Comparaison de trois méthodes pour la détection de

Comparaison de trois méthodes pour la
détection de Mycoplasma et Ureaplasma
Par Bandolier Lara
Au Laboratoire FutureLab-BBR, Lausanne
Ecole Supérieure de la Santé, Lausanne
2010 – 2011
Mentor : le laboratoire FutureLab-BBR, département de bactériologie
Sommaire
Mycoplasma et Ureaplasma sont des procaryotes plus communément appelés
mycoplasmes. Ce sont des bactéries dépourvues de paroi, ce qui les rend non colorables
au Gram. Les mycoplasmes sont principalement à l'origine d'urétrites, de salpingites, mais
sont aussi dangereux pour le fœtus car ils peuvent provoquer des méningites voire la mort
du bébé. Les mécanismes pathologiques de ces organismes sont encore mal connus,
c'est pour cela qu'il faut les détecter rapidement. Les mycoplasmes, grâce à la variation de
la structure et de l'expression de leurs protéines de surface, peuvent s'adapter facilement
à leur environnement.
Il existe plusieurs genres de la famille des Mycoplasmataceae. Il y a les Mycoplasma
pneumoniae, génitalium et hominis ainsi que les Ureaplasma urealyticum et parvum. Dans
ce travail, nous allons nous intéresser à Mycoplasma hominis et Ureaplasma urealyticum.
Le but de cette étude est de comparer trois méthodes pour la détection de Mycoplasma et
Ureaplasma dans les frottis vaginaux et dans les urines. Ces méthodes sont :la culture, la
PCR en temps réel et le kit Mycoplasma DUO.
Summary
Mycoplasma and Ureaplamsa are prokaryotes more commonly called mycoplasmas. They
are bacteria without any cell wall, that’s the reason why they are not colorable by the Gram
method. The mycoplasmas are coming from urethritis, salpingit, but are dangerous for the
fetus too, because they can cause meningitids or death of the baby. The pathological
mechanisms of these organisms are still poorly known, that’s why they must be detected
quickly. The mycoplasmas, due to the change in structure and expression of their surface
proteins, can easily be adapted to their environment.
There exist several species in the family of Mycoplasmataceae. There are Mycoplasma
pneumoniae, genitalium and hominis, Ureaplasma urealyticum and parvum too. In this
work, we mainly focus on Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum.
The purpose of this study is to compare three methods for the detection of Mycoplasma
and Ureaplasma in vaginal smears and urine. These methods are: culture, real-time PCR
and Mycoplasma Duo kit.
1
Table des matières
1. Introduction ...................................................................................................................... 4
1.1 Mycoplasma hominis .................................................................................................... 4
1.1.1 Histoire ................................................................................................................ 4
1.1.2 Caractéristiques, morphologie ............................................................................. 4
1.1.3 Habitat et mode de transmission ......................................................................... 4
1.1.4 Pathogénicité ...................................................................................................... 4
1.1.5 Traitement et prophylaxie .................................................................................... 5
1.2 Ureaplasma .................................................................................................................. 5
1.2.1 Caractéristiques, morphologie ............................................................................. 5
1.2.2 Habitat et mode de transmission ......................................................................... 6
1.2.3 Pathogénicité ...................................................................................................... 6
1.2.4 Traitement et prophylaxie .................................................................................... 6
2. Objectif de l’étude ............................................................................................................ 6
3. Matériels ........................................................................................................................... 7
4. Méthodes .......................................................................................................................... 7
4.1 Culture .......................................................................................................................... 7
4.1.1 Généralité ........................................................................................................... 7
4.1.2 Matériels ............................................................................................................. 7
4.1.3 Préparation des échantillons ............................................................................... 7
4.1.4 Interprétation des résultats .................................................................................. 8
4.2 PCR en temps réel ....................................................................................................... 8
4.2.1 Généralité ........................................................................................................... 8
4.2.2 Extraction de l’ADN ............................................................................................. 9
4.2.3 Matériel ............................................................................................................. 10
4.2.4 Protocole ........................................................................................................... 10
4.2.5 Etape de la PCR ............................................................................................... 11
4.2.6 Matériel ............................................................................................................. 12
4.2.7 Protocole ........................................................................................................... 13
4.2.8 Préparation des échantillons ............................................................................. 13
4.2.9 Interprétation des résultats ................................................................................ 14
4.3 Culture ........................................................................................................................ 16
4.3.1 Généralité ......................................................................................................... 16
4.3.2 Principe ............................................................................................................. 16
4.3.3 Matériel ............................................................................................................. 17
4.3.4 Préparation des échantillons ............................................................................. 17
4.3.5 Protocole ........................................................................................................... 17
4.3.6 Interprétation des résultats ................................................................................ 17
2
5. Résultats ......................................................................................................................... 18
5.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 18
5.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 19
6. Analyses des résultats................................................................................................... 20
6.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 20
6.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 21
7. Problèmes rencontrés .................................................................................................. 21
7.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 21
7.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 21
8. Sensibilité / spécificité................................................................................................... 22
8.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 22
8.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 23
9. Durée des analyses........................................................................................................ 23
9.1 Ureaplasma ................................................................................................................ 23
9.2 Mycoplasma ............................................................................................................... 23
10. Coût des analyses........................................................................................................ 23
11. Synthèse et conclusion ............................................................................................... 24
12. Bibliographie ................................................................................................................ 25
13. Lexique ......................................................................................................................... 27
14. Remerciements ............................................................................................................ 28
15. Annexes ........................................................................................................................ 29
3
1. Introduction
1.1 MYCOPLASMA HOMINIS
1.1.1Histoire
Microorganisme ubiquitaire, il a été découvert suite à un abcès de la glande de Bartholin
en 1937 par Diènes et Edsall. Depuis, près de 15 espèces de mycoplasmes ont été
isolées principalement du tractus respiratoire et génital. 1-2-4
1.1.2 Caractéristiques, morphologie
Classe : Mollicutes
Ordre : Mycoplasmatales
Famille : Mycoplasmataceae
Genre : Mycoplasma
Les mycoplasmes sont les plus petits organismes ayant une croissance extracellulaire.
C'est une bactérie en forme de cocci de 0.2 à 0.3 µm de diamètre, non colorable par le
Gram suite à l'absence de paroi cellulaire. Ils possèdent de l’arginine déshydrogénase.
Cette bactérie pousse sur gélose à 48h en micro-aérobiose, mais pousse très bien en
anaérobiose. Sous le microscope binoculaire, nous pouvons les identifier par leur forme
en « œufs au plat ». 1-2-4
1.1.3 Habitat et mode de transmission
Espèces prédominantes retrouvées dans le tractus uro-génital. Ils se trouvent aussi à la
surface des muqueuses du tractus respiratoire, des yeux, des glandes mammaires et des
articulations.
Le mode de transmission est sexuel. Il existe aussi une transmission de la mère à l'enfant
lors de l'accouchement par voie basse. 1-2-4
1.1.4 Pathogénicité
Il existe plus de 100 espèces de Mycoplasma dont 3 sont pathogènes pour l'homme :
Mycoplasma hominis
Mycoplasma genitalium
Mycoplasma pneumoniae
Mycoplasma hominis provoque des pyélonéphrites, des vaginoses, des endométrites et
des salpingites. Peut, aussi, être la cause de stérilité chez l'homme.
Pathologie de la grossesse :
Durant la grossesse, les mycoplasmes peuvent coloniser l'endomètre et, par voie
ascendante, les membranes fœtales, liquide amniotique et tissus fœtaux. Ils sont aussi
responsables de poussées fébriles post-partum et post-abortum(A).
4
Infections néonatales :
Les mycoplasmes peuvent provoquer des méningites, surtout chez les prématurés ayant
une infection respiratoire et des états septicémiques.
Les mécanismes physiopathologiques mis en jeu dans les infections à M.hominis sont mal
connus. Trois types de phénomènes jouent probablement un rôle : des propriétés
d’adhésion, l’existence de variations antigéniques et la production d’enzymes et de
métabolites toxiques. C’est ainsi que des phénomènes d’adhésion ont été décrits chez
M.hominis. Les variations de l’expression et de la structure des protéines de surface
jouent un rôle important dans l’adaptation des mycoplasmes à leur environnement. 1-2-4
1.1.5 Traitement et prophylaxie
Par leur absence de paroi, les Mycoplasmes sont insensibles aux antibiotiques qui
agissent sur la synthèse des peptoglycanes comme : les bêtalactamines,
glycopeptides...Ils résistent également aux polymyxines, sulfamides, triméthoprimes, acide
nalidixique et à la rifampicine. M. hominis est sensible aux lincosamides mais présente
une résistance naturelle à certains macrolides (Erythromycine) et dérivés.
Les antibiotiques qui peuvent être actifs font partie de la famille des fluoroquinolones
(Norfloxacin, Ciprofloxacin) ou des aminosides (Gentamicin, Streptomicin).
Le meilleur moyen d'éviter des infections à mycoplasmes est de se protéger lors de
relations sexuelles. 1-2-4
Image 1 : Mycoplasma
Image 2 : Mycoplasma, Microscope binoculaire
1.2 UREAPLASMA
1.2.1 Caractéristiques, morphologie
Classe : Mollicutes
Ordre : Mycoplasmatales
Famille : Mycoplasmataceae
Genre : Ureaplasma
Bactérie pléomorphique(B) se présentant sous forme coccoïde, filamenteuse ou
multinuclée, d'un diamètre de 0.3 à 0.8 µm. Les uréaplasmes sont dépourvus de paroi
mais sont liés par une membrane trilamellaire(C). Ils produisent de l'uréase et sont
immobiles. Tout comme les Mycoplasma, leur atmosphère est en micro-aérobiose sur
gélose à Mycoplasmes. Sous le microscope binoculaire, nous pouvons les différencier par
leur forme « d'oursin ». 1-4
5
1.2.2 Habitat et mode de transmission
Nous pouvons isoler les Uréaplasma dans l'appareil uro-génital et rhino-pharynx. C'est
une bactérie responsable de maladies sexuellement transmissibles, mais elle peut aussi
se transmettre de la mère à l'enfant par accouchement naturel, tout comme les
Mycoplasma.1-4
1.2.3 Pathogénicité
Il existe 7 espèces d'Ureaplasma dont 2 sont pathogènes pour l'homme :
Ureaplasma urealyticum
Ureaplasma parvum
Le pouvoir pathogène d'Ureaplasma est peu connu, mais c'est la principale cause
d'urétrites non gonococciques. Il peut causer une chorioamnionite(D) et une insuffisance
pondérale à la naissance. Il a été associé à la pyélonéphrite, au syndrome de Reiter(E), à
la pneumonie congénitale et à l'urétrocystite chronique chez les sujets immunodéprimés,
habituellement asymptomatiques. 1-4
1.2.4 Traitement et prophylaxie
Ayant la même caractéristique morphologique que les Mycoplasma, les Ureaplasma sont
naturellement résistants aux Bêta-lactamines ainsi qu'à tous les antibiotiques qui agissent
sur la paroi cellulaire des bactéries. Ils sont sensibles à la tétracycline et aux quinolones.1-4
La seule prévention connue de nos jours est l'utilisation du préservatif.
Photo 3 : Mycoplasma hominis contre Ureaplasma
2. Objectif de l'étude
Au laboratoire de bactériologie FutureLab, nous détectons les Mycoplasma et les
Ureaplasma par isolement sur gélose sélective contenant un milieu nutritif et des
antibiotiques inhibant la croissance de certaines autres bactéries et levures.
Malheureusement, il est possible d'avoir des faux négatifs si l'ensemencement est mal
effectué.
Le but de cette étude est de comparer trois méthodes :
PCR en temps réel
Culture sur gélose A7 MYCO
Kit Mycoplasma DUO (pour urine et sperme)
6
Ceci nous permettra de confirmer ou d'infirmer la qualité de la méthode utilisée
actuellement. La spécificité, la sensibilité, la durée et le coût des analyses seront
comparés tout au long de ce travail. Pour ce faire, nous avons choisi de travailler avec 25
échantillons pour Mycoplasma et 30 échantillons
pour Ureaplasma. Parmi ces
échantillons, il y a des urines natives et des frottis vaginaux.
3. Matériels
1. Echantillons provenant de FutureLab. Utilisés directement pour la mise en culture
ainsi que pour l’utilisation du Kit Mycoplasma DUO. Congelés dans une solution de
conservation avant l’utilisation pour la PCR en temps.
2. Plaques Myco A7 pour la mise en culture. Fabriquant : Biomérieux. N°lot :
1000166580. Date d’expiration : 30.03.2011. La composition sera décrite cidessous.
3. Kit et appareil pour l’extraction d’ADN, ainsi que le kit et l’automate pour
l’amplification des échantillons. Pour Uréaplasme : Fabriquant : E.coli s.r.o
Studenohorsda. N°lot : 26.09.10 Date d’expiration : 16.03.2011. Pour Mycoplasme :
Fabriquant : E.coli s.r.o Studenohorsda. N°lot : 20.11.10. Date d’expiration :
08.09.2011.
4. Kit Mycoplasma DUO qui sera décrit au point 4.3. Fabriquant : BIORAD.
N°lot : 0J3192. Date d’expiration : 15.08.2011
4. Méthodes
4.1 CULTURE
4.1.1 Généralité
La culture se fait sur Gélose A7 Mycoplasma. C'est une gélose sélective qui a une base
nutritive contenant des peptones, du sérum de cheval et des facteurs de croissance qui
favorisent le développement des mycoplasmes (Cystéine, PolyVite X, Arginine, Urée). Elle
possède aussi des antibiotiques qui inhibent la croissance des bactéries Gram+ et Gram-,
ainsi que certaines levures. 7
4.1.2 Matériels
Gélose A7 Mycoplasma mise à température ambiante
Ecouvillons
Etuve anaérobie
Echantillons 7
4.1.3 Préparation des échantillons
Pour les urines, il faut mélanger les vacutainers ou l'urine mi-jet, ensuite imbiber
l'écouvillon et ensemencer la gélose en passant dans trois sens différents. Mettre la
gélose en anaérobiose à 37 °C pendant 48h.
7
Pour les frottis vaginaux, il faut séparer la gélose en deux parties, ensemencer une moitié
directement avec l'écouvillon dans trois sens différents. Mettre la plaque en anaérobiose à
37°C pendant 48h.7
4.1.4 Interprétation des résultats
Lire les plaques sous microscope binoculaire en prenant soin de regarder chaque champs.
Attention : ne pas confondre avec des levures ou des Bacilles négatifs.
1 chaque 2 champs : +
1-2 par champs
: ++
3-5 par champs
: +++
>5 par champs
: ++++
Totalité des champs pour les frottis vaginaux : 15 champs
Totalité des champs pour les urines : 30 champs.
4.2 PCR EN TEMPS RÉEL
4.2.1 Généralité
La PCR en temps réel est une méthode rapide de biologie moléculaire pour obtenir une
quantité suffisante d'ADN grâce à l'amplification spécifique d'une séquence d'ADN in vitro.
Cette méthode permet de détecter et/ou de quantifier le matériel recherché. Grâce à la
RT-PCR, nous pouvons voir la réaction de façon exponentielle. Le CT (ou Cycle Treshold)
est calculé par le logiciel et, est inversement proportionnel à la quantité initiale de copies.
L’appareil de PCR en temps réel est muni d’un couvercle contenant un système optique,
permettant l'émission de lumière bleue et la réception de la lumière émise en retour (verte
à rouge) par les produits fluorescents, vers une caméra CCD (Charge-Coupled Device).
Le signal émis est ainsi mesuré et enregistré par un système informatique. 3
8
Image 4 : Photo du fonctionnement de l’appareil à PCR
Photo 5 : Agrandissement du système du rotor pour la PCR en temps réel
Il faut savoir, que l'échantillon est traité avant d'être utilisé pour la PCR temps réel. En
effet, chaque prélèvement biologique doit subir une extraction d'ADN ou d'ARN.
4.2.2 Extraction de l'ADN
Pour l'extraction d'ADN nous avons utilisé l'automate EZ1 BioRobot de QIAGEN. La
technique des particules magnétiques donne à l'ADN une haute qualité. Elle est utile pour
une utilisation directe d'amplification ou autre application enzymatique.
Le rendement dépend de la souche de bactéries, de la densité, du volume d'échantillon et
du volume d'élution.
L'extraction dure 15 minutes. Le tampon ainsi que la protéinase K vont permettre de
détruire la structure de l'ADN afin d'éliminer les protéines et de libérer les acides
nucléiques. Quand cette étape est terminée, les acides nucléiques sont capturés pas les
particules magnétiques qui vont être lavées à plusieurs reprises. Lors de l'élution, l'éluât
se détache des billes et celles-ci sont capturées par un système d'aimantation qui les
retient.3
9
Photo 6 : Extraction d’ADN manuelle contre automatique
4.2.3 Matériel :
Automate EZ1 BioRobot QIAGEN
Tampon G2
Protéinase K
Echantillons
Contrôles + et Standard interne 5
Photo 7 : Automate Extracteur d’ADN
4.2.4 Protocole :
Pour commencer : Pour les frottis vaginaux
Mettre 90 µl de Tampon G2
Ajouter 10 µl de Protéinase K
200 µl d'échantillon + 10 µ de standard interne
10
Pour l'urine, il faut commencer par centrifuger 5 min à 3000 rpm.
Ajouter 200 µl de Tampon G2 dilué 1/10
10 µl de Protéinase K
Ensuite :
Faire chauffer 15 min à 56 °C
Pour finir :
Insérer la carte EZ1 DNA Bacteria dans l'automate.
Appuyer sur START
Choisir le programme avec 50 µl de volume d'élution
Presser sur next jusqu'à ce que l'appareil démarre. 5
4.2.5 Etape de la PCR
Pour la PCR en temps réel, nous avons utilisé le Rotor-Gene 3000. Il permet la détection
et la quantification de microorganismes pathogènes au moyen de sondes marquées par la
fluorescence. Cet appareil utilise le « hot Start » afin de réduire les réactions aspécifiques
et d'assurer une sensibilité maximale.3
Pour commencer, il y a la dénaturation à 95°C. Cela favorise la séparation des brins
d'ADN afin d'obtenir un ADN simple brin.3
Ensuite, il y a l'hybridation à 45°C-65°C. Cette étape permet aux amorces de s'hybrider au
brin d'ADN cible afin de servir de point de départ pour la polymérisation du brin d'ADN. 3
Pour finir, vient l'étape de l'élongation à 72°C. L'ADN polymérase va polymériser le brin
par ajout successif de désoxyribonucléotides libres par complémentarité : A-T, C-G dans le
sens 5'---3'. 3
C'est à ce moment que nous pourrons voir s'il y a le pathogène recherché par
fluorescence. En effet, lors du passage de la polymérase, celle-ci vient détacher la sonde
présente (si le pathogène est présent) car elle possède une activité exonucléasique en 5'.
Le fluorochrome émetteur (Reporter) va se détacher du fluorochrome suppresseur
(Quencher) ce qui va donner une fluorescence.3
11
Photo 8 : Sonde TaqMan
4.2.6 Matériel :
Rotor-Gene 3000
Premier Mix contenant les amorces et la sonde
Deuxième Mix contenant la polymérase, un tampon et les désoxyribonucléotides
Les échantillons
Les contrôles
Malheureusement, nous n'avons aucun détail sur le contenu des Mix ni sur les séquences
des amorces et de la sonde.6
Photo 9 : Rotor-Gene 3000
12
4.2.7 Protocole
Mettre dans le premier Mix 10 µl du second (contenant la polymérase, le tampon et les
désoxyribonucléotides)
Ajouter 10 µl d'échantillon ou de contrôle.
Le volume final est de 40 µl.
Mettre les tubes dans l'appareil.
Ouvrir le programme selon besoin :
Pour Ureaplasma :
Hold
:
95°C pendant 5 min
Cycling :
95 °C pendant 20 secondes
65 °C pendant 20 secondes
72 °C pendant 20 secondes
10 cycles
Cycling 2 :
95 °C pendant 20 secondes
60 °C pendant 30 secondes
72°C pendant 30 secondes
Avec acquisition FAM/Green, JOE/Yellow
35 cycles
Pour Mycoplasama :
Hold
:
Cycling :
95°C pendant 15 min
95 °C pendant 5 secondes
65 °C pendant 20 secondes
72 °C pendant 15 secondes
5 cycles
Cycling 2 :
95 °C pendant 5 secondes
60 °C pendant 20 secondes
72°C pendant 15 secondes
Avec acquisition FAM/Green, JOE/Yellow
40 cycles
Presser OK pour que le programme commence.
A ce moment là, identifier les échantillons.6
4.2.8 Préparation des échantillons
Pour les frottis vaginaux, casser l'écouvillon dans une solution de conservation (UTM-RT
MINI transport medium pour Virus, Chlamydia, Mycoplasma et Ureaplasma). Le matériel
sera plus stable s’il y a besoin de le congeler.
Pour les urines, on les utilise à l'état natif.
13
4.2.9 Interprétation des résultats
Cycling FAM
Nous pouvons voir que les contrôles positifs ont émis de la fluorescence, ce qui signifie
que ces échantillons possèdent de l'ADN de la bactérie recherchée.
Cycling JOE
Nous pouvons constater qu'un signal pour les contrôles positifs a été émis, donc il y a
aussi de l'ADN bactérien.
14
Cycling Cy5
Les contrôles positifs émettent aussi un signal dans ce Cycling. L'ADN bactérien
recherché est donc reconnu par la sonde.
Si les échantillons ne donnent aucun signal dans ces Cycling cela veut dire qu'ils ne
possèdent pas l'ADN recherché. Pour pouvoir valider la négativité de ces derniers, il faut
que l’échantillon positif soit détecté dans FAM. JOE et Cy5 et que le contrôle négatif ne
soit pas détecté.
Limite de détection de la PCR a été calculée avec différente concentrations :
1
2
3
4
5
6
Concentration (copies/µl)
CT
Concentration calculée (copies/ µl)
1000
500
50
100
10
5
19.90
51.46
23.88
22.77
25.26
----------
1403.89
349.82
40.16
108.49
1.68
-----------------------------------------------------
Nous pouvons voir que la détection est faite jusqu’à 10 copies pas µl. En dessous de cette
concentration, il faudrait concentrer l’échantillon pour qu’il soit détecté.
15
4.3 KIT MYCOPLASMA DUO
4.3.1 Généralité
En raison de l’état commensal ou pathogène des Mycoplasma et Ureaplasma,
l’interprétation de leur isolement à partir de prélèvements urogénitaux chez l’adulte doit
tenir compte de critères quantitatifs. La notion de traitement dépend du titre et du contexte
clinique.7
Photo 10 : Kit Mycoplasma Duo
4.3.2 Principe
La cupule X (au milieu en haut) contient un antifongique et un mélange d’antibiotique, d’où
sa sélectivité. Elle sert à l’enrichissement sélectif du prélèvement en mycoplasmes, en vue
d’une préparation d’inoculum standardisé pour un antibiogramme. L’identification et le
titrage des mycoplasmes sont basés sur l’utilisation de leurs propriétés
métaboliques (cupules U et U≥104 pour Ureaplasma, cupules H et H ≥104 pour
Mycoplasma) :7
Hydrolyse de l’urée par Ureaplasma urealiticum
Hydrolyse de l’arginine par Mycoplasma hominis
avec libération d’ammoniaque et alcalinisation du milieu. La réaction est visualisée par le
virage du jaune au rouge de l’indicateur de pH (rouge de phénol) :7
Cupule jaune : absence de mycoplasmes
Cupule rouge : présence de mycoplasmes.7
Le titrage repose sur le principe des dilutions en milieu liquide :
Dans la cupule D (au milieu en bas) : dilution 10-1
Dans la cupule U ≥104 (cupule pour uréaplasmes) : dilution 10-2
Dans la cupule H ≥104 (cupule pour mycoplasmes) : dilution 10-2
Nous considérons que toute cupule ayant virée au rouge contient au moins 1 UCC (unité
changeant de couleur).7
Chaque cupule contient :
Des substrats déshydratés pour l’identification
Des facteurs de croissance des mycoplasmes
Des inhibiteurs de croissance de la flore polymorphe associée.7
16
4.3.3 Matériel
Kit Mycoplasma DUO
Etuve à 37 °C
Echantillons
4.3.4 Préparation des échantillons
Centrifuger les urines 5 min à 1500 rpm7
4.3.5 Protocole
Avec la bouteille compte gouttes, distribuer 4 gouttes dans les 3 cupules du bas : U ≥104,
D, H ≥104.7
Mettre le culot d’urine dans le milieu de suspension et distribuer à l’aide d’une micropipette
4 gouttes dans les cupules du haut : U, X, H, et une goutte dans la cupule D.7
Avec une autre micropipette, bien homogénéiser le contenu de la cupule D et distribuer
respectivement 1 goutte dans la cupule U ≥104 et H ≥104.7
Recouvrir la microplaque avec un film adhésif.
Incuber 24h à 37 °C, puis prolonger de 24h si nécessaire.7
4.3.6 Interprétation des résultats
La première lecture après 24h est définitive dans le cas des titres forts. La deuxième
lecture à 48h permet de confirmer les négatifs, de révéler les titres faibles ou de révéler
les souches à titre fort avec un métabolisme lent.7
Négatif
:
Positif à Ureaplasma :
Positif à Mycoplasma :
Positif aux deux
:
Absence de changement de couleur
Virage de(s) cupule(s) U uniquement
Virage de(s) cupule(s) H uniquement
Virage de(s) cupule(s) U et H.
17
5. Résultats
5.1 UREAPLASMA
Echantillons
Culture
1
Frottis vaginal
Négative
2
Frottis vaginal
Négative
3
Frottis vaginal
Ureaplasma + <10
4
Frottis vaginal
Négative
PCR en temps réel
3
3
Kit Mycoplasma
DUO
Négative
-------------------------
Négative
-------------------------
Négative
-------------------------
Négative
-------------------------
Faiblement positive 48 Ureaplasma >104
copies
Mycoplasma <103
5
Urines
Ureaplasma + <10
6
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
7
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
8
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
9
Urines
Négative
Négative
Négative
4
10
Frottis vaginal
Ureaplasma +++ >10
11
Frottis vaginal
Négative
Faiblement positive 450 ------------------------copies
Négative
-------------------------
12
Frottis vaginal
Ureaplasma + <103
Négative
-------------------------
13
Frottis vaginal
Ureaplasma ++++ >104
Positive 53480 copies
-------------------------
14
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
15
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
16
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
17
Urines
Négative
Négative
Négative
Positive 7038 copies
-------------------------
Négative
-------------------------
Positive 1343 copies
-------------------------
18
Frottis vaginal
Ureaplasma +++ >10
19
Frottis vaginal
Négative
20
Frottis vaginal
Ureaplasma +++ >10
21
Urines
Négative
22
23
24
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Ureaplasma ++ <10
4
4
Négative
Négative
3
Positive 74408 copies
-------------------------
3
Positive 558798 copies
-------------------------
Positive 22 copies
-------------------------
Positive 2706 copies
-------------------------
Ureaplasma ++ <10
Ureaplasma + <10
3
3
25
Frottis vaginal
Ureaplasma ++ <10
26
Urines
Négative
27
Frottis vaginal
Ureaplasma +++ >104
28
Frottis vaginal
Faiblement positive 369 Ureaplasma <103
copies
Mycoplasma <103
Ureaplasma ++ <10
3
29
Urines
Ureaplasma + <10
30
Urines
Ureaplasma + <103
3
Positive 1181 copies
-------------------------
Positive 2116 copies
-------------------------
Faiblement positive 410 Ureaplasma >104
copies
Faiblement positive 280 Ureaplasma <103
copies
18
Nous pouvons remarquer, comme cité ci-dessus, que la culture d'Uréaplasma nous donne
15 échantillons négatifs et 15 échantillons positifs.
La PCR en temps réel nous donne 16 échantillons négatifs pour 14 positifs.
Il est dur d'interpréter les résultats du Kit Mycoplasma DUO car, malheureusement, je n'ai
pas trouvé assez d'échantillons d'urine positifs pour Uréaplasma. Je l'ai tout de même
inclus dans les analyses.
5.2 MYCOPLASMA
Echantillons
Culture
PCR en temps
réel
Kit Mycoplasma
DUO
1
Frottis vaginal
Négative
Négative
------------------------
2
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
3
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Frottis vaginal
6
Frottis vaginal
7
Frottis vaginal
Négative
Positive 15346
copies
Négative
Positive 11239
copies
Faiblement
positive 34
Négative
-------------------------
4
5
Mycoplasma ++++
>104
Négative
Mycoplasma ++++
>104
Négative
8
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
9
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
10
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Positive 5423
copies
Négative
-------------------------
11
Mycoplasma ++++
>104
Négative
12
Frottis vaginal
Frottis vaginal
14
Frottis vaginal
Positive 13340
copies
Positive 3433
copies
Négative
-------------------------
13
Mycoplasma ++++
>104
Mycoplasma ++++
>104
Négative
15
16
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Négative
Négative
Négative
Négative
-------------------------------------------------
17
Frottis vaginal
Négative
Négative
-------------------------
18
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Positive 27084
copies
Négative
-------------------------
19
Mycoplasma ++++
>104
Négative
20
Frottis vaginal
Frottis vaginal
Positive 3400
copies
Négative
-------------------------
21
Mycoplasma ++++
>104
Négative
22
Frottis vaginal
Frottis vaginal
24
Frottis vaginal
25
Frottis vaginal
Positive 6545
copies
Positive 13425
copies
Positive 24430
copies
Négative
-------------------------
23
Mycoplasma ++++
>104
Mycoplasma ++++
>104
Mycoplasma ++++
>104
Négative
-------------------------------------------------------------------------------------------------
-------------------------
-------------------------------------------------
-------------------------
-------------------------
-------------------------------------------------------------------------
19
Pour la mise en culture, nous obtenons 10 échantillons positifs et 15 échantillons négatifs.
Pour la PCR en temps réel, nous obtenons les mêmes résultats.
6. ANALYSE DES RÉSULTATS
6.1 UREAPLASMA
Pour mener à bien cette étude, j'ai utilisé 15 échantillons négatifs et 15 échantillons
positifs pour Ureaplasma. Afin d'obtenir cette quantité, j'ai pris comme méthode de base la
mise en culture des échantillons car nous pouvons dire avec certitude qu'il n'y a pas de
cultures faussement positives puisque nous voyons quelles bactéries poussent sur la
gélose.
Pour les échantillons N°3 et N°12, nous pouvons constater que les échantillons sortent
positifs pour la culture d’Ureaplasma alors qu’en RT-PCR, ils sortent négatifs. Ces
résultats peuvent s’expliquer par leur très faible concentration, ce qui nous donne des faux
négatifs.
Pour l’échantillon N°5, il y a une cohérence avec la RT-PCR alors que le Kit Mycoplasma
DUO nous donne une concentration d’Ureaplasma trop élevée et une positivité pour
Mycoplasma alors que l’échantillon est négatif. Il est vrai que cet échantillon était mal
ensemencé ce qui pourrait expliquer le faux négatif pour les mycoplasmes.
Pour l’échantillon N°10, la culture ne correspond pas à la PCR. En effet, la première nous
donne une positivité forte contre une faible positivité. Cela peut s’expliquer pas une
inhibition de l’échantillon vu sa quantité.
Pour l’échantillon N°26, la culture nous donne un négatif alors que la PCR et le Kit nous
donnent faiblement positif pour Ureaplasma. Nous rencontrons à nouveau un faux négatif
car la gélose n’avait pas été ensemencée dans les trois sens comme prévu. De plus, le kit
nous donne une positivité pour Mycoplasma.
Pour l’échantillon N°29, la positivité est cohérente dans la culture et le Kit mais la
concentration ne l’est pas.
Nous pouvons déjà constater que les résultats ne sont pas concordants. En effet, certains
cas devraient être positifs alors qu'en PCR ils ne sont pas détectes et vice versa pour les
échantillons négatifs.
Malgré ce fait, nous voyons que les résultats pour Mycoplasma DUO ne sont pas
satisfaisants car tout échantillon faiblement positif, donc inférieur à 103, révèle une
positivité supérieure à 104.
20
6.2 MYCOPLASMA
Pour la comparaison des 3 méthodes concernant Mycoplasma hominis, j'ai choisi 15
échantillons négatifs et 10 échantillons positifs. Comme pour Ureaplamsa, la méthode de
référence est la culture sur gélose Myco A7.
Nous constatons, que les résultats de la PCR en temps réel sont en totale corrélation avec
ceux obtenus par la culture bactérienne. En effet, les 10 échantillons fortement positifs
émettent un fort signal dans la méthode de la PCR.
Par contre, aucun échantillon n'a pu être testé par le Kit Mycoplasma DUO car tous les
échantillons obtenus étaient des frottis vaginaux alors que cette méthode requiert des
urines natives.
7. PROBLÈMES RENCONTRÉS
7.1 POUR UREAPLASMA
D’après ces résultats, nous remarquons, pour les urines, que le Kit Mycoplasma DUO et la
culture ne correspondent pas. En effet la concentration du kit est toujours plus élevée que
le résultat de la gélose. Cela est dû au fait de l’alcalinisation du milieu car il est possible
d’y avoir des faux positifs si leur pH est alcalin. De plus, la PCR nous réconforte dans le
résultat de la culture.
Pour la culture, le seul problème que nous avons rencontré concerne l’ensemencement.
En effet, si la gélose est mal ensemencée, il se peut qu’il y ait des faux négatifs. Pour y
remédier, il faut l’ensemencer avec un écouvillon bien humide et dans trois sens de la
gélose.
La difficulté pour la PCR en temps réel est d'interpréter les résultats faussement positifs ou
faussement négatifs. En effet par manque de temps, je n'ai pas pu concentrer les cas
faussement négatifs, ni rechercher la cause des cas faussement positifs.
7.2 POUR MYCOPLASMA
Le seul grand problème rencontré durant cette comparaison est le manque d'échantillons.
En effet, j'étais sensée obtenir 15 échantillons positifs pour Mycoplasma et
malheureusement, je n'en avais que 10. De plus, il m'a été impossible de trouver des
urines positives pour Mycoplasma. Il est vrai que les infections causées par les
mycoplasmes ne sont pas fréquentes.
21
8. Sensibilité / spécificité
Il est impératif, lorsqu'on compare des méthodes, d'évaluer la validité intrinsèque. Pour
cela, il faut mesurer la sensibilité ainsi que la spécificité de chaque méthode. Afin d'y
parvenir, j'ai utilisé une méthode de référence qui nous permet de savoir si le patient est
porteur des germes recherchés ou non et si les autres tests peuvent aussi y parvenir.
La sensibilité d'un test est la probabilité que la maladie soit présente lorsque le test est
positif. De ce fait, nous tenons compte des faux négatifs et est mesurée chez les
personnes malades uniquement
La spécificité d'un test est la probabilité que la maladie ne soit pas présente lorsque le test
est négatif. De ce fait, nous tenons compte des faux positifs et est mesurée chez les
personnes saines uniquement.
Il faut savoir que la précision des valeurs de spécificité et de sensibilité est dépendante du
nombre d'échantillons testés. En effet, plus il y a de patients évalués, plus la précision des
nombres sera exacte, donc proche de la réalité. Il faut également prendre en compte la
prévalence de la maladie. En effet, plus cette dernière est fréquente, plus la sensibilité
sera élevée contrairement à la spécificité.
Le seuil d'un test, c'est-à-dire la valeur à partir de laquelle en décide que le test devient
positif, influence la sensibilité et la spécificité. Ainsi, si on abaisse ce seuil, le test sera plus
sensible mais moins spécifique. La valeur de ce seuil dépend surtout de ce que l'on
recherche. Les tests très sensibles permettent surtout de s'assurer qu'une maladie n'est
pas présente tandis qu'un test très spécifique nous assure que la maladie est bien
présente.
8.1 POUR UREAPLASMA
Comme expliqué précédemment, la méthode de référence utilisée est celle de la mise en
culture. De ce fait, la sensibilité et la spécificité vont être calculées à partir des résultats
obtenus dans cette dernière. J'ai choisi cette méthode car, pour autant que la gélose soit
bien ensemencée, nous pouvons être certains de la positivité de l'échantillon car nous
voyons au microscope binoculaire les germes recherchés.
Sensibilité / spécificité de la PCR en temps réel :
PCR positive
PCR négative
Culture positive
13
2
Culture négative
1
14
Sensibilité : Vrai positifs / (vrai positifs+faux négatifs) x 100
13 / (13+1) x 100 = 92,8 %
Spécificité : Vrai négatifs / (vrai négatifs + faux positifs) x 100
14 / (14 + 2) x 100 = 87,5 %
22
Nous pouvons constater que la PCR en temps réel a une bonne sensibilité ainsi qu'une
bonne spécificité.
Comme expliqué auparavant, je ne vais pas tester la sensibilité et la spécificité pour le Kit
Mycoplasma DUO car il est évident que je n'ai pas du tout assez d'échantillons.
8.2 POUR MYCOPLASMA
Comme pour Ureaplasma, la méthode de référence est celle de la culture. De plus, le Kit
Mycoplasma DUO ne sera pas pris en compte car aucun n'échantillon n'a été trouvé pour
le tester.
Sensibilité / spécificité de la PCR en temps réel
PCR positive
PCR négative
Culture positive
10
0
Culture négative
0
15
Sensibilité : Vrai positifs / (vrai positifs+faux négatifs) x 100
10 / (10+0) x 100 = 100 %
Spécificité : Vrai négatifs / (vrai négatifs + faux positifs) x 100
15 / (15 + 0) x 100 = 100 %
D'après ces résultats, nous avons une sensibilité et une spécificité de 100 %. Avec la
petite quantité d'échantillons, j'estime que ce nombre n'est pas significatif.
9. Durée des analyses
La mise en culture se fait l'après-midi lors de l'ensemencement et la plaque Myco A7 est
incubée 48h en anaérobiose.
La PCR en temps réel dure environ 3h entre la préparation des échantillons et l'analyse de
l'automate.
10. Coût des analyses
La gélose Myco A7 pour la culture revient à 36.70 pour un paquet de 10 plaques, donc
pour un patient le montant s’élève à 3.65.
La PCR en temps réel nous revient à 610.- pour 110 réactions donc pour un patient, le
montant s’élève à 5.55. Cela comprend tous les réactifs utilisés, un contrôle négatif, un
contrôle positif ainsi qu'un standard interne.
23
11. Synthèse et conclusion
Tout au long de ce travail, nous avons constaté que les Mycolpasma et les Ureaplasma ne
sont pas très connus quant à leur pouvoir pathogène. Il est vrai qu'ils ont une facilité
d'adaptation dans l'environnement grâce à l'expression et la structure de leurs protéines
de surface. Ils sont probablement la cause de plusieurs maladies infectieuses qui ont une
certaine gravité, c'est pourquoi il faut les détecter assez vite pour pouvoir traiter les
personnes touchées.
Au laboratoire FutureLab-BBR à Lausanne la méthode choisie pour la détection de
mycoplasmes est la culture bactérienne, c'est pourquoi elle a été utilisée comme méthode
de référence.
Mon travail a eu pour but d'évaluer trois méthodes telles que la PCR en temps réel, un Kit
commercialisé pour les mycoplasmes présents dans les urines et le sperme et la culture
sur gélose utilisée actuellement, ceci afin d'évaluer si cette dernière était la meilleure
méthode de détection. Pour ce faire, j'ai basé ma comparaison sur la sensibilité et la
spécificité de l'analyse, la durée et le coût.
La PCR en temps réel a une bonne sensibilité ainsi qu'une bonne spécificité, la durée de
l'analyse est d'environ 3 heures, ce qui est moins que la mise en culture qui, elle, est de
48heures. Par contre le coût de la PCR en temps réel est plus élevé que cette dernière.
Quant au kit, il m'est impossible de conclure car je n'avais pas assez d'échantillons pour
que les calculs soient exploitables.
En conclusion, malgré la durée de l'analyse, j'estime que la culture de mycoplasmes est
meilleure que la PCR en temps réel car nous pouvons avec certitude éliminer les faux
positifs puisque nous avons la possibilité de voir ce qui se passe sur la gélose.
D'un point de vue personnel, la réalisation de ce mémoire a été très intéressante. En effet,
je ne connaissais pas beaucoup les mycoplasmes et cela m'a aidé à y voir plus clair. La
pratique a été longue est difficile à cause du manque d'échantillons, car les infections
causées par Ureaplasma ou Mycoplasma ne sont pas courantes.
24
12. Bibliographie
Sites internet
1)
Introduction :
Djigma Wendkuuni Florencia (30/06/2009), Université de Ouagadougou Site :
http://www.cerbafaso.org/textes/DEA_Tese/Memoire_DEA_Flo.pdf (consulté le 03/12/2010)
Biomérieux. (2000), les milieux de culture, site :
http://www.biomerieux.com/upload/Milieux_de_culture.pdf (consulté le 03/12/2010)
2)
Mycoplasma
CM Bébéar, S. Pereyre, (2002) infections à « Mycoplasma hominis », Site :
http://emc.42t.com/EMC/Maladies%20infectieuses/Infections%20%E0%20%AB%20Mycop
lasma%20hominis%20%BB%20%5B8-039-V-10%5D.pdf (consulté le 05/12/2010)
Jean Weissenbach, (28/01/2008), Genoscope, centre national de séquençage,
http://www.cns.fr/spip/Mycoplasma-hominis-opportuniste.html (consulté le 05/12/2010)
3)
PCR en temps reel
Dubrana Karine, (2010), Examining the distribution of telomeric and DNA repair proteins,
site :
http://www.md.ucl.ac.be/seminfect/dia-stainier-25-10-01/Stainier-25-10-01.pdf (consulté le
12/12/2010)
Brochures
4)
Mycoplasma/Ureaplasma
Rallu Fabien, CHU Sainte-Justine, Université de Montréal, Les mycoplasme : des
bactéries pas tout à fait comme les autres.
5)
Protocole de l’extraction pour la PCR en temps réel
QIAGEN, EZ1 DNA tissue Handbook, (avril 2010)
6)
Protocole de la PCR en temps réel
GeneProof, PCR Kit. Manuals for use with the following devices, République chèque
(septembre 2009)
7)
Kit Mycoplasma DUO
BioRad, Mycoplasma DUO, Identification and differential titration of genital mycoplasmas.
(Février 2010)
25
Photos
Photo 1 : http://www.cns.fr/spip/-Mycoplasma-hominis-PG21,183-.html
Photo 2 : http://www.mycoplasma.uab.edu/Methodologies.html
Photo 3 : http://knol.google.com/k/-/-/1yexqll01wr4o/in5wc2/bannierhindi%20%284%29.jpg
Photo 4-5 : http://www.igh.cnrs.fr/equip/cavalli/Dubrana128.pdf
Photo 6 : http://www.qiagen.com/products/dnacleanup/mineluteqiaquicksystems.aspx
Photo 7 :
http://www.google.ch/imgres?imgurl=http://www.biorain.com/web/Portals/0/QIAGEN/EZ1%
2520Advanced%2520XL.png&imgrefurl=http://www.biorain.com/web/LinkClick.aspx%3Flin
k%3D114%26tabid%3D58&usg=__PCEZRwbaSGMtTwEa_NxL6gooRg=&h=268&w=402&sz=85&hl=fr&start=0&zoom=1&tbnid=ZYbWtfqssSb5uM:&tbnh=171&t
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Vs0TaTaOcqXOue4jLUC&esq=11&page=1&ndsp=24&ved=1t:429,r:15,s:0&tx=-121&ty=183
Photo 8 : http://www.asuragen.com/Services/services/gene_expression/ab_taqman.aspx
Photo 9 : http://farmacja.cm-uj.krakow.pl/index.php/owydziale/Page%3Blaboratoria_galeria
Photo 10 : http://www3.biorad.com/B2B/BioRad/product/br_category.jsp?BV_SessionID=@@@@1557452986.1295
277342@@@@&BV_EngineID=ccceademifiehkicfngcfkmdhkkdfll.0&divName=Corporate
&loggedIn=false&serviceLevel=Lit+Request&lang=English&csel=null&catLevel=7&catOID
=21026&isPA=false&categoryPath=%2fCatalogs%2fClinical+Diagnostics%2fMicrobiology%
2fIdentification%2fBiochemical+Tests%2fIdentification+Kits%2fMycoplasma+Product+Line
+for+Urogenital+Mycoplasmas
26
13. Lexique
A) Post-abortum : Période qui s’étend de la fin de l’accouchement au début des
premières règles.
B) Pléomorphique : Caractéristique que possèdent certaines bactéries à changer de
forme selon le milieu où elles se trouvent.
C) Membrane trilamellaire : Membrane constituée de 3 couches dont les pôles
hydrophobes sont face à face entourant les protéines.
D) Chorioamniotite : La chorioamniotite est une infection de la cavité amniotique qui se
fait le plus souvent par voie ascendante.
E) Syndrome de Reiter : C’est une affection qui débute par une atteinte des intestins de
manière fugace, avec des douleurs et une diarrhée. Elle est
suivie au bout de deux ou trois semaines par une urétrite.
27
14. Remerciements
Je voulais tout d’abord remercier le laboratoire FutureLab-BBR de Lausanne pour son
aide et son soutien. Un merci tout particulier au département de bactériologie et de PCR,
sans lequel, ce travail n’aurait pas pu se faire.
Un grand merci à l’équipe de bactériologie qui a pris soin de garder tous les échantillons
sur lesquels une recherche de mycoplasmes était demandée.
Un grand merci à Mr. F. Piran, directeur de département, qui a pris du temps de relire mon
travail.
Merci à tous.
28
15. Annexes
Séquence d’ADN pour Mycoplasma :
1 tcgacggccc gggctggtga cgaactcgaa agtctttata gaatttagag acatccttat
61 ttgccatcag cgatcctttc ataaagtttt tttacttctt taactttttg attccagtca
121 agactcaaga agcctttgcg agcaataatc acagtttcgt aatttaaagt gctaaaatca
181 atgtttctta gaattgatct gatttgattt ttgtaatgat ttctcaaaac agcatttgca
241 aattgcttag ggattgaaat acccacttta aagaaatcgg atttgttaaa ataaattatt
301 aaattttttg aaaccacttg attgtgagaa tcaagaattt tctgaaattc ccaatttttt
361 ttaacaacgt tatttttatt tatcataatt taaaaatatg caaggtatta gacttattta
421 ttgtctgata cagttaatgt atatctacct tttgcacgtc tagctgctaa aacttttcta
481 ccatttttag tttgcattct agccataaaa ccatgaactt taatgtgttt gcgttttttt
541 ggttggtatg ttcttttcat aacaattctc ctttgcgttt ttatatataa aataacttaa
601 tttattttac caaaaatacg acaaaaaaag tatataaaat acctaagaaa aaaatttaat
661 attttttatg tttttaatgt aaattaaaag aaacacaaaa tttaaagtta ataacaaaat
721 aaacaaagaa attatttaaa tgtttattat gttattttag tataaaaaac ttcttatttt
781 aaaaacaaaa ggcctaaaaa aaatgttaat aattttgtta ataatttgta aattagcatt
841 tataagggct tattaattta ttaattttga attttaaaat ataatagagg tatgaaaact
901 acaaatccct ctgaattaga tttaaaagcg cataatatgt catttcaaaa agaattagtt
961 aatactgcaa gtgatccctt aatatatgat caattcttgt cgtcattaga aattgtaaaa
1021 gaaaataata aaatgattta catattagtt aaaggacctg aagatgtttt aacatatatt
1081 aagaatagtc ataatgaaag tattaaaaga gcaattaaaa acgtttatgg tgaagaatat
1141 aatttggttt atattagaaa tttagatgaa attaaaagtt tgcaaaatag caataatatt
1201 gaatctccaa ctaattcatt gactaataat tctaaagaaa attttagcaa tattaagaag
1261 aatttaacat ttgatgatta tgcaatagga aaatttaata atatggcttt aaaggcagca
1321 aaggctattt gcaatagtga aaagatattg ttctctcctt tatttattca tgcttcaagt
1381 gggcttggta aaacacatct attacatgct atcggaaatg aattattaaa acacggtaga
1441 agtgcattat atataaatcc tgattcattg acaagaagat tagttgaaca attaaaatca
1501 aagaatcaag aacaaattaa taaaattatt gatgaattaa tgtcttatga ttgcctaatg
1561 tttgatgatg ttcaacaata tggtaatcgt gattctacat taaatgtctt atttaatatt
1621 attgataata tgataatgaa cgataagcaa ataatctttt gtggtgataa aaagccggat
1681 gatttaggtg gatttgaaca aagatttata actagattta atggcggatt aactgttgaa
1741 attttaaaac cagagttaaa tgatgtaatt aatatcttga aatttaagtt gcaagaaaac
1801 ggtataaatc cggaactttg agaggaggaa agcttaaaat ttattgctag aaacttctct
1861 tcatcaataa gaaatattga gggtgcaatt aacagaataa aattatttca agatggtgac
1921 gacggctttt ttacatatga tattaataca ataaaatcaa tatttaacag catgactcaa
1981 gttgctgaga atattacccc cgataaaata attgatgctg tttctaaata ctataaaatt
2041 gacagaaaaa aaatattgag taatgtaaga acaaatgatg tggttaatgc ccgtagaata
2101 gcaacatatt tagtgaataa aatttttaat tatacattgc aagaaatagg caaggttgta
2161 ggaaatcaat cacattcaaa cgttattgtt tcgcttaatt gaattgaaaa aaatgctaac
2221 agtaatccaa cgcttaaatt agcattgcaa aaaatagaaa gcaatcttaa aaaaatttcg
29
Séquence d’ADN pour Ureaplasma :
1 agagtctggc ggcatgccta atacatgcaa atcgaacgaa gcctttttgg cttagtggtg
61 aacgggtgag taacacgtat ccaatctacc cttaagattg ggataactag tcgaaagatt
121 agctaatacc gaataatgac attcttttgc atgaaagaat gtagaaagtt gcgtttgcaa
181 cgcttttgga tgagggtgcg acgtatcaga tagttggtgg ggtaacggct caccaagtca
241 ttgacgcgta gctgtactga gaggtagaac agccacaatg ggactgagac acggcccata
301 ctcctacggg aggcagcagt agggaatttt tcacaatggg cgaaagcctt atgaagcaat
361 gccgcgtgaa cgatgaaggt ctataagatt gtaaagttct tttatttggg aagaaccact
421 aaaataggaa atgattttag tctgactgta ccatttgaat aagtatcggc taactatgtg
481 ccagcagccg cggtaataca taggatgcaa gcgttatccg gatttactgg gcgtaaaacg
541 agcgcaggcg gatttgtaag tttggtatga aatctagatg cttaacgtct agctgtatca
601 aaaactacga atctagagtg tagcagagag ttggggaact ccatgtggag cggtaaaatg
661 cgtagatata tggaagaaca ccggtggcga aggcgccaac ttggactatt actgacgctt
721 aggctcgaaa gtgtggggga gcaaatagga ttagataccc tagtagtcca caccgt
30