identify the pathogen. However, these time
lags are not compatible for instance, with the analysis of some infectious disease. There is a
strong need to develop new tools to identify pathogenic bacteria in a shorter time. To achieve
this goal, Surface Plasmon Resonance imaging (SPRi) technology has been successfully used
for the specific detection of growing bacterial populations using proteins and/or antibodies
targeting these bacteria. This strategy of simultaneous bacterial growth monitoring and
specific detection, using the SPR imaging, enabled the detection of less than 50 cfu
inoculation within few hours.
First Streptococcus pneumoniae R6 was used as a model, and then Escherichia coli K12
provided the proof that this method can be applied to other strains. Our quantitative results are
consistent with the expected doubling time of bacteria reported in the literature.
Reference: Patent FR 10/59983
Differential image
recorded at 500 min
Bacterial
innoculation
Chamber 1
Sample
Open reactor with
two chambers
Gold Layer
Chamber 2
(bacteria- free)
Signal monitoring on
the SPR Imager
LED
660 nm
CCD
camera
Setup used for bacterial growth detection
and images of the specific capture of
S.pneumoniae
Inoculation with 100 cfu/ml (50 bacteria in 500µL)
Pyrrole
IgG
Anti-CbpE
Plasminogen
Glass Prism
Polariser
Reflectivity variation (ΔR%) upon
incubation time of a functionalized
biosensor measured by SPR imaging
8
SYNTHESE ET ETUDE DES PROPRIETES DIURETIQUES
D’ANALOGUES OUVERTS DE DIHYDROBENZOPYRANES
COMPORTANT DES RESTES SULFONYLUREES
BOUHEDJA Mourad,a KHELILI Smail,a BOUMENDJEL Ahcène, b PERES Basile,b
PIROTTE Bernard c
a
Département de Chimie, Faculté des Sciences, Université de Jijel, cité Ouled –Aїssa B.P.
98 JIJEL 18000
b
Département de Pharmacochimie Moléculaire -Faculté de Pharmacie Université Joseph
Fourier de Grenoble UMR UJF/CNRS 5063
c
Laboratoire de Chimie Pharmaceutique, Université de Liège, C.H.U., 1 Avenue de l’Hôpital,
B-4000 Liège, Belgique
Ce travail porte sur la synthèse de nouvelles sulfonylurées (A, B) qui sont des analogues
ouverts de dihydrobenzopyranes (I, II) possédant des propriétés pharmacologiques très
intéressantes, dans la relaxation de l’aorte de rat (I, II) et l’inhibition de la sécrétion de
l’insuline des îlots pancréatiques de rat (II) [2, 3].
O
O
O2
S
H
R
R'
R''
O
I : R'= H
II : R'= CH3
O2
S
H
Simplification
moléculaire
R1
R3
R4
R5
OR2
A : R4 = H
B : R4 = CH3
Douze composés (12) ont été synthétisés et purifiés. La confirmation des structures
chimiques a été réalisée par les méthodes d’analyse spectroscopiques usuelles (IR, RMN1H)
et l’analyse élémentaire [3].
La plus part des produits ont montré un effet diurétique considérable sur les rat Wistar
Albinos dépassant dans quelques cas l’effet diurétique de hydrochlorothiazide pris comme
référence.
D’autre part, cet effet diurétique a été accompagné d’un effet natriurétique et par fois d’un
effet kaliurétique.
[1]. Smail Khelili, Xavier Florence, Mourad Bouhedja, Samia Abdelaziz, Nadia Mechouch,a Yekhlef Mohamed,
Pascal de Tullio,Philippe Lebrun,_ and Bernard Pirotte, Synthesis and activity on rat aorta rings and rat
pancreatic b-cells of ring-opened analogues of benzopyran-type potassium channel activators, Bioorganic &
Medicinal Chemistry ,2008, 16, 6124–6130.
[2]. Smail Khelili, Philippe Lebrun, Pascal de Tullio and Bernard Pirotte, Synthesis and pharmacological
evaluation of some N-arylsulfonyl-N-methyl-N’-(2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-4-yl)ureas structurally related
to cromakalim, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006,14, 3530–3534.
[3]. S. Khelili, Q. –A. Nguyen, P. Lebrun, J. Delarge and B. Pirotte, Synthesis and Pharmacological Evaluation
of KATP -channel Openers Related to Cromakalim : Introduction of Arylsulphonylurea Moieties, Pharm.
Pharmacol. Commun., 1999, 5, 189-193.
9
CONTRIBUTION OF DAMAGED-DNA BINDING PROTEIN 2
(DDB2) TO RECOGNITION AND REPAIR OF BULKY DNA
ADDUCTS GENERATED BY UV-B AND PLATINATING AGENTS.
Ewa Barbier1, Christophe Bounaix Morand du Puch1, Lucie Morand1, Stéphane
Mouret1, Alexandra Kraut2, Yohann Couté2, Thierry Livache3, Didier
Gasparutto1, Thierry Douki1, Philippe Becuwe4, Jean Breton1
1
CEA Grenoble, INAC, SCIB (UMR E_3 CEA-Université Joseph Fourier) – Laboratoire
Lésions des Acides Nucléiques, 17 rue des Martyrs, 38 054 Grenoble cedex 09, France
2
CEA Grenoble, iRTSV, Laboratoire d'Etude de la Dynamique des Protéomes (INSERM
U880 / Université Joseph Fourier), 17 rue des Martyrs, 38 054 Grenoble cedex 09, France
3
CEA Grenoble, INAC, SPrAM (UMR 5819 CNRS-CEA-UJF), 17 rue des Martyrs, 38 054
Grenoble cedex 09, France
4
EA 4421 - Signalisation, Génomique et Recherche Translationnelle en Oncologie
(SIGRETO) - Faculté de Médecine - 9 avenue de la Forêt de Haye - BP 184 - 54505
Vandoeuvre-lès-Nancy Cedex, France
Bulky DNA lesions such as those generated by UV or platinating drugs are mainly removed
by nucleotide excision repair. The first step of this process consists in lesion recognition by
proteins such as DDB2. Using breast cancer cells genetically modified to present different
levels of DDB2 expression, we found that this protein sensitizes cells to UV-B induced stress
and platinating agents. Using HPLC-MS-MS, we have followed DNA repair of 6 different
DNA lesions after cells exposure to UV-B and of 1,2-d(GpG) crosslinks after cells exposure
to cisplatin. We have shown that DDB2 enhances repair activity for UV-B induced
cyclobutane pyrimidine dimers. On the contrary, DDB2 does not seem to play a role in repair
of cisplatin lesions. Experiments using DNA probes damaged by UV or cisplatin allowed us
to trap proteins associated with DNA lesions. Using this approach, we have demonstrated that
the affinity of DDB2 was stronger for UV induced alterations than for cisplatin adducts. The
weak affinity of DDB2 for cisplatin crosslinks was confirmed by Surface Plasmon
Resonance. As a conclusion, these preliminary results confirmed the role of DDB2 in DNA
repair of UV-induced damage but not for those produced by cisplatin. Relationships between
DDB2 and platinating agents sensitization may involve mechanisms not requiring direct DNA
damage recognition by DDB2.
10
LIPID NANOPARTICLES: A MULTIFUNCTIONAL PLATFORM FOR
THE CONTROLLED DELIVERY OF SIRNA
J. Bruniaux*1, F. Navarro1, E. Sulpice2, I. Texier1, F. Vinet1 and X. Gidrol2
1
CEA, LETI MINATEC, DTBS, Grenoble Cedex, France
CEA, DSV, iRTSV, Biomics Grenoble Cedex, France
2
Since the discovery of RNA interference, many efforts have been made to broaden
perspectives of small interfering RNA (siRNA) in research and clinical work. In this way, this
mechanism is an useful approach in research for the understanding of dysregulation occurring
in pathogenesis, especially in cancerogenesis. Moreover, siRNA shows a specific and
effective gene silencing activity through a sequence specific down-regulation of the
complementary messenger RNA as well as a tremendous potential as therapeutic agent for
treatment of numerous diseases.
However, the siRNA-mediated gene knock down requires that siRNA can reach the
protein complex RISC in the cytoplasm, where siRNA allows the specific degradation of
corresponding mRNA. Unfortunately, the siRNA is relatively vulnerable in the extracellular
environment due to the presence of degradation enzymes and its high molecular weight
associated to its anionic charge limit considerably its cell incorporation across the plasma
membrane.
To overcome these obstacles, multifunctional nanoparticles comprising an imaging
contrast agent are emerging as an original and promising approach in the monitored delivery
of siRNA. We have designed lipid nanocarriers entrapping lipophilic cyanine derivatives for
fluorescence imaging purposes, as a biocompatible alternative of the well-known quantum
dots. Recently, we have adapted this formulation of lipid nanoparticles by incorporating some
cationic compounds in order to design a novel nanocarrier dedicated to siRNA delivery.
These modifications do not influence the colloidal stability of the dispersion and enable a
complexation of positively charged nanoparticles with TAMRA-stained siRNA. The
transfection efficiency using these complexes is under investigation in a cell model overexpressing the green fluorescent protein (GFP). Next steps include the improvement of
preparation methods in a fully RNAse free environment and the surface functionalisation of
particles with specific ligand in order to target and transfect cells which present resistance to
commercially available agents.
11
STRATEGIE DE DEVELOPPEMENT DE NOUVEAUX LIGANDS
CB2
N. Chavain,1 P. Gilleron,1 J. El Bakali,1 F. Klupsch,1 D. Baudelet,1 V. Moas
Heloire,2 P. Carato,2 V. Lucas,1 A. Lemoine,1 R. Mansouri,1 C. Furman,1 N.
Renault,2 M. Body-Malapel,3 G. Muccioli,6 E. Lipka,2 C. Vaccher,2 J.P. Bonte,2
D.M. Lambert,4 P. Desreumeaux,3 P. Chavatte,1 R. Millet1*
1
Institut de Chimie Pharmaceutique Albert Lespagnol, Université Lille-Nord de France, EA
4481, IFR 114 ; 2, Faculté de Pharmacie, Université Lille Nord de France EA 4481, IFR 114 ;
3
Unité de Physiopathologie des Maladies Inflammatoires Digestives, Université Lille Nord de
France, INSERM U995; 4 Unité de Chimie Pharmaceutique et de Radiopharmacie, Louvain
Drug Research Institute, Université Catholique de Louvain (Belgique)
Les Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI) touchent
200 000 personnes en France et 2,5 millions de personnes dans le monde. Malgré leur
fréquence, elles sont largement méconnues. On distingue deux formes principales de
pathologies : la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn, qui partagent de nombreuses
similitudes épidémiologiques, thérapeutiques et cliniques. La principale différence réside dans
la localisation des lésions.
Le récepteur CB2 est le deuxième sous-type de récepteurs aux cannabinoïdes connu à
ce jour. Sa localisation au niveau des cellules immunitaires met en évidence l’implication de
ce récepteur dans les effets immunomodulateurs induits par les cannabinoïdes. De récentes
publications s’accordent à donner un rôle de plus en plus important au récepteur CB2 dans
l’inflammation et le contrôle de la réponse immunitaire. Actuellement, on compte uniquement
4 agonistes CB2 en développement pour des indications thérapeutiques relatives à la douleur
inflammatoire, la dermatite atopique, l’allergie (prurits) et les accidents vasculaires cérébraux.
Aucun ligand CB2 n’est actuellement en développement dans le traitement des MICI.
Notre projet a pour objectif de faire émerger une nouvelle classe d’agents
thérapeutiques ciblant les récepteurs CB2, et utilisable dans le traitement des MICI. Nous
avons choisi de nous focaliser sur cette niche thérapeutique particulière des MICI suite aux
premiers résultats très prometteurs obtenus in vivo. A l’heure actuelle, la preuve du concept a
déjà été validée et ce projet a donné lieu à 7 publications, deux brevets et deux ANR. Ainsi,
l'objectif général du projet est de sélectionner parmi les différents agonistes CB2 obtenus, un
candidat médicament possédant des propriétés pré-ADME-Tox et des résultats in vivo
suffisants pour pouvoir être proposés à un partenaire industriel. L’étude des propriétés
ADME-Tox sera un facteur important dans le choix des composés à évaluer in vivo.
L’objectif final est d’obtenir un composé actif par voie orale qui succède au traitement de
base du 5-ASA.
12
MORPHOLOGY AND STRUCTURE OF NANOPARTICLES
DIRECTED BY THE PHYSICOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF
BUILDING BLOCKS BIOESTERIFIED CYCLODEXTRINS
Luc Choisnard1*, Annabelle Gèze1, Cécile Vanhaverbeke1, Josias B.G.
Yaméogo1,2, Jean-Luc Putaux3, Bernard Brasme4, Laure Jullien5, Stéphanie
Boullanger3, Delphine Levilly1, Claire Elfakir6, Denis Wouessidjewe1
1
DPM, UMR CNRS 5063, ICMG FR 2607, UFR of Pharmacy, University of Grenoble,
France; 2 UFR/SDS, University of Ouagadougou, Burkina Faso; 3 CERMAV, UPR CNRS
5301, ICMG FR 2607, Grenoble, France; 4 ICMG FR2607, UFR Chemistry, University of
Grenoble, France; 5 DCM, UMR 5250, ICMG FR 2607, UFR Chemistry, University of
Grenoble, France; 6 ICOA, UMR CNRS 6005, FR 2708, UFR Sciences, University of
Orléans, France
Nanoparticles of amphiphilic -, - and -cyclodextrins were obtained by formulation of
cyclodextrins enzymatically transesterified with vinyl decanoate. The product of this
synthesis is a mixture of bioesterified cyclodextrins with various degrees of substitution (DS)
and presenting for a same DS different regio-isomer.
In a first step, the efficiency of a MALDI-TOF procedure to characterize the average
molecular weight of the derivative bulk mixture was demonstrated by comparing the results
with those obtained from complementary NMR and HPLC techniques.
In a second step, the SAXS ultrastructure of nanoparticles prepared from three different
batches of synthesis was determined and correlated with the average molecular weight and
DS of the parent derivative.
13
PRODUCTION OF PROTEOLIPOSOMES CONTAINING
THERAPEUTIC MEMBRANE PROTEINS FOR THE TREATMENT
OF GLIOBLASTOMA
Lavinia Liguori,1 Sandra Cortès,2 Jean-Luc Lenormand,2*
1
Instituto di Biofisica, Consiglio Nazionale delle Ricerche & FBK, via Sommarive, 18
I-38123 Trento, Italy
2
Laboratoire HumProTher, TIMC-IMAG, CNRS/UJF UMR 5525, Université Joseph Fourier,
38043 Grenoble Cedex 9, France
One of the major challenges in human therapy is to develop delivery systems which
are convenient and effective for tackling problems in disease treatments. The use of
recombinant proteoliposomes containing therapeutic membrane proteins is a recently
developed technology in our laboratory, allowing biologically active proteins to penetrate
across the plasma membrane of eukaryotic cells. Here, we report the therapeutic effect of
proteoliposomes containing pro-apoptotic human Bak integrated into long-circulating
liposomes produced with an innovative cell-free expression system. In vitro experiments on
different glioma cell lines demonstrate that Bak proteoliposomes are able to be internalized
and to exert an apoptotic effect via activation of the mitochondrial pathway (cleavage of
caspase 9, release of cytochrome c). Preliminary results on mice subcutaneous glioblastoma
model show a manifest delay in the tumor growth and a total regression of the tumor and
survival of 60% of the treated mice. Considering this proof of concept, we are convinced that
engineering human Bak proteoliposomes can be an effective new approach for the treatment
of glioblastoma.
14
SURFACE-MODULABLE MONODISPERSE NANOPARTICLES
BASED ON AMPHIPHILIC CYCLODEXTRINS FOR CONTROLLED
DRUG RELEASE
Alejandro Méndez-Ardoy,1 Marta Gómez-García,1 Annabelle Gèze,2 Denis
Wouessidjewe,2 Jacques Defaye,2 Carmen Ortiz Mellet,1 Juan M. Benito3 and
José M. García Fernández3
1
Dpto de Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de Sevilla, E-41012 Sevilla,
Spain, 2Dépt. de Pharmacochimie Moléculaire, Institut de Chimie Moléculaire de Grenoble
(CNRS – Univ. de Grenoble), Grenoble, France, 3Instituto de Investigaciones Químicas,
CSIC and Universidad de Sevilla, E-41092 Sevilla, Spain
Selective chemical functionalization of cyclodextrins (CDs) is a readily amenable
methodology to produce amphiphilic macromolecules endowed with modulable autoorganizing capabilities.1 Herein, the synthesis of well-defined monodisperse amphiphilic CD
derivatives that incorporate long-chain fatty esters at the secondary hydroxyls rim2 and a
variety of functionalities (e. g. iodo, bromo, azido, cysteaminyl or isothiocyanato) at the
primary hydroxyls rim is reported. Nanoprecipitation of the new facial amphiphiles, or binary
mixtures of them, resulted in nanoparticles with average hydrodynamic diameters ranging
from 100 to 240 nm that were stable in suspension for several months (see Fig., A). The size,
surface potential and topology of the nanoparticles are intimately dependent on the
functionalization pattern at the CD scaffold. Interestingly, CD-decorated CD-based
nanoparticles of 70 nm diameter could be prepared from amphiphilic heterodimers (see Fig.,
B). The possibility of inserting biorecognizable ligands in the architecture by taking
advantage of the inclusion capabilities of the external CD units offers new and versatile
possibilities for such systems. The efficient encapsulation ability of a poorly water soluble
drug (diazepam) was demonstrated for some derivatives, the drug release profile being
dependent on the type of formulation (nanomatrix or nanoreservoirs). The efficiency and
versatility of the synthetic strategy, together with the possibility of exploiting the reactivity of
the functional groups at the nanoparticle surface, offer excellent opportunities to further
manipulate the carrier capabilities of this series of amphiphilic CDs from a bottom-up
approach.
1.
2.
C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J. 2010, 15, 12871.
A. Díaz-Moscoso, L. Le Gourriérec, P. Balbuena, M. Gómez-García, J. M. Benito, N. Guilloteau, C. Di
Giorgio, P. Vierling, J. Defaye, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J. 2009, 15, 12871.
15
GLYCOCOATED CYCLODEXTRIN (CD):PDNA
NANOPARTICLES (GLYCOCDPLEXES) FOR SITE- SPECIFIC
GENE DELIVERY
Alejandro Díaz-Moscoso,1 Alejandro Méndez-Ardoy,2 Nicolas Guilloteau,3 José
L. Jiménez Blanco,2 Christophe Di Giorgio,3 Pierre Vierling,3 Jacques Defaye,4
Carmen Ortiz Mellet,2 José M. García Fernández1 and Juan M. Benito1
1
Instituto de Investigaciones Químicas, CSIC – Universidad de Sevilla, Spain, 2Dpto.
Química Orgánica, Facultad de Química, Universidad de Sevilla, Spain, 3LCMBA UMR
6001CNRS – Université de Nice Sophia Antipolis, Nice, France, 4Dépt. de Pharmacochimie
Moléculaire, Institut de Chimie Moléculaire de Grenoble (CNRS – Univ. de Grenoble),
Grenoble, France
E-mail: [email protected]
Polycationic amphiphilic CDs (paCDs) are already known to self organize in the presence of
pDNA to form small (40-70 nm) complexes (CDplexes) that mediate transfection with
remarkable efficiency.1,2 It is expected that biorecognizable epitopes installed onto the
hydrophilic rim in paCDs would be exposed at the surface of the corresponding CDplexes,
accessible to molecular recognition events. After binding to the putative receptors, selective
internalization mechanisms can be elicited (see Figure). To explore the potential of this
strategy to manipulate DNA delivery efficiency towards specific cell targets, the construction
of carbohydrate-coated paCD:pDNA mixed nanoparticles (glycoCDplexes), the evaluation of
their ability to bind to specific lectins and the implications of glycoCDplex-lectin recognition
phenomena in transfection efficiency has now been investigated.
References
1.
2.
A. Díaz-Moscoso, L. Le Gourriérec, P. Balbuena, M. Gómez-García, J. M. Benito, N. Guilloteau, C. Di
Giorgio, P. Vierling, J. Defaye, C. Ortiz Mellet, J. M. García Fernández, Chem. Eur. J. 2009, 15, 12871.
A. Díaz-Moscoso, D. Vercauteren, J. Rejman, J. M. Benito, C. Ortiz Mellet, S. C De Smedt, J. M.
García Fernández, J. Controlled Rel. 2010, 146, 318.
16
VERS UNE SYNTHESE RAISONNEE DE NOUVELLES
QUINAZOLINES ET QUINAZOLIN-4-ONES
Julien Debray, Simon Bonte et Martine Demeunynck
Département Pharmacochimie Moléculaire, UMR 5063 & FR 2607, CNRS/Université de
Grenoble, 38041 Grenoble cedex 9. France
Nous avons mis au point des procédés courts, efficaces et "propres" pour synthétiser avec de
hauts rendements diverses quinazolines and quinazolin-4-ones contenant des hétérocycles
accolés à partir d'amines aromatiques commerciales. L'étape-clé est une réaction de FriedelCrafts qui s'effectue par simple chauffage en solvant organique ou dans l'eau en absence de
tout catalyseur.
Les molécules ainsi formées ont été évaluées comme inhibiteurs de kinase ou de
topoisomerases, ou encore comme agents de reconnaissance de certaines conformations de
l'ADN comme les quadruplexes de guanines.
O
R' = OEt
H
N
NH2
Ar
Ar = quinoline, indole
phenyl, acridine....
H
N
Ar
NR
R'
O
NH
Ar
N
NHR
130°C, solvent
110°C,
ionic liquid
R' = Ph
Ph
N
Ar
N
NHR
Références :
1. "Concise synthesis of 2-amino-4(3H)quinazolinones from simple (hetero)aromatic amines", W.
Zeghida, J. Debray, S. Chierici, P. Dumy, M. Demeunynck, J. Org. Chem, 2008, 73, 2473-2475.
2. "synthesis and evaluation of fused bispyrimidoacridines as novel pentacyclic analogues of
quadruplex-binder BRACO-19", J. Debray, W. Zeghida, M. Jourdan, D. Monchaud, M.-L. DheuAndries, M.-P. Teulade-Fichou , M. Demeunynck Org. Biomol. Chem. 2009, 7, 5219-28
3. "Swift and efficient synthesis of 4-phenylquinazolines: involvement of N-heterocyclic carbene in
the key cyclization step", J. Debray, J.-M. Lévêque, C. Philouze, M. Draye, M. Demeunynck J. Org.
Chem., 2010, 75, 2092-95
4. "Montmorillonite K-10 catalyzed cyclization of N-ethoxycarbonyl-N’-arylguanidines: access to
pyrimido[4,5-c]carbazole and pyrimido[5,4-b]indole derivatives", J. Debray, W. Zeghida, B.
Baldeyrou, C. Mahieu, A. Lansiaux, M. Demeunynck Bioorg. Med. Chem. Lett., 2010, 20, 4244-47
17
NOUVEAUX COMPOSES ANTIMICROBIENNE AVEC STRUCTURE
DE BIS-PYRIDINIUM
Bianca Furdui1, Oana Constantin2, Rodica Dinică1*
1
Université “Dunărea de Jos” de Galaţi, Faculté des Sciences et Environnement, Rue
Domnească no. 47, 800008, Galaţi
2
Université “Dunărea de Jos” de Galaţi, Faculté de la Science et Ingénierie des Aliments, Rue
Domnească no. 47, 800008, Galaţi
*Contact : [email protected], [email protected]
La croissance continue de la résistance des microorganismes aux traitements spécifiques a
imposé la nécessité d’identifier en permanence des nouveaux composes avec effet
microbiostatique et microbicide, avec un spectre antibactérienne et antifongique.
La conception de molécules avec propriétés biologiques est d’intérêt majeur et ouvre un champ
de recherche très important en biologie moléculaire et en recherche pharmacologique.
Due à leur large specifité de l’activité antimicrobienne contre les bactéries Gram positifs et Gram
négatifs, aussi que contre unes des espèces pathogéniques des fongus et protozoaires, les sels
quaternaires d’ammonium représentés unes des plus utilises antiseptiques et désinfectants.
Nous avons mis au point une synthèse de nouveaux sels symétriques et non-symétriques de bispyridinium et on a investigue leur activité antimicrobienne. Apres l’évaluation qualitative et
quantitative de leur potentiel inhibiteur, nous avons observé que certains de ces hétérocycles
modifient de façon importante la croissance de microorganismes (bactéries et fongus) en fonction
de structure et dose.
18
COMPARAISON EN CULTURE CELLULAIRE DE L’EFFET DE
SIRNA DIRIGES CONTRE LA PROTEASE DE L’EPSTEIN BARR
VIRUS ET DES ANTIVIRAUX ANTI-HERPESVIRIDAE
CONVENTIONNELS
Larrat S, Germi R, Baganizi D, Grossi L, Cleret A et Morand P.
Laboratoire de Virologie /UMI 3265 CNRS-UJF-EMBL, CHU de Grenoble, France
Introduction : Le virus d'Epstein-Barr (EBV) est responsable de la mononucléose
infectieuse. Il est également étroitement associé à l’apparition de lymphomes B chez
l’immunodéprimé et du carcinome indifférencié du nasopharynx. La protéase virale, codée
par le gène BVRF2, est essentielle pour la formation de nouveaux virions lors du cycle viral
réplicatif. Des siRNA ciblant l’ARN messager de cette protéine ont été évalués en culture
cellulaire et ont montré un fort potentiel d’inhibition de l’ARNm ainsi que de la production de
particules virales infectieuses (S Larrat, Antivral Therapy, 2009). Afin de poursuivre
l’évaluation de cette stratégie thérapeutique anti-EBV, l’efficacité du meilleur siRNA antiprotéase a été comparée en culture cellulaire à celle des antiviraux conventionnels ciblant la
polymérase virale.
Matériel et méthode : Les cultures cellulaires sont réalisées à partir de cellules épithéliales
293-B95.8/F contenant un bacmide codant pour l’EBV (souche B95-8) fusionné à la GFP
(green fluorescent protein) développées par l’équipe d’Hammerschmidt (Hammerschmidt,
PNAS, 1998). L’expérience d’inhibition de la multiplication virale est réalisée sur des cellules
dans lesquelles le cycle réplicatif d’EBV a été induit par la transfection de plasmides codant
pour des gènes viraux activateurs (BZLF1 et Balf4). L’activité du siRNA anti-protéase PR1
est évaluée en parallèle de celle du ganciclovir (10 µg/ml), du foscarnet (150 µg/ml), et du
cidofovir (6 µg/ml) par la diminution de l’ARNm protéase en comparaison de l’ARNm d’un
gène cellulaire (GAPDH) et par l’inhibition du pouvoir infectieux des surnageants de culture
mesurée en sur-infectant des cellules Raji. L’association du siRNA PR1 et du ganciclovir a
également été évaluée.
Résultats : Pour l’ensemble des antiviraux testés, l’inhibition de l’ARNm protéase, par
rapport au contrôle sans antiviral, est significative (p<0.05) alors que l’ARNm GAPDH ne
change pas (p>0.1). Cette inhibition est identique pour le siRNA PR1, pour le ganciclovir, le
cidofovir et le foscarnet mais statistiquement plus importante pour l’association siRNA PR1 +
ganciclovir (p<0.001). En revanche, seul le siRNA anti-protéase, en association ou non,
permet d’obtenir une diminution significative (p<0.01) du titre viral infectieux.
Conclusion : Ces résultats confirment l’intérêt des siRNAs ciblant la protéase d’EBV comme
alternative thérapeutique pour inhiber la réplication du virus. En effet, si les médicaments
anti-herpesviridae ciblant la polymérase montrent une activité intéressante sur la baisse des
ARNm viraux, seuls les siRNAs anti-protéase permettent de diminuer le titre viral infectieux.
De plus l’association d’un siRNA et du ganciclovir semble synergique et ouvre ainsi des
perspectives d’association de thérapeutique conventionnelle avec des ARN interférents.
19
AURONES AS NEW, POTENT ALLOSTERIC INHIBITORS OF
HEPATITIS C VIRUS RNA-DEPENDANT RNA POLYMERASE
Romain Haudecoeur,1* Abdelhakim Ahmed-Belkacem,2 Wei Yi,1 Antoine
Fortuné,1 Jean-Michel Pawlotsky,2 Ahcène Boumendjel1
1
Département de Pharmacochimie Moléculaire, UMR 5036, ICMG FR 2607, Université J.
Fourier, BR 53, 38041 Grenoble, et 2INSERM U955, Hôpital Henri Mondor, 51 av. du
Maréchal de Lattre de Tassigny, 94010 Créteil.
*Contact : [email protected]
Hepatitis C virus (HCV) infection is a global public health problem. The World Health
Organisation (WHO) estimates that 120-140 million people are infected worldwide (2-3% of
the world population), while 3-4 million are newly infected each year. Chronic HCV infection
is associated with chronic liver inflammation and fibrosis and can lead to cirrhosis and
hepatocellular carcinoma in absence of treatment. The HCV RNA-dependent RNA
polymerase (RdRp NS5B) is a particularly attractive target because of its key role in viral
replication and the fact that this enzyme has no functional equivalent in mammalian cells.
Although a large number of inhibitors of the four allosteric sites of the enzyme was identified,
none of them reached the market yet due to various concerns, including safety. We have thus
identified naturally occurring 2-benzylidenebenzofuran-3-ones (aurones), flavonoid
derivatives with promising pharmaceutical potential, as new templates for non-nucleoside
HCV RdRp inhibitors.
We firstly discovered natural aureusidin as a potent inhibitor of HCV RdRp. The aurone
target site, identified by site-directed mutagenesis, is located in Thumb Pocket I of HCV
RdRp. The RdRp inhibitory activity of 42 aurones was rationally explored in an enzyme
assay. Molecular docking studies were used to determine how aurones bind to HCV RdRp
and to predict their range of inhibitory activity. Seven aurone derivatives were found to have
potent inhibitory effects on HCV RdRp, with IC50s below 5 µM and excellent selectivity. The
most active aurone analogue was (Z)-2-((1-butyl-1H-indol-3-yl)methylene)-4,6-dihydroxybenzofuran-3(2H)-one, with an IC50 of 2.2 µM. Their potent RdRp inhibitory activity,
together with their low toxicity, make these molecules attractive candidate direct-acting antiHCV agents.
20
OPTIMAL: PLATEFORME D’IMAGERIE OPTIQUE IN VIVO
POUR LA RECHERCHE ET DEVELOPPEMENT EN ONCOLOGIE
JOSSERAND* Veronique, KERAMIDAS Michelle, GUIDETTI Melanie, VOLLAIRE
Julien, COLL Jean Luc
INSERM U823, Institut Albert Bonniot, Grenoble, France
Université Joseph Fourier, Grenoble, France
L’Imagerie optique non invasive du petit animal est une modalité d'imagerie fonctionnelle
récente en plein essor. La recherche et développement en instrumentations optiques est
particulièrement active et de nouveaux systèmes sont proposés et améliorés régulièrement.
OPTIMAL est une plateforme technologique académique âgée de 6 ans équipée
d’instrumentations optiques de pointe pour la bioluminescence, la fluorescence 2D en temps
réel à différentes échelles et l’imagerie 3D bimodale couplant la fluorescence et les rayons X.
Certaines des instrumentations du parc sont disponibles dans le commerce mais la plupart a
été développé localement en collaboration avec des partenaires industriels.
A partir de sa gamme technologique OPTIMAL a également développé des modèles
biologiques et des procédures pour accélérer la recherche et développement en oncologie
préclinique. Ces procédures ainsi que des protocoles personnalisés comme par exemple (1) le
suivi non invasif de la progression tumorale chez la souris en bioluminescence, (2)
l’utilisation de la fluorescence en temps réel in vivo pour l’évaluation de la biodistribution et
des pharmacocinétiques de nouveaux composés et (3) l’évaluation de l’angiogénèse in vivo en
fluorescence 3D, sont proposés aux équipes académiques et aux industriels.
OPTIMAL fait partie d’une plateforme plus vaste d’imagerie du vivant labellisée IBISA.
Ainsi OPTIMAL peut également proposer de l’imagerie multimodale utilisant l’IRM, la TEP
ou la SPECT en collaboration avec les partenaires locaux grenoblois et répondre à toute
problématique impliquant l’imagerie in vivo en oncologie.
21
POLYELECTROLYTE MULTILAYER FILMS FOR THE DELIVERY
OF HYDROPHOBIC DRUGS
P. Kharkar,1 T. Boudou,1 J. Jing,2 D. Cui,2 F. Dalonneau,1 R. Auzély-Velty,2 C.
Picart1*
1
LMGP Minatec, Grenoble Institute of Technology and CNRS, Grenoble, France et 2
CERMAV-CNRS, Université Joseph Fourier, Institut de Chimie Moléculaire de Grenoble,
France
Worldwide, there are over 10 million new cases of cancer and more than 6 million deaths
from cancer annually. Several anti-cancer drugs like paclitaxel (PTX) used for breast cancer
treatment, have hydrophobic backbone chain and poor aqueous solubility, leading to reduced
therapeutic efficiency of the drug. Optimization of present cancer treatment is important as it
induces several side effects to other organs associated with drug and drug carrier. There is a
crucial need to develop drug carriers that could decrease the toxic side effects and increase the
water solubility. In present work, polyelectrolyte films were constructed using the layer-bylayer assembly of chemically modified hyaluronic acid (HA) with induced hydrophobic
nanocavities as anionic polyelectrolyte and quaternised chitosan (qCHI) or poly(L-lysine)
(PLL) as cationic polyelectrolyte. The films were characterized using fluorescence and
absorbance measurements. Paclitaxel was loaded inside the film in tunable amount depending
on the number of deposited layers, the initial paclitaxel concentration as well as on the type of
polycation. The films were further enzymatically hydrolyzed indicating biodegradability.
Influence of chemical cross-linking of the film on release kinetics of paclitaxel was studied.
Furthermore, metabolic activity and viability of two types of breast cancer cells (HBL-100
and MCF-7) cultured on the Paclitaxel-loaded films were investigated over several days of
culture. The films demonstrated very high capacity of incorporating anticancer agent into
hydrophobic nanocavities proving higher loading efficiency, release kinetics without initial
burst, suggesting their potential as carrier for cancer drug delivery.
22
DEIRA, UNE BACTERIE RESISTANTE AUX RADIATIONS
IONISANTES.
ETUDE DE LA PROTEINE FPG ET D’ADN CONTENANT DES
LESIONS
Morgane Lourdin1, Jean-François Constant1, Pascal Dumy1, Muriel Jourdan1,
Tobias Klar2, Sean McSweeney, 2, Joanna Timmins, 2
1
Département de Chimie Moléculaire – Equipe Interaction et Ingénierie Biomoléculaire
570 rue de la Chimie, BP 53, 38041 GRENOBLE Cedex 09
2
Cristallographie Moléculaire- ESRF- BP220, 38043 GRENOBLE
L’ADN cellulaire est soumis à de nombreuses agressions (UV, rayonnements ionisants..) qui
conduisent à la formation de lésions (perte de base nucléique, oxydation) ou de groupes de
lésions localisées sur les 2 brins de l'ADN (cluster) dont la réparation est encore mal connue.
Ces clusters de lésions peuvent conduire à des cassures doubles brins et sont beaucoup plus
toxiques et mutagènes que les mono lésions. Ils peuvent être à l'origine de processus de
cancérisation. Notre objectif est d'étudier à la fois d'un point de vue biochimique et structural
ces groupes de lésions de l'ADN et leur réparation chez une bactérie radiorésistante DEIRA
(Deinococcus Radiodurans). Cette bactérie est capable de survivre à l'exposition à des doses
de plusieurs milliers de grays, responsables de la formation de centaines de cassures double
brin par génome. De telles doses sont des centaines de fois supérieures aux doses létales pour
la plupart des autres bactéries.
Nous nous intéressons particulièrement à une protéine de réparation, la Fpg qui reconnaît
spécifiquement une base oxydée, la 8oxoguanine. Nous présenterons le protocole d'expression
et de purification de cette protéine que nous avons développé au laboratoire. Parallèlement,
nous avons débuté une étude structurale par RMN et Modélisation moléculaire
d'oligonucléotides contenant 2 lésions : selon la position relative des lésions dans l'ADN nous
avons montré que la protéine Fpg d'E. Coli est active ou inhibée. Des différences de
conformation pourraient être à l'origine de cette différence de reconnaissance.
23
ZEBRA FROM THE EPSTEIN-BARR VIRUS AS A DELIVERY
SYSTEM FOR THERAPEUTIC PROTEINS: DEVELOPMENT OF
INNOVATIVE BIOMEDICINES FOR HUMAN THERAPY
Rothe R, Marchione R and Lenormand JL*
*
TheREx- HumProTher, TIMC-IMAG Laboratory, CNRS UMR5525, University Joseph
Fourier, UFR de Médecine, 38700 La Tronche, France
E-mail : [email protected]
The limitations and the specificity of delivery therapeutic proteins into mammalian cells is a
major problem encountered for efficient treatment of some human pathology such as cancers
and infectious diseases. The bottleneck of this strategy is the hydrophobic composition of
cellular membranes that restrains the uptake of these molecules. A new and efficient protein
delivery vector deriving from the Epstein-Barr virus transcriptional activator ZEBRA has
been recently exploited in our laboratory. Analysis of different truncated forms of ZEBRA
revealed that the minimal domain (MD) required for cellular uptake is a 48 amino acids
region spanning residues 170-220. Fusion of ZEBRA-MD to different reporter proteins, such
as EGFP or β-galactosidase, is sufficient to induce the internalization into living cells.
ZEBRA-MD reporter proteins transduction through the cell membrane requires binding to
cell surface-associated heparan sulfate proteoglycans, and occurs mostly via direct
translocation. MD is able to transduce a wide range of mammalian cells with 100% efficiency
and no toxic side effects have been shown yet. MD-delivered proteins remain functional when
transduced into cells, as demonstrated by the enzymatic activity of internalized MD- βgalactosidase. This mechanism of MD-mediated internalization is suitable for the efficient
delivery of biologically active proteins, and renders ZEBRA-MD a promising candidate for
therapeutic protein delivery applications.
24
DOMAIN GLA LESS FACTOR XA : A MOLECULAR BAIT TO
BYPASS TENASE COMPLEX
R.Marlu,1,2* B.Polack1,2
1
Laboratoire TIMC TheREx,CNRS UMR5525,Université Joseph Fourier,Grenoble
et 2 Laboratoire d’hématologie, CHU, Grenoble,
Haemophilia is an X-linked bleeding disorder characterized by a dysfunction of the intrinsic
tenase complex due to the deficiency in coagulation factors VIII (haemophilia A) or IX
(haemophilia B). Treatment of severe haemophilic patients is based on the administration of
factor VIII or IX concentrates. However, some patients develop antibodies inhibiting the
activity of the therapeutic clotting factor. In these cases, haemostatic therapies which bypass
the tenase complex must be used : recombinant factor VIIa or activated prothrombin complex
concentrates. Unfortunately, some patients do not respond (1) and rare cases of
thromboembolism are reported. Alternative therapies for a better efficiency and safety need
therefore to be developed.
Gla domain less Xa (GDXa) is a truncated factor Xa. As it is unable to bind phospholipid
membranes, it is almost devoid of prothrombin into thrombin activation capacity. In this
work, we test GDXa to restore thrombin generation in severe haemophilic patients plasmas.
We demonstrate that GDXa is able to restore in vitro thrombin generation of severe A
haemophilic plasmas in an exclusive tissue factor dependent way in contrast to factor Xa.
We assume that GDXa may compete with Xa for binding to TFPI. The formation of a
GDXa/TFPI complex may limit the formation of the factor Xa/TFPI complex which is
essential to shutdown the tissue factor/VIIa coagulation initiation complex. By deshinibiting
the initiation of coagulation, GDXa may restore thrombin generation.
At first, we have initially compared the enzymatic inhibition profiles of GDXa by TFPI and
we have shown a lower TFPI inhibition capacity against to GDXa as against to Xa.
We have also shown that despite its very short half life in amidolytic assays after incubation
in plasma, GDXa retains the capacity to restore thrombin generation in haemophilic plasmas
at least 40 min after incubation.
GDXa capacity to restore thrombin generation despite a very low residual capacity of direct
activation of prothrombin suggests that GDXa might be used in haemophilia patients as a new
pro-haemostatic agent without the risk of any systemic coagulation activation in contrast to
Xa.
25
VALIDATION IN VITRO ET IN VIVO D’UN NOUVEAU DERIVE
SYNTHETIQUE DE FLAVONOÏDE CIBLANT LES TUMEURS DE
VESSIE
Véronique MARTEL-FRACHET1*, Michelle KERAMIDAS2, Dimitrios SKOUFIAS3,
Claire ROME2, Ahcène BOUMENDJEL4 et Xavier RONOT1
1
2
CaCyS, AGIM FRE3405, Faculté de Médecine, La Tronche
Unité INSERM/UJF U823, Equipe 5, Centre de recherche Albert Bonniot, Grenoble
3
Institut de Biologie Structurale J.-P. Ebel, UMR 5075, Grenoble
4
Département de Pharmacochimie Moléculaire, UMR 5063, Grenoble
En France, le cancer de la vessie arrive au 6ème rang des cancers en termes
d'incidence et de mortalité (10668 nouveaux cas et 4861 morts en 2008). Actuellement, parmi
les patients, environ 70% présentent des tumeurs superficielles, 25% des tumeurs infiltrantes
et 5% des tumeurs de type métastatiques. Cependant, 50 à 80% des tumeurs superficielles
récidivent, et 16% évoluent vers une infiltration des tissus. Ces tumeurs sont peu chimiosensible vis-à-vis des médicaments disponibles actuellement et il est donc nécessaire de
trouver de nouvelles molécules plus efficaces.
Les flavonoïdes sont des métabolites secondaires ubiquitaires chez les végétaux et
appartenant à la famille des polyphénols. Ils interviennent dans plusieurs processus
biochimiques et physiologiques des plantes et présentent une activité inhibitrice de nombreux
systèmes enzymatiques in vitro tels que le récepteur à l'EGF ou certaines Cdks. De plus, les
flavonoïdes ne semblent pas être toxiques pour l’organisme, puisqu’ils sont consommés en
grandes quantités dans l’alimentation courante (agrumes, thé vert, soja).
Nous avons récemment développé un nouveau dérivé de chalcone, le 1-(2,4dimethoxyphenyl)-3-(1methylinodolyl) propenone (ou IPP51) qui, après 24 h de traitement à
une concentration de 5µM, provoque une accumulation au stade pro-métaphase de la mitose
de cellules dérivées de tumeurs de vessie avant d'induire l'apoptose au bout de 48h. Ce
blocage en mitose s'accompagne de fuseaux mitotiques anormaux et nos études préliminaires
suggèrent que l'IPP51 agit comme un inhibiteur de la polymérisation des microtubules. Enfin,
des études menées sur des souris porteuses de tumeurs obtenues par injection sous-cutanée de
cellules humaines dérivées de tumeurs de vessie montrent que l'injection d'IPP51 réduit
significativement la croissance tumorale.
L'urothélium est un tissu qui se renouvelle très lentement. En conditions normales, la
plupart des cellules urothéliales sont quiescentes. Ciblant la mitose, l'IPP51 devrait donc
toucher préférentiellement les cellules tumorales qui prolifèrent plus rapidement. Cette
nouvelle molécule apparaît donc comme un candidat prometteur dans l’élaboration de
nouveaux traitements des tumeurs vésicales.
a
Martel-Frachet V, Areguian J, Blanc M, Touquet B, Lamarca A, Ronot X and Boumendjel A. Anticancer
Drugs. 2009, 20(6):469-76.
26
EFFETS DELETERES DES RAYONNEMENTS IONISANTS
QUID DES RADIOPROTECTEURS ?
P. Martigne1*, D. Cressier2, M. Diserbo1, W. Fauquette1, G. Rima2 et Ch. Amourette1
1
Département Effets biologiques des rayonnements, IRBA antenne CRSSA - La Tronche
2
Laboratoire d’hétérochimie, université Paul Sabatier - Toulouse
Les risques liés à l’utilisation de la radioactivité sont maintenant bien connus : en cas
d’irradiation gamma aiguë à forte dose, la mortalité et la morbidité sont importantes.
Actuellement, seules des thérapeutiques curatives sont disponibles, traitant cependant de manière
imparfaite ou symptomatique les différents symptômes radio-induits. Différentes situations
permettent d’anticiper une exposition à des doses significatives de radiations, et disposer d’une
méthode prophylactique visant à protéger le corps humain des dommages radio-induits serait une
avancée majeure, et ce quel que soit le contexte, civil, militaire, médical : incident radiologique à
bord d’un bâtiment de la Marine Nationale à chaufferie nucléaire (12 réacteurs embarqués en
2011) ; troupes militaires en opération exposées à un risque probable ou imminent d’irradiation
externe ; exposition de la sécurité civile après un accident radiologique ou nucléaire ou un
attentat de type « source radioactive cachée » ; personnel responsable de la maintenance et du
démantèlement des centrales nucléaires ; exposition du personnel responsable du fonctionnement
des irradiateurs industriels (stérilisation matériels ou aliments) ; exposition de la population et
des intervenants lors d’accidents de centrales nucléaires (exemple récent de Fukushima I) ;
protection des tissus sains lors des séances de radiothérapie ou même lors d’examens
radiologiques répétés.
En dépit des nombreux projets de recherches dans ce domaine, seul le N-(3-aminopropyl)-2aminoéthylphosphorothioate (WR-2721 ou Amifostine), découvert à la fin des années 1960 aux
Etats-Unis et commercialisé sous le nom d’Ethyol (Yuhas and Storer 1969), présente à ce jour
une activité radioprotectrice satisfaisante. Toutefois, son utilisation reste uniquement limitée à
certaines applications thérapeutiques en raison de ses effets secondaires importants (hypotension,
nausées) aux doses thérapeutiques.
De récents travaux conduits par l’équipe du Dr G. Rima de l’université Paul Sabatier de
Toulouse en collaboration avec le service de santé des armées (B. Célariès et al, 2005 et B.
Célariès et al 2006) ont néanmoins mené à la découverte d’une structure chimique de type
phosphorothioate présentant une activité radioprotectrice équivalente à celle de l’éthyol, et ce, à
une posologie trois fois moindre sur modèle murin. L’évaluation des capacités radioprotectrices,
financée par la DGA et réalisée in vivo par l’IRBA, a également permis de révéler des effets
secondaires moindres rendant particulièrement pertinente une éventuelle mise sur le marché de
cette molécule.
Trois phases de développement sont initialement prévues les deux prochaines années :
1) Elucidation des problèmes de reproductibilité ; amélioration de la solubilité.
2) Introduction de variations structurales : établissement d’une relation structure-activité.
3) Développement d’un procédé robuste de production de l’analogue le plus efficace.
Suivra une étape de confirmation sur d’autres modèles in vivo ainsi qu’une réflexion sur la
galénique.
27
THERAPIE CELLULAIRE PAR CELLULES SOUCHES ADULTES
DANS L’ACCIDENT VASCULAIRE CEREBRAL
COMPRENDRE SON MODE D’ACTION POUR OPTIMISER CETTE STRATEGIE
THERAPEUTIQUE
MOISAN Anaïck1,2; FAVRE Isabelle1,3; ROME Claire4; BARBIER Emmanuel L.1;
REMY Chantal1; DE FRAIPONT Florence5; RICHARD Marie-Jeanne2,4,5 et
DETANTE Olivier1,3
1
Inserm U836, Grenoble Institut des Neurosciences/UJF; 2Unité Mixte de Thérapie Cellulaire,
CHU de Grenoble / EFS Rhône Alpes ; 3Unité Neurovasculaire, CHU de Grenoble ; 4Inserm
U823, Institut Albert Bonniot/UJF ; 5UM Biochimie des Cancers et Biothérapie, CHU de
Grenoble* Contact : [email protected]
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la première cause de handicap chez l’adulte.
Aujourd’hui, la thrombolyse est le seul traitement efficace mais doit être administré dans les
4h30 suivant les symptômes et ne permet donc la prise en charge de seulement 10% des
patients. Hormis la rééducation, il n’existe, à ce jour, aucun traitement efficace administrable
dans les semaines suivant l’AVC (phase subaiguë). Dans ce contexte, la transplantation de
cellules souches, encore appelée thérapie cellulaire, a émergé comme stratégie de réparation.
Parmi les sources cellulaires, les cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh)
issues de moelle osseuse ont montré une bonne tolérance et un bénéfice fonctionnel après
injection à la phase aiguë de l’infarctus cérébral (IC) chez l’animal. Cependant, leur
mécanisme d’action et leur effet après une administration à la phase subaiguë de l’IC restent
mal connus. Parmi les hypothèses de mécanisme d’action des CSMh, celle d’un effet
paracrine sur l’angiogenèse et la microvascularisation cérébrale semble être une piste
prometteuse. En effet, après un IC, le remodelage microvasculaire joue un rôle prépondérant
pour favoriser la neurogenèse endogène et la migration des neuroblastes propices à la
récupération fonctionnelle.
L’objectif de notre travail préclinique est donc d'évaluer si ces CSMh, injectées à la phase
subaiguë de l'IC, modifient la microvascularisation cérébrale dans notre modèle transitoire
d’ischémie chez le rat (oACM). L’identification de facteurs angiogéniques impliqués dans cet
effet des CSMh permettra d’envisager une optimisation de la source thérapeutique. Nous
avons réalisé un suivi IRM in vivo de la microvascularisation cérébrale (volume sanguin
cérébral, diamètre des vaisseaux et densité microvasculaire) et une analyse des facteurs
angiogéniques par biologie moléculaire (RT-PCR) durant 16 jours de suivi au sein de 2
groupes de rats ayant subi une ischémie: l’un traité par injection IV de CSMh à J8 (oACM
CSMh, n=4), et l’autre par injection IV de PBS (oACM PBS, n=4). Une cinétique
d’expression des facteurs angiogéniques a été réalisée à partir des cerveaux prélevés aux
différents temps du suivi (H2, J1, J2, J3, J7, J9 et J16) par RT-PCR.
Nos résultats préliminaires montrent que l’administration de CSMh, à la phase subaiguë de
l’IC expérimental, favorise la formation de néo-vaisseaux et leur stabilisation précoce,
augmentant ainsi la densité vasculaire. Les facteurs angiogéniques identifiés comme étant à
l’origine de cet effet pourraient nous permettre d’optimiser notre source thérapeutique.
28
THE ANTIBIOTIC DRUGS AMINOGLYCOSIDES CLEAVED DNA
AT ABASIC SITES
M. Perigolo de Oliveira,1 M. Peuchmaur,1* J.-F. Constant,2 I. Baussanne,1
J.-L. Décout1*
1
Département de Pharmacochimie Moléculaire UMR 5063, 2Département de Chimie
Moléculaire UMR 5250 CNRS/Université Joseph Fourier-Grenoble I, 38041Grenoble
Abasic sites which result from the loss of a nucleic base are the most frequent lesions in
DNA and appear as the most common damages induced by chemotherapeutic DNA alkylating
agents.1 This lesion can occur spontaneously through a variety of processes. If not repaired,
the abasic site may promote misincorporation of nucleotides in vitro and can be cytotoxic and
mutagenic. The repair of abasic sites is thus essential to cell viability.
We were interested in examining whether aminoglycosides (figure 1) used as antibiotic
drugs could cleave DNA specifically at abasic sites. The broad antimicrobial spectrum of
these antibiotic drugs, their rapid bactericidal
action, have made them especially useful in the
R
6'
O
HO
HO
NH2
Ring II
O
HO
NH2
O
H2N
OH
Ring IV
NH2
O
O
OH
5
OH
Ring III
O
NH2
4'
HO
H2N Ring I
HO
O
3'
H2N
NH2
O
HO
NH2
5
OH
3: R= NH2, neamine
OH
1: R= NH2, neomycin B
2: R= OH: paromomycin
treatment of serious infections.2
Figure 1. Structure of some aminoglycosides studied here.
Figure 2. Cleavage of pBr322 plasmid DNA (1.8 abasic
sites/molecule, pH 7.2, 100 mM KCl). Fraction of
nicked plasmid as a function of neomycin 1 and neamine
3 molar concentrations.
The cleavage of pBr322 plasmid DNA containing an average of 1.8 abasic sites per
molecule was studied in the presence of various natural and synthetic aminoglycosides. The
ratio of conversion from the supercoiled form to the nicked form was measured and the
nicked plasmid fraction revealed the strong cleavage efficiency of most of them at abasic
sites. The half maximal effective concentration (EC50) was determined for the most active
aminoglycosides at pH 7.2 in the presence of 100 mM KCl (Figure 2).
Among nine natural aminoglycosides studied and used for their antibiotic properties, the
most efficient one was neomycin with a 1 M EC50.
Clearly, natural and synthetic aminoglycosides appeared to be able to cleave strongly DNA at
abasic sites. Such a cleavage could be related in part to some of the observed toxic effects of
aminoglycosides.
1.
2.
Lindahl, T., Karran, P., Wood, R. D. Curr. Opin. Genet. Dev. 1997, 7, 158.
Magnet, S., Blanchard, J. S. Chem. Rev. 2005, 105, 477-497. Hermann, T. Cell. Mol. Life Sci. 2007, 64,
1841-1852.
29
STRUCTURE-SWITCHING APTAMER-BASED CAPILLARY
ELECTROPHORESIS ASSAY FOR MULTIPLE SMALL
MOLECULE DETECTION
Z. Zhu1, C. Ravelet1, S. Perrier1, V. Guieu1, E. Peyrin1*
1
Département de Pharmacochimie Moléculaire UMR 5063 CNRS, ICMG FR 2607,
Université Grenoble I, Campus universitaire, Saint-Martin d’Hères, France
Affinity probe capillary electrophoresis (APCE) assays, combining the separation power of
CE with the specificity of interactions occurring between a target and a molecular recognition
element (MRE), constitute a very interesting alternative to conventional sensing approaches
[1,2]. A rationalized method was developped for the design of a novel APCE mode dedicated
to small molecules detection. The strategy was based on two properties of nucleic acid
aptamers (Apt) used as MRE: (i) the conformational change triggered by the target
complexation known as the structure-switching concept [3] and (ii) the ability of nucleic acids
to form duplex structures with their complementary sequences (CS). The assay configuration,
designed for multi-analyte sensing used an unmodified Apt and its fluorescein-labeled (LIF
detection) and cholesteryl-tagged complementary strand (Chol-CS*). The separation of the
cholesteryl-tagged species i.e. free Chol-CS* and the duplex formed with Apt (duplex*) was
realized through the size-dependent shift of their electrophoretic mobility in the presence of a
neutral micellar phase (MEKC) [4]. When the target was introduced in the pre-incubated
sample, the hybridized form was destabilized resulting in the decrease in the duplex* peak
area and the concomitant increase in the free Chol-CS* peak area. By introducing a poly(T)
tail of an adequate length at one extremity of the Chol-CS* species, the electrophoretic
separation of different Chol-CS* from each other and from their associated duplex* was
successfully performed. This allow the simultaneous detection of multiple analytes in a single
capillary by monitoring accurately each target-induced duplex-to-complex change.
[1]. H. Zhang, X.F. Li and X.C. Le, J. Am. Chem. Soc., 130, 34 (2008).
[2]. W.S.B. Weung, G.A. Luo, Q.G. Wang and J.P. Ou, J. Chromatogr. B, 797, 217 (2003).
[3]. R. Nutiu and Y. Li, J. Am. Chem. Soc., 125, 4771 (2003).
[4]. J. Ruta, S. Perrier, C. Ravelet, B. Roy, C. Perigaud and E. Peyrin, Anal. Chem., 81, 1169 (2009).
30
AZAINDOLE DERIVATIVES ARE NOVEL TUBULIN
POLYMERIZATION INHIBITORS WITH ANTICANCER AND ANTIANGIOGENIC ACTIVITIES
Renaud Prudent1,2,#, Emilie Vassal2,#, Chi-Hung Nguyen3, Marjorie Mollaret2, Jean
Viallet1, Agnès Castan4, Caroline Barette2,5, Catherine Pillet2,5, Anne Martinez1,
Emmanuelle Sans-Soleilhac2,5 Jean-Jacques Feige4, Marc Billaud1, Jean - Claude
Florent6 and Laurence Lafanechère1,2,*.
1
Equipe 3 « Polarité, Développement et Cancer » Institut Albert Bonniot, CRI INSERM-UJF, U
823, Rond-point de la Chantourne, La Tronche 38706 CEDEX, France ; 2 iRTSV/CMBA, CEA
Grenoble,17 rue des martyrs F-38054 CEDEX 09, France; 3 UMR 176 CNRS-Institut Curie ;
Institut Curie Bât 110 ;F-91405 Orsay, France ; 4 BCI UMR INSERM-CEA-UJF U1036iRTSV,
CEA Grenoble,17 rue des martyrs F-38054 CEDEX 09, France; 5 Gen&Chem iRTSV/BGE, CEA
Grenoble,17 rue des martyrs F-38054 CEDEX 09, France; 6 UMR 176 CNRS-Institut Curie,
Centre de Recherche, 26 rue d’Ulm, Paris F-75248, France; # Contributed equally to this work.
* To whom correspondence should be addressed. Phone: (+33) (0)4 76 54 95 71 (L.L.); Fax:
(+33) (0)4 38 78 50 32 (L.L.); E-mail: [email protected] (L.L.)
Drugs targeting microtubules are important components in combination chemotherapy for
cancer treatment. The emergence of resistances, however, entails a continuous need for new
microtubule targeting agents. Using a cell-based assay designed to probe for microtubule
polymerization status, we identified azaindole derivatives as cell permeable microtubule
depolymerizing agents. These compounds induce a G2/M cell cycle arrest and exert potent
cytostatic effects on several cancer cell lines including a multidrug resistant cell line. In vitro
experiments revealed that azaindole derivatives inhibit tubulin polymerization and bind to the
colchicine binding site, strongly indicating that tubulin is the cellular target of azaindole
derivatives. In vivo experiments, using a chicken chorioallantoid xenograft tumor assay, revealed
that these compounds exhibit a potent anti-tumoral effect. This experiment, together with an
assay that probes for the growth of vessels from spheroid of endothelial cells, shows that
azaindoles derivatives also exhibit anti-angiogenic activities. This class of compounds represents
an attractive lead for the development of new microtubule targeting agents.
1
31
A NEW LIMK INHIBITOR THAT STABILIZES MICROTUBULES
AND INHIBITS CELL MOTILITY
Chloé Prunier1*, Anne Martinez1*, Catherine Pillet2, Renaud Prudent1, Chi-Hung
Nguyen3 and Laurence Lafanechère1
1
INSERM, U823, Grenoble, F-38706 France; Université Joseph Fourier-Grenoble 1,
Grenoble, F-38706 France; Institut Albert Bonniot, Grenoble, F-38706.
2
IRSTV/BGE/GEN&CHEM/CMBA, CEA-Grenoble17 rue des Martyrs, Grenoble F-38054.
3
CNRS UMR176, Institut Curie, Orsay F-91405.
* co-first authors

contact : [email protected]
Approximately 90% of cancer deaths arise from the metastatic spread of primary
tumours. Tumor cell motility is the hallmark of invasion and an essential step in metastasis.
The identification of small molecule inhibitors that target key regulators of cell motility
would help to understand this fundamental process and may lead to novel therapeutic
opportunities.
Using an original high throughput phenotypic screen, our team has discovered and
characterized a specific inhibitor of LIM Kinase (LIMK), which was named LIMINIB (patent
WO2010/000141). Phosphorylation of the actin binding protein cofilin by LIMK is the last
step of the Rho-GTPase cascade that regulates actin dynamics. LIMK has been identified as
an enzyme whose inhibition is supposed to stop the progression of invasive cancers.
We have demonstrated that LIMINIB reversibly inhibits cofilin phosphorylation in
vitro and in cells. LIMINIB blocks actin microfilament dynamics, inhibits cell motility and
stabilizes microtubules. We have established that the microtubule stabilizing effect of the
compound is the result of its inhibitory effect on LIMK and is independent of its effect on the
actin cytoskeleton. The inhibitor is effective not only in cancerous cell lines but also in mice,
where it delays tumors formation while showing a good tolerability. It could represent a
pharmacological alternative to overcome the resistances often observed when tumors are
treated with microtubule targeting agents.
32
NOUVELLE VOIE DE SYNTHESE RAPIDE DE
DIAZAHETEROCYCLES D’INTERET THERAPEUTIQUE
B.-L. Renard1, B. Maurin1, B. Boucherle1, M.-C. Molina1, L. Dannhoffer2, C.
Norez2, F. Becq2 et J.-L. Décout1*
1
Département de Pharmacochimie Moléculaire, UMR 5063 CNRS/Université Joseph Fourier
Grenoble I, ICMG- FR CNRS 2607, 2Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires, UMR
6187 CNRS, Université de Poitiers.
*
La condensation de deux molécules de méthylglyoxal (MG) en milieu aqueux sur des aminoazahétérocycles conduit à la formation de deux couples d’énantiomères i. Les diadduits
correspondants de dérivés de l’adénine et de la 2’-désoxyadénosine se sont révélés
respectivement activateursii et inhibiteursiii des canaux CFTR avec une application potentielle
dans le traitement de la mucoviscidose et des diarrhées sécrétoires (ex: Choléra).
COO
OH
COO
OH
HN
HN
OH
NH2
O
O
+
OH
N
N
H2O
N
80°C
COO
OH
HN
OH
COO
OH
HN
OH
N
N
A partir des diadduits isolés en série aminopyridine et aminoquinoléine, des hétérocycles
aromatiques d’une nouvelle classe ont été obtenus par simple chauffage en présence d’une
solution aqueuse de soudeiv et certains ont montré une inhibition du fonctionnement des
canaux CFTR. Des expériences sous irradiation micro-ondes ont permis d’écourter fortement
la procédure de synthèse.
Cette méthodologie a été étendue à la préparation de dérivés antioxydants de type 5pyrimidinol à partir de dérivés non hétérocycliques en série amidine et guanidine. Nous avons
également démontré la formation lente des biomarqueurs du diabète de type "argpyrimidine",
produits in vivo, à partir de l’arginine et du MG dans les conditions physiologiques selon les
réactions mises en évidence précédemment.
R1
NH2
N
1) R1COCHO
en excès, H2O
R2 = CH3, Ph, NHEt, N(CH3)2, NHAc, AcNH-Arg
R3 = CH3, Ph, NHEt, N(CH3)2, NH2, Arg
NH2
2
R
N
R1
R1 = CH3 ou C2H5
CH3
2) NaOHaq 3M
OH
N
NH
R3
i
O
N
N
CH3
C. Routaboul, L. Dumas, I. Gautier-Luneau, J. Vergne, M.-C. Maurel, J.-L. Décout. Chem. Commun. 2002, 1114-1115.
B. Boucherle, A. Billet, P. Melin-Heschel, L. Dannhoffer, C. Vandebrouk, C. Jayle, C. Routaboul, M.-C.Molina, J.-L. Décout, F.
Becq, C. Norez. Eur. Respir. J. 2010, 36, 311-322.
iii
C. Routaboul, C. Norez, P. Melin, M.-C. Molina, B. Boucherle, F. Bossard, S. Noel, R. Robert, C. Gauthier, F. Becq, J.-L.
Décout. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2007, 322, 1023-1035.
iv
B.-L. Renard, B. Boucherle, B. Maurin, M.-C. Molina, C. Norez, F. Becq, J.-L. Décout, Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 19351941.
ii
33
CARACTERISATION DE L’INTEGRITE DE LA MYOGLOBINE
LIBEREE A PARTIR DE MICROSPHERES DE PCL PAR
SPECTROMETRIE UV/VIS. ET BIOCAPTEUR BI-ENZYMATIQUECONDUCTIMETRIQUE
E. Ruffin1*, M. Hnaien2, C. Bordes2, O. Marcillat3, F. Lagarde2,
N. Jaffrezic Renault2, S. Briançon4
1
Université Grenoble 1, Laboratoire de Pharmacie Galénique et Industrielle, Domaine de la
Mercie ¬ Place du Commandant Nal, 38700 La Tronche ;
2
Université Lyon 1, LSA, UMR/CNRS 5180, Bât. CPE, 43 Bd du 11 Novembre, 69100
Villeurbanne ; 3 Université Lyon 1, ICBMS, UMR/CNRS 5246, Bât. Chevreul, 43 bd du 11
novembre, 69100 Villeurbanne et 4 Université Lyon 1, LAGEP, UMR/CNRS 5007, Bât. CPE,
43 Bd du 11 Novembre, 69100 Villeurbanne.
*Contact : [email protected]
Des microparticules de poly (ε-caprolactone) (PCL) chargées en Myoglobine (Mb) ont été
préparées par émulsion multiple avec extraction/évaporation du solvant dans des conditions
plus ou moins délétères pour la protéine.
L'intégrité de la protéine encapsulée a été contrôlée en utilisant les deux méthodes
complémentaires : la spectrométrie UV/Vis. (méthode classique de contrôle de la
conformation 3D, reposant sur la localisation des bandes d’absorbance spécifiques + calculs
des principaux rapports d'absorbance) et la conductimétrie via un biocapteur bi-enzymatique
(méthode non conventionnelle basée sur la réaction de protéolyse combinée par 2 enzymes,
protéinase K + pronase, en fonction de la conformation globale de la protéine).
La conformation native de la Mb est maintenue dans des conditions standard, tandis que
différents degrés de dénaturation de la protéine ont pu être observés en modifiant les
conditions d'encapsulation.
Il a été montré que l'élimination du solvant à pression réduite et, dans une moindre mesure,
que l’emploi d'un PCL de masse moléculaire plus élevée ont conduit à l’altération de la Mb.
Dans le 1er cas, l'intégrité perdue peut être attribuée au solvant résiduel rapidement piégé lors
de la solidification accélérée des particules. Dans le 2ème cas, la dénaturation peut être
expliquée par une augmentation du temps d'exposition de la Mb aux interfaces eau/solvant
organique due notamment à une augmentation de la viscosité de la phase organique.
Enfin les 2 méthodes de contrôle protéique ont donné des résultats comparables.
Le biocapteur conductimétrique bien qu’étant plus discriminatif que la spectrophotométrie
pour l’établissement du degré de dénaturation, ne permet pas une identification non-invasive
de la partie protéique affectée par le procédé.
34
SIRNA DELIVERY SYSTEMS WITH A VIRUS-LIKE
STRUCTURE
Laurent Bui1,2, Cathy Staedel2, Jean-Jacques Toulmé2, Sébastien
Lecommandoux1, Christophe Schatz1*
1
LCPO (Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques) – Ecole Nationale Supérieure de
Chimie, de Biologie et de Physique, 16 av Pey Berland, 33607 Pessac
2
ARNA (ARN : Régulations Naturelle et Artificielle) – Université Victor Segalen - 146 rue Léo
Saignat 33076 Bordeaux cedex
* contact : [email protected]
Synthetic nanocarriers for the in vivo delivery of nucleic acids must combine some antagonist
features as prolonged blood circulation time, targeting capabilities and high transfection
efficiency. Viral systems perform all these tasks and are far more efficient than current
synthetic ones. Hence, mimicking the viral structure might help designing nanocarriers
endowed with such capabilities. Herein, we report a two-step procedure for loading short
interference ribonucleic acids (siRNA) within a polymer matrix in the nanometer size-range.
At first, colloidal particles were prepared by complexing siRNA molecules with polyethylene
imine in aqueous media. The pH, the ionic strength of the medium as well as several N/P
ratios were studied among other parameters to find the right window where small, stable and
positively charged complexes could be formed. In a second step, the electrostatic complexes
were coated by an oppositely charged block copolymer containing both polysaccharide and
polypeptide segments. This copolymer being amphiphilic by nature, the second step was
achieved in presence of a water-miscible organic solvent. Hence, the final structure matched
closely the morphology of viral particles with a core made of condensed nucleic acids and a
shell of a copolymer based on saccharidic and peptidic units. Especially, it is believed that
such a capsid of copolymer would prevent the dissociation of the PEI/siRNA complexes that
are known to be less stable than PEI/DNA ones. The virus-like structure was evidenced by
fluorescence microscopy, light scattering and microelectrophoresis. In vitro cell transfection
studies were performed on HeLa cells using the luciferase assay. First results showed high
transfection of the nanocarriers but low gene silencing. Fortunately, the system is versatile
enough to be improved and various strategies are under study to favour the dissociation of the
nanocarriers within endosomal compartments.
35
ÉTUDES DES LIGANDS ANTI-CANCER : RELATION
STRUCTURE-ACTIVITE
R. M. F. Leal,1* S. C.M. Teixeira,2,3
1
ESRF, 6 rue Jules Horowitz, Grenoble, France. 2 EPSAM, Keele University, Keele,
Staffordshire, ST5 5BG, UK. 3 Institut Laue Langevin, 6 rue Jules Horowitz, 38042 Grenoble
cedex 9, France.
Les études cristallographiques de la structure des oligonucleotides avec des ligands anticancer fournissent des informations structurales très précises. La haute résolution de la
cristallographie des rayons X permet une analyse détaillée de l’interaction des drogues avec
des différents oligonucleotides, aussi que de l’influence du solvant dans ces interactions [1].
Les rayons X ne sont pourtant presque pas sensibles aux atomes d’hydrogène et ne fournissent
qu’une image statique d’une structure possible dans des conditions spécifiques.
Des informations complémentaires sont essentielles pour un design raisonnable des nouvelles
drogues de chimiothérapie dans le cadre d’un mécanisme d’activité qui dépend des nombreux
facteurs comme l’acidité des protons [2], la cinétique des réactions, la stœchiométrie et la
stabilité des complexes, etc. Ces informations sont pourtant à la portée d’autres techniques
comme la Calorimétrie isotherme à titration (ITC), la Cristallographie de Neutrons ou la
spectroscopie RMN.
La détermination expérimentale de la position précise des atomes d’hydrogène ou deutérium
dans des structures cristallines de macromolécules biologiques est indispensable pour la
compréhension de la relation structure-activité. La complémentarité des techniques exploitées
sera illustrée par notre expérience avec des études des ligands à possible activité anticancéreuse (des dérivés d’acridines et de phenazines produits à Auckland Cancer Research
Center). Il s’agit des stratégies d’autant plus importantes pour les médicaments qui doivent
cibler des structures très spécifiques dans des environnements complexes : on soulignera
l’importance de l’utilisation intégrée des méthodes pour la validation des résultats et la
maitrise des propriétés.
[1] Teixeira, S., Thorpe, J., Todd, A., Powell, H., Adams, A., Wakelin, L., Denny, W.,
Cardin, C. (2002). J. Mol. Biol. 323(2), 167-171. [2] Leal, R., Teixeira, S., Blakeley, M.,
Mitchell, E., Forsyth, V. (2008), Acta Cryst F65, 232-235.
36
NOUVEAUX ANALOGUES DE PRODUITS NATURELS A
ACTIVITES ANTIPALUDIQUES
Mariam TRAORE,1* Yung-Sing WONG1
1
Département de Pharmacochimie Moléculaire, Université de Grenoble, CNRS UMR 5063,
CNRS ICMG FR 2607, 470 rue de la Chimie, F-38 041 Grenoble Cedex 9.
* [email protected]
Les aculéatines sont des produits naturels cytotoxiques qui présentent de bonnes propriétés
antipaludiques. Ils peuvent être obtenus en utilisant une approche basée sur des réactions
d’oxydation en cascade induites par des réactifs à l’iode hypervalent (III). Ce concept permet
en effet de construire en une seule étape le motif spirocyclohexa-2,5-dienone qui a été
identifié comme pharmacophore responsable de l’activité antipaludique.[1]
O
O
12
HO
O
O
O
OH
O
O
O
O
O
O
O
HO
HO
14
14
12
()-aculeatin A
P. falciparum 3D7
IC50 (M)
0.23
(+)-aculeatin B
0.45
(-)-amomol A
0.50
(+)-amomol B
0.50
Dans le but d’améliorer l’activité biologique antipaludique, nous réalisons des synthèses
courtes de nouveaux composés analogues des aculéatines. Récemment nous avons réalisé la
synthèse biomimétique des amomols A et B qui étaient connus auparavant pour leur propriété
anticancéreuse et avons montré qu’ils possèdent également des propriétés antipaludiques aussi
efficaces que les aculéatines.[2] D’autres composés synthétiques analogues de produits
naturels ont permis de faire des études de relation structures activités et d’émettre des
hypothèses sur la structure du composé optimisé qui aura la meilleure activité
antipaludique.[2]
[1] Traoré, M.; Ahmed-Ali, S.; Peuchmaur, M.; Wong, Y.-S. Tetrahedron, 2010, 66, 5863-5872.
[2] Traoré, M.; Maynadier, M.; Souard, F.; Choisnard, L.; Vial, H.; Wong, Y-S. J. Org. Chem, 2011,
76, 1409-1417.
37
NMR EVALUATION OF INTERACTIONS BETWEEN
SUBSTITUTED-INDOLE AND PDZ1 DOMAIN OF PSD95
Vogrig.A1, Boucherle.B1, Bouzidi.N1, Deokar.H1, Ripoche.I1, Thomas.I1, Lian.LY2, Ducki.S1*
1
Clermont Université, ENSCCF, EA 987, LCHG, BP 10448, F-63000 Clermont-Ferrand
2
University of Liverpool, NMR Centre for Structural Biology, UK-L69 3BX Liverpool
PDZ domains are important protein–protein interactions domains; they are almost always
associated with the cell membrane where they play an essential role in the clustering of
proteins and signal transduction. Disrupting interaction between PDZ-containing protein
PSD-95, and its natural ligand 5-HT2A receptor, was found to reduce hyperalgesia in a rodent
model of neuropathic pain. Thus, inhibiting this interaction could lead to the development of a
novel class of analgesic agents.
Starting from a hit previously identified by our laboratory, we carried out a structure activity
relationship (SAR) study. 7 indole-based compounds were synthesized in 3-5 steps with good
overall yields (50-85%). These molecules were evaluated by NMR as ligands of the PDZ1
domain of PSD95. Three of these compounds were found able to interact with the targeted
protein during NMR. One of the new compounds showed an improvement of the binding
affinity compared to the hit compound and could be considered as a lead molecule for the
development of new series of PDZ ligands.
R2
R3
R4
OH
N
O
R1
38
SMART-PROBES FOR NEAR-INFRARED IMAGING
OF CANCER
Christiane H. F. Wenk 1,2,3*, Véronique Josserand1,2, Pascal Dumy2,3, Didier
Boturyn2,3, Jean-Luc Coll1,2*
1
CRI-INSERM U823, Cibles diagnostiques ou thérapeutiques et vectorisation de drogues
dans les cellules tumorales, Institut Albert Bonniot, Grenoble, France
2
Université Joseph Fourier, Grenoble, France
3
CNRS, UMR-5250, Département de Chimie Moléculaire, Grenoble, France
* Contact: [email protected]
[email protected]
Innovative methods improving the results of cancer surgery are needed to lower the
risks of postoperative relapses of cancer patients.
In a preclinical study we already compared the quality of tumor removal of peritoneal
carcinomatosis (PC), performed under “conventional” light, versus near-infrared image
guided (NIR) surgery using a tumor targeting probe (RAFT(c[-RGDfK-])4-Alexa Fluor®
700) and a portable clinical imaging device ("Fluobeam"). The results showed that NIR image
guided surgery using RAFT-RGD and the "Fluobeam" greatly improved the quality of the
surgery of PC by doubling the number of detected nodules and reducing significantly the
duration of the surgery.
The aim of the first project is the transfer of this technology, consisting of the RAFTRGD-probe and the "Fluobeam", into a clinical veterinary phase as an evaluation regarding
clinical surgery in human, that is to say the clinical surgery of spontaneous tumors in
domestic animals.
The second project is the chemical design of an innovative fluorescent molecule for the
diagnosis and the therapy of cancer. This molecule is based on the RAFT-c(RGD)4, targeting
the Integrin αvβ3. By combining this with a cleavable cassette for tumor-overexpressed
enzymes, the tumor specificity should increases. The principle is that the fluorescence of the
molecular complex is quenched while remaining intact and it will be turn on as soon as the
peptide bond of the cleavage cassette is cut by the enzyme. By engrafting a therapeutic agent,
the molecule could be used as a shuttle, releasing this agent in the cancerous environment.
39
SYNTHESE D’INHIBITEURS D’HISTONE DEACETYLASE
SELECTIFS CONTRE LES PARASITES APICOMPLEXES
Mariam Traoré,1 Danièle Maubon,2,3 Alexandre Bougdour,2 Flore Mietton,2
Aurélie Curt,2 Hervé Pelloux,2,3 Mohamed-Ali Hakimi,2 et Yung-Sing Wong1*
1
Département de Pharmacochimie Moléculaire, Université Joseph Fourier, UMR 5063, 470
rue de la chimie, 38041 Grenoble cedex 9
2
UMR5163, LAPM, CNRS/Université Joseph Fourier, Domaine de la Merci, 38700 Grenoble
3
Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, CHU Grenoble, BP 217 38043 Grenoble cedex
Le phylum des apicomplexes inclut d’importants pathogènes humains tels que Plasmodium
falciparum et Toxoplasma gondii, responsables respectivement du paludisme et de la
toxoplasmose. Les inhibiteurs d’histone déacétylase (iHDAC) tiennent une place importante
dans les traitements ciblant les mécanismes épigénétiques, à savoir une action qui perturbe le
niveau d’acétylation post-traductionnelle des résidus lysines localisés à l’extrémité des
histones. Les premiers médicaments dont le mode d’action se réfère à l’inhibition de la
déacétylation des histones sont apparus depuis quelques années seulement dans le domaine de
la cancérologie principalement. Très récemment, des chercheurs du CNRS, de l’Université
Joseph Fourier et du CHU de Grenoble ont montré qu’un produit naturel de type
cyclotétrapeptide, le FR235222 (Figure 1), agit efficacement contre différent parasites
apicomplexes, bloquant leur croissance et perturbant leur différenciation. Cette étude a révélé
notamment que cette molécule induit la différentiation de T. gondii, de la forme réplicative
(tachyzoïte) vers la forme kystogénique (bradyzoïte).[1] T. gondii HDAC3 (TgHDAC3), une
enzyme déacétylase de classe I, a été identifiée comme étant la cible de FR235222. Des
études ex vivo ont également montré que la différenciation du bradyzoïte au tachyzoïte, est
abolie par FR235222, élargissant ainsi le champ d’application de cette molécule pour des
traitements visant aussi bien des phases aigües que chroniques de la toxoplasmose.[2]
Figure 1
A partir de la structure de FR235222, une série de nouveaux analogues cyclotétrapeptides a
été synthétisée en peu d’étape à partir d’un intermédiaire commun et en faisant varier les
caractéristiques structurales importantes (voir Figure 1) permettant de conserver l’efficacité
en tant qu’iHDAC tout en améliorant l’index de sélectivité.
[1] A. Bougdour, D. Maubon, P. Baldacci, P. Ortet, O. Bastien, A. Bouillon, J.-C. Barale, H. Pelloux, R. Menard and M.-A.
Hakimi, J. Exp. Med., 2009, 206, 953-966.
[2] D. Maubon, A. Bougdour, Y.-S. Wong, M.-P. Brenier-Pinchart, A. Curt, M.-A. Hakimi and H. Pelloux, Antimicrob.
Agents Chemother., 2010, 54, 4843-4850.
40
NANO-SYSTEMES A BASE DE -CYCLODEXTRINE
BIOESTERIFIEE CHARGES D’ARTEMISININE POUR LE
TRAITEMENT DU PALUDISME GRAVE
Josias Yaméogo1,3, Annabelle Gèze1, Luc Choisnard1, Jean-Luc Putaux2, Christine
Brunet-Manquet1, Rasmané Semdé3, Denis Wouessidjewe1
1
DPM, UMR CNRS 5063, ICMG FR 2607, UFR de Pharmacie, Université de Grenoble, 2 Centre
de recherche sur les macromolécules végétales, UPR CNRS 5301, ICMG FR 2607, Grenoble,
France, 3 UFR/Sciences Santé, Université de Ouagadougou, Burkina Faso
* [email protected]
L’artémisinine (ART) est une substance naturelle très active sur les souches multi-résistantes de Plasmodium
falciparum. Cependant son application clinique est limitée par sa faible solubilité en milieu aqueux (0,064 mg.mL-1 à
25°C) et sa faible biodisponibilité par voie orale [1]. La mise en œuvre de cyclodextrines amphiphiles bioestérifiées
dont la synthèse est maîtrisée dans notre laboratoire [2,3] et d’esters de polyéthylène glycol, permet de viser deux
objectifs : i) d’une part d’améliorer la mise en solution de l’ART à travers son association aux vecteurs colloïdaux de
cyclodextrines (CDs) modifiées, ii) d’autre part d’améliorer la biodisponibilité de l’ART et son efficacité
thérapeutique à travers l’hydrophilisation de la surface des vecteurs pour augmenter leur résidence vasculaire en
évitant une capture trop rapide par les organes du système des phagocytes mononuclées [4], suite à leur
administration intraveineuse.
Dans ce travail, les CDs bioestérifiées ont été obtenues par transestérification de la γ-CD en présence de décanoate
de vinyle. La réaction est catalysée par la thermolysine [5]. Les dérivés obtenus (γ-CDC10), principalement
caractérisés par spectrométrie de masse MALDI/MS, conduisent par la méthode de nanoprécipitation, à des systèmes
submicroniques de forme sphéroïdale de type nanosphères ou nanoréservoirs, de tailles monodisperses de l’ordre de
70 et 220 nm, respectivement. Ces nanostructures d’ester de γ-CDC10 prennent en charge des quantités appréciables
d’ART avec un taux de recouvrement de l’ordre de 95 %, permettant ainsi d’envisager une administration par voie
parentérale. A titre d’exemple, la concentration de l’ART dans les suspensions aqueuses avoisine 0,4 mg. mL-1, soit
une augmentation de la dose d’ART mise en solution en milieu aqueux d’un facteur 6,25 pour le cas des
nanosphères. Dans le cas des nanoréservoirs, les concentrations sont de l’ordre de 1,6 mg.mL-1, soit une
augmentation d’un facteur 25. Les suspensions colloïdales d’ART ont été stabilisées avec du stéarate de PEG 4000
ou 1500. Cette couronne hydrophile, qui protège les particules de la floculation par répulsion stérique, devrait
également permettre de les rendre furtives. Toutes les suspensions colloïdales chargées d’ART sont actives in vitro
sur des souches chloroquino-résistantes (K1) et chloroquino-sensibles (3D7) de Plasmodium falciparum. Les CI50, de
l’ordre de 3 à 6 ng.mL-
1
déterminées après 72h d’incubation des nanosystèmes dans le milieu de culture, sont
comparables à celle d’une solution d’ART en solvant non aqueux déterminées dans les mêmes conditions. Ainsi, en
accord avec les études in vitro de dissolution, l’ART est relarguée à partir de son support nanoparticulaire et peut
alors exercer son activité antiparasitaire. Enfin, l’évaluation de la sécurité d’emploi et de la furtivité des nanovecteurs
(tests in vitro et in vivo) est en cours d’évaluation. Des résultats préliminaires semblent montrer que la décoration des
« nanocargos » par le PEG 1500 est en faveur d’une diminution de l’activation du complément.
[1]
[2]
[3]
[4]
M.E. Van Agtmael, T.A. Eggelte, C.J. van Boxtel, TiPS 20 (1999) 199-205.
L. Choisnard, A. Gèze, J-L. Putaux, Y.S. Wong, D. Wouessidjewe, Biomacromolecules 7 (2006) 515-520.
L. Choisnard, A. Gèze, B.G.J. Yaméogo, J-L. Putaux, D. Wouessidjewe, Int. J. Pharm. 344 (2007) 26-32.
A. Gèze, L. Tieu Chau, L. Choisnard, J.P Mathieu, D. Marti-Battle, L. Riou, J-L. Putaux, D. Wouessidjewe, Int. J. Pharm.
344 (1-2) (2007) 135.
[5] A. Gèze, L. Choisnard, J-L. Putaux, D. Wouessidjewe, Mater. Science Eng. C 29 (2009) 458-462.
[6] A. Gèze, J-L. Putaux, L. Choisnard, P. Jehan, D. Wouessidjewe, J. Microencapsulation, 21 (6) (2004) 607-613.
41
IN VITRO INHIBITION OF PHOSPHODIESTERASE 4A1α,
PHOSPHOLIPASE A2 AND 5-LIPOXYGENASE I-B BY
WALTHERIA INDICA L. (STERCULIACEAE)
F. Zongo* 1,2; C. Ribuot 1; I.P. Guissou 2
1
Laboratory of Hypoxia-Physiopathology, University of Grenoble I, 2Laboratory of PharmacoToxicology, University of Ouagadougou
Introduction:
Waltheria indica L. (Sterculiaceae) is tropical herbaceous used in traditional pharmacopeia at
Burkina Faso for treatment of respiratory diseases such as cough and asthma.
This study aims to highlight the effect of plant on enzymes activity implied in smooth muscle
contraction (PDE4A1α) or inflammatory reaction (PLA2 and 5-lox I-B).
Methods:
Fractions were prepared from hydro-alcoholic extract of roots using dichloromethane, nhexane and ethyl acetate. Fluorimetric and photometric methods were used to measure
enzymatic activity in presence of the hydro-alcoholic extract and its fractions.
Results:
Significant inhibitory effect of Waltheria indica L. on activity of three enzymes was compared
to aminophylline or indomethacin. Ethyl acetate (F3) and residual (F4) fractions whose effect
are similar to initial hydro-alcoholic extract (HA), are more effective than n- hexane (F1) and
dichloromethane (F2) fractions. For PLA2 and 5-lox I-B, F3 and F4 fractions induced a 50%
inhibition at the concentration of 0.05 mg/mL and a 100% inhibition at the concentration of
0.5 mg/mL. Their effect on PDE4A1α activity is less only of 40% and seems not to be dosedependent.
Conclusion:
the present study demonstrates that Waltheria indica L. inhibited the activity of three enzymes
implied in smooth muscle contraction confirming its potential interest in respiratory diseases
treatment. Since F3 and F4 fractions are more potent than F1 and F2 ones, additional studies
will be performed using NMR and mass spectrometry for compounds identification. Isometric
contraction effects will be studied on tracheal, extrapulmonary and intrapulmonary bronchial
rings for better pharmacological characterization.
Key words: Waltheria indica, phosphodiesterase 4A1α, phospholipase A2, 5-lipoxygenase IB.
42
THE AMINOGLYCOSIDES: POTENTIAL ANTIVIRAL AGENTS
TARGETING HIV RNA SEQUENCES
Cécile Vanhaverbeke1*, Chady Nasrallah1, Renée Mayap-Talom1, Isabelle
Baussanne1, Jérôme Désiré1, Eric Ennifar2, Jean-Luc Décout1
1
Equipe Médicaments et Acides Nucléiques (EMAN), Département de Pharmacochimie
Moléculaire, ICMG FR2607, Grenoble, 2 Architecture et Réactivité de l’ARN, Université de
Strasbourg, IBMC CNRS, Strasbourg
Since the discovery of streptomycin in the 1940s, aminoglycosides have enjoyed
widespread applications as chemotherapeutic agents in the treatments of many types of
bacterial infections, including both Gram-positive and Gram-negative pathogens.1 Their
antibacterial mechanism of action has been shown to be linked to the aminoglycoside
molecular interaction with the 16S rRNA subunit of the 30S bacterial ribosome that disturbs
protein synthesis.
In the family of the aminoglycosides, neomycin B has also appeared to be able to
strongly inhibit the interaction between the HIV-1 TAR RNA and the transactivating protein
Tat.2 However, aminoglycosides have no real antiviral activity.
In the search for new antiviral agents, a small aminoglycoside, neamine, which
corresponds in neomycin B to a crucial recognition element for TAR RNA interaction, has
been modified selectively on different hydroxyl functions. Several derivatives able to strongly
inhibit the TAR-Tat binding with submicromolar concentrations were identified using FRET
experiments.3 Affinity constants for TAR of the inhibiting derivatives also were measured by
SPR and microcalorimetry (ITC).
O
H
H
O
H
O
N
eom
ycinB
O
H
O
H
2N
N
H
2
O
H
O
O
O 5
O
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H
2
O
H
2N
O O
H
N
H
2
4'
N
H
2
H
O
H
O
5' O
1' H
N
4 2 3
3' HN 2'
2
O
H
O
N
eam
ine
2
N
H
2
H1
5 6O
O
H
References
1.
2.
3.
J. Zhou, G. Wang, L.-H. Zhang, X.-S Ye, Med. Res. Reviews, 2007, 27, 279-316.
H.-Y. Mei, A. Galan, S. Halim, P. Mack, W. Moreland, B. Sanders, H. N. Truong, A. W. Czamikt, Bioorg.
Med. Chem. Lett., 1995, 5, 2755-2760.
E. Riguet, J. Désiré, O. Boden, V. Ludwig, M. Göbel, C. Bailly, J.-L. Décout, Bioorg. Med. Chem. Lett.,
2005, 15, 4651-4655.
43
Synthesis and antimicrobial evaluation of
amphiphilic neamine derivatives
Zimmermann Louis1, Baussanne Isabelle1, Vanhaverbeke Cécile1, Bussière
Antoine1, Ouberai Myriam2, Mingeot-Leclercq Marie-Paule2, Décout Jean-Luc1*
Université de Grenoble I/CNRS, UMR 5063, Département de Pharmacochimie Moléculaire,
ICMG FR2607, France et 2Université Catholique de Louvain, Louvain Drug Research
Institute, LDR1, Unité de Pharmacochimie Cellulaire et Moléculaire, FACM, Brussel, Belgium
Since the discovery of streptomycin in the 1940s, aminoglycosides have enjoyed widespread
applications as chemotherapeutic agents in the treatment of many types of bacterial infections,
including both Gram-positive and Gram-negative pathogens. Their antibacterial mechanism
of action has been shown to be linked to the aminoglycoside molecular interaction with the
16S rRNA subunit of the 30S bacterial ribosome that disturbs protein synthesis. Due to the
rapid emergence of resistant bacterial strains and the toxicity of certain antibiotics, it is
imperative to discover and develop novel antimicrobial drugs.
In the search for new antibiotics agents, neamine derivatives were prepared through
modification of the amino or the hydroxyl functions in order to increase the affinity for rRNA
and prevent the activity of aminoglycoside-modifying enzymes. For this purpose, it is
necessary to develop short and regioselective methodologies to introduce for example
aromatic rings able to improve the affinity for the RNA target, through groove binding and/or
stacking1.
NH
2
O
HO O
3'
NH2
H2N
O
HO
NH2
6
O
neamine derivative
The antibiotic activities of different neamine derivatives were measured on a wild type
and resistant cells. Neamine carrying two or three naphthylmethylene groups in position 3’, 4’
and/or 6 were found to be interesting antibiotic agents against a broad range of Gram (+) and
(-) strains surexpressing resistance to aminoglycosides2. Mechanistic studies suggest a new
mode of action for the aminoglycosides through a membrane destabilization3.
References
1
E. Riguet, J. Désiré, C. Bailly, J.-L. Decout, Tetrahedron, 2004, 60, 8053-8064.
2
I. Baussanne, A. Bussière, S. Halder, C. Ganem-Elbaz, M. Ouberai, M. Riou, J.-M. Paris, E. Ennifar, M.-P.
Mingeot-Leclercq, J.-L. Décout, J. Med. Chem., 2010, 59, 119-127.
3
M. Ouberai, F. El Garch, A. Bussière, M. Riou, D. Alsteens, L. Lins, I. Baussanne, Y. F. Dufrêne, R. Brasseur,
J.-L. Décout, M.-P. Mingeot-Leclercq, Biochim. Biophys. Acta, 2011, doi: 10.1016/j.bbamem.2011.01.014.

1ère Journée Scientifique du Médicament

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