Mode opératoire V3 SSEIA

03/09/02
MODE OPERATOIRE
SEROTYPAGE VIH
*V3 A-B-C-D-AE / O / 2
*TM (cons + D) / O / 2
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Sensibilisation de 10 plaques
TM
M+D
1.
O
V3
VIH-2
O VIH-2
V3
A
B
C
D
AE
100%
0%
mél.
peptide
Tp
PBS
Décongeler les peptides de sensibilisation (peptides V3 longs avec Cystéine à 30AA).
l TM : gp M, D, O, VIH-2 (sm) à 100 µg/ml
l V3 : A, B, C, D, AE, O, VIH-2 (sm) à 100 µg/ml
Préparer du tampon PBS
2.
Préparer la solution de sensibilisation TM cons M + D à 1 µg/ml :
+
50 µl de peptide TM D
50 µl de peptide TM cons M qsp 10 ml de PBS 1X (soit + 9,900 ml)
Préparer la solution de sensibilisation TM O à 1 µg/ml :
100 µl de peptide O qsp 10 ml de PBS 1X (soit + 9,900 ml)
Préparer la solution de sensibilisation TM VIH-2/sm à 1 µg/ml :
100 µl de peptide sm qsp 10 ml de PBS 1X (soit + 9,900 ml)
Préparer la solution de sensibilisation V3 O à 2,5 µg/ml :
250 µl de peptide O qsp 10 ml de PBS 1X (soit + 9,750 ml)
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Préparer la solution de sensibilisation V3 VIH-2/sm à 2,5 µg/ml :
250 µl de peptide sm qsp 10 ml de PBS 1X (soit + 9,750 ml)
Préparer la solution de sensibilisation V3 A-B-C-D-AE à 2,5 µg/ml soit 0,5 µg/ml de
chaque peptide :
+
+
+
+
3.
300 µl de peptide A
300 µl de peptide B
300 µl de peptide C
300 µl de peptide D
300 µl de peptide AE qsp 60 ml PBS 1X (soit + 58,5 ml)
Distribuer 100 µl de solution de sensibilisation TM cons M + D, O, VIH-2/sm et V3 O
dans leurs colonnes respectives.
Distribuer 100 µl de solution de sensibilisation V3 A-B-C-D-AE dans les colonnes A, B,
C, D, AE, mél. peptide et Tp PBS.
4.
Incuber une nuit (20h) à 37°C sans couvrir les plaques dans une étuve autre que CO2.
Vérifier au bout de 20h que les solutions soient évaporées.
5.
Préparer la solution de lavage PBS 1X + Tween 20 – 0,5%
= 1 l PBS + 5 ml Tween 20
6.
+
7.
Préparer la solution de saturation des puits PBS 1X + 2% Sérum de Veau Nouveau Né
(SVNN)
200 ml de PBS 1X
4 ml de SVNN
Faire 3 lavages (200µl par puits)
Tapoter les plaques
8.
Distribuer 200 µl de solution de saturation des puits dans les tous les puits
Incuber 45 minutes à + 37°C sans couvrir les plaques dans une étuve autre que CO2.
9.
Faire 3 lavages
Tapoter les plaques
Laisser sécher les plaques environ 30 minutes à température ambiante ;
Stocker les plaques, enveloppées 2 par 2 dans du papier aluminium, à –20°C (stable 2
mois). Indiquer la date de la sensibilisation.
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SEROTYPAGE 2 plaques
l
Décongeler :
- Sérum de veau nouveau né (SVNN)
- 2 plaques sensibilisées
- Peptides d'inhibition A, B, C, D, AE et le mélange A-B-C-D-AE à 100 µg/ml
- Echantillons à tester et 1 témoin négatif et positif
(1 témoin négatif et 1 témoin positif par série)
l
Préparer :
- Tampon de lavage : PBS 1X / 0,5% Tween 20
- Tampon de dilution de sérums : Nacl 5M – PBS – 10% SVNN – 0,05% Tween 20
18 ml Nacl 5M
+ 10 ml SVNN
+ 50 µl TW 20
+ 72 ml PBS
l
Diluer les échantillons et les témoins : 1/100°
1,5 ml Tp de dilution
+15 µl échantillon
l
Distribuer les peptides d'inhibition : 10 µl
Peptide A dans colonne 6
Peptide B dans colonne 7
Peptide C dans colonne 8
Peptide D dans colonne 9
Peptide AE dans colonne 10
Mélange A-B-C-D-AE dans colonne 11 (100% d'inhibition)
Tampon PBS dans colonne 12 (0% d'inhibition)
l
Distribuer les échantillons et les témoins : 100 µl (lignes 1 à 8)
l
Incubation 30 minutes à température ambiante (pièce climatisée)
l
5 lavages PBS-Tween 20
l
Avant la fin des lavages, préparer le conjugué : 1/5000°
25 ml Tp de dilution
+
5 µl Conjugué (Fab'2 de chèvre anti IgG humaines)
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l
Tapoter la plaque
l
Distribuer le conjugué : 100 µl
l
Incubation 30 minutes à température ambiante (pièce climatisée)
l
Avant la fin de l'incubation, préparer le substrat :
20 ml H2O
1 cp Buffer Urea H2O2
1 cp OPD
BIEN AGITER POUR DISSOUDRE
l
3 lavages PBS-Tween 20
l
Tapoter la plaque
l
Distribuer le substrat : 100 µl
l
Incubation 15 minutes à température ambiante et à l'obscurité
l
Arrêt de la réaction avec H2SO4 2N / 50 µl
l
Lecture de la densité optique : 492 nm /620-630nm
l
Remplir la feuille de traçabilité
RESULTATS
Test valide si : DO mélange 100% inhibition ≤ DO PBS O% inhibition/2
Cocher la DO la plus faible = blocage maximum = sous-type
VALEUR SEUIL pour TM cons M + D, TM O, TM VIH-2/sm et V3 VIH-2/sm, V3 O :
N+0.100
Il est possible que les VIH 1 M réagissent à la fois sur TM cons M + D et TM O avec une
DO < en TM O
% inhibition = [ (DO Tp PBS – DO peptide) / (DO Tp PBS – DO Mél A-B-C-D-AE)]*100
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PREPARATION DES REACTIFS
1.
Préparation des solutions mères de peptides longs (30 AA avec Cystéine) de
sensibilisation à 1 mg/ml
- dissoudre chaque peptide lyophilisé dans de l'eau distillée stérile pour obtenir une
solution mère à 1 mg/ml
- aliquoter par 1 ml
- stoker à –20°C
2.
Préparation des solutions mères de peptides courts (sans Cystéine) d'inhibition à 1 mg/ml
- dissoudre chaque peptide lyophilisé dans de l'eau distillé pour obtenir une solution mère
à 1 mg/ml
- aliquoter par 1 ml
- stoker à –20°C
3.
Préparation des solutions stocks de peptides d'inhibition à 100 µg/ml
-diluer chaque solution mère au 1/10 ° dans du tampon PBS pH 9.6 pour obtenir une
solution stock à 100 µg/ml ( 100 µl de la solution mère
+ 900
µl de tampon PBS)
-Pour le mélange A-B-C-D-AE : prélever 20 µl de chaque peptide à 1 mg/ml + 900 µl de
tampon PBS.
4.
Solution de saturation / PBS + 2% SVNN
Pour 10 plaques : 200 ml de PBS 1X + 4 ml de SVNN
5.
Tampon de dilution de sérum / NaCl 5M – PBS 10% SVNN 0.05% Tw 20
Pour 100 ml : 18 ml NaCl 5M + 10 ml SVNN + 50 µl Tw 20 + 72 ml PBS
6.
Conjugué ( Fab'2 de chèvre anti IgG humaines)
Dilution au 1/5000° : 5 µl de conjugué + 25 ml de tampon de dilution de sérum.
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REFERENCE DES REACTIFS
1. Plaques : Plaques FD PLAT Becton Dikinson Falcon 96 pts Flex ( par 50 pq)
Réf : 5633
2. Sérum Veau Nouveau Né Gibco par 100ml
Life Technology Invitrogen.
Réf : 16010 – 167 Prix = 9 Euros 40 cts.
3. Conjugué Fab'2 de chèvre anti IgG humaine, HRP 1ml
Cat aHI 1304
Origine Biossource Int'l, INC./USA
Fournisseur : Clini Sciences
4. Tween 20 : Polyoxyéthylènesorbitan monolaurate Tween
Ref : P 1379 500ml Px=127F
5. OPD Tablets 50 sets (sigma)
Ref: P 9187 Px=636F
6. PBS poudre 4*1L
Ref : 75511 Biomérieux
7. Sodium Chloride, 5M Solution Molecular /
Ref S5150-1L - Sigma
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