Faculté de Pharmacie - de l`Université libre de Bruxelles

Transcription

Faculté de Pharmacie
Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Etude phytochimique et activité antimicrobienne directe et indirecte
de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Philippe OKUSA NDJOLO
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur et co-promoteur:
Prof. Pierre DUEZ (Pharmacognosie, de Bromatologie et Nutrition Humaine)
Prof. Caroline STEVIGNY (Pharmacognosie, de Bromatologie et Nutrition Humaine)
Composition du jury :
Prof. Véronique FONTAINE (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles)
Prof. Jean-Michel KAUFFMANN (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles)
Prof. François DUFRASNE (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles)
Prof. Monique TITS (Jury externe, Faculté de Médecine, Université de Liège)
Prof. Bertrand BLANKERT (Jury externe, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de Mons)
Octobre 2012
« Ne parlez jamais de vous, ni en bien, car on ne vous
croirait pas, ni en mal car on ne vous croirait que trop. »
Confucius.
i
ii
REMERCIEMENTS
Je suis reconnaissant au Professeur Pierre Duez, promoteur de cette thèse, de m’avoir accueilli
dans son laboratoire et de m’avoir offert tant d’opportunités. Merci Monsieur d’avoir consacré autant
d’énergie à ce travail.
Ma reconnaissance va aussi à toute l’équipe PlantNut : Professeur Caroline Stévigny (copromoteur de cette thèse, Merci Caro pour tout !), Marie Faes, Olivier Vaillant ainsi que mes
collègues chercheurs et stagiaires (Catherine, Léocadie, Valérian, Jérémie, Jacob et les anciens). A
mes collègues de l’Université de Mons (Laetitia, Isabelle, Stéphanie, Antonelle, Amandine,
Charline, Maxime et Aurélie), Merci de vos encouragements.
J’exprime également ma gratitude aux Professeurs J.C. Braekman et M. Gelbcke pour l’aide
précieuse dans l’identification des composés isolés de Cordia gilletii ; au Professeur V. Fontaine
pour le cadre de travail qu’elle a mis à ma disposition. Je ne saurais oublier l’apport du Professeur
M. Devleeschouwer dans l’élaboration du protocole pour les différents tests antimicrobiens et du
Professeur A. Kumps dans l’utilisation de la GC-MS.
Ma gratitude va aussi à tous les membres du jury (V. Fontaine, J.M. Kauffmann, F. Dufrasne, M.
Tits et B. Blankert) qui, malgré leurs multiples occupations, ont accepté de juger cette thèse.
J’ai pu bénéficier pour réaliser ce travail de l’accueil et de l’aide de certains laboratoires que je
remercie de tout cœur : Laboratoire de Microbiologie Pharmaceutique de l’ULB (tests
antimicrobiens : Naïma), Laboratoire de RMN de l’ULB (Prises de spectres RMN : M. Luhmer,
R. D’Orazio), Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique de l’ULB (Spectrométrie de
masse : P. Van Antwerpen et C. Delporte), Laboratoire de Biotechnologie Végétale de l’ULB
(effets sur le quorum sensing : Tsiry, Martin et Olivier), Laboratoire de Pharmacognosie de l’ULg
(tests antipaludiques : M. Frédérich et O. Jansen), CHU Charleroi (tests antimicrobiens :
G. Larson et D. Fammerée), Laboratoire de Nutrition et des Sciences de la Santé de l’Université
de Calabre en Italie (Analyse de l’huile essentielle, M. Bonesi), Laboratoire de Biologie
Pharmaceutique de l’Université de Braunschweig en Allemagne (Recherche d’alcaloïdes
pyrrolizidiniques : T. Beuerle et C. Theuring).
Que mon collègue et ami Tom Nanga (Faculté de Pharmacie, Université de Kinshasa), Mr Nzeza
(Botaniste au Jardin Botanique de Kisantu) et Monsieur Luc Pauwels (Jardin Botanique National
de Belgique) trouvent dans ces quelques mots l’expression de ma sincère reconnaissance pour la
récolte et l’identification du matériel végétal.
J’ai autour de moi tout un réseau d’amis et de proches qui, de diverses manières, m’ont aidé à aller
jusqu’au bout de ce travail. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma profonde gratitude.
A mon Papa, qui me sert de modèle dans bien de domaines et à qui je dois tout, je dis Merci.
Last but not least, ma dernière pensée va à mon épouse et à mes enfants.
Philippe
iii
iv
TABLE DES MATIERES
Titres
Pages
Remerciements………………………………………………………………………………
iii
Liste des abréviations…………………………………………………………………………
ix
Résumé / Summary…………………………………………………………………………...
1
Avant propos…………………………………………………………………………………
5
1. Introduction………………………………………………………………………………..
7
1.1. Les maladies infectieuses………………………………………………………...
9
1.1.1. Généralités…………………………………………………………………………….
9
1.1.2. Agents infectieux : Microbes et Parasites…………………………………………….
10
1.1.2.1. Les virus…………………………………………………………………………….
11
1.1.2.2. Les bactéries………………………………………………………………………..
12
1.1.2.3. Les champignons parasites………………………………………………………….
18
1.1.2.4. Les protozoaires…………………………………………………………………….
19
1.1.3. Relation Hôte – microorganismes……………………………………………………..
23
1.2. Le traitement des maladies infectieuses………………………………………………..
25
1.2.1. Traitement d’infections bactériennes : les antibiotiques……………………………..
26
1.2.1.1. Définition…………………………………………………………………………..
26
1.2.1.2. Principales classes d’antibiotiques…………………………………………………
27
1.2.1.3. Nouvelles stratégies pour la recherche de nouveaux antibiotiques………………..
30
1.2.2. Traitement d’autres infections……………………………………………………….
35
1.2.2.1. Traitements des infections virales………………………………………………….
35
1.2.2.2. Traitement des infections fongiques……………………………………………….
36
1.2.2.3. Traitement du paludisme…………………………………………………………..
36
1.3. Les résistances aux antibiotiques………………………………………………………
39
1.3.1. Définition…………………………………………………………………………….
39
1.3.2. Déterminisme génétique de la résistance…………………………………………….
39
v
1.3.2.1. Mutations chromosomiques………………………………………………………..
39
1.3.2.2. Acquisition des gènes de résistance………………………………………………..
39
1.3.2.3. Mutation des gènes acquis……………………………………………………………
40
1.3.3. Mécanismes biochimiques de résistances……………………………………………...
40
1.3.3.1. Modification de l’antibiotique……………………………………………………….
40
1.3.3.2. Modification de la cible…………………………………………………………….
40
1.3.3.3. Accessibilité réduite de la cible………………………………………………………
41
1.3.3.4. Pompes à efflux……………………………………………………………………..
41
1.3.4. Mécanismes de résistances de différentes classes d’antibiotiques…………………….
42
1.4. Place des plantes médicinales dans la lutte contre les résistances aux antibiotiques……
45
1.5. Cordia gilletii De Wild………………………………………………………………….
63
1.5.1. La famille des Boraginaceae…………………………………………………………...
63
1.5.2. Le genre Cordia………………………………………………………………………………..
63
1.5.3. L’espèce Cordia gilletii De Wild ……………………………………………………..
67
1.5.3.1. Description botanique……………………………………………………………….
68
1.5.3.2. Répartition géographique……………………………………………………………
68
1.5.3.3. Caractères microscopiques………………………………………………………….
68
1.5.3.4. Usages médico-traditionnels…………………………………………………………
71
1.6. Les alcaloïdes pyrrolizidiniques…………………………………………………………
72
2. Objectif du travail………………………………………………………………………….
75
3. Matériel et méthodes………………………………………………………………………
79
3.1. Matériel………………………………………………………………………………….
81
3.1.1. Matériel végétal……………………………………………………………………….
81
3.1.2. Solvants, réactifs et milieux de culture………………………………………………..
81
3.1.3. Microorganismes et parasites………………………………………………………….
81
3.1.4. Chromatographie………………………………………………………………………
82
3.2. Méthode………………………………………………………………………………….
82
vi
3.2.1. Extraction et criblage phytochimique préliminaire……………………………………
82
3.2.2. Activité antimicrobienne directe………………………………………………………
82
3.2.3. Activité antimicrobienne indirecte…………………………………………………….
83
3.2.4. CCM-bioautographie………………………………………………………………….
84
3.2.5. Activité antioxydante………………………………………………………………….
84
3.2.6. Activité antiplasmodiale……………………………………………………………….
85
3.2.7. Etude préliminaire de l’effet sur le quorum sensing…………………………………..
86
3.2.8. Fractionnements et isolements………………………………………………………..
87
3.2.9. Méthodes spectroscopiques……………………………………………………………
89
3.2.10. Recherche d’alcaloïdes pyrrolizidiniques……………………………………………
90
3.2.11. Extraction de l’huile essentielle……………………………………………………..
91
3.2.12. Evaluation de l’effet anticholinestérase……………………………………………..
92
4. Résultats et discussion……………………………………………………………………..
93
4.1. Etude de l’effet antimicrobien direct et indirect ainsi que de l’activité antioxydante de
Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)…………………………………………………….
97
4.2. Optimisation du milieu de culture utilisé pour la CCM-bioautographie. Application à la
détection des composés antimicrobiens de Cordia gilletii De wild (Boraginaceae)…………
105
4.3. Férulaldéhyde et Lupéol : composés antimicrobiens direct et indirect de Cordia gilletii
De Wild (Boraginaceae)……………………………………………………………………..
111
4.4. Autres activités biologiques de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)………………..
127
4.5. Composition chimique, propriétés antioxydantes et anticholinestérase de l’huile
essentielle de feuilles de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)……………………………
139
4.6. Absence d’alcaloïdes pyrrolizidiniques dans Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)….
145
5. Conclusion générale ………………………………………………………………………
155
Références bibliographiques………………………………………………………………….
163
Annexes.
vii
viii
LISTE DES ABBREVIATIONS
-
ADN : Acide desoxyribonucléique
-
AHL : Acyl homosérine lactone
-
ARN : Acide ribonucléique
-
AB : Antibiotique
-
ACE : Extrait acétate d’éthyle
-
AP : Alcaloïde pyrrolizidinique
-
AQ : Extrait aqueux
-
ATCC : American Type Culture Collection
-
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
-
CFU : Colonies Forming Units
-
CMB: Concentration Minimale Bactéricide
-
CMI: Concentration Minimale Inhibitrice
-
COX : Cyclooxygénase
-
D.H.F.R : Dihydrofolate réductase
-
D.P.P.H : Diphénylpicrylhydrazyl
-
DCM : Extrait dichlorométhanique
-
DE50 : Dose efficace 50%
-
DMSO : Diméthylsulfoxyde
-
E.G.C.G : Epigallocatechine gallate
-
EP : Extrait de plante
-
F.B.C : Fractional Bactericidal Concentration
-
F.I.C : Fractional Inhibitory Concentration
-
HEX : Extrait hexanique
-
IC50 : Inhibitory concentration 50%
-
M.H : Mueller Hinton
-
MIC : Minimum Inhibitory Concentration
-
MRSA: Methicillino-Resistant Staphylococcus aureus
-
MET : Extrait méthanolique
-
MTT : Méthyltétrazolium
-
OMS : Organisation Mondiale de la Santé
-
PBP : Penicillin Binding Protein
-
PG : Peptidoglycane
ix
-
PEG : Polyéthykèneglycol
-
PEN : Pénicilline G
-
QS: Quorum sensing
-
R.D.C : République Démocratique du Congo
-
R.O.S : Reactive Oxygen Species
-
STR : Streptomycine
-
TET : Tétracycline
-
UV : Ultraviolet
-
WHO : World Health Organization
x
RESUME / SUMMARY
1
2
RESUME
Les maladies infectieuses constituent un sérieux problème de santé publique aussi bien dans les pays en
développement où elles sont la principale cause de taux de mortalité élevés, que dans les pays industrialisés où
les résistances aux antibiotiques existants se développent de façon alarmante. Cette situation engendre un besoin
sans cesse croissant de trouver de nouveaux composés antimicrobiens et/ou inhibiteurs de mécanismes de
résistances aux antibiotiques. Les plantes médicinales, notamment celles utilisées de façon traditionnelle dans les
pays en développement, constituent une source potentielle de ce type de composés. C’est dans ce cadre que
l’espèce Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae), une plante dont les écorces de racines et les feuilles sont
traditionnellement utilisées en République Démocratique du Congo pour combattre les maladies infectieuses, a
été étudiée sur le plan tant de ses activités biologiques que de sa composition chimique. Les extraits obtenus à
partir des écorces de racines de cette plante ont montré d’intéressantes activités biologiques, (i) un effet
antimicrobien direct (bactéricide pour les bactéries gram positif et bactériostatique pour les gram négatif) et
indirect (augmentation ou restauration de l’activité des antibiotiques vis-à-vis des souches résistantes); (ii) un
effet inhibiteur sur deux des gènes impliqués dans le quorum sensing de Pseudomonas aeruginosa, lasB and
rhlA; (iii) un effet antiplasmodial sur une souche chloroquino-sensible de Plasmodium falciparum; (iv) un effet
antioxydant mis en évidence par réaction avec le radical libre DPPH. Pour les extraits de feuilles, seule l’activité
antiplasmodiale a été observée.
Les extraits d’écorces de racines, doués d’activité antimicrobienne directe (extrait méthanolique) et indirecte
(extrait n-hexanique) ont été soumis à une série de fractionnements dans le but d’isoler et d’identifier les
composés actifs. Pour suivre l’activité lors des fractionnements, le milieu de culture utilisé pour la détection des
composés actifs sur une plaque chromatographique (CCM-bioautographie) a été optimisé. Le composé
férulaldéhyde, isolé de l’extrait méthanolique, a montré des propriétés antimicrobiennes, antioxydantes et
antiplasmodiales. De l’extrait n-hexanique ont été isolés deux composés, l’un actif, le lupéol et l’autre inactif, la
friedéline. Le lupéol a montré un effet antimicrobien indirect en réduisant la CMI de certains antibiotiques vis-àvis d’une souche de MRSA. Ces trois composés, s’ils ont déjà été identifiés dans d’autres plantes, sont décrits
pour la première fois dans l’espèce Cordia gilletii ; et ce travail constitue le premier rapport de l’effet
antimicrobien indirect du lupéol.
Dans le but de s’assurer de l’innocuité des extraits de C. gilletii, une recherche d’alcaloïdes pyrrolizidiniques
(APs) a été réalisée par GC-MS. Ces alcaloïdes présentent en effet un réel danger pour la santé humaine et la
famille des Boraginaceae, à laquelle appartient l’espèce C. gilletii, est connue comme une des principales
sources de ces composés. Aucun AP n’a pu être mis en évidence dans les extraits d’écorces de racines et de
feuilles de cette plante jusqu’à une limite de détection de 2 ppm, suggérant ainsi une absence de risque
toxicologique en relation avec ces alcaloïdes. Ces résultats rassurants restent à confirmer sur d'autres échantillons
obtenus dans des lieux de récolte différents.
Le présent travail montre que C. gilletii peut agir contre les microorganismes pathogènes par : (i) son action
antimicrobienne directe (due entre autre au férulaldéhyde); (ii) son effet antimicrobien indirect (dû au lupéol),
effet permettant d’augmenter ou de restaurer l’activité des antibiotiques vis-à-vis des souches résistantes ; et (iii)
son effet inhibiteur de l’expression des gènes du quorum sensing, effet permettant d’atténuer la virulence
d’agents infectieux. Ces actions peuvent permettent de faire face aux infections dues notamment à des
microorganismes résistants.
3
SUMMARY
Infectious diseases remain a serious public health problem both in developing countries, where they are the main
cause of the high mortality rates recorded, and in industrialized countries where there is an alarming incidence of
antibiotic resistance. There is thus an increasing need for new compounds that can act by a direct antimicrobial
effect or by an indirect effect, inhibiting resistance mechanisms of microorganisms. Medicinal plants,
particularly those traditionally used against infectious diseases in developing countries, are a probable source for
these types of compounds. In this context, Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae), a medicinal plant from which
root barks and leaves are traditionally used against infectious diseases in Democratic Republic of Congo, was
investigated for biological activities and phytochemical composition. Root bark extracts showed interesting
biological activities: (i) antimicrobial properties, acting directly (bactericid and bacteriostatic effects against
gram positive and gram negative bacteria, respectively) or indirectly (enhancement or restoration of antibiotic
activity on resistant strains); (ii) inhibitory effect on the expression of two Pseudomonas aeruginosa QS genes,
lasB and rhlA; (iii) antiplasmodial effect against a chloroquine sensitive strain of Plasmodium falciparum; (iv)
antioxidant effect determined by the free radical DPPH quenching. Leaves extracts showed only antiplasmodial
activity.
Root barks extracts with the highest direct (methanol extract) and indirect (n-hexane extract) antimicrobial
properties were fractionated to isolate and to identify the active compounds. To bio-guide the fractionation, the
culture medium for the detection of active compounds on chromatographic plates (TLC-bioautography) was
optimized. The compound ferulaldehyde, isolated from the methanol extract, showed antimicrobial, antioxidant
and antiplasmodial properties. From the n-hexane extract two compounds were isolated, lupeol and friedelin.
Lupeol showed indirect antimicrobial effect by decreasing the MIC of some antibiotics against MRSA; whereas
friedelin was inactive. Although these three compounds have already been described in other plant species, this
is the first report of their occurence in Cordia gilletii; the indirect antimicrobial effect of lupeol is described for
the first time in this work.
As it belongs to the family of Boraginaceae, a family well known as one of the most important sources of
pyrrolizidine alkaloids (PAs), Cordia gilletii is susceptible to contain these toxic compounds that were
consequently researched. A GC-MS analysis did not reveal the presence of PAs (detection limit, 2 ppm) in root
barks and leaves extracts of C. gilletii, suggesting a lack of PA-related toxicity of this plant. This reassuring
finding needs to be confirmed with samples harvested at different locations.
This work reveals that C. gilletii may act against pathogenic microorganisms by: (i) a direct antimicrobial effect
(partly due to férulaldéhyde); (ii) the enhancement or restoration of antibiotic activity against resistant strains
(effect of lupeol); and (iii) an inhibitory effect on the expression of quorum sensing regulator genes, decreasing
the virulence of microorganisms. These actions could help to fight infections caused by resistant strains.
4
AVANT PROPOS
Les maladies infectieuses constituent un sérieux problème de santé publique aussi bien dans
les pays en développement que dans les pays industrialisés. Elles constituent la principale
cause du taux de mortalité élevé enregistré dans les pays en développement ; la population y a
en effet un accès fort limité aux soins de santé adéquats et a recours, pour se soigner, aux
guérisseurs qui offrent des soins de santé alternatifs constitués essentiellement des plantes
médicinales. Dans les pays développés par contre, le principal problème lié aux maladies
infectieuses réside dans le développement alarmant de la résistance des microorganismes aux
antibiotiques ; ce qui engendre une nécessité sans cesse croissante de nouveaux composés
pouvant agir soit directement sur les microorganismes pathogènes, soit indirectement en
inhibant les mécanismes de résistance. Les plantes médicinales, utilisées notamment dans les
pays en développement pour combattre les infections, représentent une source potentielle de
nouveaux composés antimicrobiens et/ou inhibiteurs de la résistance aux antibiotiques. A ce
jour cependant, relativement peu de remèdes traditionnels ont été évalués cliniquement ou ont
fait l’objet d’études chimiques et biologiques afin d’en identifier les substances actives. En
République Démocratique du Congo (RDC), plusieurs enquêtes ethnobotaniques, menées
dans toutes les provinces de la RDC par différentes équipes de chercheurs, ont fourni nombre
de données sur les plantes utilisées traditionnellement pour combattre les maladies
infectieuses. Ces plantes constituent un matériel de travail en pharmacognosie pour la
recherche de nouveaux anti-infectieux non seulement pour les pays en développement, mais
aussi pour les pays développés.
5
6
1. INTRODUCTION
7
Dans ce chapitre, les différents aspects bibliographiques de notre sujet de recherche sont
traités. Dans un premier temps, les maladies infectieuses sont abordées sur plusieurs points,
notamment les différents agents pathogènes (virus, bactéries, champignons et protozoaires)
ainsi que les conditions pour le développement d’une infection. Dans une seconde section, le
traitement et les différentes stratégies de lutte contre les maladies infectieuses sont présentés ;
dans la foulée, la section suivante traite des résistances des microorganismes aux
antibiotiques. L’objet de notre travail étant essentiellement l’étude des propriétés
antimicrobiennes d’une plante médicinale (Cordia gilletii De Wild), une revue
bibliographique traite de la place des plantes médicinales dans la lutte contre les résistances
aux antibiotiques ; cette section aborde aussi bien les techniques d’évaluation des propriétés
antimicrobiennes des plantes, que les composés doués d’activité antimicrobienne directe et/ou
indirecte isolés des plantes médicinales. Une dernière section présente l’espèce C. gilletii De
Wild, la description de sa famille botanique (Boraginaceae), les données sur la phytochimie et
les propriétés biologiques de son genre (Cordia), sa description botanique et ses usages en
médecine traditionnelle.
8
1.1. MALADIES INFECTIEUSES
1.1.1. Généralités
Il y a quelques décennies, les maladies infectieuses semblaient maîtrisées grâce à la
généralisation des mesures d’hygiène et à l’utilisation des antibiotiques et des vaccins. Les
progrès scientifiques et technologiques laissaient même croire à une possible éradication de
nombreuses pathologies ; celle de la variole à la fin des années 1970 par la vaccination
généralisée en a été le symbole (Sansonetti and Orth, 2006). La résurgence des maladies
infectieuses et des parasitoses et l’émergence régulière de nouveaux agents infectieux ont
démenti ce pronostic optimiste. Les faits sont éloquents : (i) la permanence d’endémies dans les
pays en développement et leurs corollaires, le risque de pathologies d’importation dues à
l’explosion des voyages intercontinentaux et à la globalisation du commerce ; (ii) la résistance
des microbes aux antibiotiques et antiparasitaires ; (iii) le sida et les hépatites B et C devenus
endémiques ; (iv) les toxi-infections d’origine alimentaire ; (v) les infections acquises en milieu
hospitalier ; (vi) la menace de catastrophes économiques dues à la résurgence d’épizooties avec
le risque croissant de transmission à l’homme ; (vii) les risques plausibles du bioterrorisme ;
sans oublier l’impact du réchauffement global de la planète sur les agents infectieux, leurs
réservoirs et leurs vecteurs (Connolly et al., 2004; Desenclos and De Valk, 2005).
Avec une mortalité de près de 15 millions chaque année, les maladies infectieuses et
parasitaires sont responsables de 26,3 % des décès causes par l’ensemble des maladies et des
traumas survenant sur la planète (OMS, 2002a). Les principaux types d’infections responsables
de décès sont les infections respiratoires aigues (3,9 millions par an), le sida (2,9 millions par
an), les maladies diarrhéiques (2 millions par an), la tuberculose (1,6 million par an) et le
paludisme (1,1 million par an). La rougeole cause encore 745 000 décès en dépit de l’existence
d’un vaccin efficace, bien toléré et abordable (Sansonetti and Orth, 2006). Plus de 90 % des
maladies infectieuses humaines surviennent dans les pays en voie de développement,
particulièrement chez les enfants, dans les régions les plus déshéritées, où l’hygiène générale et
individuelle est insuffisante et où les politiques de prévention sont inexistantes, inadaptées ou
insuffisamment financées (McMichael, 2004). Cependant, le développement industriel génère
aussi dans les pays industrialisés de nouvelles conditions d’émergence infectieuse, comme les
infections alimentaires par des agents prenant avantage de la chaîne du froid ou de
l’industrialisation de la chaine alimentaire, les infections nosocomiales survenant dans un
environnement hospitalier de plus en plus complexe, alors que la multi-résistance va croissant,
les infections opportunistes chez les patients immuno-compromis et les infections des
9
voyageurs (McMichael and Butler, 2004b); par exemple en France environ 7 000 cas annuels
de paludisme sont enregistrés (Desenclos, 2005). Bien que de moindre prévalence dans les
pays industrialisés, les maladies infectieuses y sont encore responsables d’une mortalité non
négligeable (Péquignot et al, 2002). Il est également important de signaler qu’un pourcentage
important de cancers (de 15 a 20 %) sont probablement causés par un agent infectieux, viral ou
bactérien (Sansonetti and Orth, 2006). Les cancers du foie, du col utérin et de l’estomac
pourraient être quasi éradiqués par la mise au point ou l’utilisation (lorsque disponibles) de
vaccins, respectivement contre les virus des hépatites B (vaccin disponible) et C, certains
papillomavirus (vaccins en partie disponibles) et Helicobacter pylori. Il est par ailleurs
probable que des infections constituent un facteur de risque dans l’étiologie de maladies
touchant une large fraction de la population du globe, telles que l’athérosclérose avec
Chlamydia pneumoniae (Yamashita et al., 1998) et le diabète avec Helicobacter pylori (Jeon et
al., 2012).
Les décès et la morbidité liés aux maladies infectieuses et parasitaires humaines ont un coût
économique et social considérable et un effet sur la croissance qui peuvent être évalués
globalement en incorporant les coûts directs imputables aux soins médicaux et les coûts
indirects imputables à la réduction d’années d’espérance de vie et de productivité dus à des
morts prématurées ou à des complications chroniques. Ce poids porte essentiellement sur les
populations les plus défavorisées de la planète (McMichael and Butler, 2004). Grâce à l’index
Daly (Disability adjusted life years) qui intègre le nombre annuel de vies perdues à cause
d’une maladie donnée, multiplié par un coefficient de ressources par individu, les pertes
économiques subies peuvent être évaluées. Avec un Daly de 30 %, les maladies infectieuses
représentent la fraction la plus élevée du poids socio-économique total des maladies,
largement devant les maladies neuropsychiatriques (12,9 %), la traumatologie (12,2 %), la
pathologie maternelle périnatale (11 %), les maladies cardio-vasculaires (9,9 %) et le cancer
(5,1 %) (Sansonetti and Orth, 2006). Les simulations montrent, particulièrement dans le cas
de la tuberculose, du sida et du paludisme, que la prévention et le contrôle des maladies
infectieuses dans les régions endémiques représente une approche socio-économique rentable
autant qu’humaniste (Sansonetti and Orth, 2006; OMS, 2002b).
1.1.2. Agents infectieux : Microbes et Parasites
Les organismes causant les infections chez l’homme appartiennent à une très large gamme de
groupes taxonomiques et vont des virus aux vers, une variété considérable en termes de taille
et de niveau d’organisation (figure 1.1.1).
10
Figure 1.1.1. Principaux groupes d’agents pathogènes (Playfair and Bancroft, 2008)
1.1.2.1. Les virus
Les virus infectent toutes les formes de vie, des bactéries à l’homme en passant par les
champignons, les plantes et les animaux (Mims et al., 1993). Ils portent l’information
génétique dans leur ADN ou ARN, mais étant métaboliquement inertes par eux-mêmes, ils ne
peuvent se répliquer qu’après avoir infecté un hôte, parasitant ainsi l’habilité de l’hôte à
transcrire l’information génétique (Kayser et al., 2008).
La classification des virus en grands groupes (familles) est basée sur quelques critères simples
incluant le type d’acide nucléique du génome, le nombre de brins et la polarité des chaînes
d’acides nucléiques, le mode de réplication, la taille, la structure et la symétrie des particules
virales (Tableau 1.1.1) (Mims et al., 1993 ; Kayser et al., 2008).
11
Tableau 1.1.1. Caractéristiques et importance médicale des virus
Famille
Enveloppe
Symétrie
capside
Taille
(nm)
PM AN
(x106)
Structure AN
Importance médicale
Parvoviridae
Non
Icosahédral
22
2
SB linéaire
B19 virus
Papovaviridae
Non
Icosahédral
55
3-5
DB circulaire
Polyomavirus
Adenoviridae
Non
Icosahédral
75
23
DB linéaire
Adénovirus
Hepadnaviridae
Oui
Icosahédral
42
1,5
DB circulaire, incomplète
Virus hépatite B
Herpesviridae
Oui
Icosahédral
100
100 - 150
DB linéaire
Herpex simplex virus,
varicella-zoster virus,
cytomegalovirus, EpsteinBarr virus
Papillomaviridae
Non
Icosahédral
55
3-5
DB circulaire
Papillomavirus
Poxviridae
Oui
Complexe
250x400
125-185
DB linéaire
Virus de la variole, virus de
la vaccine
Picornaviridae
Non
Icosahédral
28
2–3
SB linéaire, non segmenté,
sens +
Polyovirus, rhinovirus, virus
hépatite A, enterovirus
Reoviridae
Non
Icosahédral
75
15
DB linéaire, 10 segments
Réovirus, rotavirus
Togaviridae
Oui
Icosahédral
40 – 70
4
sens +
Rubéole, fièvre jaune
Retroviridae
Oui
Icosahédral
100
7
SB linéaire, 2 segments,
sens +
Virus du sida
Coronaviridae
Oui
Hélical
100
5
sens +
Coronavirus
Calciviridae
Non
Icosahédral
35 – 40
2,6
Orthomyxoviridae
Oui
Hélical
80 – 120
4
SB linéaire, 8 segments,
sens -
Grippe
Paramyxoviridae
Oui
Hélical
150
6
sens -
Rougeole, oreillons,
parainfluenza
Rhabdoviridae
Oui
Hélical
75 x 180
3–4
sens -
Rage
Arenaviridae
Oui
Hélical
80 – 130
5
SB circulaire, 2 segments,
sens -
Bunyaviridae
Oui
Hélical
100
5
SB circulaire, 3 segments,
sens -
Filoviridae
Oui
Complexe
80 x 800
4,2
Virus à ADN
Virus à ARN
SB linéaire, sens +
SB, sens -
Marburg, Ebola
Légende : SB, simple brin ; DB, double brin ; AN, acide nucléique. (Mims et al., 1993 ; Kayser et al., 2008 ;
Mandell et al, 2010)
1.1.2.2. Les bactéries
Les bactéries sont des cellules procaryotes avec une organisation cellulaire caractéristique ;
elles sont ubiquitaires et la plupart ont un effet bénéfique direct ou indirect soit pour leur
12
potentiel usage commercial, soit pour leur action sur l’organisme humain (flore commensale)
ou sur l’environnement dans lequel nous vivons (Mims et al., 1993). Par rapport au grand
nombre de bactéries vivant librement, il y en a relativement peu qui causent des pathologies
avec un impact important sur le bien-être des humains. Leur importance est telle que les
principales ont été bien étudiées et sont actuellement bien connues. Cependant de nouveaux
pathogènes continuent à émerger entraînant l’apparition d’infections non encore connues,
ainsi des cas d’infections à Photorhabdus asymbiotica, bactérie pourtant entomopathogène,
ont été récemment signalés aux Etats-Unis et en Australie (Costa et al., 2010).
Les cellules bactériennes ont une petite taille (0,3 à 0,5 µm). Elles peuvent avoir deux formes
de base : la coque et le bacille. D’une façon générale, une bactérie est constituée par (Mims et
al., 1993 ; Kayser et al., 2008):
Ø Le nucléoïde (équivalent du noyau chez les eucaryotes), un filament d’ADN circulaire,
très fin et long qui n’est pas entouré par une membrane ; on retrouve aussi des
plasmides qui sont des structures génétiques non essentielles.
Ø Le cytoplasme qui contient un grand nombre de composés solubles de poids
moléculaires variables, de l’ARN, et environ 20 000 ribosomes par cellule. Les
ribosomes bactériens sont constitués de protéines et d’ARN ribosomal ; ils sont formés
à partir des sous-unités 30S et 50S en ribosomes 70S ; ce sont les organelles de la
synthèse protéique. Le cytoplasme contient également des substances de réserve
comme le glycogène ou les lipides.
Ø La membrane cytoplasmique qui est une membrane biologique élémentaire typique,
constituée par une double couche phospholipidique, dans laquelle sont ancrées de
nombreuses protéines comme les perméases, des enzymes notamment pour la synthèse
de la paroi cellulaire, des protéines sensorielles et, chez les bactéries aérobies, des
protéines de la chaîne respiratoire.
Ø La paroi cellulaire, fonctionnant comme une armure autour de la membrane, est
constituée essentiellement de la muréine. Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi
possède une couche extérieure supplémentaire, appelée « membrane externe »,
parsemée de pores et dans laquelle est inséré un lipopolysaccharide important pour la
pathogénie des infections à Gram négatif. Cette membrane externe est absente chez les
bactéries à Gram positif où la muréine est plus épaisse et contient un acide téichoïque
et des protéines associées à la paroi qui jouent un rôle dans la pathogénie des
infections à Gram positif.
13
Ø La capsule est une structure retrouvée chez beaucoup de bactéries ; elle est constituée
de polysaccharides et son rôle est de protéger la bactérie de la phagocytose.
Ø Les flagelles sont constitués de protéines permettant à la bactérie de se déplacer
activement en tournant comme une hélice autour d’un axe.
Ø Les fimbriae et les pili sont des structures retrouvées à l’extérieur de la paroi
cellulaire ; leur rôle est de permettre l’adhésion des bactéries aux cellules hôtes. Ils
peuvent également jouer un rôle dans le transfert d’éléments génétiques d’une bactérie
à l’autre (pili sexuels)
Ø Le biofilm est un ensemble structuré de cellules bactériennes, enveloppé dans une
matrice de polymère autoproduite, qui s’amarre sur des surfaces inertes ou sur des
tissus vivants. Le biofilm peut atteindre une épaisseur conséquente (quelques
millimètres) et les bactéries situées dans sa profondeur sont largement protégées
contre les cellules immunitaires, les anticorps et les antibiotiques. Les polymères
secrétés sont souvent des monosaccharides glucidiques en réseaux appelés glycocalyx
(« coquille de glycosides »).
Ø Les spores bactériennes sont des formes persistantes issues d’une cellule
« végétative » ; elles sont de forme sphérique à ovale, possèdent une paroi épaisse et
ont une résistance élevée vis-à-vis d’agents nocifs chimiques ou physiques. Parmi les
bactéries pathogènes pour l’homme, seuls les genres Clostridium et Bacillus forment
des spores. L’importance des spores en médecine réside principalement dans leur
résistance à la chaleur, nécessitant ainsi des températures très élevées au cours de la
stérilisation.
Ø Les bactéries pathogènes pour l’homme puisent leur énergie de la dégradation de
composés nutritifs organiques pour de nouvelles synthèses et des activités secondaires.
L’oxydation des substrats énergétiques résulte d’une voie respiratoire (l’accepteur
d’électrons et de protons est l’O2) ou de fermentation (l’accepteur est une molécule
organique). En fonction de leur comportement vis-à-vis de l’O2, les bactéries
pathogènes peuvent être classées en anaérobies facultatives (utilisent les substrats
énergétiques aussi bien par la chaîne respiratoire que par la fermentation), aérobies
strictes (ne se multiplient qu’en présence d’oxygène), anaérobies strictes (meurent en
présence d’oxygène) et anaérobies aérotolérantes (Murray et al., 2009).
Ø Les bactéries causant des infections chez l’homme peuvent être classées suivant leurs
familles et genres taxonomiques ou suivant leurs plus importantes caractéristiques de
diagnostic. La deuxième classification est la plus intéressante car elle reflète des
14
caractéristiques pertinentes en clinique, notamment la coloration de Gram, la forme et
les voies de respiration (Figure 1.1.3).
Figure 1.1.2. Structure d’une bactérie (http://micro.magnet.fsu.edu/cells/bacteriacell.html)
Figure 1.1.3. Grandes familles de bactéries d’intérêt médical (Mims et al., 1993)
15
Comportement social des bactéries : le quorum sensing
De nombreuses bactéries pathogènes produisant des facteurs de virulence sous le contrôle du
quorum sensing (QS), inhiber celui-ci pourrait constituer un moyen efficace d’atténuer la
virulence des agents infectieux (Ruimy and Andremont, 2004). Comme, dans notre travail,
l’effet de C. gilletii sur l’expression de certains gènes impliqués dans le QS et sur la
bioluminescence de Vibrio fischerii a été évalué, cette mini-section présente ce phénomène.
Le QS est un mécanisme de régulation qui permet aux bactéries de détecter la densité d’une
population et de mettre en place une réponse communautaire (organisation multicellulaire).
Le QS utilise de petites molécules pouvant diffuser à travers les membranes cellulaires ; ces
molécules appartiennent à différentes familles parmi lesquelles on retrouve les AHLs
(acylhomosérine lactones), des dérivés d’acides gras, des quinolones, des furanones et des
oligopeptides (Ruimy and Andremont, 2004). Certaines bactéries en produisent plusieurs
types. Les AHLs constituent la famille la plus étudiée, elles sont utilisées par des bactéries à
Gram négatif et peuvent être ou non spécifiques à certaines espèces. Elles sont constituées
d’une chaîne acyl de 4 à 14 carbones comportant divers substituants liés à l’homosérine
lactone par une liaison peptidique (Figure 1.1.4) (Pesci et al., 1997).
Figure 1.1.4. Structure des acylhomosérines lactones (AHLs)
Le principe de fonctionnement du QS repose sur le fait que chaque cellule de la population
produit l’AHL à un niveau de base ; la concentration en cette molécule signal augmente donc
avec la population. Quand celle-ci atteint un certain seuil (quorum), l’AHL se lie à une
protéine réceptrice, lui permettant d’exercer un rôle de régulation au niveau de la transcription
de l’expression de certains gènes regroupés en opéron. Cette expression peut résulter en
production de biofilm, de facteurs de virulence, ou de luminescence (Ruimy and Andremont,
2004).
Le premier système de QS, identifié dans les années 1970, a été la bioluminescence produite
par la bactérie Vibrio fischerii. Cette bactérie peut être retrouvée dans la mer soit à l’état libre
soit en symbiose dans des organes particuliers de l’espèce de calamar, Euprymna scolopes. A
16
l’état libre (concentration de l’ordre de 102 cellules/ml), la bactérie n’émet pas de lumière,
mais concentrée dans ces organismes (forte densité de l’ordre de 1010 cellules/ml) elle est
luminescente (Kaplan and Greenberg, 1983). Cette symbiose fournit un environnement riche
en nutriments pour les bactéries et permet aux hôtes d’échapper à leurs prédateurs. En effet,
les calamars sont repérés par leurs prédateurs situés en dessous d’eux grâce à l’ombre qu’ils
provoquent en passant devant la lumière de la lune. Devenant lumineux grâce à la bactérie, les
calamars ne provoquent plus d’ombre et peuvent se nourrir en toute tranquillité. Le terme
« quorum sensing » a été utilisé pour décrire ce phénomène car la population doit atteindre un
certain niveau (quorum) pour que la lumière soit émise (Ruimy and Andremont, 2004). Dans
les années 1990, des mécanismes similaires ont été découverts chez d’autres bacilles à Gram
négatif comme le Pseudomonas aeruginosa, une bactérie opportuniste responsable de diverses
infections nosocomiales. Ses biofilms constituent la cause principale de persistance de
pneumopathie chez les patients souffrant de mucoviscidose et d’infection oculaire chez les
porteurs de lentilles de contact (Driscoll et al., 2007). Pour déclencher une infection, la
bactérie doit orchestrer un groupe de molécules qui déterminent la pathogénicité (facteurs de
virulence) ; il s’agit d’une étape cruciale pour la survie du pathogène et le succès de l’invasion
de l’hôte (Passador et al, 1993).
Figure 1.1.5. Mécanisme moléculaire du Quorum sensing chez P. aeruginosa (Ruimy and
Andremont, 2004). Deux systèmes de Quorum sensing ont été identifiés chez P. aeuginosa : les systèmes las
et rhl. Le système las est constitué d’un gène régulateur lasR codant pour la protéine LasR, d’un gène lasI codant
pour une synthase auto-inductrice LasI participant à la synthèse d’une petite molécule de la famille des
homosérines lactones (HSL) la 3-oxo-C12-HSL. Le complexe LasR/3-oxo-C12-HSL est activateur
transcriptionnel de gènes de virulence (indiqués en bas de la figure) et de lasI. Selon le même modèle, le système
rhl est constitué de gènes rhlR, rhlI et basé sur une autre HSL, la C4-HSL. Ce système active des gènes en
commun avec le système las et qui lui sont propres comme celui du rhamnolipide.
17
Implications du QS en pathologie
Des expériences menées sur des souris avec P. aeruginosa PAO1, souche chez laquelle le QS
a été décrit, ont permis d’étudier l’intensité de l’infection par la mesure de la capacité à
déclencher une pneumonie aiguë, une bactériémie et une mortalité. Les lésions pulmonaires
obtenues avec PAO1 sont essentiellement de type inflammatoire avec une infiltration de
polynucléaires sans destruction des structures alvéolaires. En comparaison, une souche
dérivée de PAO1 et rendue déficiente pour le gène lasR déclenche une pneumonie beaucoup
moins sévère, peu ou pas de bactériémie, et une mortalité significativement plus basse. De
même, une réduction significative de la virulence a été retrouvée avec les souches mutantes
pour les autres gènes du QS en lasI, rhlI, ou à la fois en lasI et rhlI. Lorsque ces souches
mutées sont respectivement complémentées par un plasmide portant soit lasR, lasI, rlhlI, ou
lasI et rhlI, le niveau de virulence est restauré. Ces résultats confirment le rôle prépondérant
du QS dans la pneumopathie à P. aeruginosa (Sawa et al., 1998)
1.1.2.3. Les champignons parasites
Les champignons sont des microorganismes eucaryotes dont 200 seulement, parmi plus d’un
million d’espèces existantes, ont été décrits jusqu’à présent comme agents infectieux chez
l’homme. Seulement une douzaine de ces espèces pathogènes sont responsables de 90 % des
mycoses (Kayser et al., 2008). Beaucoup de mycoses sont relativement bénignes, c’est le cas
des dermatomycoses (Mims et al., 1993). Cependant, ces dernières années, le nombre de
mycoses menaçant le pronostic vital a augmenté, de par notamment l’augmentation du nombre
de patients présentant un déficit immunitaire, quelle qu’en soit la cause (Kayser et al., 2008).
Les champignons d’intérêt médical sont généralement classés en levures qui croissent soit
comme cellules individuelles, soit en filaments pluricellulaires ou hyphomycètes, champignons
dimorphes (se rencontrent sous forme de levure ou de mycelium) et dermatophytes (causent les
infections superficielles de la peau) (Murray et al., 2009). La plupart des champignons
pathogènes vivent librement ; ils entrent dans l’organisme de l’hôte par inhalation ou à travers
les plaies. Certains existent dans la flore normale du corps humain (Candida) et sont inoffensifs
à moins qu’il y ait une défaillance des défenses immunitaires (Kayser et al., 2008).
Les infections fongiques peuvent être superficielles ou profondes. Les mycoses superficielles
sont (i) soit cutanées, localisées au niveau de l’épiderme, des ongles, des cheveux ; elles
provoquent des dermatophytoses, des teignes, elles sont dues à plusieurs genres dont
18
Microsporum, Trichophytum et Malassezia ; (ii) soit sous-cutanées, elles provoquent
notamment la sporotrichose et la maduromycose, plusieurs genres en sont responsables parmi
lesquels Sporotrix et Madurella (Mims et al., 1993 ; Murray et al., 2009). Les mycoses
profondes peuvent être (i) systémiques, elles provoquent de pathologies telles que la
coccidioidomycose, la blastomycose et l’histoplasmose dont les genres responsables sont
Coccidioides, Blastomyces et Histoplasma respectivement ; ou (ii) opportunistes, elles sont
responsables de diverses maladies dont l’aspergillose, la candidose, la cryptococcose et la
pneumocystose dues respectivement aux genres Aspergillus, Candida, Cryptococcus et
Pneumocystis (Mims et al., 1993 ; Murray et al., 2009).
Les champignons vivant librement peuvent également causer des intoxications de façon
indirecte via les toxines (cas des aflatoxines d’Aspergillus ou des alcaloïdes de l’ergot) qu’ils
libèrent sur les aliments (Kayser et al, 2008).
1.1.2.4. Les protozoaires
Les protozoaires sont des eucaryotes unicellulaires vivant librement dans l’environnement,
mais parasitant l’homme. Ils causent ainsi des infections dont la prévalence est
particulièrement importante dans les pays chauds. Ainsi par exemple le paludisme, une des
plus grandes maladies infectieuses de notre planète, est-il très fréquent dans les régions
tropicales et subtropicales (Mims et al., 1993). La transmission des parasites protozoaires se
fait principalement par deux voies, les piqûres d’insectes suceurs de sang et l’ingestion
accidentelle d’agents infectieux. La restriction géographique de certaines espèces est due à la
distribution des insectes vecteurs et/ou aux conditions climatiques nécessaires pour compléter
le développement du parasite dans l’insecte (Sansonetti and Orth, 2006). Les infections
acquises par voie orale dépendent peu des conditions climatiques, cependant la transmission
oro-fécale est favorisée par de mauvaises conditions sociales et hygiéniques, ainsi que par une
augmentation de la survie des agents infectieux dans des conditions chaudes et humides
(McMichael, 2004).
Les protozoaires peuvent infecter tous les tissus et organes du corps humain. On les retrouve
comme parasites intracellulaires dans une grande variété de cellules et comme parasites
extracellulaires dans le sang, l’intestin et le système urogénital (Mims et al., 1993).
Au niveau médical, les protozoaires sont classés en fonction de leur localisation dans l’hôte,
du mode de transmission et de la pathologie causée (Tableau 1.1.2 ; Figure 1.1.6).
19
Tableau 1.1.2. Classification et importance médicale des protozoaires
Localisation
Espèce de parasite
Mode de transmission
Entamoeba histolytica
Tractus intestinal
Giardia lamblia
Amibiase
Ingestion des kystes dans
les aliments
Cryptosporidium spp
Tractus urogénital
Trichomonas vaginalis
Pathologie
Giardiase
Cryptosporodiose
Sexuel
Trichomoniase
Trypanosoma spp
Trypanosomiase
T. cruzi
Réduves
Maladie de Chagas
T. gambiense
Piqûre de mouche tsé-tsé
Maladie du sommeil
T. rhodesiense
Leishmania spp
L. donovani
Leishmaniose viscérale
Piqûre de phlébotomes
Sang et tissus
L. tropica
Leishmaniose cutanée
L. braziliensis
Leishmaniose mucocutané
Plamodium spp
P. vivax
P. ovalae
P. malariae
Piqûre de moustique
anophèle
Malaria
inhalation
Pneumonie
P. falciparum
Pneumocystis carinii
(Mims et al., 1993 ; Kayser et al., 2008)
Cas du paludisme
Le paludisme ou malaria est une infection parasitaire des hématies, causée par quatre espèces
de Plasmodium (vivax, ovale, malariae et falciparum), transmises à l’homme par un
moustique femelle du genre Anophèle selon le cycle représenté sur la figure 1.1.7. Le
paludisme se manifeste généralement par des accès de fièvre, des maux de tête et des
vomissements (Kayser et al., 2008). La forme la plus virulente et létale est due au
Plasmodium falciparum, espèce que l’on trouve surtout en Afrique subsaharienne, mais qui se
propage à d’autres régions du monde telles que l’Asie du Sud-est et qui réapparaît dans les
20
zones où il avait été éradiqué. La seconde espèce la plus fréquente, P. vivax, est rarement
fatale et se trouve notamment en Asie, dans certaines parties de l’Amérique, dans le Sud de
l’Europe et en Afrique du Nord (Murray et al., 2009).
Parmi la quarantaine d’espèces d’anophèles transmettant la malaria humaine, l’espèce
Anopheles gambiae, la plus compétitive et la plus difficile à combattre, est trouvée
exclusivement en Afrique dans les régions où sont réunies les meilleures conditions
(pluviosité, température, humidité) pour sa reproduction et sa survie.
Les catégories de population les plus touchées par la malaria sont les enfants de moins de cinq
ans, les femmes enceintes et les personnes immuno-déficientes. En 2010, sur les 216 millions
de cas de paludisme enregistrés, il y a eu 655 000 décès (WHO, 2010). La plupart de ces
décès surviennent chez des enfants vivant en Afrique, où chaque minute un enfant meurt de
paludisme et où cette maladie est à l’origine de près 22% de l’ensemble des décès infantiles
(WHO, 2010).
Le paludisme constitue une entrave majeure au développement des pays où il sévit par le
drame qu’il engendre sur le plan aussi bien humain, sanitaire que socio-économique. Le
paludisme est en effet responsable de l’absentéisme des travailleurs, des élèves, et les enfants
ayant survécu à des crises de paludisme sévère peuvent en garder des séquelles et connaître
des difficultés dans leurs études. Dans les milieux ruraux, les paysans peuvent rater des
saisons de culture ou de récolte, exposant ainsi leurs familles à la famine et à un manque de
revenus (Holding and Snow, 2001).
On estime que, dans les pays fortement impaludés, les dépenses liées au paludisme
représentent environ 40% du budget alloué au secteur de santé publique ; les familles
dépensent 25 % de leur revenu pour la prévention et le traitement du paludisme (WHO, 2010).
21
Figure 1.1.6. Grands groupes de protozoaires (Mims et al., 1993)
Figure 1.1.7. Cycle du Plasmodium (CDC, Centers for Disease Control and Prevention)
22
1.1.3. Relation hôte - bactéries
Certains microorganismes coexistent avec l’hôte dans une relation équilibrée, ils constituent
ce qu’on appelle la flore indigène ou flore commensale du corps que l’on retrouve chez des
individus bien portants. Certaines de ces espèces sont bénéfiques pour l’hôte, leur importance
étant mise à mal par l’antibiothérapie (Murray et al., 2009). Il est difficile de déterminer avec
précision la composition de la flore normale car elle dépend de plusieurs facteurs dont l’âge,
l’état nutritionnel et les conditions environnementales. Elle est également éminemment
variable d’un individu à l’autre (Mims et al, 1993). Les microorganismes de cette flore sont
rencontrés au niveau des parties exposées ou en communication avec l’environnement
externe, notamment la peau, le nez, la bouche, l’intestin et le tractus uro-génital (Figures 1.1.8
et 1.1.9).
Une infection se développe quand un agent pathogène pénètre dans l’organisme, s’y multiplie
et fait apparaître des symptômes de la maladie suite à des lésions cellulaires ou à des réactions
immunitaires (Mims et al., 1993). Les vertébrés ont toujours été exposés aux infections
microbiennes depuis des centaines de millions d’années. Comme résultat de ce contact
constant pouvant engendrer la maladie ou la mort, ils ont développé des systèmes de
reconnaissance des invasions étrangères hautement efficaces, avec des réponses immunitaires
et inflammatoires pour restreindre la croissance et la propagation des microorganismes ainsi
que pour les éliminer du corps. Si ces réponses étaient totalement efficaces, il y aurait très peu
d’infections microbiennes, les microorganismes ne pouvant pas persister dans l’organisme de
l’hôte (Kayser et al., 2008).
Pour assurer le succès de l’infection chez l’hôte et se maintenir en vie, les microorganismes
doivent passer par les étapes suivantes (Mims et al., 1993):
Ø L’attachement et/ou l’entrée dans l’organisme : surmonter les barrières naturelles de
l’organisme de l’hôte (peau, muqueuse, cils, etc.)
Ø La propagation locale ou générale
Ø La multiplication : augmentation en nombre
Ø L’échappement au système immunitaire de l’hôte
Ø L’excrétion du corps : étape de transmission permettant aux microorganismes de se
propager sur des hôtes frais.
Ø L’attaque qui cause des dommages chez l’hôte.
23
Figure 1.1.8. Distribution de la flore normale (Mims et al., 1993)
Figure 1.1.9. Relation Hôte – Parasite (Mims et al., 1993)
24
1.2. LE TRAITEMENT DES MALADIES INFECTIEUSES
La prise en charge et la prévention des maladies infectieuses se réalise essentiellement par
l’usage des médicaments (chimiothérapie), l’utilisation des vaccins (immunisation) et des
mesures d’assainissement de l’environnement (meilleures conditions d’hygiène, de nutrition,
etc.) (Walsh, 2003). La chimiothérapie et l’immunisation diffèrent sur plusieurs
points (Walsh, 2003 ; Geddes, 2005 ; Murray et al., 2009):
Ø Spécificité : au niveau des antibiotiques, elle constitue leur habilité à détruire les
cellules du microbe et non celles de l’hôte, ce qui suppose que l’antibiotique devrait
idéalement toucher une cible présente uniquement dans le microbe. La spécificité des
vaccins est assez différente, car les cibles spécifiques sur lesquelles ils doivent agir
existent déjà chez l’hôte, dans le système immunitaire, et demandent seulement à être
activées.
Ø Résistance : Le développement de la résistance affecte aussi bien les antibiotiques que
les vaccins. Ainsi la résistance aux antibiotiques peut être due à la production par les
microbes des enzymes qui désactivent l’antibiotique (β-lactamases) ou au
développement d’un mécanisme qui diminue la concentration intracellulaire en
antibiotique (pompe à efflux). Tandis la résistance aux vaccins est généralement due à
une modification des protéines de surface des microbes qui permet d’échapper à la
reconnaissance immunitaire.
Ø Observance et praticabilité : Une différence majeure entre antibiotiques et vaccins est
le fait que les antibiotiques sont destinés à soigner une pathologie et doivent être
administrés régulièrement, tandis que les vaccins sont destinés à prévenir la pathologie
et sont administrés quelques fois seulement, souvent une seule fois.
Une autre approche pour combattre les maladies infectieuses repose sur l’aspect
épidémiologique. L’épidémiologie concerne les moyens par lesquels les maladies surviennent,
se propagent et s’éradiquent dans une communauté ; les études épidémiologiques peuvent
donc contribuer efficacement à prendre des mesures nécessaires au contrôle d’une maladie.
Par exemple, si une maladie infectieuse est transmise par un insecte vecteur, une stratégie
alternative d’attaque repose sur le contrôle du vecteur ; la transmission par voie oro-fécale
peut être prévenue par la surveillance de la qualité de l’eau et de l’évacuation des eaux usées ;
les infections se transmettant par les produits sanguins peuvent être en partie contrôlées par
des dépistages systématiques au niveau des centres de transfusion.
25
Enfin l’hôpital constitue un environnement où le contrôle est particulièrement crucial ; on y
trouve en effet des patients souffrant de plusieurs pathologies, dont les infections qui se
propagent facilement dans cet environnement confiné.
Il existe de nombreux médicaments combattant les maladies infectieuses, mais le
développement rapide des résistances suscite à rechercher de nouvelles molécules ou
d’envisager d’autres moyens de combattre ces maladies.
1.2.1 Traitement d’infections bactériennes : les antibiotiques
1.2.1.1. Définition
Les antibiotiques sont des molécules d’origine naturelle, semi-synthétique ou synthétique, qui
arrêtent la croissance des microorganismes ou les tuent. Les antibiotiques qui stoppent la
croissance des microbes sont bactériostatiques, ceux qui tuent les microbes sont bactéricides.
Certains antibiotiques peuvent être bactériostatiques dans certaines circonstances et
concentrations, et bactéricides dans d’autres (Walsh, 2003).
Les antibiotiques sont destinés à bloquer sélectivement des processus cruciaux dans les
cellules microbiennes. La plupart des molécules introduites en thérapeutique des maladies
infectieuses dans les 60 dernières années ont été des produits naturels, élaborés par des
microorganismes dans des conditions particulières pour affecter les microbes voisins, soit
pour réguler leur croissance, soit pour les tuer (Murray et al., 2009). Les produits naturels
possédant l'activité antimicrobienne sont des produits du métabolisme secondaire aux voies
primaires et fonctions vitales du métabolisme. Lorsque les microorganismes producteurs
d'antibiotiques entrent en phases stationnaires de croissance et font face à une compétition
pour l'espace vital et les substances nutritives, ils déclenchent les gènes qui encodent la
production des molécules d'antibiotiques et les utilisent pour réguler la croissance de leurs
voisins. Les producteurs d'antibiotiques ont ainsi un avantage sélectif de croissance, y compris
d'accès aux substances nutritives par rapport à leurs voisins mourants (Walsh, 2003).
La production d'antibiotiques par les microbes nécessite des mécanismes de "self-protection"
des producteurs afin de se protéger de l’action létale des antibiotiques. Il y a plusieurs
stratégies parmi lesquelles l'efflux de l'antibiotique de la cellule productrice au milieu
extérieur de façon à maintenir de faibles concentrations intracellulaires. Certains
antibiotiques, tels que la streptomycine et l'oléandomycine, sont excrétés à l'état inactif et la
dernière étape de maturation enzymatique se fait à l'extérieur de la cellule. D'autres
26
microorganismes producteurs d'antibiotiques altèrent la structure de leurs propres parois
cellulaires, modifient par exemple la peptidyltransférase de la synthèse protéique ou
produisent des mutations structurales désensibilisant à l’antibiotique, pour se protéger de
l'autodestruction (Walsh, 2003; Yao and Moellering, 2003).
1.2.1.2. Principales classes d’antibiotiques
Les antibiotiques sont groupés en classes en rapport avec leurs cibles dans les bactéries. Il y a
quatre principales cibles (Figure 1.2.1):
-
La synthèse de la paroi bactérienne
-
La synthèse des protéines par les bactéries
-
La synthèse de l’ADN ou de l'ARN bactérien
-
La synthèse des folates
Figure 1.2.1. Principales cibles d'antibiotiques (Walsh, 2003)
1.2.1.2.1. Les antibiotiques agissant sur la biosynthèse de la paroi cellulaire
Les bactéries gram-négatif et gram-positif ont toutes une couche de peptidoglycane (PG)
comme composante de la structure de leurs parois cellulaires. La couche de PG est
généralement plus épaisse et possède plusieurs sous-couches dans les bactéries gram-négatif.
Le PG est formé par liaisons enzymatiques des brins de glycanes par l’action de
transglycosidases et de peptides. Ces enzymes introduisent des liens covalents, donnent une
force mécanique et fournissent la structure majeure de la barrière qui permet de résister à des
27
forces de pression osmotique pouvant tuer la cellule (Murray et al., 2009). Plusieurs des
antibiotiques qui affectent les parois des cellules bactériennes inhibent ces enzymes ou
séquestrent les substrats impliqués dans l’assemblage et la liaison des éléments constitutifs
des PG. Les protéines de surface attachées à la couche des PG des bactéries gram-positif sont
connectées durant la biosynthèse par l’action enzymatique de la sortase, une cible potentielle
des antibiotiques (Walsh, 2003).
Les bactéries gram-positif sont sensibles à certains antibiotiques qui n’agissent pas ou peu sur
les gram-négatif. Cette différence est liée à la capacité des antibiotiques à être bloqués par la
taille limitée des pores des membranes externes des gram-négatif ; il n’existe pas une telle
barrière de diffusion chez les gram-positif. Par exemple, la vancomycine, qui ne peut pas
pénétrer la membrane externe, n’agit que sur les gram-positif et est inactive sur les gramnégatif (Walsh, 2003).
Les antibiotiques qui agissent sur la biosynthèse de la paroi cellulaire des bactéries
comprennent deux groupes. (i) Les β-lactames bloquent la transpeptidation qui conduit à la
formation d’un peptidoglycane mécaniquement solide. Ce groupe contient les pénicillines et
les céphalosporines, des métabolites secondaires de champignons, respectivement Penicillium
chrysogenium et Acremonium chrysogenium. (ii) Les glycopeptides agissent en complexant
les brins de peptides non liés et en bloquant la transpeptidation. Ils comprennent la
vancomycine et la teicoplanine. Ils ne traversent pas les pores des membranes externes des
gram-négatif, et ne sont donc utilisés que contre les gram-positif (Murray et al., 2009).
1.2.1.2.2. Les antibiotiques bloquant la biosynthèse des protéines bactériennes
Etant donné l’importance de la biosynthèse des protéines sur le fonctionnement cellulaire et le
grand nombre d’étapes impliquées, qui vont de l’activation des 20 amino-acides
protéinogènes par l’amino-acyl tRNA synthétase, aux multiples étapes de l’initiation, de
l’élongation et de la terminaison de la chaîne des polypeptides sur les ribosomes, il est naturel
que certains antibiotiques ciblent une ou plusieurs étapes de la biosynthèse des protéines
(Murray et al., 2009).
Cette classe comprend : (i) Les macrolides bloquent la traduction peptidique ainsi que
l’assemblage des sous-unités 50s des ribosomes. Ce groupe comprend outre l’érythromycine
produite par Saccharopolyspora erythrae, des molécules synthétiques telles que
l’azithromycine et la clarithromycine qui sont utilisées dans le traitement des infections des
28
voies respiratoires. (ii) Les tétracyclines : produites par Streptomyces aureofaciens et
Streptomyces rimosus. Ces antibiotiques bactériostatiques agissent au niveau de la sous-unité
ribosomale 30s en bloquant le transport des aminoacyl t-RNA. (iii) Les aminoglycosides
ciblent les régions accessibles des 16s RNA polyanioniques sur les sous-unités ribosomales
30s, particulièrement le site A pour le transport des aminoacyl t-RNAs. (iv) Le linézolide est
un antibiotique totalement synthétique qui agit en bloquant la synthèse des protéines. Il
occuperait le site P dans le centre de la peptidyltransférase du ribosome, bloquant ainsi la
première étape de formation des peptides dans la synthèse des protéines (Yao et Moellering,
2003; Walsh, 2003).
1.2.1.2.3. Les antibiotiques bloquant la réplication de l’ADN
Cette classe est constituée des quinolones, molécules synthétiques qui inhibent les
topoisomérases, particulièrement l’ADN-gyrase. Les topoisomérases sont essentielles pour la
viabilité des cellules procaryotes et eucaryotes ; les quinolones qui sélectivement inhibent les
topoisomérases de type II dans les cellules bactériennes, sont des antibiotiques puissants avec
une bonne sélectivité (Walsh, 2003).
1.2.1.2.4. Les antibiotiques inhibant la synthèse des folates
Cette classe comprend la combinaison de sulfaméthoxazole et de triméthoprime. Cette paire
de molécules valide le fait qu’une combinaison de thérapies peut être une stratégie efficace
dans le traitement des infections bactériennes. Chacune des molécules bloque une étape de la
synthèse des folates ; le sulfaméthoxazole bloque la dihydroptéroate synthétase, tandis que le
triméthoprime inhibe la dihydrofolate reductase (DHFR), enzyme clé fournissant les
thymidylates pour la biosynthèse de l’ADN (Murray, 2009).
1.2.1.2.5. Antibiotiques agissant par d’autres mécanismes
La rifampicine, un dérivé semi-synthétique de la rifamycine B (naturellement produite par
Saccharomyces mediterranei), inhibe l’ARN polymérase, bloquant ainsi la transcription
bactérienne (Murray et al., 2009).
Les polymyxines se fixent sur les phospholipides de la membrane externe qui ne peut plus se
remanier, se déforme et devient perméable (Walsh, 2003).
29
1.2.1.3. Nouvelles stratégies pour la recherche de nouveaux antibiotiques et l’extension
de leur durée de vie
Le développement rapide de résistances (cfr section 1.3) nécessite la poursuite des recherches
en vue de trouver de nouveaux antibiotiques et de prolonger la durée d’utilisation des
antibiotiques existants. Parmi les stratégies envisageables, il y a la recherche de nouvelles
cibles, la recherche de nouvelles molécules et la recherche de composés non-antibiotiques
pouvant soigner les infections.
1.2.1.3.1. Recherche de nouvelles cibles
Les biologistes caractérisent sans cesse de nouveaux gènes ou enzymes essentiels à la survie
des bactéries ou à leur virulence. C’est à partir de ces cibles moléculaires que les laboratoires
de recherche envisagent les antibiotiques du futur, qu’il s’agisse des modifications de
molécules actuelles ou de molécules radicalement nouvelles (Tytgat et al, 2009).
La plupart des antibiotiques actuels proviennent du criblage des produits naturels et ont été
choisis surtout de manière empirique, en fonction de leur effet antibactérien, de leur
pharmacocinétique ainsi que de leur toxicité. Dans bien des cas, on ne connaissait pas leur
mécanisme d’action. Leur cible réelle (enzyme ou gène bactérien) n’a été identifiée que
pendant ou après leur développement clinique (Walsh, 2003). Actuellement, les antibiotiques
sont groupés en quelques grandes classes chimiques dont chacune agit sur un mécanisme
biologique vital pour l’agent infectieux. Mais un nombre croissant de souches microbiennes,
en particulier en milieu hospitalier, devient résistant à ces médicaments, ce qui pose un
sérieux problème de santé publique (Perry and Hall, 2009). L’exploration des processus
métaboliques essentiels des bactéries et la caractérisation des enzymes qui les catalysent
constituent donc des voies importantes de recherche de nouveaux points d’attaque potentiels.
Cela permet d’espérer la mise au point de nouveaux antibiotiques contre lesquels les bactéries
n’ont encore développé aucune résistance. Autrefois empirique, la démarche des laboratoires
devient donc plus rationnelle : c’est à partir des protéines cibles parfaitement connues que des
molécules inhibitrices sont recherchées, et certaines de ces molécules deviendront
probablement les antibiotiques de demain (Falconer and Brown, 2009). Un exemple de cette
démarche est le cas de la platensimycine et de la platencine, deux molécules isolées de
Streptomyces platensis, qui s’attaquent à une cible non encore exploitée, l’inhibition des voies
de synthèse d’acides gras de type II (Wright and Reynolds, 2007).
30
Les laboratoires partent souvent des antibiotiques connus pour développer des dérivés plus
actifs, soit en modifiant la molécule d’origine de manière à la faire agir sur une cible
légèrement différente, soit en lui adjoignant un inhibiteur de résistance lorsque le mécanisme
est connu . Dans certains cas, la modification structurale peut aboutir à un changement de
mécanisme d’action. Ainsi par exemple :
Ø Les kétolides sont efficaces sur les pneumocoques pourtant résistant aux autres
macrolides ; comme les autres macrolides, les kétolides inhibent la synthèse protéique
en se fixant sur les ribosomes, mais avec ici un site ribosomique supplémentaire
(Walsh, 2003).
Ø Les quinolones empêchent la réplication de l’ADN et sa transcription en ARN en
inhibant l’ADN-gyrase, enzyme impliquée dans le contrôle tridimentionnel de l’ADN.
Il existe d’autres quinolones, dérivées des premières, qui intéragissent avec la topoisomérase IV, une autre enzyme contrôlant la conformation de l’ADN. Cette topoisomérase serait la cible principale des quinolones chez les staphylocoques, alors que
la gyrase serait particulièrement visée chez les gram négatif. Le développement de
molécules agissant sur les deux cibles à la fois pourrait donner des antibactériens
particulièrement efficaces (Walsh, 2003 ; Murray et al., 2009).
La recherche basée sur les nouvelles cibles doit se faire dans le cadre d’une stratégie à plus
long terme pour créer de nouvelles classes d’antibiotiques agissant sur des cibles jusqu’ici
inexplorées. L’idée est de tenter d’inhiber une étape de biosynthèse propre aux procaryotes, ce
qui limite la toxicité du produit pour l’homme (walsh, 2003). L’action pourrait être envisagée
à plusieurs niveaux :
Ø La synthèse du peptidoglycane de la paroi bactérienne est un processus hautement
spécifique. Elle nécessite plusieurs étapes enzymatiques ; les bétalactamines agissant à
la dernière étape d’assemblage des monomères, l’identification de cibles parmi les
réactions précédentes est une option intéressante. La stratégie consiste à inhiber le
gène qui code pour l’enzyme catalysant la réaction choisie et à vérifier ainsi son
importance pour la synthèse du peptidoglycane chez les bactéries pathogènes visées
(Walsh, 2003).
Ø La division cellulaire est aussi une étape importante qui fait intervenir certaines
protéines propres aux procaryotes comme FtsZ, constituant principal du fuseau de
division. C’est un phénomène fort complexe dans lequel interviennent de nombreuses
31
enzymes et molécules, d’où la tendance de certains chercheurs à perturber les
mécanismes généraux d’interactions entre protéines au lieu d’inhiber telle ou telle
enzyme (Falconer and Brown, 2009).
Ø Au niveau de la synthèse protéique, il y a des différences entre les bactéries et les
eucaryotes, comme l’allongement de la chaîne peptidique, qui est contrôlé par le
« facteur d’élongation » bactérien EF-Tu, ou la maturation post-traductionnelle qui
comprend une étape d’hydrolyse de la formylméthionine N-terminale. Ces étapes
typiquement bactériennes constituent des cibles potentielles pour un effet spécifique
(Walsh, 2003).
Ø L’analyse du génome des bactéries représente une autre voie d’approche, à partir des
gènes propres aux procaryotes, on peut espérer remonter vers des protéines cibles
jusqu’alors inconnues. La taille du génome bactérien (quelques milliers de gènes, le
génome humain comptant environ cent mille gènes) et son organisation particulière
(un seul chromosome, des gènes sans introns) permettent d’espérer des résultats à
beaucoup plus brève échéance. Pour certaines espèces bactériennes, les séquences des
génomes complets sont disponibles (Walsh, 2003).
1.2.1.3.2. Recherche de nouvelles molécules
La recherche de nouveaux antibiotiques part de deux sources, les produits naturels et les
composés synthétiques. Les produits naturels ont fourni de nombreux médicaments à la
thérapeutique et ont servi à la semi-synthèse de beaucoup d’autres. L’objectif de molécules de
synthèse entièrement nouvelles n’ayant pas rencontré le succès espéré, les laboratoires se sont
intéressés
aux
antibiotiques
existants
en
améliorant
leur
efficacité,
stabilité,
pharmacocinétique ou en diminuant les effets indésirables par des modifications chimiques.
Cette approche a permis par exemple d’obtenir cinq générations de pénicillines, quatre
générations de céphalosporines, deux générations de carbapenems (Lam, 2007).
Une stratégie alternative dans la recherche de nouvelles molécules oriente vers les composés
inhibant les mécanismes de résistance aux antibiotiques. Cette stratégie a déjà donné de bons
résultats tels que le développement des inhibiteurs de bétalactamases (acide clavulanique,
sulbactam, tazobactam), qui sont co-administrés avec des bétalactames (amoxicilline) donnant
une combinaison de composés comme Augmentin®. De même, l’étude des pompes à efflux a
donné la tigecycline qui est issue des modifications chimiques de la tétracycline en vue d’en
réduire l’efflux et par conséquent la résistance (Walsh, 2003).
32
1.2.1.3.3. Recherche de composés non antibiotiques
L’usage des antibiotiques exerce une pression sélective sur les bactéries en les obligeant à
procéder à des modifications induisant une résistance. Une des stratégies efficaces de limiter
l’apparition de la résistance serait d’utiliser des composés « attaquant » les bactéries
différemment. C’est le cas par exemple des inhibiteurs du quorum sensing (QS). A la
différence des antibiotiques, l’inhibition du QS n’a pas d’action directe sur la croissance
bactérienne, mais sur la virulence (Ruimy and Andremont, 2004). Il est ensuite nécessaire que
le système immunitaire du patient élimine les microorganismes rendus moins virulents
(Geddes, 2005). Cette voie thérapeutique ne sera cependant efficace que si la souche
responsable de l’infection exerce une virulence principalement contrôlée par le QS.
Actuellement, trois cibles potentielles peuvent être envisagées pour inhiber le QS : la synthèse
et l’activitation des AHLs ; la formation des complexes LasR et RHlR avec les AHLs
correspondantes ; et la transcription de lasR/lasI et rhlR/rhlI par les activateurs GacA et Vfr
i) Inhibition de l’activation et de la synthèse des AHLs
Les AHLs sont des molécules instables même au pH physiologique ; elles sont détruites
lorsque le pH du milieu augmente. Cette inactivation passe par une ouverture du cycle appelée
« lactonolyse ». Certaines bactéries, comme Bacillus sp, possèdent des lactonases clivant le
noyau des AHLs. Les gènes aiiA codant pour des lactonases ont été introduits et exprimés
dans une souche de P. aeruginosa via un plasmide, ce qui induit une réduction considérable
des AHLs, de telle sorte qu’elles ne peuvent plus déclencher l’activation de la transcription
des gènes de virulence (Smith and Iglewski, 2003). L’utilisation de telles enzymes se heurte à
deux inconvénients. D’une part, le caractère réversible de l’action de l’enzyme dépend du pH
et donc les AHLs inactivées par l’ouverture du cycle pourraient redevenir actives par
fermeture spontanée du cycle ; d’autre part la taille trop importante des enzymes rend difficile
leur transport jusqu’au site infectieux et donc leur utilisation par voie systémique peu
probable. La seule application possible pourrait être locale comme topique dans les infections
cutanées à P. aeruginosa chez les sujets brûlés (Ruimy and Andremont, 2004). Il est
également possible d’inhiber la synthèse des AHLs en modifiant la nature des précurseurs
indispensables à cette synthèse. C’est ainsi que les mutations dans les enzymes impliquées
dans le métabolisme des acides gras, précurseurs d’AHLs, entraînent une synthèse importante
d’acides gras à courtes chaînes. L’enzyme LasI se trouve alors saturée d’acyles à courte
chaînes et réduit la synthèse de 3-oxo-C12-HSL. Dans ces conditions la virulence de P.
33
aeruginosa est significativement atténuée. L’application pratique ne semble pas évidente.
Néanmoins l’ensemble de ces travaux ont validé l’approche de l’inactivation des AHLs
(Smith and Iglewski, 2003).
ii) Inhibition de la formation des complexes LasR ou RhlR avec les AHLs
La liaison des protéines LasR ou RhlR avec leurs AHLs correspondantes entraîne une
activation de la transcription de plusieurs gènes. L’inhibition de la liaison LasR-AHL par une
AHL antagoniste est une approche en développement, et plusieurs analogues d’AHLs ont déjà
été synthétisés (Smith, 2003). Une autre voie d’inhibition de la liaison LasR-AHL repose sur
l’utilisation d’antagonistes dérivés de furanones. On a en effet observé que, chez l’algue
Delisea pulchra, les furanones déplacent la liaison luxR-AHL et empêchent la colonisation de
l’algue par les bactéries. C’est ainsi que des composés synthétiques de furanones halogénées
(Figure 1.2.2) ont été testés, composés effectivement capables d’inhiber la transcription des
gènes de virulence chez P. aeruginosa (Manefield et al., 1999). Leur administration chez la
souris dans un modèle de pneumopathie réduit de 3 log la quantité de bactéries isolées de
leurs poumons par rapport aux souris non traitées. L’avantage de l’utilisation de telles
molécules réside dans leur petite taille et leur facilité d’administration (Steenackers et al.,
2010).
Figure 1.2.2. Structures chimiques de furanones halogénées (Manefield et al., 1999).
iii) Inhibition de la transcription de lasR/lasI et rhlR/rhlI
La délétion des gènes qui contrôlent la transcription de lasR et de rhlR comme gacA et vfr
réduirait la production des protéines LasR et RhlR et donc la production des facteurs de
virulence. Ceci a notamment été rapporté sur un modèle murin de brûlure infectée à P.
aeruginosa lorsque le gène pour gacA a été supprimé (Ruimy and Andremont, 2004).
iv) Inhibition du QS par les macrolides
Les macrolides n’ont pas d’action bactéricide ou bactériostatique sur P. aeruginosa.
Cependant plusieurs études montrent des effets bénéfiques du traitement au long cours par les
34
macrolides de patients mucoviscidosiques ou atteints de panbronchiolite diffuse. L’action des
macrolides pourrait être anti-inflammatoire et/ou modulerait la production des protéases de P.
aeruginosa. Il a été rapporté que l’azithromycine inhibe le QS, mais le mécanisme d’action
reste à déterminer (Tateda et al., 2001).
v) Autres approches
Des études récentes fondées sur l’analyse transcriptionnelle du génome de P. aeruginosa ont
montré que, lorsque la densité bactérienne est faible, l’apport d’AHL exogène ne permet pas
d’activer le QS. Ces études suggèrent donc que d’autres facteurs doivent être impliqués dans
l’activation du QS et l’inhibition de ces facteurs en amont ouvre ainsi une voie potentielle
pour inhiber le QS. Enfin l’utilisation d’oligonucléotides antisens pouvant s’hybrider aux
ARNm des gènes lasR, lasI, rhlR, rhlI pourrait également inhiber le QS (Ruimy and
Andremont, 2004).
1.2.2. Traitement d’autres infections
1.2.2.1. Traitement des infections virales
La prise en charge des infections virales se fait suivant deux options. La première consiste en
une prévention par la vaccination ; c’est la meilleure option, elle permet de prévenir de
nombreuses viroses telles que la poliomyélite, la rougeole, la rubéole, la varicelle, les
hépatites A et B. Cependant il existe encore nombre de virus pour lesquels les vaccins ne sont
pas disponibles (VIH, hépatite C, Ebola, etc.). La deuxième option, moins efficace et plus
coûteuse, repose sur un traitement curatif faisant appel aux antiviraux notamment pour le VIH
ou la grippe. Cependant, pour de nombreuses maladies virales, une fois déclarées, il n’existe
pas de traitement ; c’est le cas de la rougeole et de la rubéole (Kayser et al., 2008).
Les maladies virales doivent être prises au sérieux car les virus sont susceptibles à tout
moment d’émerger (SARS), de muter (H5N1), de devenir résistants aux rares antiviraux
disponibles (VIH), de provoquer des épidémies potentiellement dévastatrices (VIH) ou de
franchir la barrière d’espèce (VIH) ; en outre les médicaments antiviraux sont en nombre très
limité (beaucoup moins nombreux que les antibiotiques). Il faut cependant remarquer que les
maladies virales sont parfois relativement bénignes, car nombre d’entre elles peuvent être
contrées par notre système immunitaire et sont accessibles à la vaccination (Kayser et al.,
2008 ; Murray et al., 2009).
35
1.2.2.2. Traitement des infections fongiques
Le traitement des infections fongiques fait appel à un nombre restreint d’antifongiques
pouvant être classés somme suit. (i) Les polyènes (Amphotéricine B, Nystatine) détruisent la
structure de la membrane en se fixant sur les stérols membranaires. (ii) Les azolés
(Kétoconazole, Fluconazole, Itraconazole, etc.) inhibent la synthèse de l’ergostérol dans la
membrane, action essentiellement fungistatique. (iii) Le 5-fluorocytosine (Flucytosine)
interfère avec la synthèse de l’ADN (analogue de bases). (iv) L’echinocandine inhibe la
synthèse du glucane de la paroi cellulaire. (v) L’allylamine inhibe la biosynthèse de
l’ergostérol. (vi) La griséofulvine inhibe la mitose des cellules fongiques (Walsh, 2003 ;
Murray et al., 2009).
Le développement de nouveaux antifongiques demeure nécessaire étant donné que les
champignons, comme les autres microorganismes pathogènes, développent des mécanismes
de résistance. Cette résistance repose notamment sur la modification de la perméabilité
membranaire (diminution de l’influx et augmentation de l’efflux) et sur des mutations
aboutissant à des produits géniques présentant une affinité moindre pour les antifongiques. La
recherche peut aussi s’orienter vers les inhibiteurs de la résistance, notamment les inhibiteurs
des pompes à efflux (Kayser et al., 2008).
1.2.2.3. Traitement du paludisme
La lutte contre le paludisme englobe deux aspects : (i) La lutte contre le moustique vecteur,
l’anophèle ; si cette lutte est une réussite dans les pays tempérés, il y subsiste néanmoins le
paludisme d’importation. La situation est tout à fait différente dans les régions tropicales où
on assiste en plus à l’apparition de la résistance des moustiques vis-à-vis des insecticides
après les échecs de tentatives d’éradication. (ii) La lutte contre l’agent pathogène, le
Plasmodium, rendue compliquée par le développement de la résistance du parasite à l’égard
des médicaments existants (Mims et al., 1993).
Mode d’action des médicaments antipaludiques majeurs
Le parasite au stade intra-érythrocytaire synthétise des protéines à partir des acides aminés
issus de la dégradation de l’hémoglobine, processus libérant l’hème qui est toxique pour le
parasite. Le parasite détoxifie l’hème en le polymérisant en hémozoïne qui lui est non
toxique. Les aminoquinoléines et les aminoalcools agissent principalement en inhibant cette
formation d’hémozoïne, restaurant ainsi l’effet toxique de l’hème sur les parasites (Kumar et
al., 2007).
36
L’artémisinine et ses dérivés agissent grâce à leur pont endoperoxyde en libérant des espèces
réactives de l’oxygène qui sont toxiques pour le Plasmodium dans toutes les phases du cycle
schizogonique, en déclenchant un stress oxydatif (Meshnick et al., 1993). Il a également été
reporté que l’artémisinine et ses dérivés auraient un mode d’action multivarié, ils agiraient par
interférence avec le transport mitochondrial d’électrons, par modulation de l’effet du système
immunitaire et par interférence avec la calcium-ATPase sarcoplasmique / endoplasmique
(Golenser et al., 2006).
Les antimétabolites (ex : pyriméthamine) inhibent la dihydrofolate réductase, enzyme
nécessaire à la rédution du dihydrofolate, cofacteur essentiel à la biosynthèse du thymidilate,
des bases puriques et de nombreux acides aminés. Ils empêchent ainsi la division du noyau du
parasite (Warhurst et al., 1998).
Les naphtoquinones (ex : atovaquone) inhibent les fonctions mitochondriales du parasite par
le blocage du transfert d’électrons au niveau de la dihydroorotate déshydrogénase, ce qui
empêche la synthèse de l’orotate et par conséquent celle des bases pyrimidiques (Vaidya,
1998).
Les tétracyclines agiraient par blocage de la réplication du génome de l’apicoplaste,
empêchant ainsi le développement des parasites en mérozoïtes (Dahl et al., 2006).
Cependant, le Plasmodium falciparum développe des résistances vis-à-vis des antipaludiques
courants, notamment la chloroquine, ce qui cause des échecs thérapeutiques qui contribuent à
l’élévation des taux de mortalité (Trape, 2001). La chimiorésistance apparue dans les années
1950 en Asie, s’est étendue à d’autres parties du monde et touche toutes les zones tropicales
(OMS, 2005). Cette chimiorésistance est généralement due à des mutations qui induisent entre
autres une diminution de l’accumulation des médicaments dans la vacuole digestive du
parasite par un phénomène d’efflux, une modification de la cible des médicaments et une
inactivation des médicaments (Urso et al, 2001).
Pour faire face au développement de la chimiorésistance du Plasmodium falciparum, une des
solutions envisageables consiste à restaurer la sensibilité de Plasmodium en combinant les
médicaments auxquels il est devenu résistant à d’autres composés pouvant inhiber cette
résistance. Ainsi dans le cas de chloroquino-résistance, le vérapamil empêche l’efflux de la
chloroquine hors de la vacuole digestive du parasite, ce qui favorise son accumulation,
restaurant ainsi son effet (Martin et al., 1978). Un autre exemple est la modulation de la
résistance à la méfloquine par le penfluridol qui agit également en favorisant l’accumulation
de la méfloquine dans les vacuoles digestives du parasite (Afonso et al., 2006).
37
38
1.3. LES RESISTANCES AUX ANTIBIOTIQUES
1.3.1. Définition
Une souche est dite résistante à un antibiotique si la concentration minimale inhibitrice de
celui-ci est supérieure à sa concentration plasmatique maximale (non toxique) obtenue lors du
traitement. La résistance à un antibiotique peut être naturelle ou innée ; certaines souches
sauvages résistent naturellement à certains antibiotiques. Elle peut également être acquise ;
elle apparaît chez les espèces bactériennes jusqu’alors sensibles à un antibiotique donné
(Walsh, 2003).
1.3.2. Déterminisme génétique de la résistance
La résistance acquise des microorganismes aux antibiotiques résulte de processus
biochimiques qui sont codés par les gènes des bactéries. Cette résistance provient de
mutations génétiques, de l’acquisition de gènes ainsi que de la mutation de gènes acquis
(Walsh, 2003).
1.3.2.1. Mutations chromosomiques
Les mutations chromosomiques peuvent modifier les cibles des antibiotiques telles que les
transpeptidases, l’ADN gyrase, les protéines ribosomales, l’ARN polymérase ou encore les
porines. Ces mutations peuvent entraîner une modification de certaines structures cellulaires,
par exemple de la paroi pour les PBPs, ou de certaines fonctions comme la perméabilité de la
membrane externe. Ce type de mutation est stable, transmis à la progénie, mais non
transmissible horizontalement à d’autres bactéries. Le plus souvent, une mutation entraîne la
résistance à un antibiotique donné ou à des antibiotiques appartenant à la même famille.
Cependant une mutation peut également entraîner la résistance à plusieurs antibiotiques par
imperméabilisation de la membrane cellulaire (Rice et al., 2003).
1.3.2.2. Acquisition des gènes de résistance
Cette résistance est due à l’acquisition d’informations génétiques exogènes portées par des
plasmides et des transposons. Elle concerne la quasi-totalité des antibiotiques et correspond à
la majorité des cas isolés en clinique. Cette résistance est due à l’expression par les bactéries
réceptrices de ce matériel génétique pour former des protéines nouvelles qui vont, soit,
modifier le système de transport de l’antibiotique, inactiver l’antibiotique, modifier la cible de
l’antibiotique ou encore substituer une cible insensible à une cible sensible (Walsh, 2003).
39
1.3.2.3. Mutation des gènes acquis
La réponse typique à l’apparition de la résistance a été un effort concerté à développer de
nouveaux agents antimicrobiens actifs sur les souches résistantes. L’émergence de la
résistance aux antibiotiques par la production des bétalactamases en est un exemple.
L’ampicilline a été développée comme la première pénicilline active sur les bacilles gramnégatif, principalement E. coli. Quelques années après son introduction en clinique, il y a eu
apparition des souches de E. coli résistantes à l’ampicilline due à la production des βlactamases régulée par un plasmide TEM (Rice et al., 2003).
1.3.3. Mécanismes biochimiques de résistances
1.3.3.1. Modification de l’antibiotique
Plusieurs enzymes modifiant les antibiotiques ont été décrites, incluant les β-lactamases, les
enzymes modifiant les aminoglycosides ou les chloramphénicol acétyltransférases. Bien que
ces enzymes soient, dans beaucoup de cas, acquises, quelques-unes sont intrinsèques à
certaines espèces. En général, ces enzymes confèrent un niveau élevé de résistance aux
antibiotiques contre lesquels ils sont actifs. Ainsi, par exemple, l’expression de TEM-1 βlactamase par E. coli peut augmenter la concentration minimale inhibitrice de l’ampicilline de
8 µg/ml à 10.000 µg/ml (Rice et al., 2003).
1.3.3.2. Modification de la cible
Comme l’interaction entre l’antibiotique et la molécule cible est assez spécifique, de faibles
altérations de la cible peuvent avoir des effets importants sur la liaison de l’antibiotique. Un
exemple de ce mode de résistance est la modification des PBPs qui peut affecter l’affinité de
ces molécules pour les β-lactames. Alors que la modification des PBPs semble être le
mécanisme principal de résistance aux β-lactames chez les bactéries gram-positif, la
production de β-lactamases est surtout impliquée chez les gram-négatif (Walsh, 2003).
D’autres exemples de modification de cibles concernent l’altération des précurseurs de la
paroi cellulaire conférant la résistance aux glycopeptides, la mutation de l’ADN gyrase et de
la topoisomerase IV conférant la résistance aux fluoroquinolones, les mécanismes de
protection ribosomale conférant la résistance aux tétracyclines, les mutations de l’ARN
polymérase conférant la résistance à la rifampicine. Le degré de résistance conférée par les
modifications de cible est variable et dépend de la capacité de la cible mutée à accomplir ses
fonctions (Rice et al., 2003; Murray et al., 2009).
40
1.3.3.3. Accessibilité réduite de la cible
L’antibiotique doit atteindre la cible pour agir et, lorsqu’il doit traverser des barrières pour y
arriver, celles-ci constituent un mécanisme de résistance efficace. Toutes les bactéries gramnégatif ont une membrane externe qui doit être franchie avant d’atteindre la membrane
cytoplasmique. Il a été reporté que la réduction des porines contribue à la résistance à certains
antibiotiques. Dans beaucoup de cas, cette accessibilité réduite doit être associée à la
production d’au moins une β-lactamase d’activité modérée pour obtenir un niveau élevé de
résistance aux β-lactames (Murray et al., 2009).
Les barrières d’entrée peuvent aussi exister dans la membrane cytoplasmique. Le mouvement
des aminoglycosides à travers la membrane cytoplasmique est un processus oxygénodépendant, ainsi ces antibiotiques sont-ils inactifs dans un environnement anaérobie (Rice et
al., 2003).
1.3.3.4. Pompes à efflux
Parmi les domaines les plus actifs de la recherche sur la résistance aux antimicrobiens, il y a
l’identification et la caractérisation des pompes qui chassent une ou plusieurs classes
d’antibiotiques de la cellule bactérienne. Plusieurs classes de pompes ont été décrites dans les
bactéries gram-positif et gram-négatif. La majorité de ces pompes sont localisées au niveau de
la membrane cytoplasmique et utilisent la force motrice du proton pour chasser les
antibiotiques de la cellule (Walsh, 2003).
Les pompes à efflux existent en deux configurations chez les bactéries (Figure 1.3.1) (Rice et
al., 2003) :
(a) Le transporteur se trouve dans la membrane cytoplasmique. Dans les bactéries grampositif, les médicaments entrent sans obstacle et sont pompés vers le milieu extérieur.
Dans les bactéries gram-négatif, les molécules, qui sont entrées dans l’espace
périplasmique par les porines ou par passage direct à travers la double couche
lipidique de la membrane externe, arrivent au niveau de la double couche lipidique de
la membrane interne où elles sont expulsées par la pompe à efflux vers le milieu
extérieur en passant par l’espace périplasmique .
(b) Dans les bactéries gram-négatif, il existe aussi des pompes à efflux complexes. Ici les
médicaments sont capturés et pompés directement dans le milieu extérieur par un
41
ensemble contenant, en plus de la pompe, un canal dans la membrane externe et une
protéine de fusion membranaire.
(a)
(a)
(b)
Figure 1.3.1. Structure des pompes à efflux. LPS, lipopolysaccharide ; OM, membrane
extérieure ; IM, membrane intérieure (Rice et al., 2003)
1.3.4. Mécanismes de résistance à différentes classes d’antibiotiques
Les principaux mécanismes de résistance à différentes familles d’antibiotiques sont résumés
dans le tableau 1.3.1. (Yao et Moellering, 2003).
42
Tableau 1.3.1. Mécanismes de résistance aux principales familles d'antibiotiques
Classe d’antibiotiques
Mécanismes de résistance
Exemples
β-lactames
Altération de la cible PBPs 2a
MRSA
Inactivation enzymatique (β-lactamases)
Entérobactéries
Réduction de la perméabilité
Pseudomonas aeruginosa
Altération de la cible
Entérocoques
Inactivation enzymatique
Staphylococcus aureus
Altération de la cible (ADN gyrase)
Entérobactéries
Entérobactéries
Staphylococcus aureus
Entérobactéries
Bactéries gram-négatif
Aminoglycosides
Quinolones
Macrolides
Chloramphénicol
Entérocoques
Altération de cible
Entérobactéries
Pompe à efflux
Entérobactéries
Rifampicine
Altération de l’ARN polymérase
Entérobactéries
Triméthoprime/
sulfamethoxazole
Altération des enzymes cibles
Tétracyclines
(Yao et Moellering, 2003)
43
44
1.4. PLACE DES PLANTES MEDICINALES DANS LA LUTTE CONTRE LES
RESISTANCES AUX ANTIBIOTIQUES
Après avoir abordé différents aspects des maladies infectieuses, des agents infectieux aux
mécanismes de résistance en passant par le traitement, nous nous sommes intéressé à l’apport
des plantes médicinales dans la lutte contre les agents pathogènes. Notre travail a en effet
pour objet l’étude d’une plante traditionnellement utilisée pour combattre diverses pathologies
dont les infections. C’est dans ce cadre que nous avons réalisé une revue bibliographique
traitant des plantes médicinales comme sources non seulement de composés antimicrobiens,
mais aussi d’inhibiteurs des mécanismes de résistances aux antibiotiques. Cette revue
bibliographique a été publiée en fin 2009, et depuis, plusieurs travaux sur les antimicrobiens
directs ou indirects ont été publiés. Nous présentons dans cette introduction à la revue, les
principaux éléments supplémentaires.
La résistance des microorganismes aux antibiotiques est devenue un sérieux problème de
santé publique qui concerne presque tous les antibiotiques et qui se manifeste dans tous leurs
champs d’application. D’où l’intérêt sans cesse croissant de chercher de nouveaux composés
pouvant agir soit directement sur les microorganismes, soit indirectement en inhibant un ou
plusieurs mécanismes de résistance. Cette recherche nécessite de disposer de méthodes
d’évaluation des propriétés antimicrobiennes des extraits de plantes et des composés purs. Les
méthodes les plus couramment utilisées sont la microdilution qui permet de déterminer la
CMI, la diffusion sur agar permettant de mesurer le diamètre d’inhibition, tandis que la CCMbioautographie permet la localisation des composés actifs sur une plaque chromatographique.
Si ces méthodes classiques permettent d’évaluer l’effet antimicrobien des composés testés,
une fois l’activité établie, des méthodes plus élaborées sont requises pour élucider le
mécanisme d’action de ces composés.
Les nouveaux composés actifs peuvent être recherchés dans les plantes médicinales, car
celles-ci constituent une source potentielle de composés antimicrobiens et/ou inhibiteurs des
mécanismes de résistances aux antibiotiques. En effet, de nombreux composés d’origine
végétale ont déjà démontré des propriétés antimicrobiennes ; ces composés agissent suivant
plusieurs mécanismes : (i) formation de complexes avec des macromolécules telles que les
protéines et les polysaccharides, inhibant ainsi leurs fonctions (polyphénols) ; (ii) rupture de
membranes microbiennes (flavonoïdes lipophiles, terpénoïdes, défensines) ; et (iii) inhibition
de l’adhésion de protéines microbiennes aux récepteurs polysaccharidiques de l’hôte
45
(polypeptides). Les plantes médicinales fournissent également des composés qui n’ont pas
nécessairement un effet direct sur les microorganismes, mais qui augmentent ou restaurent
l’activité des antibiotiques en inhibant les mécanismes de résistance. Ces composés
appartiennent à diverses classes phytochimiques et agissent comme inhibiteurs des pompes à
efflux (flavonoïdes, terpénoïdes, alcaloïdes), inhibiteurs des PBP 2a (quinones, terpénoïdes),
provoquant la perméabilité des membranes bactériennes (terpénoïdes) et inhibiteurs des bétalactamases (alkyls gallates).
En plus des mécanismes d’action et des classes phytochimiques auxquelles appartiennent les
composés actifs présentés ci-dessus, il y a lieu d’ajouter quelques résultats importants publiés
récemment et qui viennent enrichir la revue présentée ci-après. (i) La formation de biofilms
par les agents infectieux rend ces derniers inaccessibles aux antibiotiques, leur conférant ainsi
une résistance. Inhiber la formation des biofilms constitue donc une stratégie permettant aux
antimicrobiens d’atteindre les agents infectieux ; des métabolites secondaires de plantes
médicinales peuvent jouer ce rôle. Ainsi, les huiles essentielles de Cymbopogon citratus et
Syzygium aromaticum inhibent la formation des biofilms chez Candida albicans (Khan and
Ahmad, 2012). Le Tan Re Qing (TRQ), extrait aqueux d’un mélange de cinq drogues
(Scutellaria baicalensis Georgi, Bear Gall, Goral, Lonicera japonica Thunb et Forsythia
suspensa (Thunb.) Vahl.) présente une double action, d’une part il inhibe la formation des
biofilms chez Pseudomonas aeruginosa et d’autre part il tue les microorganismes se trouvant
dans la matrice (Wang et al., 2011). (ii) Une macrolactone contenant le D-xylose et le Lrhamnose, la pescapréine, isolée de Ipomoea pes-caprae a montré un effet inhibiteur sur les
pompes à efflux des MRSA, augmentant ainsi l’action de la norfloxacine (Escobedo-Martinez
et al, 2010). (iii) L’effet antimicrobien indirect de deux triterpènes, l’acide oléanolique et
l’acide ursolique, a été décrit. Ces deux composés augmentent l’activité de β-lactames vis-àvis des souches de S.aureus, S. epidermidis et L. monocytogenes (Kurek et al., 2012).
Ces trois avancées sont exemplatives d’innombrables travaux traitant des plantes à propriétés
antimicrobiennes directes et/ou indirectes publiés depuis 2010 ; pour la plupart des autres
travaux, les classes phytochimiques et les propriétés biologiques qui leur sont associées ont
déjà été abordées dans notre revue.
Chapitre 13 du Livre « Medicinal Plants : Classification, Biosynthesis and Pharmacology »
Editeurs : Alejandro Varela and Jasiah Ibañez, ©2009 Nova Science Publishers, Inc.
ISBN: 978-1-60876-027-5
Pages 315 - 336
46
In: Medicinal Plants Classification, Biosynthesis …
Editors: Alejandro Varela and Jasiah Ibañez
ISBN: 978-1-60876-027-5
©2009 Nova Science Publishers, Inc.
Chapter 13
Medicinal Plants: A Tool to Overcome
Antibiotic Resistance?
Philippe N. Okusa*, Caroline Stévigny and Pierre Duez
Université Libre de Bruxelles, Bruxelles, Belgique
Abstract
Bacterial antibiotic resistance has become a serious problem of public health that
concerns almost all antibacterial agents and that manifests in all fields of their application.
Consequently, there is an increasing interest in the search for new compounds which can
act by a direct antimicrobial effect or by inhibiting resistance mechanisms of
microorganisms of medical importance. Medicinal plants nowadays remain a valuable
source for this kind of compounds. The direct antimicrobial properties of a number of
natural compounds have indeed been reported; such compounds act by many mechanisms,
including: (i) complexation with macromolecules such as proteins and polysaccharides,
thus inhibiting their functions (polyphenols); (ii) disruption of microbial membranes
(lipophilic flavonoids, terpenoids, plant defensins); and (iii) inhibition of adhesion of
microbial proteins to host polysaccharide receptors (polypeptides). Medicinal plants also
provide compounds which are not necessarily effective against microorganisms, but
which enhance or restore the activity of antibiotics by inhibiting resistance mechanisms.
These compounds belong to several phytochemical groups and act as inhibitors of efflux
pumps (flavonoids, terpenoids, alkaloids); inhibitors of PBP 2a (quinones, terpenoids),
enhancers of the permeability of bacterial membrane (terpenoids) and beta-lactamases
inhibitors (alkyls gallates).
* Corresponding author. Tel.: +3226505281, fax: +3226505430, e-mail: [email protected]
47
316
Philippe N. Okusa, Caroline Stevigny and Pierre Duez
1. Introduction
Infectious diseases caused by bacteria, fungi, viruses and parasites remain a major threat
to public health due to the emergence of widespread antimicrobial resistance (WHO, 1996)
increasing at an alarming rate (Hawkey, 2000). Thus, it is essential that resistance to
currently used antimicrobial agents be prevented, limited or reversed. Antibiotic resistance is
the ability of microorganisms to remain impervious to the inhibitory or lethal effect of
antibiotics (Kaye et al., 2000). This resistance can be intrinsic, inherent to a particular species;
for example gram-negative bacteria are intrinsically resistant to vancomycin because these
organisms contain an additional protective outer membrane, absent in gram-positive cells, that
prevents the agent from reaching the target site (Walsh, 2003). The resistance can also be
acquired, when it refers to an attribute resulting from a change in the genetic composition of
the bacteria, rendering a previously active drug ineffective (Rice et al., 2003).
If inappropriate prescribing and use of antibiotics are considered as the major factors in
the emergence of the resistance phenomenon, education addressed to both prescribers and
patients can help to reduce resistance (Yates, 1999). A further approach resides in the
research for new drugs, acting by other mechanisms than those described for existing
antibiotics, or inhibiting resistance mechanisms of microorganisms of medical importance.
These new drugs can be provided by natural sources, particularly by medicinal plants. Indeed,
medicinal plants have always provided modern therapeutic a most important source of lead
compounds in the search of new drugs and medicines (Cowan, 1999). Indigenous herbals are
widely used against many infectious diseases and can be a valuable source for natural
compounds, with a great interest in the fight against pathogenic bacteria and antibiotics
resistance. Many studies report the antimicrobial properties of secondary metabolites from
medicinal plants, of which it is estimated that less than 10% of the total have been
characterized (Schultes, 1978). Such compounds are part of "vegetal immunity", complex
mechanisms of plants’ defenses against predation by microorganisms, insects and herbivores.
Interestingly, some phytochemical compounds, although lacking antimicrobial activity,
display an inhibitory effect on resistance mechanisms of microorganisms, thus enhancing or
restoring the activity of some antibiotics. All these compounds belong to many phytochemical
groups found in several botanical families; .among these, tannins and essential oils are
particularly known for their direct antimicrobial properties.
The antimicrobial activity of plant extracts, essential oils or pure compounds can be
assessed by different methods, including broth dilution (determination of minimum inhibitory
concentrations), diffusion on agar (determination of inhibition diameter) and bioautography
(localization of active compounds on a TLC plate) (Botz et al., 2001). The solvents used for
plant extraction are an important factor in the antimicrobial evaluation; there are solvents
more favorable according to the number of inhibitors extracted (Vanden Berghe et Vlietinck,
1991; Eloff, 1998). The collection and conservation of plant materials is also important to
ensure correct botanical identification and preservation of biological activities.
The present paper reviews (i) the different methods of evaluation of antimicrobial
activity of plant extracts and natural compounds, (ii) the principal groups of direct
antimicrobial compounds from medicinal plants and their mechanisms of action; and (iii) the
natural compounds inhibiting resistance mechanisms of microorganisms.
48
Medicinal Plants: A Tool to Overcome Antibiotic Resistance?
317
2. Extraction and Biological Tests of
Medicinal Plants
2.1. Extraction
The screening of medicinal plants for antimicrobial activity follows a logical pathway.
Plants are collected randomly or by following instructions given by traditional healers in the
areas where the plants are found (Verpoorte et al., 2005). Any part of the plant may contain
antimicrobial compounds, for instance, the roots of Albertisia villosa contain antimicrobial
alkaloids (Lohombo-Ekomba et al., 2004), while eucalyptus leaves are harvested for their
essential oils and tannins. It is also possible to use herbarium specimens to test the
antimicrobial activity of medicinal plants (Eloff, 1999).
Crude aqueous or alcohol extracts are typically used for the preliminary antimicrobial
tests; they can be followed by various organic extractions. For alcoholic extracts, plant parts
are dried, ground to a fine texture, and then soaked in methanol or ethanol for extended
periods. The slurry is filtered and the filtrate dried under reduced pressure. Crude extracts can
then be used in agar disk diffusion or broth dilution tests for antimicrobial properties and for
other biological activities. Active crude extracts can be submitted to a bio-guided
fractionation in order to purify and identify the active compounds by various techniques
including chromatography and spectroscopy (Pieters et Vlietinck, 2005).
Eloff has examined the ability to extract antimicrobial compounds from plants of a
variety of solvents, as well as other factors such as their relative rankings as biohazards and
the ease of removal from fractions (Eloff, 1998). Acetone, which is not one of the most
frequently used extractants in published studies, received the highest overall rating, followed
by dichloromethane, methanol, ethanol and water, respectively. This study suggests that most
of the active antimicrobial compounds are not water-soluble and that the most commonly
used solvents may not present the highest sensitivity in initial screenings for antimicrobial
compounds.
2.2. Agar Diffusion Methods
The agar diffusion assay is one of the most commonly used methods for antimicrobials
susceptibility testing. Test compounds at known concentrations are brought in contact with an
inoculated agar medium, the inoculated system is maintained at room temperature for several
hours in order to favor the diffusion of test compounds over the microbial growth surface.
The system is then incubated at requested t° and the diameter of the clear zone around the
disk of test compound ("inhibition diameter") is measured after the incubation period. The
diffusion method is not appropriate for testing non-polar samples or samples that do not easily
diffuse into agar. In general, the relative antimicrobial potency of different samples may not
always be compared, mainly because of differences in physical properties, such as solubility,
volatility and diffusion characteristics in agar (Cos et al., 2006).
The agar diffusion technique can also be used to study the effect of plant extracts on
antibiotics resistance. In this purpose, inactive plant extracts are dissolved and incorporated in
317
49
318
molten agar medium and cast in Petri dish (Okusa et al., 2007); suitable controls are prepared
with medium without plant extracts. The susceptibility of antibiotics is then evaluated by a
classical disk diffusion method. Another possible approach is the incorporation of antibiotic
in the agar layer overlaid by disks containing tested plant extracts (Shahverdi et al., 2004).
2.3. Liquid-and Agar-Dilution Methods
Liquid broth dilution methods, including microdilution methods, are widely used to
quantitatively measure the in vitro activity of an antimicrobial agent against a given bacterial
strain. A series of serial dilutions of the tested agent in broth tubes or multiwell plates are
inoculated with a standardized suspension of the test microorganism. After overnight
incubation, the minimum inhibitory concentration (MIC) is visually or spectrometrically
estimated by determination of turbidity (NCCLS, 2003) or of reaction products from redoxindicators such as MTT or resazurin (Gabrielson et al., 2002). Test samples may react with
the chromogenic reagent or, if not fully soluble, may interfere with turbidity readings,
emphasizing the need for suitable controls, i.e. extract dissolved in blank medium without
micro-organisms. The liquid-dilution method also allows determination whether a compound
or extract has a cidal or static action at a particular concentration. The minimal bactericidal or
fungicidal concentration (MBC or MFC) is determined by plating-out samples of completely
inhibited dilution cultures on agar medium and visually assessing growth (static, MIC) or nogrowth (cidal, MBC) after incubation (NCCLS, 2002, 2003).
In agar-dilution methods, various concentrations of antibacterial substance are mixed
with nutrient agar and caste. Casted agar plates are then inoculated and incubated. The lowest
concentration of antimicrobial compound resulting in no visible growth is considered as the
MIC value.
Liquid-and agar-dilution methods can also be used to study the effect of plant extracts on
antibiotics resistance.
2.4. Synergy between Plant Extracts and Antibiotics
Antimicrobial combinations are considered to be synergistic if the effect of combination
is greater than the effect of either agent alone or greater than the sum of the effects of
individual agents. Antagonism results if the combination provides an effect less than the
effect of either agent alone or less than the sum of the effects of the individual agents.
Indifference results if the combination provides an effect equal to the effect of either agent
alone. The distinction between synergy, antagonism and indifference classically relies on the
determination of Fractional Inhibitory Concentrations (FIC= MIC of a drug given in
combination/MIC of the same drug alone) and FIC index (for a mixture of drugs A and B,
FIC index = FICA + FICB). The FIC index is classically evaluated as follows: synergy (FIC
index ≤ 0.5), additive (0.5 < FIC index ≤1), indifference (1 < FIC index ≤ 2) and antagonism
(FIC index > 2) (Mackay et al., 2000).
50
319
2.5. Bioautography on Thin-Layer Chromatoplates
TLC-bioautography, a convenient and simple way of testing plant extracts and pure
substances for their effects on pathogenic microorganisms, allows an easy detection of active
fractions (Hostettmann et al., 1997). Three variants of the technique are described: (i) direct
bioautography, in which a broth of the micro-organism is directly applied on the TLC plate;
(ii) contact bio-autography, where the antimicrobial compounds are transferred from the TLC
plate to an inoculated agar plate through direct contact; and (iii) agar-overlay bioautography,
where a seeded agar medium is applied directly onto the TLC plate (Botz et al., 2001). In the
1960's, contact and immersion bioautography in various versions were routinely used, but
nowadays direct bioautography largely prevails (Hamburger et Cordell, 1987).
TLC is usually performed in duplicate with suitable mobile phases and the plates are
dried to remove the eluents, a critical step. One set of plates is used as the "reference"
chromatogram, spots being visualized under UV light or by spraying a specific or a general
reagent (Wagner et Bladt, 1996). The second plate is placed in a Petri dish, aseptically
overlaid by the inoculated medium and incubated overnight. The bioautogram is subsequently
sprayed with an aqueous solution of MTT 0.8 mg/ml and incubated for a few hours (Botz et
al., 2001). The MTT is converted to a formazan dye by the microorganisms and active
compounds are indicated by inhibition zones observed as clear spots against a purple
background (Begue et Kline, 1972). The applicability of TLC-bioautography is however
limited to microorganisms that easily grow on TLC plates and requires complete removal of
residual low volatility solvents, such as n-BuOH, trifluoroacetic acid or ammonia, which can
inhibit the growth of several microorganisms (Nagy et al., 2002).
2.6. Antiparasitic Test
In contast to antibacterial, antifungal and antiviral assays that are based on common test
conditions and endpoints, antiparasitic assays are more complicated and more exclusive since
they tend to be highly species-specific (Plasmodium, Entamoeba, helminthes...). Particular
interest is devoted to malaria, one of the protozoal diseases that have been defined by the
WHO as major health risks. Extracts possibly effective against Plasmodium can be tested on
microorganisms in an erythrocyte infection assay on microtiter plates. Parasitized erythrocytes
are incubated with and without test substances, and the numbers of Plasmodium organisms
after the incubation period are quantitated either by measurements of radioactivity
(radiolabeleld parasites) (Cos et al., 2006) or of the parasite lactate deshydrogenase (pLDH)
activity, using 3-acetyl pyridine NAD (APAD) as a coenzyme; as human red blood cell LDH
carries out this reaction at a very slow rate in the presence of APAD, the measurements
correlate with the levels of parasitemia (Makler et al., 1993).
319
51
320
2.7. General Toxicity Tests
To assess the selectivity of the observed antimicrobial activity, cytotoxicity assays on
mammalian cells is very important and should be included in parallel. A MRC-5 cells model
is frequently used; cell proliferation and viability is assessed either by visual counting or by
spectrophotometry after addition of MTT, Alamar BlueTM or resazurin (McMillian et al.,
2002).
3. Plant Compounds with Direct
Antimicrobial Activity
Natural products from plants are a source of “lead” compounds in the search for new
antimicrobial drugs and medicines. Over the past three decades, researchers have also turned
to many of the traditional folk medicines, essentially cocktails of natural products, to uncover
the scientific basis of their remedial effects, endeavors which have their roots in a desire to
improve the efficacy of modern medical practice (Haslam, 1996). In this context, particular
attention has been given to the traditional herbal medicines which provide antimicrobial
compounds with newly discovered mechanisms of action. Table 1 lists examples of some
antimicrobial compounds from medicinal plants.
3.1. Mechanisms of Direct Antimicrobial Action
3.1.1. Association with Macromolecules
The antimicrobial properties of some phytochemicals, notably polyphenols, may be
attributed to their ability to form complexes with macromolecules such as proteins and
polysaccharides. This propensity to bind proteins can presumably lead to an inhibition of
enzymes. Assessment of the medical significance of inhibition of a particular enzyme,
determined in vitro, is however dependant on the absorption and distribution of administered
compounds to the desired in vivo site of action. Such limitations do not arise on local
applications, especially when the enzymes are extracellular. Polyphenols for example are
known to bind glycosyl transferases, enzymes involved in the synthesis of water-insoluble
glucans from sucrose by Streptococcus mutans (Hattori et al., 1990). These glucans firmly
bind the bacteria to the tooth surface, leading eventually to the formation of dental plaque and
development of dental caries; polyphenols extracted from green tea showed inhibitory activity
against glycosyl transferases and their administration led to highly significant reduction in
dental caries in animals (Ooshima et al., 1993).
Antimicrobial quinones also often act by protein binding mechanisms. Indeed, quinones
are known to covalently and irreversibly bind nucleophilic amino acids in proteins, often
leading to inactivation of proteins (Cowan, 1999). Probable targets in the microbial cell are
surface-exposed adhesins, cell wall polypeptides, and membrane-bound enzymes.
52
321
Table 1. Examples of some antimicrobial compounds from medicinal plants by class,
source and activity
Compounds
Phenylpropanoids
Eugenol
Medicinal plants
Antimicrobial property
Activity
MO highly
sensitive
References
MIC
range
(µg/ml)
Syzygium aromaticum
(Myrtaceae)
Olea europaea
(Oleaceae)
Antibacterial
B.s, E.c, H.p 2
Antibacterial
S.m, E.cl
2
Glycyrrhiza inflate
(Fabaceae)
Antibacterial
Antimucobacterial
Antileishmanial
Antiplasmodial
Antiviral
S.a, B.s, M.t
L.m
P.f
H.I.V
2-8
7
1.6 µM
-
(Shea et al., 1993;
Chen et al., 1994;
Zhai et al., 1995;
Haraguchi et al.,
1998; Friis-Moller et
al., 2002;
Tsukiyama et al.,
2002)
Laburnetin
Ficus chlamydocarpa
(Moraceae)
Antibacterial
Antimucobacterial
Antifungal
S.a
M. s
C.a
19
0.6
39
(Kuete et al., 2008)
Piliostigmol
Piliostigma reticulatum
(Caesalpiniaceae)
Antibacterial
Antifungal
S.a, E.c
C.a
2-3
10
(Babajide et al.,
2008)
Glabranin
Helichrysum forskahlii
(Asteraceae)
Antibacterial
S.a, B.s
3-6
(Al-Rehaily et al.,
2008)
Sulcatone A
Ouratea sulcata
(Ochnaceae)
Antibacterial
S.a, B.s
8 - 12
(Pegnyemb et al.,
2005)
Cunonia macrophylla
(Cunoniaceae)
Antibacterial
Antifungal
S.a
C.a
-
(Fogliani et al.,
2005)
Newbouldia laevis
(Bignoniaceae)
Antibacterial
Antifungal
Antimaplasmodial
E.c, K.p
C.g
P.f
0.3-10
0.31
-
(Eyong et al., 2005)
(Kuete et al., 2007)
Stereospermum zenkeri
(Bignoniaceae)
Antibacterial
P.a, E.c,
9-18
(Lenta et al., 2007)
Antibacterial
Antifungal
B.c, S.a
C.a
18-39
130
(Buwa et van
Staden, 2006)
(Drewes et al., 2005)
Salvia sclarea (Lamiaceae) Antibacterial
Helichrysum tenax
Antibacterial
(Asteraceae)
Antifungal
S.a, S.e
B.c, S.e
C.a
37-75
3-31
62
(Kuzma et al., 2007)
(Drewes et al.,
2006)
Caffeic acid
Flavonoids
Licochalcone
Tannins
Corilagin
Quinones
Newbouldiaquinone A
Zenkequinone B
2-methyl-6-(-3-methyl-2- Gunnera perpensa
butenyl)benzo-1,4-quinone (Haloragaceae)
(Ali et al., 2005;
Rastogi et al., 2008)
(Almeida et al.,
2006; Pereira et al.,
2007)
Terpenoids
Aethiopinone
ent-beyer-15-en-19-ol
321
53
322
Table 1. (continued)
Compounds
Medicinal plants
imberbic acid
Combretum imberbe
(Combrataceae)
11-hydroxy-12-oxo7,9(ll),13-abietatriene
Epidioxysterol
Plectranthus elegans
(Lamiaceae)
Morinda citrifolia
serrulatic acid
Eremophila sturtii
(Myoporaceae)
Alkaloids
Cocsoline
Cryptolepine
Antimicrobial property
Activity
MO highly
sensitive
Antibacterial
Antimucobacterial
Antifungal
Antibacterial
S.a
M.f
C.a
S.a, B.S
Antibacterial
Antimucobacterial
Antifungal
Antibacterial
S.a, P.a
M.t
F.o
S.a
2.5
15
(Levand et Larson,
1979; Saludes et al.,
2002)
(Liu et al., 2006)
S.t, E.c, S.s
C.a
Pf
Cs
Mt, Mf
16-32
32
0.55µM
12
12-16
(Otshudi et al.,
2005)
K.p, E.c
3–6
(Sawer et al., 1995;
Cimanga et al.,
1996; Paulo et al.,
2000; Gibbons et
al., 2003)
(Morel et al., 2002)
S.a
C.a
1.56
-
(Nissanka et al.,
2001)
F.s
0.2 µM
Antibacterial
Sa, Pa
80
Antibacterial
Antifungal
C.m
F.o
7.3
6
(Terras et al., 1992;
Thevissen et al.,
1996; Gutierrez et
Perez, 2004)
(Mandal et al.,
2008)
(Yokoyama et al.,
2008)
Albertisia villosa
(Menispermaceae)
Antibacterial
Antifungal
Antiparasitic
Cryptolepis sanguinolenta Antibacterial
(Periplocaceae)
Antimucobacterial
Condalia buxifolia
Antibacterial
(Rhamnaceae)
8-acetonyldihydronitidine Zanthoxylum tetraspermum Antibacterial
Antifungal
Plant defensins
RsAFP2
Raphanus sativus
Antibacterial
(Brassicaceae)
Antifungal
condaline A
Cn-AMP1
Cy-AMP1
Cocos nucifera
(Arecaceae)
Cycas revoluta
(Cycadaceae)
References
MIC
range
(µg/ml)
3
1.5
100
10-40
(Katerere et al.,
2003; Angeh et al.,
2007)
(Dellar et al., 1996)
Legend:MO: microorganisms, MIC: mimimum inhibitory concentration, S.a: Staphylococcus aureus,
B.s: Bacillus subtilis, E.c: Escherichia coli, C.a: Candida albicans, P.s: Pseudomonas aeruginosa,
L.m : Leishmania major, M.s : Mucobacterium smegmatis, M.t : Mucobacterium tuberculosis,
C.g : Candida gabrata, K.p : Klebsiella pneumoniae, F.s : Fusarium solani, F.o : Fusarium
oxysporum, C.m : Clavibacterium michiganensis, S.m : Serratia marcescens, E.cl :Enterobacter
cloacae, H.p : Helicobacter pylori
3.1.2. Detergent-Like Membrane Disruption
Microbial membrane disruption can occur either by formation of pores which increase the
membrane permeability to ions and larger molecules, or by hydrolysis of membrane
phospholipids. Most of these bactericidal agents are peptides or peptide-based molecules that
have been either isolated from natural sources or synthetically designed. Lipophilic
flavonoids and terpenoids may also disrupt the microbial membranes.
As resistances to antimicrobial compounds that disrupt the structure of the bacterial
membranes, rather than inhibiting a specific enzyme, are less likely, such compounds are
considered as the probable future of antibiotics (Lockwood et Mayo, 2003).
54
323
3.1.3. Other Mechanisms
Since microorganisms need to adhere to host cells to cause infection, compounds that can
inhibit the adhesion of microbial proteins to host polysaccharide receptors are potential
antimicrobial agents. This mode of action is particularly encountered in lectin molecules and
it is worth emphasizing that such antimicrobial lectins are not detected by using classical
general antimicrobial screening protocols.
The antimicrobial and/or antiparasitic activity of planar molecules, including quaternary
alkaloids (berberine, harmane) is probably due in part to their ability to intercalate within
DNA (Omulokoli et al., 1997).
3.2. Phytochemical Classes of Antimicrobial Compounds
3.2.1. Antibiotic Compounds from Microorganisms
Antibiotics, agents “against life”, can either be natural products or synthetic chemicals,
designed to block some crucial process in microbial cells selectively. Most of the antibiotics
introduced into human clinical use to treat infectious disease in the past 60 years have been
natural products, elaborated by one microorganism in a particular habitat and set of
environmental conditions to affect neighboring microbes, either to regulate their growth or to
trigger their elimination (Walsh, 2003). Diverse structures isolated from a series of
microorganisms have yielded the antibiotics, an extremely important class of medicinal
compounds reviewed in details in many papers. Streptomycetes, gram-positive filamentous
bacteria, account for the production of about 55 % of the commercially significant antibiotics
including macrolides, glycopeptides, tetracyclines, β-lactams, aminoglycosides.
Platensimycin, a previously unknown class of antibiotics, is produced by Streptomyces
platensis and shows a strong, broad-spectrum Gram-positive antibacterial activity by
selectively inhibiting cellular lipid biosynthesis (Wang et al., 2006).
3.2.2. Phenolic Compounds
Among the simplest bioactive phytochemicals, simple phenols and phenolic acids
consist of a single, mono- or polysubstituted, phenolic ring and include compounds with
interesting antimicrobial activity. For example, caffeic acid is effective against viruses,
bacteria and fungi, catechol, pyrogallol and arbutine are shown to be toxic to microorganisms;
the site and number of hydroxyl groups are thought to be related to the relative toxicity to
microorganisms, with evidence that increased hydroxylation results in increased toxicity. The
phenolic toxicity to microorganisms can be attributed to their oxidized, eventually quinone,
forms which lead to enzyme inhibition, possibly through reaction with sulfhydryl and amino
groups or through more non-specific interactions with proteins (Haslam, 1996). The
phenylpropanoids (C6-C3), phenolic compounds with a C3 side chain, are found in essential
oils and often cited as antimicrobial agents. Eugenol, a C6-C3 compound, present in clove oil,
is effective against bacteria and fungi and has been widely used in dentistry.
Flavonoid and stilbene, structures based on a phenylchromane or a diphenylethene, are
well-known phytoalexins, compounds synthesized by plants in response to microbial and
fungal infections. It should not be surprising that they have been found to be effective against
323
55
324
a wide array of microorganisms. The antimicrobial activity of teas is related to their content in
catechins, reduced form of the C3 unit of flavonoids. These compounds are effective against
many microorganisms including Vibrio cholerae, Streptococcus mutans, Shigella sp.
Flavonoids are also effective against many viruses; swertifrancheside and chrysin have been
found active against HIV; other flavone derivatives show an inhibitory effect on respiratory
syncytial virus (RSV) (Cushnie et Lamb, 2005). Resveratrol, a diphenylethene phytoalexin
commonly found in food and drinks, including red wine, grapes, and peanuts; is effective
against bacteria and fungi.
Tannins, polymeric phenolic substances, characterized by their astringency, are capable
of tanning leather or precipitating gelatin from solution. They are divided into three groups,
(i) the hydrolysable tannins, based on gallic and ellagic acids usually as multiple esters with
polyols; (ii) the procyanidols or condensed tannins which are oligo- and polymerized
flavonoid monomers; and (iii) the complex tannins, comprising monomers from the other 2
classes. Many physiological activities, such as stimulation of phagocytic cells, host-mediated
antitumor activity and antimicrobial effects, have been assigned to tannins. Indeed, in many
studies, tannins showed toxicity to yeasts, filamentous fungi and bacteria; and the
antibacterial effect of some medicinal plants extracts is explained by their content in tannins.
It is also reported that tannins have an inhibitory effect on viral reverse transcriptases
(Scalbert, 1991).
Coumarins, phenolic substances made of fused benzene and α-pyrone rings, are
particularly known for their antithrombotic, anti-inflammatory and vasodilatatory activities.
Warfarin is a well-known coumarin which is used both as an oral anticoagulant and,
interestingly, as a rhodenticide; it may also have antiviral effects. Several other coumarins
have shown antimicrobial activity against many fungi, gram-positive bacteria and viruses. An
indirect negative effect on infections has been observed with some coumarins that stimulate
macrophages.
The potential antimicrobial activity of quinones, aromatic rings with two ketone
substitutions, oxidized phenols ubiquitous in nature and characteristically highly
reactive,toward proteins has been discussed in Section 3.1.1. Anthraquinones, among which
hypericin, isolated from Hypericum perforatum, are effective against many microorganisms
(Cowan, 1999). Arbutin, a hydroquinone derivate, is effective against Pseudomonas
aeruginosa. In Pyrus ussuriensis, arbutin is metabolized to hydroquinone, then to
benzoquinone; this later compound is the substance essential for antibacterial activity of
Pyrus spp.
3.2.2. Terpenoids
Many studies report the antibacterial, antifungal, antiviral and anti protozoal activities of
terpenes and terpenoids, ubiquitous compounds synthesized from isoprene units and occuring
as monoterpenes, sesquiterpenes, diterpenes, triterpenes and tetraterpenes according to their
numbers of carbons. A great part of essential oils, essentially composed of monoterpenoids,
but also of sesquiterpenoids, phenols and/or C6-C3 units, are effective against fungi and
bacteria; it is reported that 60% of essential oils derivatives examined are effective against
fungi while 30% possess antibacterial effects. The triterpenoid betulinic acid has been
reported to inhibit HIV (Cowan, 1999). The sesquiterpene artemisinin and its derivate α-
56
325
artemether, find current use as antimalarials, the latter drug having been chosen by the
scientific working group of the WHO as a treatment for cerebral malaria (Vishwakarma et al.,
1992)..
3.2.3. Alkaloids
Alkaloids are a family of extremely diverse nitrogen compounds possessing many
biological activities. The indoloquinoline alkaloids such as cryptolepine have a high
antimycobacterial effect against Mycobacterium tuberculosis (MTB) and have recently been
shown to be an alternative screening model to MTB for potential antitubercular drugs
(Okunade et al., 2004). The bisbenzylisoquinoline (B.B.I.Q) alkaloids from Menispermaceae
species have shown antimalarial, antifungal, antiviral, and antibacterial activities; for example
cycleanin, a B.B.I.Q isolated from Albertisia villosa, has been found effective against
bacteria, fungi and plasmodia (Otshudi et al., 2005). Berberine alkaloids are cationic
antimicrobials produced by several Berberis medicinal plants, their antimicrobial effect is
highly enhanced by flavonoids such as 5-MHC (Stermitz et al., 2000a).
3.2.4. Defensins
Plant defensins, which are also known as γ-thionins, are one of the most important and
very well studied classes of antimicrobial peptides. They are produced by plants in order to
defend themselves against invading microbial pathogens (Thevissen et al., 2007).
Interestingly, plant defensins display antimicrobial activity, not only against plant pathogens
but also against human microbial pathogens, including bacteria, fungi and parasites (Lay et
Anderson, 2005).
The exact mechanism of the antimicrobial action of defensins remains a matter of
controversy; there is nevertheless a consensus that these peptides selectively disrupt the cell
membranes and the amphipathic structural arrangement of the peptides is believed to play an
important role in this mechanism (Thomma et al., 2003). It is also reported that these
antibacterial peptides, which are usually highly basic, recognize the acidic phospholipids
exposed on the surface of the bacterial membrane (Thevissen et al., 2003). In the case of
microbes, the anionic lipids are effectively present on the outer surface of the membrane
whereas for mammalian cells, anionic lipids are present along the cytoplasmic side of the
membrane. This feature might account for their preferential activity against bacteria but not
against mammalian cells (Thevissen et al., 2004).
4. Effects of Plant Compounds on Antibiotic
Resistance
Three main mechanisms of antibiotic resistance have been so far identified: (i) the ability
of microorganisms to reduce the intracellular concentration of drug (reduced permeability,
reduced uptake, active efflux); (ii) the inactivation of antibiotics; and (iii) the modification or
elimination of the target site. Microorganisms may use one or more of these strategies to
evade the inhibitory or lethal effects of a particular antibiotic and may transfer these
capabilities to other strains, notably through plasmids.
325
57
326
The fight against antibiotics resistance implies on one hand the research for active
compounds with a new mode of action, different of those described for existent antibiotics;
that is the case of platensimycin, a previously unknown class of antibiotics produced by
Streptomyces platensis. This antibiotic has a strong broad spectrum activity on Gram-positive
strains by inhibiting the bacterial lipid biosynthesis, through the selective targeting of ketoacyl-(acyl-carrier-protein (ACP)) synthase I/II (FabF/B) (Wang et al., 2006).
A second approach in this fight against antibiotic resistance is the use of compounds
without direct antimicrobial properties, but which enhance or restore the effects of antibiotics
on resistant microorganisms (Shahverdi et al., 2004). This approach compares the effects of
antibiotics by themselves to the combination of antibiotics and inactive compounds or plant
extracts against resistant microorganisms. It is also possible to evaluate the effect of active
plant extract (or compounds) in association, in sub-inhibitory concentrations, with antibiotics
(Shahverdi et al., 2003). Different mechanisms of antibiotic resistance and their inhibitors
from medicinal plants are summarized in Figure 1.
Figure 1. Mechanisms of antibiotic resistance and examples of their inhibitors from medicinal plants
4.1. Efflux Pumps Inhibitors
4.1.1. Efflux Systems
Among the major mechanisms involved in bacterial resistance, efflux pumps, responsible
for the extrusion of the antibiotic outside the cell, have recently received a particular
attention. These systems can confer resistance to a specific class of antibiotics or to a large
number of drugs, thus conferring a multi-drug resistance to bacteria. Efflux pumps are
currently classified into five families:
ü ATP-binding cassette (ABC) transporters are ubiquitous membrane systems involved
in different transport functions such as the efflux of toxins, metabolites and drugs.
Bacterial ABC transporters involved in drug resistance are mainly drug-specific
58
ü
ü
ü
ü
327
transporters and many of them are found in antibiotic producing organisms, such as
Streptomyces spp, thus ensuring self-resistance to the drug they produce. In some
Gram positive bacteria, such as Staphylococci and Enterococci, such specific
transporters are also found, conferring resistance to macrolides and related
compounds (Holland, 2003).
Major facilitator superfamily (MFS) are ubiquitous systems ensuring transport of
sugars, intermediate metabolites and drugs.
Resistance nodulation and cell division (RDN) are involved in the transport of
lipophilic and amphiphilic molecules or toxic divalent cations, also responsible for
the solvent resistance of some bacterial strains. They are mainly found in Gram
negative bacteria.
Small multi-drugs resistance (SMR) are the smallest drug efflux proteins known,
involved in the efflux of lipophilic cationic drugs.
Multi-drug and toxic compounds extrusion (MATE) are mainly Na+/drug antiporters
in contrast to the other families of secondary transporters which act as proton/drug
antiporters.
These five families of efflux pumps are commonly grouped in two major groups based
upon bioenergetical and structural features: (i) the primary transporters which hydrolyze ATP
as source of energy (ABC transporters); and (ii) the secondary transporters which use the
proton (or sodium) gradient as source of energy (MFS, RDN, SMR and MATE). In bacteria,
secondary transporters are dominant and many of them are multi-drugs resistance
transporters, whereas ABC transporters are mainly specific drug resistance transporters.
In Gram positive bacteria, MDR is mainly conferred by MFS efflux systems, the most
studied being NorA of Staphylococcus aureus and its homologues in Bacillus subtilis, Mmr
and Blt. Whereas RDN efflux systems are major contributors to resistance for Gram negative
bacteria, AcrAB-TolC and MexAB-OprM are also involved in the intrinsic resistance of
Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa, respectively.
4.1.2. Efflux Pumps Inhibitors (EPIs)
The research of compounds inhibiting the efflux pumps is crucial in the fight against
antibiotic resistance. These compounds are expected to: (i) decrease the intrinsic resistance of
bacteria to antibiotics; (ii) reverse acquired resistance; and (iii) reduce the frequency of
resistant mutant strains emergence.
Medicinal plants extracts and natural compounds have been reported to inhibit efflux
systems, thus enhancing or restoring the activity of diverse antibiotics. Among them:
4.1.2.1. Alkaloids
Reserpine, an antihypertensive alkaloid isolated from Rauwolfia sp, is known to inhibit
the P-gp and potentiate the activity of fluoroquinolones on MDR Gram-positive bacteria; it
enhances also the activity of tetracycline against MRSA strains and it has been shown to
inhibit the LmrA of L. lactis, the ABC efflux system that confers MDR to this strain
(Marquez, 2005). These effects of reserpine however appear at concentrations too high to be
327
59
328
clinically relevant and moreover bacterial resistance to reserpine has been selected in some
strains.
4.1.2.2. Flavonoids
Several Berberis medicinal plants producing berberine, an antimicrobial alkaloid, were
found to also synthesize 5-methoxyhydnocarpin (5-MHC), an inhibitor of the NorA MDR
pump of S. aureus (Stermitz et al., 2000a). 5-MHC, an amphipathic weak acid, distinctly
different from the cationic substrates of the NorA, has no antimicrobial activity per itself but
increases the intracellular accumulation of berberine and strongly potentiates its activity
(Stermitz et al., 2000b).
4.1.2.3. Alkyl Gallates
Numerous biological properties have been reported for the green tea phenols, epigallocatechin gallates and epicatechin gallates, including antimicrobial activities, reversal of
methicillin resistance or inhibition of P-gp. These compounds were also found to reverse
tetracycline resistance in Staphylococci strains and to potentiate the activity of norfloxacin
against a NorA over-expressing S. aureus (Hatano et al., 2005).
4.1.2.4. Terpenoids
Diterpens compounds, carnosic acid from Rosmarinus officinalis and isopimarane
derivatives from Lycopus europaeus, potentiate the activity of erythromycin and tetracycline
against a macrolide- highly resistant S. aureus harboring the ABC transporter MsrA (BrehmStecher and Johnson, 2003).
4.2. β-Lactamases Inhibitors
The production of β-lactamases, enzymes that hydrolyse the β-lactam ring of
cephalosporins and penicillins, is the most determinant cause of resistance to β-lactams
(Livermore, 1995).
To overcome β-lactamases related resistance, antibiotics association including non βlactams can be used; an other approach, more interesting, is the use of β-lactams in
association with inhibitors of β-lactamases. Clavulanic acid combination with amoxicillin
demonstrates how successful this approach can be; this beta-lactamase inhibitor is combined
with penicillin group antibiotics to overcome resistance in bacteria which otherwise would
inactivate most penicillins.
Some natural products, such as epigallo-catechin gallates inhibit the penicillinase
produced by S. aureus, restoring the activity of penicillin (Zhao et al., 2002).
In efforts to find new β-lactamases inhibitors, sixteen Cameroonian medicinal plants were
investigated. Seven extracts from Mammea Africana, Garcinia lucida, Garcinia kola,
Bridelia micrantha, Ochna afzelii, Prunus aficana and Adenia lobata, presented interesting
anti-β-lactamases activities (Zhao et al., 2002; Gangoue-Pieboji et al., 2007). These plant
extracts are worthy of further investigation to isolate and identify the bioactive compounds,
which can provide useful leads in the development of new β-lactamases inhibitors.
60
329
4.3. Inhibitors of PBP 2a
The production of penicillin-binding proteins (PBPs) 2a is the most important mechanism
involved in the antibiotics resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PBPs 2a
interact with β-lactams, although much less strongly than other PBPs; modification of PBPs
seems to be the favored mechanism of β-lactam resistance in gram positive bacteria, whereas
β-lactamase production is favored in gram negative bacilli (Rice et al., 2003); the use of
inhibitors of PBP 2a is an interesting approach to overcome resistant microorganisms.
Many studies report the enhancement or restoration of β-lactams activity against MRSA
by natural compounds, including several catechins, notably the epigallocathechin gallate from
green tea, tellimagrandin (tannin) and rugosin B from Rosa canina, corilagin (tannin) from
Arctostaphylos uva-ursi, have been found to markedly reduce the MIC of β-lactams against
MRSA, effect attributed to an inhibition of either PBPs 2a activity or its production (Gibbons
et al., 2004; Hatano et al., 2005). The modulation of antibiotic resistance by inhibition of
PBPs 2a is also encountered in flavonoids, such as licoricidin and licochalcone, which
markedly reduce the MIC value of oxacillin against MRSA. It has been reported that
licoricidin does not affect the production of PBP 2a in an MRSA strain, although it might still
alter PBP 2a’s inhibitory effect on cell wall production in some way.
4.4. Other Inhibitors of Antibiotic Resistance
As the reduction of bacterial membrane permeability to antibiotics is one of the
mechanisms of resistance, restoring or enhancing the membrane permeability to antimicrobial
drugs may be an attractive mean to overcome antibiotics resistance (Nikaido, 1994). The
sesquiterpenoids nerolidol, farnesol, bisabolol, and apritone were investigated for their
abilities to enhance bacterial permeability and susceptibility to antimicrobial compounds; flow
cytometry studies suggest that enhanced permeability results from disruption of the
cytoplasmic membrane (Brehm-Stecher et Johnson, 2003). In disk diffusion assays, treatment
with low concentrations (0.5 to 2 mM) of these sesquiterpenoids enhanced the susceptibility of
Staphylococcus aureus to ciprofloxacin, clindamycin, erythromycin, gentamicin, tetracycline,
and vancomycin. Nerolidol and farnesol also sensitized Escherichia coli to polymyxin B
(Daugelavicius et al., 2000).
5. Conclusion
Antimicrobial medicinal plants play an important role in health care in traditional
medicine and could yield compounds important for modern medical practice. In developing
countries, where the impact of infectious diseases is particularly large, traditional healers
predominantly recourse to medicinal plants. From these medicinal plants, most often used for
millenia, many antimicrobial compounds have already been isolated and identified,
supporting thus their traditional uses. In modern medical practice, medicinal plants have a
major interest for their possible role in the fight against antibiotics bacterial resistance.
329
61
330
Indeed, the alarming worldwide incidence of antibiotics resistance causes an increasing need
for new compounds that can act either by a direct antimicrobial activity or by inhibiting
resistance mechanisms of microorganisms of medical importance. Compounds belonging to
several phytochemical groups and displaying an antimicrobial effect against bacteria, fungi,
viruses and parasites have been isolated from medicinal plants, promising to enrich the
arsenal of antimicrobial drugs, particularly against multi-resistant microorganisms. More
interestingly, medicinal plants provide compounds inactive by themselves, but that can
enhance or restore the activity of existing antibiotics. These compounds generally act by
inhibiting resistance mechanisms of microorganisms to antibiotics, and may permit to extend
the effective life span of currently used antibiotics or to recover antibiotics to which
microorganisms have already developed resistance. The synergistic concomitant use of
natural compounds and antibiotics can also help to reduce doses of the later in order to help
avoiding adverse side effects.
62
1.5. CORDIA GILLETII DE WILD
1.5.1. La famille des Boraginaceae
La famille des Boraginaceae comprend environ 100 genres pour 2000 espèces regroupant des
arbustes, des arbres, des plantes herbacées et des lianes (Evans, 2009). Les feuilles sont souvent
entières, simples, alternes (rarement opposées), exstipulées, et possèdent des poils rigides ; les
cellules des feuilles possèdent souvent des cristaux d’oxalate de calcium. Les fleurs, qui sont le
plus souvent hermaphrodites, ont un calice à lobes imbriqués et une corolle tubuleuse
campanulée, divisée en 5 lobes parfois relativement réduits, et souvent munie d'écailles ou de
poils au centre (Bremer et al., 2003). Les plantes appartenant à cette famille sont rencontrées
dans les régions tropicales, subtropicales et tempérées des cinq continents du globe terrestre.
Elles sont utilisées comme plantes ornementales (Echium, Myosotis, Eritrichium, etc.), pour le
bois (Cordia) ainsi que pour des propriétés médicinales ; c’est le cas de la bourrache (Borago
officinalis), la grande consoude (Symphytum officinale), la pulmonaire (Pulmonaria officinalis),
la vipérine (Echium vulgare). Cette famille contient également des plantes tinctorales (Alkanna
tinctoria) (SNHF, 1999).
La famille des Boraginaceae contient comme composants chimiques essentiellement des
naphtoquinones, l’allantoïne, les alcaloïdes pyrrolizidiniques, les acides phénoliques et les
tanins. La présence d’alcaloïdes pyrrolizidiniques suscite des inquiétudes quant à l’usage
médicinal de nombre des espèces de cette famille (Evans, 2009).
1.5.2. Le genre Cordia
Le genre Cordia est le plus vaste de la famille des Boraginaceae, il contient à lui seul environ
350 espèces et s’étend dans les régions tropicales et subtropicales des deux hémisphères,
principalement en Amérique du Nord et du Sud ; il est peu représenté en Asie et en Afrique où
l’on dénombre environ une quarantaine d’espèces. Le genre Cordia comprend principalement
des arbres à feuilles persistantes, il contient aussi des arbres pubescents et des arbustes à latex.
Son fruit est une drupe orange-rouge (Thirupathi et al, 2008).
Les fruits, les feuilles, les écorces, les graines, les racines de la plupart des plantes du genre
Cordia sont utilisés traditionnellement comme cicatrisant, astringent, anti-inflammatoire, antihelminthique, anti-malarique, diurétique, antipyrétique, suppresseur d’appétit, antitussif et pour
leurs propriétés anti-infectieuses (Thirupathi et al, 2008). Les principales classes
phytochimiques retrouvées dans le genre Cordia sont résumées dans le Tableau 1.5.1 et la
Figure 1.5.1.
63
64
Malaria, abcès
-
-
Vers intestinaux, asthme,
toux, démangeaisons
C. goetzei Gürke
C. latifolia Roxb
C. linnaei Steam
C. millenii Baker
C. globosa Jacq.
-
-
C. curassavica Jacq.
Fatigue
-
C. boissieri A. DC.
C. dewevrei De Wild
-
Fatigue, plaies, fracture
C. africana Lam
C. alliodora Oken
Usages traditionnels
Espèces
-
Antifongique et larvicide
Nématicide, antiulcéreux,
antihistaminique
Antifongique
Antiparasitaire, vasodilatateur et
spasmolytique
-
Antimicrobien, larvicide,
antiinflammatoire
Antimicrobien
Antimicrobien, larvicide
-
Activités biologiques
Tableau 1.5.1. Usages, propriétés biologiques et phytochimie des espèces du genre Cordia
-
-
Dérivés de naphtoquinones
Acides gras, stérols, flavonoïdes, triterpènes
Flavonoïdes
-
Cordiaquinones (A,J,K), flavonoïdes,
triterpènes, sesquiterpènes
-
Alliodorine, hydroquinone,
phenylpropanoïde
-
Métabolites secondaires isolés
(Neuwinger, 2000)
(Ioset et al., 1998)
(Akhtar et Ahmad, 1995;
Begum et al., 2011)
(Neuwinger, 2000)
(Alencar de Menezes et al.,
2005; Vieira et al., 2008)
(Neuwinger, 2000)
(Ioset et al., 2000b; Bayeux et
al., 2002)
(Salazar-Aranda et al., 2009)
(Ioset et al., 2000a)
(Neuwinger, 2000)
Références
65
-
-
C. verbenacea D.C.
Fièvre, malaria,
conjonctivite,
dysménorrhée
C. sinensis Lam
C. spinescens L.
Diverses douleurs
C. senegalensis Juss
Anti-inflammatoire,
antimicrobienne, anti-ulcéreux
Antivirale
Anticancéreux
-
Anti-HSV1, antifongique,
larvicide
C. salicifolia Cham
-
Anti-inflammatoire
Trypanosomiase, plaies
Antimicrobienne
-
Activités biologiques
C. obliqua Willd.
C. myxa L
-
Douleurs abdominales,
vomissements, plaies,
fièvre
C. monoica Roxb
C. monosperma Jacq.
Usages traditionnels
Espèces
-
Flavonoïdes, tanins, mucilage
artemetine, acides rosmarinique
monoterpènes, sesquiterpènes
Rosmarinate de magnésium, rosmarinate de
calcium
Alcaloïdes pyrrolizidiniques
naphtoquinones
Toxifolin-3,5-dirhamnoside
Alcaloïdes pyrrolizidiniques
-
-
Composition chimique
Tableau 1.5.1. Usages, propriétés biologiques et phytochimie des espèces du genre Cordia (suite)
(Sertie et al., 1988; de Carvalho
et al., 2004; Ticli et al., 2005)
(Matsuse et al., 1999)
(Wassel et al., 1987;
Neuwinger, 2000)
(Kerharo, 1973)
(Hayashi et al., 1990)
(Tiwari et Srivastava, 1979)
(Kerharo, 1973; Wassel et al.,
1987)
(de Souza et al., 2004)
(Neuwinger, 2000)
Références
1,4,11 trihydroxyoppositane (sesquiterpène), C. trichotoma
1,4,6 trihydroxyeudesmane (sesquiterpène), C. trichotoma
Abietane diterpène, C. latifolia
Cordialine (triterpène), C. multispicata
Cabraleadion (triterpène), C. spinescens
Lupa-20,29 ene 3-O-β-d-maltoside (triterpène), C. obliqua
Cordiaquinone A (naphtoquinones), C. curassavica
Cordiaquinone K (naphtoquinones), C. curassavica
Sphingolipides, C. platythyrsa
Floridanine (alcaloïde), C. sinensis
Acide 3 (2’, 4’,5’ trimethoxyphenyl) propanoïque, C. alliodora
7-methoxyflavone (flavonoïde), C.macleodii
Rufescidride (lignane), C. rufescens
2-(3-hydroxy-3,7-diméthylocta-2,6diényl)-1,4-benzènediol
(Hydroquinone prénylée), C. alliodora
Figure 1.5.1. Structures chimiques de principaux représentants des composés
phytochimiques repris au Tableau 1.5.1. et isolés du genre Cordia
66
Figure 1.5.2. Distribution géographique du genre Cordia (Mobot, Missouri Botanical Garden)
1.5.3. L’espèce Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Figure 1.5.3. Photo de Cordia gilletii De Wild (Photo prise à Kisantu, RDC, en janvier 2009)
67
1.5.3.1. Description botanique
Cordia gilletii, un arbre pouvant atteindre 15 m de hauteur, possède des feuilles simples,
alternes, avec limbe elliptique ou obovale, arrondies ou cordées à la base, de 6-20 x 3-9,5 cm,
avec une face inférieure densément pubescente ; il y a absence de stipules. Il porte des fleurs
hermaphrodites, jaunes, avec calice fortement côtelé, tomenteux, une corolle tubuleuse de 1621 mm de long et des étamines 4-5. Ses fruits sont des drupes.
1.5.3.2. Répartition géographique
Selon la base de données WCMC (World Conservation Monitoring Centre) du Programme
des Nations Unies pour l’Environnement (PNUE), l’espèce Cordia gilletii a une distribution
géographique restreinte à la République Démocratique du Congo.
Figure 1.5.4. Carte de la République Démocratique du Congo (Ritimo, 2008)
1.5.3.3. Caractères microscopiques
Dans le but de fournir une description permettant d’identifier les feuilles et les écorces de
racines de Cordia gilletii par les caractères microscopiques, nous avons réalisé des
préparations des poudres de ces deux parties de plante dans le réactif de Steinmetz. Ces
préparations ont été observées au microscope optique (grossissement 100 et 400) et les
éléments suivants ont été observés : (i) Pour les écorces de racines (Figure 1.5.5) ; des grains
68
d’amidon, des vaisseaux ponctués et des fibres cristallifères. (ii) Pour les feuilles (Figure
1.5.6) ; des cellules striées de l’épiderme avec des stomates paracytiques, des poils, des
vaisseaux scalariformes et des poils cystolytiques
Fibre
Fibre cristallifère
Vaisseau ponctué
Vaisseau ponctué et grains d’amidon
Parenchyme
Suber
Figure 1.5.5. Eléments microscopiques de la poudre d’écorces de racines de Cordia gilletii
observés dans le réactif de Steimetz.
69
Poil
Poils
Epiderme avec stomates paracytiques
Poils cystolithiques
Vaisseau scalariforme
Epiderme avec stomates paracytiques
Figure 1.5.6. Eléments microscopiques de la poudre de feuilles de Cordia gilletii observés
dans le réactif de Steimetz.
70
1.5.3.4. Usages médico-traditionnels
Ecorces de racines
Feuilles
Figure 1.5.7. Drogues séchées de Cordia gilletii De Wild
Les écorces de racines sont traditionnellement utilisées pour traiter les maladies cutanées
(application locale), les plaies (application locale), le paludisme (décoction) et les maladies
diarrhéiques (décoction) dans la région du Bas-Congo (Rép. Dém. Du Congo). Tandis que la
décoction des feuilles est utilisée comme fébrifuge et antipaludique dans la même région
(Kambu, 1990). Ces différents usages se rencontrent également dans d’autres espèces du
genre Cordia (Tableau 1.5.1).
71
72
1.6. LES ALCALOIDES PYRROLIZIDINIQUES
Nous présentons dans cette section les alcaloïdes pyrrolizidiniques, car la plante faisant l’objet
de notre travail, Cordia gilletii De Wild, est susceptible d’en contenir vu qu’elle appartient à
la famille botanique de Boraginaceae, une des principales sources de ces alcaloïdes (Ober and
Hartmann, 1999).
Les alcaloïdes pyrrolizidiniques (APs) sont des métabolites secondaires dont la structure de
base est le noyau pyrrolizidine (Figure 1.6.1). Leur rôle biologique dans les plantes n’est pas
élucidé, ils constitueraient des moyens de dissuasion des plantes envers les insectes
herbivores. Les APs sont principalement présents dans les familles botaniques des
Boraginacae, Asteraceae, Orchidaceae et Fabaceae. Plus de 95% de plantes contenant les APs
appartiennent à ces quatre familles (Ober and Hartmann, 1999).
Généralement, les APs sont des esters des méthylpyrrolizidines hydroxylés, constitués d’une
base nécine et d’un acide nécique. La base nécine peut être insaturée (en position 1-2) ou
saturée. Les APs peuvent se retrouver dans les plantes sous forme de base ou sous forme de
N-oxyde, les deux formes existent souvent ensemble dans les plantes (Rosemann, 2006).
Platynécine
Retronécine
Otonécine
N-oxyde
Noyau pyrrolizidine
Figure 1.6.1. Noyau pyrrolizidine et types de bases nécines
Le risque potentiel de ces alcaloïdes sur la santé humaine peut provenir de : (i) L’utilisation
des plantes en contenant comme remèdes, cas de Petasites hybridus (L.) Gaertn (Asteraceae),
plante utilisée depuis plus de 2000 ans comme relaxant musculaire et contre les coliques, les
spasmes du tractus uro-génital, la toux et la dysménorrhée. Si les sesquiterpènes sont
considérés comme les principes actifs majeurs de cette plante, celle-ci contient aussi les APs
toxiques. D’où la nécessité de limiter la consommation de ce type de remèdes. En Allemagne
par exemple, la consommation en APs est restreinte à 1 µg par jour pour un usage de
73
maximum 6 semaines par année ; ou 0,1 µg par jour pour un usage de plus de 6 semaines par
année. (ii) La contamination de la chaîne alimentaire, cas de lait produit par des animaux
ayant consommé des plantes contenant des APs (Dickinson et al., 1976), les poules peuvent
aussi transférer les APs aux œufs après avoir ingéré des grains contaminés (Edgar and Smith,
2000), des fortes concentrations en APs peuvent également être trouvées dans le miel (Kempf
et al., 2010). Par contre, il est peu probable de trouver les APs dans les viandes, vu qu’ils sont
rapidement éliminés des tissus (Rosemann, 2006)
Les APs peuvent présenter une toxicité aigue, qui se manifeste par une vaso-occlusion
hépatique menaçant le pronostic vital. La toxicité chronique se traduit par des dommages au
niveau du foie, des poumons, des vaisseaux sanguins, des reins, du tractus gastro-intestinal,
du pancréas et de la moelle osseuse.
Pour pouvoir exercer cette toxicité, les APs doivent avoir dans leurs structures les éléments
suivants : (i) Une insaturation en position 1 – 2 du noyau pyrrole ; (ii) un ou deux hydroxyles
attachés au noyau pyrrol par un carbone ; (iii) présence d’une chaîne ramifiée dans la partie
acide; (iv) au moins un de ces hydroxyles doit être estérifié, les diesters étant plus toxiques
que les monoesters (Rosemann, 2006).
Figure 1.6.2. Eléments structuraux indispensables pour la toxicité des APs. : (1) Une insaturation en position 1 –
2 du noyau pyrrol ; (2) un ou deux hydroxyles attachés au noyau pyrrol par un carbone ; (3) présence d’une
chaîne ramifiée dans la partie acide ; (4) au moins un de ces hydroxyles doit être estérifié, les diesters étant plus
toxiques que les monoesters.
74
2. OBJECTIFS DU TRAVAIL
75
76
Ce travail a pour but d’étudier l’effet antimicrobien de Cordia gilletii De Wild
(Boraginaceae), une plante utilisée traditionnellement à l’Ouest de la République
Démocratique du Congo contre diverses pathologies dont les maladies infectieuses. Etant
donné que les résistances aux antibiotiques se développent de façon alarmante, il apparaît
nécessaire d’envisager plusieurs approches dans le traitement des maladies infectieuses. Ainsi
l’effet antimicrobien de C. gilletii sera-t-il abordé sur différents aspects : activité
antimicrobienne directe (tuer les agents infectieux ou inhiber leur croissance), activité
antimicrobienne indirecte (inhiber les mécanismes de résistance aux antibiotiques), effet sur le
quorum sensing (atténuer la virulence des agents infectieux). D’autres activités biologiques
(antioxydante, antiplasmodiale et anticholinesterase) seront également étudiées en vue de
justifier certains usages traditionnels de cette plante.
Ce travail s’articulera autour des points suivants :
Ø Evaluation de l’activité antimicrobienne directe et indirecte et de l’effet antioxydant
des extraits de Cordia gilletii
Ø Optimisation de la détection des composés antimicrobiens après chromatographie sur
couche mince couplée à la bioautographie
Ø Fractionnement des extraits actifs afin d’isoler et d’identifier les molécules
responsables de l’activité
Ø Evaluation de l’activité antiplasmodiale et de l’effet sur le quorum sensing
Ø Analyse de la composition chimique et évaluation de l’activité antioxydante et
anticholinestérase de l’huile essentielle des feuilles de C. gilletii
Ø Recherche d’alcaloïdes pyrrolizidiniques en vue de s’assurer de l’innocuité des
extraits de C. gilletii.
77
78
3. MATERIEL ET METHODES
79
80
3.1. Matériel
3.1.1. Matériel végétal
Les feuilles et les écorces de racines de Cordia gilletii De Wild ont été récoltées en janvier
2005 dans la région de Kisantu (République Démocratique du Congo, latitude sud 05° 07’,
longitude est 15° 06’), lavées et séchées à la température ambiante sous ombre. L’identité de
la plante a été confirmée au Jardin Botanique National de Meise (Belgique) où un specimen a
été déposé sous le numéro BR-S.P. 627 986.
3.1.2. Solvants, réactifs et milieux de culture
Les solvants utilisés dans ce travail sont les suivants : n-hexane, dichlorométhane, acétate
d’éthyle, méthanol, DMSO, chloroforme, pétroléine, éther diéthylique, chloroforme deutéré.
Tous ces solvants étaient de grade analytique et fournis par Sigma-Aldrich (Saint Louis,
USA).
Les réactifs que nous avons utilisés étaient obtenus de Sigma-Aldrich (Saint Louis, USA)
pour l’iodure de potassium, la vanilline, l’anisaldéhyde, l’acide sulfurique, l’hydroxyde de
potassium, le polyéthylèneglycol 400, le chlorure ferrique, le DPPH, la quercétine ; de FlukaBiochemika pour le méthytétrazolium ; de Merck pour le chlorure de sodium, le caronate de
sodium ; de MP Biochemicals pour le 3-N-morpholino propanesulfonique (MOPS).
Les milieux de culture étaient obtenus de Oxoid (Hampshire, UK) pour le bouillon et l’agar
de Mueller Hinton, le TSA, le bouillon lysogène (LB) ; de MP Biochemicals pour le RPMI1640.
3.1.3. Microorganismes et parasites
Les souches utilisées pour les tests antimicrobien et antiparasitaire comprennent les bactéries
à gram positif (Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus C100450 et
Staphylococcus aureus C98506), les bactéries à gram négatif (Escherichia coli ATCC 11229,
Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, Klebsiella pneumoniae C139186, Enterobacter cloacae C136349,
Proteus mirabilis C126995 et Serratia marcenscens C135352), un champignon (Candida
albicans ATCC 10231) et un parasite (Plasmodium falciparum 3D7). Les souches ATCC
nous ont été fournies par le Laboratoire de Microbiologie Pharmaceutique de l’Université
Libre de Bruxelles (M. Devleeschouwer), les souches avec l’initiale C ont été gracieusement
81
mises à notre disposition par le Centre Hospitalier Universitaire de Charleroi (D. Fammerée et
G. Lerson). La souche de P. falciparum nous a été fournie par le Musée National d’Histoire
Naturelle de Paris (Professeur Grellier).
3.1.4. Chromatographie
·
Plaques CCM analytique (10 x 20 cm) : gel de silice 60F254 (Merck)
·
Plaques CCM préparative (20 x 20 cm, préparées au laboratoire) : un mélange 1/1 de
gels de silice 60F254 et 60PF254 (Merck) dans l’eau est coulé sur des plaques de verre ;
l’épaisseur de la couche étant de 0,5 mm.
·
Chromatographie sur colonne ouverte : colonnes en verre (diamètres : 2,5 et 5 cm), gel
de silice 40-63 µm (Merck)
·
Chromatographie Flash : appareil Intelliflash 280 (Analogix, USA) ; cartouches
SuperFlash (15-12 g, Interchim, Montluçon, France).
3.2. Méthode
3.2.1. Extraction et criblage phytochimique préliminaire
Les poudres de feuilles et des écorces de racines ont été épuisées successivement par les
solvants suivants : n-hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle, méthanol et eau. Les
solutions obtenues ont été concentrées (sous pression réduite à 40°C) puis évaporées à sec
(Speed Vac).
Le criblage chimique préliminaire a été réalisé par CCM (Wagner and Bladt, 1996) ainsi que
par des réactions chimiques en solution (Longanga Otshudi et al., 2000). Les principaux
réactifs utilisés pour mettre en évidence la présence des métabolites secondaires sont : réactif
de Dragendorff (recherche d’alcaloïdes), anisaldéhyde – acide sulfurique (recherche de
terpénoïdes), diphénylborinate / PEG 400 (recherche de flavonoïdes), hydroxyde de
potassium (recherche d’anthraquinones), chlorure ferrique (recherche de tanins).
3.2.2. Activité antibactérienne directe
L’activité antimicrobienne directe a été réalisée par la méthode de microdilution sur bouillon.
Les extraits ont été dissous dans du DMSO (20 mg / 250 µl) puis dilués à 5 ml dans du
bouillon de Mueller Hinton (test antibactérien) ou dans du RPMI-1640 (test antifongique), la
82
concentration finale de DMSO étant de 5 %. Cette solution a été transférée dans des plaques
96 puits (200 µl / puits) et des dilutions ½ en série ont été opérées avec du bouillon de
Mueller Hinton ou du RPMI-1640. Des cultures microbiennes de 24 h ont été suspendues
dans une solution de Na Cl 0,9 % de façon à obtenir une turbidité de 0,5 Mc Farland (108
bactéries/ml, 106 champignons/ml), ces suspensions ont été diluées 1/100, et inoculées dans
les plaques 96 puits contenant les dilutions d’extraits de plante. Après 24 h d’incubation à
37°C (bactéries) ou 28°C (champignons), la concentration minimale inhibitrice (CMI) a été
déterminée comme étant la plus faible concentration d’extrait qui inhibe complètement la
croissance des microorganismes. La concentration minimale bactéricide (CMB) ou fongicide
(CMF) a été déterminée en incubant les puits de croissance négative sur du TSA (Tryptic Soy
Agar) et considérée comme la plus faible concentration qui donne des sous-cultures négatives.
Dans le but de chercher une éventuelle synergie, des combinaisons entre extraits de Cordia
gilletii et antibiotiques ont été testées, permettant ainsi de calculer l’index FIC selon la
formule :
La valeur obtenue pour l’index FIC (ΣFIC) a permis de qualifier les associations testées de
synergique (ΣFIC < 0.5), d’additive (0.5 < ΣFIC < 1), d’indifférente (1 < ΣFIC index < 2) ou
d’antagoniste (ΣFIC > 2) (Mackay et al., 2000).
3.2.3. Activité antibactérienne indirecte
Cette activité a été recherchée par les méthodes de diffusion sur agar et de microdilution sur
plaques 96 puits. Pour la première méthode, les extraits de C. gilletii ne possédant pas
d’activité antimicrobienne directe sur les souches MRSA (S. aureus C100459 et S. aureus
C98506) ont été dissous dans du DMSO (25 mg/ml), la solution a été incorporée dans l’agar
fondu de Mueller Hinton à 50°C (1 ml de solution de l’extrait dans le DMSO + 99 ml d’agar
fondu ; concentration finale de DMSO, 1 %), puis l’agar contenant l’extrait a été coulé dans
des boîtes de Pétri, refroidi à température ambiante jusqu’à solidification et conservé à 4°C
jusqu’à utilisation. Des boîtes de Pétri avec l’agar de MH ainsi que 5% de DMSO dans l’agar
de MH ont servi de contrôle. Les boites de Pétri ainsi préparées ont été ensemencées avec le
MRSA, des disques d’antibiotiques y ont été déposés. Après 24h d’incubation à 37°C, les
diamètres d’inhibition éventuelle ont été mesurés à l’aide d’un pied à coulisses. Pour la
seconde méthode, les extraits inactifs sur le MRSA ont été dissous dans le DMSO
83
(25 mg/ml), puis dilués dans le bouillon de Mueller Hinton (1 ml de solution de l’extrait dans
le DMSO + 61.5 ml de bouillon de MH ; la concentration en DMSO est 1,6%). Le milieu
ainsi préparé a servi à déterminer la CMI des antibiotiques comme décrit ci-haut, les contrôles
réalisés avec le bouillon seul et le bouillon contenant 5% de DMSO permettant de constater
s’il y a un effet indirect (diminution de la CMI de l’antibiotique).
3.2.4. CCM-Bioautographie
La réalisation de la CCM-bioautographie, une technique simple permettant de détecter des
composés antimicrobiens sur une plaque de CCM, demande un milieu suffisamment fluide
pour permettre la préparation de la suspension microbienne et le coulage sur la plaque et
pouvant solidifier à température ambiante afin d’adhérer à la plaque tout en gardant une
certaine quantité d’eau. L’agar fondu et le bouillon de Mueller Hinton ne répondant pas à ces
exigences, nous avons optimisé le milieu en utilisant la combinaison bouillon – agar dans les
proportions 9/1 ; les détails de cette optimisation sont renseignés dans la section 4.3. Les
chromatographies sur couche mince ont été réalisées en deux exemplaires : l’un comme
chromatogramme de référence visualisé sous UV (254 et 365 nm) ou par pulvérisation du
réactif vanilline - acide sulfurique et l’autre pour la bioautographie. 10 µl des solutions
d’extraits de plantes 1 mg/ml ont été déposés sur la plaque chromatographique, puis élués par
un système de solvants adéquat. Après migration, la plaque a été séchée, puis la suspension
bactérienne dans le mélange MH bouillon/agar à 37°C a été coulée aseptiquement sur la
plaque. Après solidification du milieu à température ambiante, la plaque a été placée dans
l’étuve à 37°C pendant 24 heures. Une solution stérile de MTT 0,8 mg/ml a alors été
pulvérisée sur la plaque, celle-ci a de nouveau été incubée à 37°C pendant 3 heures. Les zones
d’inhibition, caractérisées par une couleur claire sur fond sombre, ont indiqué la présence des
substances actives. Pour les extraits ne possédant pas d’activité antibactérienne directe, une
concentration sub-inhibitrice d’antibiotique (2 µg/ml pour la pénicilline G, sa CMI vis-à-vis
des souches de MRSA testées étant de 8 µg/ml) a été ajoutée au mélange MH bouillon/agar
pour réaliser la bioautographie.
3.2.5. Activité antioxydante
L’activité antioxydante a été déterminée par un test au diphénylpicrylhydrazyl (DPPH). La
molécule de 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyl (DPPH) est un radical libre stable en vertu de la
délocalisation de son électron libre sur la molécule. Cette délocalisation donne lieu à une
coloration mauve. Lorsque la solution de DPPH est mise en contact avec une substance
84
pouvant donner un atome d’hydrogène, il y a formation de la forme réduite avec perte de la
coloration mauve et apparition de la coloration jaune (Pandey et al., 2005).
Différents dilutions d’extraits de plantes dans du méthanol (10 µl ; 500 à 1,95 µg/ml) ont été
mises en contact avec 200 µl d’une solution méthanolique de 0,004% de DPPH dans des
plaques 96 puits. Après 30 minutes dans l’obscurité, les absorbances ont été mesurées à l’aide
du lecteur de plaques Labsystems iEMS reader/dispenser (Labsystems, Finlande) à 540 nm
en utilisant le méthanol comme blanc. La CI50, la concentration de l’extrait de plante qui
piège 50% du radical libre DPPH, a été déterminée par ajustement aux points expérimentaux
d’une fonction à deux paramètres : N = N0 . e-kC (où C est la concentration en µg/ml, N le
pourcentage d’inhibition ; N0 le pourcentage de DPPH à la concentration 0 et k sont les
paramètres de l’équation). Les résultats ont été exprimés en équivalent-quercétine qui est le
rapport entre la CI50 de la quercétine (composé actif de référence) et la CI50 de l’extrait testé.
3.2.6. Activité antiplasmodiale
Ce test a été réalisé sur la souche P. falciparum 3D7 maintenue en culture à 37°C dans des
globules rouges humains (Centre de transfusion sanguine de la Croix Rouge de Belgique)
sous une atmosphère composée de 5 % de CO2, 5 % de O2 et 90% de N2. Les extraits de C.
gilletii ou les composés purs ont été dissous dans le DMSO à une concentration de 10 mg/ml
ou 5 mg/ml respectivement. La culture de P. falciparum a été mise en contact avec une série
de 8 dilutions ½ de chaque extrait ou composé dans deux colonnes d’une plaque 96 puits, les
concentrations finales des produits testés allant de 100 à 0,8 µg/ml ou de 50 à 0,4 µg/ml pour
les extraits et les composés purs respectivement. La mesure de l’inhibition de la prolifération
parasitaire a été réalisée par une méthode colorimétrique exploitant la lactate déshydrogénase
du P. falciparum (pLDH). En effet, la pLDH a la capacité d’utiliser l’APAD (3-acétylpyridine
adénine dinucléotide) comme coenzyme dans la transformation de lactate en pyruvate, alors
que cette réaction est environ 300 fois plus lente avec la lactate déshydrogénase humaine en
présence du même coenzyme. Après 48 h d’incubation, les plaques 96 puits sont congelées
pendant environ 24 h, puis décongelées à 37°C pendant 45 minutes. Après homogénéisation,
20 µl de chaque puits ont été transférés dans une nouvelle plaque 96 puits et 100 µl de la
solution I (1g de lactate de lithium, 10 mg de saponine, 50 mg d’APAD, 1 ml de Triton-X 100
et 100 ml de tampon Tris pH 8) ont été ajoutés à chaque puits. La nouvelle plaque 96 puits est
incubée à 37°C pendant 15 minutes, puis 20 µl d’un mélange à parties égales de la solution II
(Phénazine éthosulfate à 0,1 mg/ml dans du tampon Tris pH 8) et de la solution III
(Nitritetrazolium blue chloride à 2 mg/ml dans l’eau) ont été ajoutés à chaque puits. La plaque
85
est de nouveau incubée à 37°C pendant 45 minutes avant de mesurer l’absorbance de chaque
puits à 630 nm à l’aide du spectrophotomètre Stat Fax (Fisher Bioblock, USA). Le sel de bleu
de tétrazolium incolore est transformé en formazan de coloration bleue. L’intensité de cette
coloration est proportionnelle à la quantité d’enzymes présents dans le milieu et par
conséquent au nombre de parasites.
3.2.7. Etude préliminaire de l’effet sur le Quorum sensing
De nombreuses bactéries pathogènes produisant des facteurs de virulence sous le contrôle du
quorum sensing (QS), inhiber celui constitue un moyen efficace d’atténuer la virulence des
agents infectieux. C’est pourquoi nous nous sommes intéressé à évaluer l’effet des extraits de
C. gilletii sur la production des facteurs de virulence chez Pseudomonas aeruginosa, une
espèce connue comme la cause majeure des infections nosocomiales. Les extraits ont été
testés sur la production de la pyocyanine ainsi que sur l’expression de deux des gènes
impliqués dans le QS (lasB et rhlA) et un gène contrôle n’intervenant pas dans le QS (aceA).
Pour évaluer l’effet sur la production de la pyocyanine, la souche P. aeruginosa PAO1 a été
cultivée pendant 18 h dans 5 ml de milieu LB-MOPS (37°C et agitation 175 rpm), les cellules
ont été ensuite lavées deux fois avec du milieu LB-MOPS frais afin d’éliminer les homosérine
lactones. Dans une plaque 24 puits, 50 µl de suspension de cellules ont été ajoutés à 940 µl de
LB-MOPS de façon à avoir une absorbance à 600 nm de 0,020 à 0,025 correspondant à
environ 107 CFU/ml et 10 µl d’extrait de C. gilletii dissous dans le DMSO (10 mg/ml) ont été
ajoutés à cette suspension. Après 18 h d’incubation (37°C, 175 rpm), 900 µl de suspension
bactérienne de chaque puits ont été transférés dans des tubes Eppendorf de 2 ml, puis
centrifugés à 16000 g pendant 1 minute. Puis 700 µl de surnageant ont été mis en contact avec
500 µl de chloroforme dans de nouveaux tubes. Après avoir agité sur vortex et centrifugé pour
séparer les deux phases, la phase chloroformique contenant la pyocyanine a été transférée
dans un nouveau tube Eppendorf, et 300 µl d’acide chlorhydrique 0,2 N ont été ajoutés à ce
tube pour extraire la pyocyanine. 200 µl de phase aqueuse ont ensuite été transférés dans une
plaque 96 puits, et l’absorbance a été mesurée à 380 nm à l’aide du spectrophotomètre Spectra
Max M2 (Molecular Devices) pour quantifier la pyocyanine produite par la bactérie.
L’effet sur l’expression des gènes lasB, rhlA et aceA a été réalisé avec des souches de
bactéries portant un plasmide contenant le promoteur et une partie du gène d’intérêt fusionné
avec un gène rapporteur permettant de quantifier l’activité du promoteur ; ces souches sont
dites « rapportrices ». Ainsi le gène rapporteur lacZ (codant pour la β-D-galactosidase) a été
86
fusionné aux gènes lasB et rhlA (gènes impliqués dans la régulation du mécanisme de QS)
ainsi qu’au gène aceA (gène constitutif indépendant du mécanisme de QS). Les souches
rapportrices ont été cultivées comme décrit pour la quantification de la pyocyanine. Après 18
h d’incubation de la suspension bactérienne (obtenue avec 50 µl de suspension de la souche
rapportrice, 940 µl de LB-MOPS et 10 µl de l’extrait à tester à 10 mg/ml), 100 µl de cette
suspension sont dilués 4,8 et 16 fois dans un tampon de perméabilisation dans des plaques 96
puits. Après 15 minutes d’incubation, 20 µl de chacune des dilutions sont transférés dans une
autre plaque 96 puits contenant 120 µl de substrat o-NPG (ortho-nitrophényl-β-Dgalactoside). La réaction est incubée entre 5 et 60 minutes à 37°C en fonction de l’évolution
de la réaction. Cette dernière est ensuite stoppée avec 150 µl de solution de Na2CO3 1M.
L’intensité de la coloration représentant l’activité LacZ est mesurée à 420 et 550 nm en
transférant 200 µl de réaction dans des plaques 96 puits. L’activité LacZ est calculée par
l’expression suivante :
Abs420 : absorbance du o-nitrophenol ; Abs550 : mesure des débris cellulaires qui, multipliée
par 1,75 donne une valeur approximative de leur impact sur l’absorbance à 420 nm ; t : temps
d’incubation de réaction en minutes ; v : volume de la suspension bactérienne en ml ; d :
facteur de dilution ; Abs600 : densité bactérienne
3.2.8. Fractionnements et isolements
Dans le but d’identifier les composés actifs et de réaliser une étude phytochimique de Cordia
gilletii, deux extraits d’écorces de racines ont été retenus car ayant présenté les meilleures
activités antimicrobiennes indirecte (extrait n-hexanique) et directe (extrait méthanolique).
1,2 g d’extrait n-hexanique a été fractionné par chromatographie sur colonne ouverte (gel de
silice 40-63 µm, Merck ; diamètre 2,5 cm ; hauteur 30 cm) en éluant avec la pétroléine
contenant des volumes croissants d’éther diéthylique (0 à 100%). Des fractions de 100 ml
chacune ont été récoltées, analysées par CCM pour être combinées en dix fractions (Figure
3.2.1).
87
Figure 3.2.1. CCM de dix fractions obtenues de l’extrait n-hexanique d’écoreces de racines
de C. gilletii. Phase stationnaire : gel de silice 60F254. Phase mobile : pétroléine/éther
diéthylique/acide acétique (90/10/1). Révélation : vanilline – acide sulfurique.
La fraction 7 ayant présenté un effet antimicrobien indirect a été soumise à une
chromatographie flash sur une colonne pré-remplie de gel de silice (40-63 µm) dans des
cartouches en polyéthylène (SuperFlash, 15-12 g, Interchim, Montluçon, France) en éluant
avec du n-hexane contenant des volumes croissants d’acétate d’éthyle (0 à 100% en 20
minutes). Un composé (24 mg) a pu être isolé et purifié par CCM-préparative sur gel de silice
60 F254 en éluant avec le mélange n-hexane / acétate d’éthyle / acide acétique (80/20/2). Dans
les mêmes conditions de chromatographie flash et de CCM-préparative, un composé (32 mg)
a été isolé et purifié de la fraction 3, ce composé n’a cependant pas montré d’activité
antimicrobienne directe, ni indirecte.
L’extrait méthanolique d’écorces de racines (33,1 g) a été soumis au fractionnement sur
colonne ouverte (gel de silice 40-63 µm, Merck ; diamètre 5cm ; hauteur 30 cm) en éluant
avec du dichlorométhane contenant des proportions croissantes de methanol (0 à 100%, 300
ml par fraction). Ce fractionnement a été bio-guidé par l’activité antibactérienne sur la souche
S. aureus ATCC 6238 réalisée par CCM-bioautographie telle que décrite dans la section 3.2.6.
L’analyse par CCM a permis de regrouper les éluats en neuf fractions parmi lesquelles les
cinq premières ont montré un effet sur S. aureus ATCC 6538 (Tableau 3.2.1).
88
Tableau 3.2.1. Fractionnement bio-guidé de l’extrait méthanolique
MIC (µg/ml)
S. aureus ATCC 6538
CCM-bioautographie
nombre de spots
Fraction 1
62
3
Fraction 2
16
2
Fraction 3
62
1
Fraction 4
32
2
Fraction 5
125
1
Fraction 6
> 500
0
Fraction 7
> 500
0
Fraction 8
> 500
0
Fraction 9
> 500
0
La fraction 3, montrant un seul spot actif en CCM-bioautographie, a été soumise à une
chromatographie flash sur gel de silice 40-63 µm dans des cartouches en polyéthylène
(SuperFlash, 15-12 g, Interchim, Montluçon, France) en éluant avec du n-hexane contenant
des volumes croissants d’acétate d’éthyle (0 à 100% en 20 min, puis 100% pendant 10 min).
Un composé actif (2,1 mg) a été isolé et purifié par CCM préparative sur gel de silice 60 F 254
en éluant avec le mélange dichlorométhane / méthanol (90/10).
3.2.9. Méthodes spectroscopiques
Spectrométrie de masse : Les composés à analyser ont été dissous dans du méthanol pour
une concentration de 1 mg/ml, ces solutions ont ensuite été diluées 1/100 (10 µg/ml). Les
spectres de masse ont été obtenus via un Quadripôle Time-of-Flight (TOF) LC/MS Agilent
6520, équipé d'une source ESI (en mode positif). Les composés (2 µl de solution) ont été
directement infusés via une phase mobile MeOH/ Eau acidifiée avec acide formique 0.2%
(50/50) à un débit de 0.4 ml/min. Les données ont été acquises avec les paramètres suivants :
source ESI, mode positif, voltage capillaire (Vcap) : 3500 V; température du gaz (N2): 325°
C; intervalle de masses: 100-1600 m/z.
En électrospray, les ions sont générés sous pression atmosphérique. L’échantillon en solution
pénètre la source d’ions via un capillaire en acier inoxydable entouré d’un flux coaxial
89
d’azote, appelé gaz nébuliseur. L’extrémité du capillaire est maintenue à une tension élevée
par rapport à une contre-électrode, la différence de potentiel produit un gradient de champ
pouvant atteindre 5 kV/cm. Un aérosol de gouttelettes chargées se forme lorsque la solution
quitte le capillaire, le flux de gaz nébuliseur dirige les effluents vers le spectromètre de masse.
Dans l’aérosol, la taille des gouttelettes diminue avec l’évaporation du solvant, la
concentration en ions chargés augmentant en conséquence. Quand la répulsion électrostatique
entre les ions atteint un point critique, les gouttelettes subissent une « explosion
Coulombienne » qui libère les ions de la phase vapeur, et ces ions seront focalisés vers
l’analyseur de masse (Sylverstein, 2008).
Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) : Les composés analysés ont été
dissous dans du chloroforme deutéré contenant du tétraméthylsilane (référence pour le
déplacement chimique). Les spectres RMN (1H, 13C, Dept90, Dept135) ont été relevés sur
les appareils suivants : Bruker Avance 300 MHz, 400 MHz.
Le spectre RMN 1H renseigne sur le nombre et le type de protons présents dans l’échantillon.
Le spectre RMN 13C donne des informations sur le nombre et le type de carbones. Des
données structurales supplémentaires sont fournies par les spectres de type DEPT
(Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer) ; ainsi le DEPT-135 montre des
signaux positifs pour CH et CH3, et des signaux négatifs pour CH2 ; tandis que le DEPT-90 ne
montre que des signaux positifs correspondant aux CH ; les C quaternaires n’apparaissent pas
dans les spectres de type DEPT. Le spectre de type APT (Attached Proton Test) donne des
signaux positifs pour CH et CH3, et des signaux négatifs pour CH2 et les C quaternaires
(Silverstein, 2008).
3.2.10. Recherche d’alcaloïdes pyrrolizidiniques
Environ 12 g de matériel végétal ont été degraissés avec de la pétroléine à l’aide d’un appareil
Soxelet pendant 6 h. La poudre degraissée a ensuite été extraite avec du méthanol au Soxelet
pendant 6 h. L’extrait obtenu a été évaporé à sec et le résidu suspendu dans l’acide
chlorhydrique 1N, puis lavé avec du dichlorométhane ; la phase aqueuse acide a ensuite été
divisée en deux parties égales. Une moitié a été alcalinisée avec de l’ammoniaque 25% puis
appliquée sur une colonne Extrelut Merck (1 ml d’extrait / g d’Extrelut), et l’élution a été
réalisée avec du dichlorométhane ; après évaporation du solvant, le résidu a été dissous dans
du méthanol. Pour la recherche des APs qui sont sous forme N-oxyde, l’autre moitié a été
réduite avec la poudre de zinc (environ 0,3 g) pendant 4h, puis traitée comme la première
90
moitié (voir ci-haut) ; l’efficacité de la réduction étant assurée en incubant avec une quantité
supplémentaire de zinc chaque fois que la formation des bulles d’hydrogène n’était plus
visible.
Les extraits obtenus ont été soumis à la chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie
de masse (GC-MS) dans le but d’identifier et de quantifier les APs. La GC-MS est en effet
fréquemment utilisée pour l’analyse des mélanges complexes des APs, identifiant les
composés à l’aide des indices de retention (RIs) et des fragments spécifiques retrouvés dans
leurs spectres de masse. La combinaison de ces deux paramètres permet d’une part d’avoir
suffisamment d’informations pour une identification sans équivoque de la plupart d’APs de
sources connues et d’autre part d’avoir des informations structurales d’autres APs. En effet, le
spectre de masse est dominé par la base nécine, ce qui résulte en une fragmentation typique,
particulièrement pour les APs 1,2-insaturés qui sont toxiques. Les APs sont caractérisés par
des structures très similaires, souvent différant seulement par les chaines latérales, les
substitutions sur les nécines ou par la stéréochimie ; la détection des APs de structures
inconnues est facilitée, les informations structurales pouvant être déduites à partir des
similarités des spectres de masse avec des APs connus.
Pour la GC-MS, le chromatographe utilisé était le Hewlett–Packard 5890A équipé d’une
colonne ZB-1 (Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) 30 m x 0.32 mm (ft 0.25 µm). La
colonne capillaire était directement couplée à un spectromètre de masse TSQ 700 (Finnigan,
Bremen, Germany). Les conditions appliquées étaient les suivantes : l’injecteur et la ligne de
transfert étaient chauffés à 250°C ; la programmation de température était de 100°C (3 min) –
6°C/min – 310°C (3 min) ; le volume injecté était 1 µl ; le split était de 1 : 20 ; le débit du gaz
vecteur (Helium) était 1,6 ml/min ; et l’énergie de collision était de 70 eV. Une
chromatographie gazeuse de routine a également été réalisée dans les mêmes conditions en
utilisant une colonne « fused silica » (DB1, J&W Scientific) 15 m x 0.25 mm (ft 0.32 µm),
avec les detecteurs FID et NPD. Un mélange d’hydrocarbures (nombres pairs de carbones
C14 – C32) a été utilisé pour calculer les indices de rétention par extrapolation linéaire.
3.2.11. Extraction de l’huile essentielle
100 g de feuilles séchées de C. gilletii ont été soumis à l’entrainement à la vapeur d’eau
pendant 3 heures dans un appareil de type Clevenger. L’huile essentielle recueillie, 100 µl, a
été conservée à 4°C à l’abri de la lumière jusqu’à l’utilisation.
91
3.2.12. Evaluation de l’effet anticholinestérase
Dans de tubes à essai, 20 µl de solution d’AChE ou de BChE (0,2 U/ml dans un tampon pH 8)
et différentes concentrations de l’huile essentielle de C. gilletii (20 µl, 31 à 1000 µg/ml) ont
été ajoutés à 2 ml de tampon pH 8 et pré-incubés dans un bain de glace à 4°C pendant 30 min.
La réaction a été déclenchée par l’ajout de 20 µl de solution de DNTB 0,05 mM dans tampon
pH 7), et les tubes ont été placés dans un bain marie à 37°C pendant 20 min. La réaction a par
la suite été arrêtée en plaçant les tubes dans le bain de glace et en ajoutant 20 µl de
physostigmine (0,018 mM dans tampon pH 7). Un essai à blanc (tous les réactifs sans huile
essentielle) et un contrôle positif (physostigmine 0,018 mM) ont été réalisés. L’hydrolyse de
l’acétylthiocholine et butyrylthiocholine étaient suivie par la formation de la coloration jaune
due à l’anion 5-thio-2-nitrobenzoate, résultant de la réaction entre le DNTB et la thiocholine
libérée par hydrolyse enzymatique. Cette coloration a été mesurée au spectrophotomètre à 405
nm et le pourcentage d’inhibition a été calculé.
92
4. RESULTATS ET DISCUSSION
93
94
Ce chapitre présente les résultats de différentes investigations menées dans le cadre de
l’évaluation des propriétés biologiques et de l’analyse phytochimique de Cordia gilletii De
Wild (Boraginaceae). Ces résultats sont répartis en six sections.
4.1. Etude de l’effet antimicrobien direct et indirect ainsi que de l’activité antioxydante de
Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
4.2. Optimisation du milieu de culture utilisé en CCM-bioautographie. Application à la
détection des composés antimicrobiens de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
4.3. Férulaldéhyde et Lupéol : Composés antimicrobiens directs et indirects d’écorces de
racines de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
4.4. Autres activités biologiques de Cordia gilletii de Wild (Boraginaceae) : Effet
antiplasmodial et Etude préliminaire de l’activité sur la production des facteurs de virulence
régulés par le QS chez Pseudomonas aeruginosa PAO1
4.5. Composition chimique, propriétés antioxydante et anticholinestérase de l’huile essentielle
des feuilles de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
4.6. Absence d’alcaloïdes pyrrolizidiniques dans Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
95
96
4.1. Etude de l’effet antimicrobien direct et indirect ainsi que de l’activité antioxydante
de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Les maladies infectieuses constituent un véritable problème de santé publique, elles
représentent la principale cause des taux de mortalité élevés enregistrés dans les pays en
développement où la majeure partie de la population a un accès fort limité aux soins de santé
adéquats ; tandis, que dans les pays industrialisés, les résistances aux antibiotiques existants se
développent de façon alarmante. Ces situations engendrent un besoin sans cesse croissant de
trouver de nouveaux remèdes pouvant agir soit directement en tuant les agents pathogènes ou
en inhibant leur croissance ; soit indirectement en inhibant les mécanismes de résistance,
augmentant, voire restaurant ainsi l’activité des antibiotiques. Les plantes médicinales
constituent une source potentielle de ce type de composés.
C’est dans ce cadre que nous nous sommes intéressé à Cordia gilletii De Wild
(Boraginaceae), une plante traditionnellement utilisée dans l’Ouest de la République
Démocratique du Congo pour traiter diverses pathologies telles que la diarrhée, les plaies, les
maladies cutanées (écorces de racines) et la malaria (écorces de racines et feuilles). Dans le
but de vérifier le bien-fondé de certains de ces usages, nous avons procédé à une évaluation
des propriétés antimicrobiennes directes et indirectes ainsi que de l’activité antioxydante des
extraits de racines de cette plante.
L’activité antimicrobienne directe des extraits obtenus après épuisements successifs de la
poudre d’écorces de racines de C. gilletii avec le n-hexane, le dichloromethane, l’acétate
d’éthyle, le méthanol et l’eau a été évaluée sur 10 souches de bactéries et une souche de
champignon par les méthodes de microdilution. Les extraits ayant une CMI inférieure à
500 µg/ml ont été considérés actifs ; de 500 à 1000 µg/ml l’activité était considérée faible ;
au-delà de 1000 µg/ml l’extrait était considéré inactif (Rios and Recio, 2005 ; Molina-Salinas
et al., 2007). La recherche d’éventuelles synergies entre les extraits et les antibiotiques a été
réalisée par la détermination de l’index FIC (Fractional Inhibitory Concentration). L’extrait
méthanolique a montré une activité antimicrobienne directe sur tous les microorganismes
testés avec des concentrations minimales inhibitrices allant de 125 à 1000 µg/ml ; les extraits
acétate d’éthyle et dichlorométhane ont été actifs respectivement sur quatre et trois souches
bactériennes. Parmi les combinaisons entre extraits et antibiotiques testées, seule l’association
de l’extrait méthanolique à la tétracycline a montré une synergie d’action, les autres ayant
présenté des effets additifs. L’effet synergique peut être exploité pour réduire la dose de
97
l’antibiotique, et en minimiser les effets indésirables, pour autant que les composés agissant
en synergie arrivent à la cible avec la même cinétique et dans le rapport de concentrations
adéquat.
L’activité antimicrobienne indirecte a été mesurée avec des extraits n’ayant pas d’effet
inhibiteur sur les souches de MRSA, les extraits n-hexanique et dichlorométhanique à une
concentration de 200 µg/ml. Nous avons observé qu’en présence de ces extraits, il y a eu
augmentation, voire restauration de l’activité de certains antibiotiques vis-à-vis de deux
souches de MRSA ; la présence de ces extraits a en effet entraîné d’une part une diminution
des CMI des β-lactames et de la streptomycine d’un facteur allant de 2 à 64, et d’autre part
une augmentation sensible des diamètres d’inhibition des β-lactames mesurées sur les
antibiogrammes.
Dans l’évaluation des propriétés antioxydantes par un test au DPPH, les extraits méthanolique
et dichlorométhanique ont montré la plus grande activité en piégeant les radicaux DPPH avec
des CI50 respectives de 3,2 et 8,1 µg/ml. L’activité antioxydante observée avec ces extraits
pourrait expliquer l’utilisation traditionnelle des écorces de C. gilletii dans le traitement des
plaies. En effet, les espèces réactives de l’oxygène, produites notamment au niveau des sites
inflammatoires, sont connues pour retarder la guérison des plaies par leurs effets néfastes sur
les cellules et les tissus. Il a été démontré que l’application locale de composés capteurs de
radicaux libres améliore significativement la guérison des plaies en protégeant les tissus des
dommages oxydatifs.
Les résultats obtenus avec les écorces de racines de C. gilletii justifient certains usages
traditionnels de cette plante et suscitent la poursuite des travaux en vue d’identifier les
composés responsables des activités observées.
98
Journal of Ethnopharmacology 112 (2007) 476–481
Direct and indirect antimicrobial effects and antioxidant activity
of Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
P.N. Okusa a,b,∗ , O. Penge b , M. Devleeschouwer c , P. Duez a
a
Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles,
CP 205/09, Bd du Triomphe, 1050 Bruxelles, Belgium
b Laboratoire de Pharmacognosie, Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa, B.P. 212 Kinshasa XI, Congo
c Laboratoire de Microbiologie Pharmaceutique et Hygiène, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles,
CP 205/02, Bd du Triomphe, 1050 Bruxelles, Belgium
Received 5 January 2007; received in revised form 20 March 2007; accepted 12 April 2007
Available online 24 April 2007
Abstract
Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae) root bark is traditionally used in Democratic Republic of Congo (DRC) for the treatment of various
disorders, including malaria, diarrhea, wounds and skin diseases; part of these activities may rely on antimicrobial and antioxidant properties.
Successive extracts of root barks powder with n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol and water were tested for antimicrobial activity,
both direct and indirect (antibiotic resistance reversal), against 10 strains of bacteria and 1 strain of fungi by broth microdilution and agar
diffusion methods. The eventual synergy between plant extracts and antibiotics was investigated by the determination of the fractional inhibitory
concentration index (FIC index). The methanol extract showed direct antimicrobial activity against all tested microorganisms with minimum
inhibitory concentrations (MIC) ranging between 125 and 1000 mg/ml, whereas the ethyl acetate and the dichloromethane extracts showed activity
on four and three strains, respectively. 200 mg/ml of n-hexane and dichloromethane extracts decreased the MICs of penicillin and streptomycin
4–64-fold for methicillin-resistant Staphylococcus aureus. A synergistic effect was found between the methanol extract and tetracycline, whereas
additive effects were observed for the other combinations tested. The methanol and dichloromethane extracts showed the greater antioxidant activity
by scavenging the free radical DPPH with IC50 values of 3.2 and 8.1 mg/ml, respectively. These results support the use of the plant in the treatment
of infectious diseases and wounds; they warrant further studies as to the nature of active compounds.
© 2007 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
Keywords: Reversal of antibiotic resistance; DPPH; Cordia gilletii; FIC index; MRSA
1. Introduction
In developing countries, infectious diseases remain the main
cause of the high mortality rates recorded; the majority of rural
people has limited access to formal and adequate health services and thus heavily recourses to traditional healers (WHO,
1996). Indigenous herbal remedies are widely used against many
infectious diseases, but only few of them have been studied
chemically and biologically in order to identify their active constituents (Longanga Otshudi et al., 2000). In modern medical
practice, the alarming worldwide incidence of antibiotic resis∗
Corresponding author at: Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie
et de Nutrition Humaine, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles,
CP 205/09, Bd du Triomphe, 1050 Bruxelles, Belgium. Tel.: +32 26505281;
fax: +32 26505430.
E-mail address: [email protected] (P.N. Okusa).
tance causes an increasing need for new compounds that can act
either by a direct antimicrobial activity or by inhibiting resistance mechanisms of microorganisms of medical importance.
Medicinal plants represent a valuable source for this kind of
compounds (Hatano et al., 2005).
In Democratic Republic of Congo, numerous plants are traditionally used against infectious diseases, among them is Cordia
gilletii De Wild (Boraginaceae). Its root barks are used for
the treatment of malaria and diarrhea (decoction), wounds and
skin diseases (topical application), whereas its leaves decoction
is used against fever (Kambu, 1990). Pyrrolizidine alkaloids
(Wassel et al., 1987), terpenoids (Kuroyanagi et al., 2003),
flavonoids, lignans and meroterpenoids naphtoquinones (Ioset
et al., 2000) have been isolated from the genus Cordia and some
biological activities like antibacterial (De Carvalho et al., 2004),
antifungal (Ioset et al., 2000), larvicidal (Ioset et al., 2000), anti
HIV-1 reverse transcriptase (RT), antiedematogenic (Bayeux
0378-8741/$ – see front matter © 2007 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.jep.2007.04.003
99
P.N. Okusa et al. / Journal of Ethnopharmacology 112 (2007) 476–481
et al., 2002), antiandrogenic, analgesic and anti-inflammatory
(Kuroyanagi et al., 2003) have been reported. Nevertheless, no
phytochemical or biological studies have been reported so far
on the species Cordia gilletii. This paper deals with the evaluation of direct antimicrobial effects of Cordia gilletii extracts
and their influence on antibiotic resistance, including a preliminary phytochemical study. In order to understand the use
of this plant in the treatment of wounds, the antioxidant activity was evaluated. Indeed reactive oxygen species (ROS), from
their harmful effects on cells and tissues, are deleterious to the
wound healing process (Halliwell and Gutteridge, 1999) and
topical applications of compounds with free-radical-scavenging
properties have been shown to significantly improve wound healing and to protect tissues from oxidative damage (Singh et al.,
2006).
2. Experimental
2.1. Plant material
Root barks of Cordia gilletii were collected in July 2005
from the Kisantu area (Democratic Republic of Congo). The
plant was identified by the specialists of the Herbarium of the
National Botanical Garden of Meise, Belgium, where a voucher
specimen has been deposited under the number BR-SP.627986.
2.2. Chemicals
The Mueller Hinton broth and agar were from Oxoid (Hampshire, UK) and the RPMI 1640 from Gibco BRL (Middlesex,
UK). As control, the following antibiotics were used: penicillin
G, streptomycin, tetracycline and nystatin for the microdilution
assay; whereas Neo-sensitabs tablets of ampicillin (33 mg), cefotaxim (30 mg), oxacillin (1 mg) and penicillin (5 mg) from Rosco
Diagnostica (Taastrup, Denmark) were used for the agar diffusion assay. All the other reagents were of the analytical grade
and obtained from Sigma (St Louis, USA).
2.3. Extraction and preliminary phytochemical
investigation
Root barks powder was extracted successively with n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, methanol and water.
Evaporation of the solvent under reduced pressure (40 ◦ C)
provided the extracts. A preliminary phytochemical screening
investigated the presence of alkaloids (Dragendorff”s test),
saponins (foam formation), flavonoids (diphenylboryloxyethylamine–polyethylene glycol reagent), terpenoids (Liebermann–Bouchardat’s test) and tannins (FeCl3 ) according to standard methods (Sofowora and Olaniyi, 1975; Wagner and Bladt,
1996).
2.4. Microorganisms
The microorganisms used in the antimicrobial tests were
Gram-positive (Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus C98506 and Staphylococcus aureus C100459)
477
and Gram-negative (Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia
coli C139187, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Klebsiella pneumoniae C139186, Enterobacter cloacae C136349,
Proteus mirabilis C126995 and Serratia marcescens C135352)
bacteria and a fungus (Candida albicans ATCC 10231). The
ATCC strains were obtained from the American Type Culture
Collection; all the other strains were clinical isolates, a generous gift from the Centre Hospitalier Universitaire of Charleroi,
Belgium (Mr Lerson). The strains C98506 and C100459 were
methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA).
2.5. Antimicrobial assay
The direct antibacterial effect was evaluated by a broth
microdilution method; plant extracts were dissolved in DMSO
(20 mg/250 ml) and diluted to 5 ml with Mueller Hinton broth
(for antibacterial test) or with RPMI 1640 (for antifungal test),
the final DMSO concentration being 5%. This solution was
transferred in 96-wells plates (200 ml/well) and serially diluted
(base 2 logarithmic dilutions) with Mueller Hinton broth or with
RPMI 1640. 24-h cultures of microbial strains were stirred with
0.9% NaCl to achieve 0.5 McFarland (108 cells/ml for bacteria
and 106 for fungi), diluted 1/100 to achieve 106 and 104 cells/ml
for bacteria and fungi, respectively and inoculated in the 96wells plates (100 ml/well). The cultures were incubated at 37 ◦ C
(bacteria) and 28 ◦ C (fungi) for 24 h in ambient atmosphere.
The minimum inhibitory concentration (MIC) was the lowest
concentration of extract that completely inhibited the growth
of microorganisms in the microdilution wells, as detected by
the unaided eye; the minimal bactericidal/fungicidal concentration (MBC/MFC) was determined by sub-culturing the negative
wells on a Mueller Hinton agar plate and was the lowest concentration that yielded negative sub-cultures.
To study the effect of extracts on antibiotic resistance, the
extracts with no direct antibacterial activity were dissolved in
DMSO (25 mg/ml), incorporated in Mueller Hinton agar at 50 ◦ C
(1 ml DMSO solution + 99 ml agar suspension; final DMSO
concentration, 1%) and cast in a 9-cm Petri dish. The susceptibility of microorganisms to antibiotics was then evaluated by
a disk diffusion method (Jorgensen and Turnidge, 2003) using
the antibacterial Neo-sensitabs tablets. Suitable controls were
made with media prepared without plant extract but with DMSO
(NCCLS, 2002, 2003).
2.6. Synergy between plant extracts and antibiotics
Antimicrobial combinations are considered to be synergistic
if the effect of combination is greater than the effect of either
agent alone or greater than the sum of the effects of individual
agents. Antagonism results if the combination provides an effect
less than the effect of either agent alone or less than the sum
of the effects of the individual agents. Indifference results if
the combination provides an effect equal to the effect of either
agent alone. The distinction between synergy, antagonism and
indifference classically relies on the determination of Fractional
Inhibitory Concentrations (FIC) and FIC index (Mackay et al.,
2000).
100
478
Table 1
Minimum inhibitory concentrations MICs (mg/ml) of Cordia gilletii root barks extracts (data from three experiments in quadruplicate, MIC defined as the lowest
concentration for which no growth was observed in every tested well)
HEXa
DCM
Gram-positive bacteria
Staphylococcus aureus ATCC 6538
Staphylococcus aureus C98506
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
125
250
250
Gram-negative bacteria
Escherichia coli ATCC 25922
Escherichia coli C139187
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
Klebsiella pneumoniae C139186
Enterobacter cloacea C136349
Proteus mirabilis C126995
Serratia marcenscens C135352
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
500
500
>1000
500
Fungi
Candida albicans ATCC 10231
>1000
>1000
ACE
MET
AQ
PEN
TET
STR
NYS
125
125
125
>1000
>1000
>1000
0.25
8
8
1
1
0.5
4
4
4
n.d
n.d
n.d
1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
500
1000
500
1000
500
1000
250
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
>1000
1
64
16
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
2
2
8
4
4
2
2
4
n.d.
8
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d
n.d
n.d
n.d
n.d
n.d
n.d
>1000
250
>1000
n.d.
n.d.
n.d.
1
a
HEX: n-Hexane extract; DCM: dichloromethane extract; ACE: ethyl acetate extract; MET: methanol extract; AQ: aqueous extract PEN: penicillin G; TET:
tetracyclin; STR: streptomycin; NYS: nystatin; n.d.: not determined.
The strains Staphylococcus aureus ATCC 6538 and
Escherichia coli ATCC 25922 were used to test for the combination of antibiotics and Cordia gilletii extracts by a broth
microdilution method using 96-wells microtiter plates. The
FIC index was calculated according to the equation: FIC
index = FICA + FICB = (MIC of drug A in combination/MIC of
drug A alone) + (MIC of drug B in combination/MIC of drug
B alone). The FIC index was evaluated as follows: synergy
(FIC index ≤ 0.5), additive (0.5 < FIC index ≤ 1), indifference
(1 < FIC index ≤ 2) and antagonism (FIC index > 2) (Mackay et
al., 2000).
2.7. Antioxidant test
The antioxidant activity was assessed by the measurement of the scavenging ability of extracts towards the stable
free radical 2,2′ -diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH); the radical DPPH is reduced to the corresponding colorless hydrazine
upon reaction with hydrogen donors (Pandey et al., 2005). Serial
dilutions of plant extracts (10 ml) were mixed with 200 ml of
methanolic 0.004% DPPH in 96-wells microtiter plates and
left for 30 min in dark; the absorbances were measured with
a Labsystems iEMS reader/dispenser MF (Labsystems, Finland) at 540 nm versus a 620 nm reference, using methanol as
blank.
To determine the IC50 (the concentration of plant extract that
quenches 50% of DPPH), all the experimental results obtained
from three separate experiments in quadruplicate were fitted to
a parametric function in Systat 7.1 (Systat Software):
N = N0 exp (−k C), where C is the concentration; N the
percentage of DPPH remaining at concentration C; N0
the percentage of DPPH at concentration 0 and k is the
parameter.
Quercetin was used as reference and results expressed as
quercetin-equivalent (Q-E), calculated as IC50 quercetin/IC50
plant extract.
2.8. Statistical analysis
Statistical analysis was performed by ANOVA with a posteriori pairwise comparisons (Bonferroni correction). Differences
were accepted as statistically significant when P < 0.05.
3. Results and discussion
3.1. Extraction and preliminary phytochemical screening
Hundred grams of Cordia gilletii root bark were powdered and sequentially extracted (percolation) by 800 ml of
n-hexane (yield, 0.11 g), dichloromethane (yield, 0.35 g), ethyl
acetate (yield, 0.18 g), methanol (yield, 4.17 g) and water
(yield, 7.87 g). The preliminary phytochemical investigation
reveals the presence of terpenoids and/or steroids (n-hexane and
dichloromethane extracts), tannins (ethyl acetate and methanol
extracts), alkaloids (methanol extract) and saponins (water
extract).
3.2. Direct antimicrobial effects
Table 1 presents the direct antimicrobial effects of the different extracts, measured by the broth microdilution technique
on a series of microbial strains. Extracts displaying a MIC
below 500 mg/ml were considered worthy of further investigation; from 500 to 1000 mg/ml, the antimicrobial activity was
judged weak and, over 1000 mg/ml, the extract was considered
inactive. The methanol extract showed antimicrobial activity
against all the strains tested, which could be explained by the
presence of tannins and/or alkaloids. Tannins are effectively
known to possess interesting antimicrobial activities, particularly for infectious skin diseases and diarrhea (Bruneton, 1993);
several pyrrolizidine alkaloids from Boraginaceae species have
previously been reported to present antimicrobial activity against
many germs (Jain and Sharma, 1987). The ethyl acetate and
101
479
Table 2
Effects of Cordia gilletii root barks extracts on the antibiotic resistance of MRSA (agar diffusion technique) (inhibition zone in mm ± standard deviation; n = 3)
Antibiotics
Oxacillin
Penicillin G
Cefotaxim
Ampicillin
a
b
c
d
MRSA C98506
MRSA C100459
Controla
HEXb
DCMb
Controla
HEXb
9.0c
14.1 + 1.8
9.0
14.1 + 1.4
9.0 NSd
22.0 ± 1.3**
22.3 ± 0.3***
21.7 ± 0.7**
9.0 NS
23.3 ± 0.8***
27.2 ± 1.5***
22.0 ± 1.5**
9.0
9.0
17.7 ± 1.8
16.3 ± 0.5
20.4
26.0
29.1
28.0
±
±
±
±
DCMb
1.1***
2.4***
1.5**
0.7***
17.2
22.6
27.7
26.2
±
±
±
±
0.8***
0.9***
2.0**
0.5***
Control (Mueller Hinton agar + DMSO 5%); NS, non-significant.
HEX: n-Hexane extract 250 mg/ml in Mueller Hinton agar + DMSO 1%; DCM: dichloromethane extract 250 mg/ml in Mueller Hinton agar + DMSO 1%.
9.0 mm = diameter of the disk (equivalent to “no effect”).
Statistically significant differences in comparison with control: * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
dichloromethane extracts showed weak activities, which may
be due to the presence of low molecular weight polyphenols and
terpenoids, respectively.
The effects observed on Gram-positive bacteria were bactericidal because the MBCs were within a two-fold dilution of the
MICs, whereas the effects on the Gram-negative and the fungi
were bacteriostatic and fungistatic, respectively with MBCs values at least within an eight-fold dilution of the MICs.
3.4. Synergy between plant extracts and antibiotics
The active ethyl acetate and methanol extracts were
also tested against Staphylococcus aureus ATCC 6538 and
Escherichia coli ATCC 25922 in combination with tetracycline
and streptomycin (Table 4). Whereas the methanol extract was
synergistic with tetracycline (FIC index < 0.5) against the two
microorganisms, all the other combinations showed additive
effects with FIC index between 0.5 and 1.
3.3. Effects on antibiotic resistance
The n-hexane and dichloromethane extracts were inactive
against MRSA but their incorporation in Mueller Hinton agar
restored or enhanced the activities of oxacillin, penicillin G,
ampicillin and cefotaxim (P < 0.05) (Table 2). As the extracts
are inactive by themselves, this cannot be considered in terms
of “synergy” (FIC index cannot be computed), but rater as a
reversal of antibiotic resistance.
The antibiotic resistance of MRSA is mainly attributed to
the production of penicillin binding protein (PBP) 2a, which
interact with b-lactams, although much less strongly than other
PBPs; the development of efflux pumps and of mechanisms that
make it difficult for antibiotics to penetrate bacterial colonies
also contribute to antibiotic resistance (Rice et al., 2003). The
observed restoration or enhancement of antibiotic activity might
be explained by the presence of terpenoids in these extracts.
Indeed, some monoterpenoids, including geraniol, have previously been reported to lower the stability of the MRSA cell
membrane, consequently decreasing the MICs of b-lactams and
restoring their activities (Hatano et al., 2005); some diterpenoids
inhibit the MFS efflux pump of MRSA, restoring the activity
of antibiotics like erythromycin and tetracycline (Oluwatuyi et
al., 2004) whereas other diterpenoids interact with the expression of PBP 2a, reducing the resistance of MRSA to b-lactams
(Nicholson et al., 1999).
The present study shows that Cordia gilletii n-hexane and
dichloromethane extracts are quite effective in reducing the MIC
values of penicillin G 2–64-fold (Table 3). Streptomycin, an
aminoglycoside antibiotic, also showed a 4 to 32-fold reduced
MIC in the presence of these n-hexane and dichloromethane
extracts (Table 3); the concomitant use of such extracts may
help to reduce the dose of this aminoglycoside which has adverse
side effects on renal and acoustic-nerve functions (Hatano et al.,
2005).
3.5. Antioxidant activity
The methanol extract presents a quite potent antioxidant
activity, efficiently scavenging the DPPH free radical with an
IC50 value of 3.2 mg/ml (0.31 Q-E). The other extracts also
show antioxidant activity but notably less than the methanol
extract (Table 5). Such a radical scavenging action contributes
Table 3
Decrease in the minimum inhibitory concentration (MIC) of penicillin G
and streptomycin for MRSA in the presence of Cordia gilletii n-hexane and
dichloromethane extracts (broth microdilution technique) (data from three
experiments in quadruplicate, MIC defined as the lowest concentration for which
no growth was observed in every tested well)
Antibiotic
Penicillin G alone
Penicillin G + n-hexane
extract 100 mg/ml
Penicillin G + n-hexane
extract 200 mg/ml
Penicillin
G + dichloromethane
extract 100 mg/ml
Penicillin
G + dichloromethane
extract 200 mg/ml
Streptomycin alone
Streptomycin + n-hexane
extract 100 mg/ml
Streptomycin + n-hexane
extract 200 mg/ml
Streptomycin + dichloromethane
extract 100 mg/ml
Streptomycin + dichloromethane
extract 200 mg/ml
102
MIC (mg/ml)
MRSA C98506
MRSA C100459
8
1
8
1
0.25
0.125
4
1
2
0.25
4
1
4
1
0.125
0.125
1
0.5
0.5
0.25
480
Table 4
Synergy between plant extracts and antibiotics (MIC in mg/ml) (data from three experiments in quadruplicate, MIC defined as the lowest concentration for which no
growth was observed in every tested well)
MIC ABa
MIC PE
1
Tetra/ACEb
Tetra/MET
1
Strepto/ACE
4
Strepto/MET
4
Tetra/ACEb
Tetra/MET
Strepto/ACE
Strepto/MET
a
b
125
125
125
125
2
2
4
4
1000
500
1000
500
MIC AB/PE
FIC index
Evaluation
0.25/62.5
0.125/15.6
1/62.5
1/62.5
0.75
0.25
0.75
0.75
Additive effect
Synergy
Additive effect
Additive effect
0.5/125
0.5/62.5
2/500
1/250
0.75
0.375
1
0.75
Additive effect
Synergy
Additive effect
Additive effect
AB: antibiotic; PE: plant extract; FIC: fractional inhibitory concentration.
Tetra: tetracyclin; Strepto: streptomycin; ACE: ethyl acetate extract; MET: methanol extract.
Table 5
Antioxidant activity (IC50 ± standard deviation) (data from three experiments in quadruplicate)
n-Hexane extract
Dichloromethane extract
Ethyl acetate extract
Methanol extract
Quercetin
IC50 (mg/ml) 5 min
IC50 (mg/ml) 30 min
Equivalent quercetin (30 min)
238.3
26.5
59.1
10.5
2.5
83.5
8.1
25
3.2
1
0.01
0.12
0.04
0.31
1
±
±
±
±
±
19.5
3.8
3.5
1.4
0.2
to prevent deleterious effects from reactive oxygen species generated in inflammatory conditions (Halliwell and Gutteridge,
1999; Singh et al., 2006) and most probably plays a part in
the wound healing properties of Cordia gilletii-based herbal
medicines.
4. Conclusion
The methanolic extract of Cordia gilletii root barks exhibits
potent antimicrobial and antioxidant activities that support the
use of polar extracts of this plant for the treatment of infectious
diseases and wounds in Traditional Congolese Medicine. The
n-hexane and dichloromethane extracts restored or enhanced
the activity of four b-lactams and one aminoglycoside against
MRSA, which may help to extend the use of these antibiotics or
to reduce doses in order to prevent adverse effects. Further work
is in progress to identify the compounds responsible for these
interesting activities.
These results suggest that selecting a plant for antimicrobial
study by an ethnopharmacological approach may be useful, the
chances of success being more if the chosen species is traditionally used for the treatment of infectious diseases.
Acknowledgements
Dr G. Lerson (CHU Charleroi, Belgium) is acknowledged
for the generous gift of bacterial strains and invaluable help in
establishing working procedures. We are grateful to Mrs M. Faes
and M.O. Vaillant for maintaining excellent conditions of work
in the laboratory. The Belgian Technical Cooperation (CTBBTC) is acknowledged for financial support to P.N. Okusa.
±
±
±
±
±
7.0
4.0
2
0.3
0.2
References
Bayeux, M.C., Fernandes, A.T., Foglio, M.A., Carvalho, J.E., 2002. Evaluation
of the antiedematogenic activity of artemetin isolated from Cordia curassavica DC. Brazilian Journal of Medicinal and Biological Research 35,
1229–1232.
Bruneton, J., 1993. Pharmacognosie Phytochimie. Plantes Médicinales, third ed.
Tec and Doc, Paris, p. 1120.
De Carvalho Jr., P.M., Rodrigues, R.F., Sawaya, A.C., Marques, M.O., Shimizu,
M.T., 2004. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Cordiaverbenacea D.C. Journal of Ethnopharmacology 95, 297–
301.
Halliwell, B., Gutteridge, J.M., 1999. Free Radicals in Biology and Medicine,
third ed. Oxford University Press, Oxford, pp. 936.
Hatano, T., Kusuda, M., Inada, K., Ogawa, T.O., Shiota, S., Tsuchiya,
T., Yoshida, T., 2005. Effects of tannins and related polyphenols on
methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Phytochemistry 66, 2047–
2055.
Ioset, J.R., Marston, A., Gupta, M.P., Hostettmann, K., 2000. Antifungal and
larvicidal compounds from the root bark of Cordia alliodora. Journal of
Natural Products 63, 424–426.
Jain, S.C., Sharma, R., 1987. Antimicrobial activity of pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium ellipticum. Chemical and Pharmaceutical Bulletin
(Tokyo) 35, 3487–3489.
Jorgensen, J.H., Turnidge, J.D., 2003. Susceptibility test methods: dilution and
disk diffusion methods. In: Murray, P.R. (Ed.), Manual of Clinical Microbiology, 1, eighth ed. ASM Press, Washington, p. 1108.
Kambu, K., 1990. Eléments de Phytothérapie Comparée: Plantes Médicinales
Africaines. Centre de Recherche Pédagogique de Kinshasa, Kinshasa, p.
148.
Kuroyanagi, M., Kawahara, N., Sekita, S., Satake, M., Hayashi, T., Takase, Y.,
Masuda, K., 2003. Dammarane-type triterpenes from the Brazilian medicinal plant Cordia multispicata. Journal of Natural Products 66, 1307–
1312.
Longanga Otshudi, A., Vercruysse, A., Foriers, A., 2000. Contribution to the
ethnobotanical, phytochemical and pharmacological studies of traditionally
used medicinal plants in the treatment of dysentery and diarrhoea in Lomela
103
area, Democratic Republic of Congo (DRC). Journal of Ethnopharmacology
71, 411–423.
Mackay, M.L., Milne, K., Gould, I.M., 2000. Comparison of methods for assessing synergic antibiotic interactions. International Journal of Antimicrobial
Agents 15, 125–129.
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), 2002. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of
filamentous fungi. Approved Standard, M38-A 22, Wayne.
NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards), 2003. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow
aerobically. Approved Standard, sixth ed. M7-A6 23, Wayne.
Nicholson, K., Evans, G., O’Toole, P.W., 1999. Potentiation of methicillin activity against methicillin resistant Staphylococcus aureus by diterpenes. FEMS
Microbiology Letters 66, 233–239.
Oluwatuyi, M., Kaatz, G.W., Gibbons, S., 2004. Antibacterial and resistance modifying activity of Rosmarinus officinalis. Phytochemistry 65,
3249–3254.
481
Pandey, M.M., Govindarajan, R., Rawat, A.K., Pushpangadan, P., 2005. Free
radical scavenging potential of Saussarea costus. Acta Pharmaceutica 55,
297–304.
Rice, L.D., Sahm, D., Bonomo, R.A., 2003. Mechanisms of resistance to antimicrobial agents. In: Murray, P.R. (Ed.), Manual of Clinical Microbiology, 1,
eighth ed. ASM Press, Washington, p. 1074.
Singh, M., Govindarajan, R., Nath, V., Rawat, A.K., Mehrotra, S., 2006.
Antimicrobial, wound healing and antioxidant activity of Plagiochasma
appendiculatum Lehm. et Lind. Journal of Ethnopharmacology 107, 67–72.
Sofowora, E.A., Olaniyi, A.A., 1975. Phytochemical examination of Dracaena
mannii stem bark. Planta Medica 27, 65–67.
Wagner, H., Bladt, S., 1996. Plant Drug Analysis. Springer, Berlin.
Wassel, G., El-Menshawi, B., Saeed, A., Mahram, G., Reich, J., 1987. New
sources of pyrrolizidine alkaloids: genus Cordia and Schismus. Scientia
Pharmaceutica 55, 166–193.
WHO SWG, 1996. Resistance to antimicrobial agents. Bulletin of the World
Health Organization 71, 335–336.
104
4.2. Optimisation du milieu de culture utilisé en CCM-bioautographie. Application à la
détection des composés antimicrobiens de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Les extraits de racines de Cordia gilletii ayant montré d’intéressantes activités
antimicrobiennes directe et indirecte, nous nous sommes intéressé à leurs fractionnements
bio-guidés afin d’en isoler les molécules actives. Pour ce faire, nous nous sommes proposé de
suivre l’activité antimicrobienne des fractions par CCM-bioautographie, qui est une technique
simple permettant une détection aisée des composés actifs. L’application de cette technique
requiert un milieu suffisamment fluide pour couler la suspension de microorganismes, mais
aussi suffisamment visqueux pour adhérer à la plaque de CCM et maintenir une humidité
adéquate pour la croissance bactérienne. Les milieux de Mueller Hinton (MH) agar et
bouillon sont souvent utilisés pour la CCM-bioautographie. Ces deux milieux présentent
cependant de grands inconvénients ; la température désirée pour garder l’agar liquide en vue
de préparer et de couler la suspension microbienne peut provoquer un choc thermique, en plus
la couche d’agar peut diluer les composés antimicrobiens ; quant à l’immersion dans du
bouillon, le milieu n’adhère pas convenablement sur plaque de CCM et sèche rapidement.
Pour contourner ces inconvénients, nous avons évalué plusieurs combinaisons de MH
bouillon et MH agar (proportions 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 60:40 et 50:50) afin
de trouver un mélange suffisamment fluide à 37°C (température optimale de croissance de
nombreux microorganismes pathogènes) pour pouvoir préparer et couler la suspension
bactérienne, et qui se solidifie à température ambiante. Le mélange MH bouillon – MH agar
90:10 a rempli toutes ces conditions, les mélanges contenant de plus grandes proportions
d’agar étaient solides à 37°C, tandis ceux contenant de faibles proportions d’agar coulaient
sur la plaque entraînant ainsi les spots actifs avec comme conséquence une mauvaise
détection. Cette stratégie pour optimiser le milieu de culture peut être appliquée à la plupart
de milieux utilisés en CCM-bioautographie. Le mélange MH bouillon – MH agar 90:10 a été
utilisé pour la détection des composés antimicrobiens des extraits et fractions de Cordia
gilletii De Wild (Boraginaceae). Les extraits actifs ont en plus été soumis à un second test
biologique pour détecter des composés pouvant inhiber la luminescence de Vibrio fischerii,
qui est décrit comme un bio-indicateur de toxicité et d’activité biologique en général. Dans
nos conditions, les deux tests biologiques, la CCM-bioautographie et le test sur V. fischerii,
ont mis en évidence des composés différents dans les mêmes fractions, suggérant ainsi une
probable faible toxicité des composés antimicrobiens de Cordia gilletii.
105
Original Research Papers
Optimization of the Culture Medium Used for Direct
TLC–Bioautography. Application to the Detection
of Antimicrobial Compounds from Cordia gilletii De Wild
(Boraginaceae)
Philippe N. Okusa*, Caroline Stévigny, Michel Devleeschouwer, and Pierre Duez
Key Words
TLC–bioautography
Antimicrobial
Cordia gilletii
Culture medium
Summary
TLC–bioautography, a convenient and simple mean of testing
plant extracts and pure substances for their effects on pathogenic
microorganisms, enables easy detection of active fractions. Its application requires a medium fluid enough to cast suspensions of
microorganisms but viscous enough to adhere to the TLC plate and
maintain sufficient humidity for bacterial growth. Mueller–Hinton
(MH) agar and broth are often used for this purpose. These media
have major drawbacks, however – microorganisms can suffer thermal shock from the temperature required for agar casting, and agar
can also dilute the antimicrobial compounds, and immersion broth
does not conveniently adhere to the TLC plate and dries too rapidly. To overcome these problems, we investigated several combinations of MH broth and MH agar (proportions 95:5, 90:10, 85:15,
80:20, 75:25, 70:30, 60:60, and 50:50) to discover a medium sufficiently fluid to prepare bacterial suspensions at 37°C (the temperature for optimum growth of many pathogenic bacteria) yet which
solidifies at ambient temperature. The mixture MH broth–MH agar
90:10 fulfilled these requirements; media containing higher proportions of MH agar were solid at 37°C and those containing lower proportions of MH agar flowed down the plate, partly carrying the
active spots, leading to poor detection and resolution. This simple
modification of the culture medium can be applied to most media
amenable to TLC–bioautography. This 90:10 mixture was used to
detect antimicrobial compounds in a Congolese medicinal plant,
Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae), affording superior chromatographic resolution compared with MH broth alone. The active
extracts were further compared by a second TLC bioassay for compounds able to quench the luminescence of Vibrio fischerii, a
bioindicator for toxicity and general biological activity.
pathogenic microorganisms, enables easy detection of active
fractions, notably for study of medicinal herbs [1]. Its application requires a medium fluid enough to cast a suspension of
the microorganisms but viscous enough to adhere to the TLC
plate and maintain sufficient humidity for bacterial growth.
Mueller–Hinton (MH) agar is often used for this purpose. The
microorganism suspension is prepared in molten MH agar at
approximately 45–50°C and distributed over the plate; after
solidification of the medium at ambient temperature the plate is
incubated at 37°C [2]. MH broth is also frequently used, TLC
plates being dipped in the broth containing the microorganisms,
air dried, and incubated in humidified chambers [3]. These two
techniques each have a major drawback, however; (i) microorganisms can suffer heat shock from hot molten agar and the agar
can dilute antimicrobial compounds [4, 5], and (ii) broth does
not conveniently adhere to the TLC plate or dries too fast [6]. To
overcome these problems, combinations of MH agar and broth
in different proportions were investigated; the method was then
used to study antimicrobial compounds from Cordia gilletii De
Wild (Boraginaceae), a Congolese medicinal plant traditionally
used for treatment of malaria, diarrhea, fever, skin diseases, and
wounds [7]. A second TLC bioassay, based on extinction of Vibrio fischerii bioluminescence and proposed for detection of biologically active compounds on TLC plates, the Bioluminex
assay [8], was also investigated.
2 Experimental
1 Introduction
2.1 Chemicals and Plant Material
Direct TLC–bioautography, a convenient and simple means of
testing plant extracts and pure substances for their effects on
All reagents were of analytical grade and obtained from
Sigma–Aldrich (St Louis, USA).
P.N. Okusa, C. Stévigny, and P. Duez, Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine; and M. Devleeschouwer, Laboratoire de Microbiologie Pharmaceutique, Université Libre de Bruxelles (ULB), CP 205/09, Bd du
Triomphe, 1050 Brussels, Belgium. P.N. Okusa and P. Duez, Service de Chimie
Thérapeutique et Pharmacognosie, Université de Mons (UMONS), 20 Place du
Parc, 7000 Mons, Belgium.
E-mail: [email protected]
Cordia gilleti root bark was collected in July 2005 from the
Kisantu area of the Democratic Republic of Congo, carefully
washed, dried in the shade, and powdered. The plant was identified by specialists at the Herbarium of the National Botanical
Garden of Meise, Belgium, where a voucher specimen has been
deposited (BR-S.P. 627 986).
Root bark powder (100 g) was successively extracted exhaustively with 800 mL n-hexane (yield, 0.11 g), dichloromethane
DOI: 10.1556/JPC.23.2010.4.1
Journal of Planar Chromatography 23 (2010) 4, 245–249
0933-4173/$ 20.00 © Akadémiai Kiadó, Budapest
106
245
TLC–Bioautography. Application of Antimicrobial Compounds in Cordia gilletii
Mueller–Hinton (MH) broth and MH agar (Oxoid, Hampshire,
UK) were prepared according to the manufacturer’s instructions
and autoclaved at 121°C for 15 min. Mixtures of the broth and
agar in different proportions (95:5, 90:10, 80:20, 70:30, 60:40
and 50:50) were prepared at 70°C. The fluidity of these mixtures
was observed at temperatures down to 37°C in order to select
mixtures which were fluid enough for preparation of suspensions of microorganisms.
2.3 Direct Bioautography
Figure 1
Direct bioautography – comparison of MH broth alone (left) and the
combination MH broth–MH agar 90:10 (right). Samples: Cordia gilletii
ethyl acetate extract, 10 µg (lane E), Cordia gilletii methanol extract,
10 µg (lane M). Stationary phase, silica gel 60 F254; mobile phase,
dichloromethane–methanol 80:20; strain, S. aureus C100459; detection, MTT. Elution of spots by broth flowing down the plate (left) was
prevented by combining the broth with the agar medium (right), leading to clearly better chromatographic resolution.
Table 1
Antibacterial effect of fractions from methanol extract of Cordia
gilletii by broth microdilution method and by direct TLC bioautography.
Broth microdilution
MICa) [µg mL–1]
TLC–bioautography
(number of active spots)
Fraction 1
62
3
Fraction 2
16
2
Fraction 3
62
1
Fraction 4
32
2
Fraction 5
125
1
Fraction 6
> 500
0
Fraction 7
> 500
0
Fraction 8
> 500
0
Fraction 9
> 500
0
a)MIC
= minimum inhibitory concentration
(yield, 0.35 g), ethyl acetate (yield, 0.18 g), and methanol (yield
4.17 g). The methanolic extract (3 g), the most active fraction [9], was submitted to silica gel column chromatography
(Merck silica gel 60, 63–230 mesh, 70 g; 3 cm i.d. column). Elution with a dichloromethane–methanol gradient (100:0, 95:5,
90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 60:40, 50:50) yielded nine
fractions of 100 mL each which were evaporated to dryness
under vacuum (40°C).
2.2 Microorganisms and Culture Media
The test strains were Staphylococcus aureus ATCC 6538
obtained from American Type Culture Collection, and C100458,
a clinically isolated, methicillin-resistant, Staphylococcus
aureus (MRSA), obtained from the Centre Hospitalier Universitaire, Charleroi, Belgium.
TLC was performed on 10 cm x 5 cm precoated silica gel 60 F254
glass plates (Merck, Darmstadt, Germany). After application
of plant extracts (1 mg mL–1, 10 µL) or fractions (0.01 to
1 mg mL–1, 10 µL) the plates were developed with dichloromethane, dichloromethane-methanol 90:10 or 80:20 or petroleum ether–diethyl ether–acetic acid 90:10:1 as mobile phase,
then dried at 40°C for 1 to 4 h. One set of plates was used as the
reference chromatogram; spots were visualized by spraying
with 1% vanillin in ethanol followed immediately by 10%
ethanolic sulfuric acid, then the plate was heated at 105°C for
10 min [10]. For bioautography, 1 mL of 0.5 McFarland
microorganism suspension (approx. 108 CFU mL–1) was diluted
with 9 mL of the tested mixture of MH broth and agar (107
CFU mL–1) at 37°C. Dried TLC plates were placed in a Petri
dish, the inoculated mixture of MH broth and agar was aseptically distributed over the plate, and the dish was covered. After
solidification of the medium at ambient temperature, the TLC
plate was incubated overnight at 37°C. The bioautogram was
subsequently sprayed with an aqueous solution of MTT
0.8 mg mL–1 and incubated at 37°C for 4 h; the MTT is converted to a formazan dye by the microorganisms and active compounds are indicated by inhibition zones observed as clear spots
against a purple background [11]. To study indirect antibacterial
activity against MRSA, a sub-inhibitory concentration of penicillin G (1 µg mL–1) was incorporated in the mixture of MH
broth and agar; extracts with no direct antibacterial activity were
selected, chromatographed, and bioautographed with this medium as described above.
2.4 Bioluminex Assay
The Bioluminex assay is a TLC detection method based on the
natural bioluminescence of the non-pathogenic bacteria Vibrio
fischerii. These bacteria emit light as a by-product of cellular
respiration when the bacteria reach a critical cellular density; the
lux operon expresses the enzyme luciferase which, in the presence of oxygen, catalyses an oxidation reaction that releases
energy in the form of blue–green light. As this reaction is dependent on the overall metabolism of the microbes, compounds
interfering with metabolic processes of the bacteria are detected
as contrasting dark spots on the bioluminescent background of
the TLC plate. This method is regarded as a general bioassay
suitable for detection of ‘biologically active’ compounds [8].
The Bioluminex kit from Chromadex (Santa Ana, California,
USA) was prepared in accordance with the manufacturer’s
instructions. Medium (200 mL) was seeded with 1 vial of bacteria and incubated in an incubator/shaker at 28°C and 120 rpm for
28–32 h in the dark until luminescence could be observed. After
TLC development and drying of the plate as described above,
the plate was dipped for 5 s in an immersion chamber (CAMAG,
246
Journal of Planar Chromatography 23 (2010) 4
107
Figure 2
Figure 3
Detection of antimicrobial compounds in active fractions 1 and 2
Minimum detectable doses (MDD, expressed in µg applied to TLC
obtained by column chromatography of a methanol extract of Cordia
plate) of fractions F1 and F2 obtained from methanol extracts of
gilletii. Samples (in parentheses, µg applied): F1, fraction 1 (10 µg);
Cordia gilletii. Stationary phase, silica gel 60 F254; mobile phase, di-
F2, fraction 2 (10 µg); F1a, sub-fraction from F1 (5 µg). Stationary
chloromethane; strain, S. aureus ATCC 6538; detection, MTT.
phase, silica gel 60 F254; mobile phase, dichloromethane. Left to right:
direct bioautography revealed by MTT (strain: S. aureus ATCC 6538);
detection with vanillin–sulfuric acid reagent; Vibrio fischerii bioassay
(the dark spots are compounds inhibiting emission of light by bioluminescent bacteria and the white spots are compounds activating the
bioluminescence of the bacteria).
Switzerland) containing the bacterial culture; excess liquid was
then immediately wiped from the plate by use of a smooth rubber blade. The bioluminescent bacterial coating was visualized
by use of a Bioluminizer (CAMAG), the TLC plate being
exposed to a cooled charge-coupled device camera (five consecutive exposures each with a 2-min exposure time).
3 Results and Discussion
In bioautography the culture medium captured by the silica particles of the TLC plate acts as a source of nutrients and energy
for the test microorganisms. Working with MH agar alone causes some problems – the microorganism are exposed to the temperature needed to maintain the agar in the liquid state and the
agar layer dilutes the antimicrobial compounds thus reducing
sensitivity. The broth alone is not sufficiently viscous and the
culture medium is likely to flow off the plate surface after the
immersion process [6]. The viscosity of the culture medium is,
then, an important property for successful bioautography. For
example, the only commercial ready-to-use bioautography kit
from Merck (Darmstadt, Germany), Chrom Biodip Antibiotics,
based on Bacillus subtilis spores, contains 1.5% of a bacterial
polysaccharide to increase the viscosity of the medium [12].
It is therefore of interest to develop a simple method to achieve
the appropriate viscosity with media commonly used in microbiology laboratories and which could be applied to diverse media
and microorganisms. To this end, MH broth and agar, media
widely used in antibacterial tests (most bacteria, both Gram positive and Gram negative, can be cultivated on MH medium)
were selected as a model. Instead of the complexity of supplementing the broth with different amounts of agents to increase
the viscosity, we investigated the simple alternative of mixing
the corresponding broth and agar media in different proportions
to rapidly investigate mixtures with different viscosities. The
mixture MH broth–MH agar fulfilled all requirements, yielding
a medium fluid enough to prepare bacterial suspensions at 37°C
(optimum growth temperature for many microorganisms) yet
was solid at ambient temperature, and thus adhered to the TLC
plate. Mixtures containing greater proportions of MH agar were
solid at 37°C whereas containing lower proportions of the agar
flowed down from the TLC plate.
Ethyl acetate and methanol extracts of Cordia gilletii root
bark, active against Staphylococcus aureus ATCC 6538 and
C100459 [9], were used to compare post-chromatographic
detection using MH broth alone and MH broth–agar 90:10 as
culture media. The chromatographic resolution achieved with
MH broth–agar 90:10 was clearly better than that with MH
broth. Indeed, the viscosity due to the agar prevented the broth
from flowing down the plate, partly eluting and washing away
active spots and thus leading to poorly visible inhibition zones
and poor resolution (Figure 1).
TLC–bioautography with the optimized culture medium was
used for bio-guided fractionation of the most active extracts of
C. gilletii. A microdilution antibacterial test [13] revealed that
five of the nine fractions (F1–F9) obtained by column chromatography of the methanolic extract were active against S.
aureus ATCC 6538 and S. aureus C100459 with MIC values
between 16 and 125 µg mL–1 (Table 1). Bioautography and
vanillin detection revealed that the most active fraction was F2,
with a compound present at very low concentration but with
high antimicrobial activity (Figure 2). To determine the bioautography detection limits, fractions F1 and F2 were applied at
decreasing concentrations. Active spots could be observed down
to 0.5 and 0.25 µg applied for F1 and F2, respectively
(Figure 3).
The n-hexane extract, inactive against the two strains, but
enhancing the activity of some antibiotics against MRSA [9],
was also investigated by TLC–bioautography to identify the
compounds responsible for restoration or enhancement of
247
108
Figure 4
Figure 5
TLC–direct bioautography of n-hexane extract of Cordia gilletii.
Vibrio fischerii bioluminescence assay of extracts of Cordia gilletii
Stationary phase, silica gel 60 F254.; mobile phase, petroleum ether–
roots bark. H, hexane extract (10 µg); D, dichloromethane extract
diethyl ether–acetic acid 90:10:1; strain, S. aureus C100459; medium,
(10 µg); E, ethyl acetate extract (16 µg, 8 µg, 4 µg, and 2 µg);
MH broth–agar 90:10 supplemented with 1 µg mL–1 penicillin G. Left,
M, methanol extract (8 µg, 4 µg, 2 µg, and 1 µg). Stationary phase,
detection with vanillin–sulfuric acid reagent; right, direct bioauto-
silica gel 60 F254; mobiles phases, dichloromethane (H and D),
graphy.
dichloromethane–methanol 90:10 (E and M).
antibiotic activity. The mixture MH broth–agar 90:10 supplemented with penicillin G enabled location of two compounds
(Figure 4); their isolation and identification are under investigation. In this experiment, however, on-plate growth of the bacteria was substantially reduced. This could be because of slight
bacterial sensitivity to the antibiotic spread over the plate or
because of residual acetic acid left over from the mobile phase
evaporation. Indeed, if solvents of low volatility are used in
mobile phases and completely removed before the microbial
assay, traces of most acids and bases can remain even after prolonged drying, and could inhibit bacterial growth [3].
icinal plant, Cordia gilletii, affording superior post-chromatographic detection compared with MH broth alone. Thus we
could use this technique in the bio-guided fractionation of a
methanol extract of Cordia gilletii, using minute amounts of
extracts and fractions. This will be very useful for isolation, for
structure elucidation, of the active compounds detected.
Because the phytochemistry of Cordia gilletii has never been
investigated, we still have no clues to the structure of active
compounds; other Cordia species have yielded several compounds including cordiaquinones, terpenoids, and phenolic
derivatives [16], but no antibacterial effect has yet been demonstrated.
All tested extracts revealed compounds able to inhibit light
emission by the bioluminescent Vibrio fischerii, down to 0.5 µg
and 2 µg applied amounts for methanol and ethyl acetate
extracts, respectively (Figure 5). Fraction F1 contained three
compounds activating the bioluminescence of Vibrio fischerii
and at least three compounds quenching the light. Although no
activators were observed in F2, inhibitor compounds were present. Light quenching is generally believed to reveal ‘biologically active’ compounds, i.e., compounds interfering with the metabolic processes of the bacteria [8]; light activation could be
because of luciferase substrates (aldehydes) or stabilizers,
NADH reductase activators, readily metabolized substrates of
the bacteria or quorum sensing mimics [14, 15]. Given the quite
short contact time between bacteria and TLC plate, however, the
last two possibilities are unlikely. Under our conditions, no relationship between bioautography and V. fischerii assays could be
established, the two tests revealing distinct compounds in the
same fraction (Figure 2).
The simple procedure for media optimization described in this
study could be applied to most media amenable to direct
TLC–bioautography. Vibrio fischerii-based assays are regarded
as general bioindicators of toxicity [17]; the lack of a relationship between bioautography and V. fischerii assays suggests
probable low toxicity of the antimicrobial compounds of C.
gilletii which are worthy of further investigation.
Acknowledgments
The authors wish to thank the companies CAMAG and Chromadex for allowing access to a Bioluminizer and a Bioluminex
kit. Help from Mrs S. Gosset and technical support from Mr O.
Vaillant, Mrs M. Faes, and Mrs N. El Mansouri are gratefully
acknowledged. The Belgian Technical Cooperation (CTB-BTC)
and the Fonds de la Recherche Scientifique (FRS-FNRS, Belgium) are acknowledged for partial financial support.
4 Conclusion
References
Combination of MH broth and MH agar in the appropriate proportion (90:10) for direct TLC–bioautography ensures the viscosity necessary for convenient adherence of the inoculated
medium to TLC plates. This easy modification was successfully
used to detect antimicrobial compounds from a Congolese med-
[1] J.L. Rios, M.C. Recio, A. Villar, J. Ethnopharmacol. 23 (1988)
127–149.
[2] I. Ahmad, A.Z. Beg, J. Ethnopharmacol. 74 (2001) 113–123.
[3] M.O. Hamburger, G.A. Cordell, J. Nat. Prod. 50 (1987) 19–22.
248
109
[4] L.V. Stamm, F.C. Gherardini, E.A. Parrish, C.R. Moomaw, Infect.
Immun. 59 (1991) 1572–1575.
[11] W.J. Begue, R.M. Kline, J. Chromatogr. 64 (1972) 182–184.
[12] C.B.A. 1.05638, in Merck, Darmstadt, Germany, 2000.
[5] L. Botz, S. Nagy, B. Kocsis, in Sz. Nyiredy (ed.), Planar Chromatography: A Retrospective View for the Third Millennium, Springer,
Budapest, 2001.
[13] NCCLS, Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for
bacteria that grow aerobically, Washington, 2003.
[6] S. Nagy, B. Kocsis, T. Kõszegi, L. Botz, J. Planar Chromatogr. 15
(2002) 132–137.
[14] K.H. Nealson, J.W. Hastings, Microbiol. Rev. 43 (1979) 496–
518.
[7] K. Kambu, Eléments de Phytothérapie comparée: plantes médicinales africaines, C.R.P., Kinshasa, 1990.
[15] M.R. Ganjalikhanya, B. Ranjbara, S. Hosseinkhanib, K. Khalifeha, L. Hassania, J. Mol. Catal. B: Enzyme 62 (2009) 127–132.
[8] S. Parvez, C. Venkataraman, S. Mukherji, Environ. Int. 32 (2006)
265–268.
[16] K. Thirupathi, S. Sathesh Kumar, V.S. Raju, B. Ravikumar,
D.R. Krishna, G. Krishna Mohan, J. Nat. Rem. 8 (2008) 1–10.
[9] P.N. Okusa, O. Penge, M. Devleeschouwer, P. Duez, J. Ethnopharmacol. 112 (2007) 476–481.
[17] M. Davere, M. Bahadir, Chemosphere 28 (1994) 261–271.
Ms received: December 23, 2008
Accepted: February 23, 2010
[10] H. Wagner, S. Bladt, Plant Drug Analysis, Springer, Berlin, 1996.
249
110
4.3. Férulaldéhyde et Lupéol : Composés antimicrobiens direct et indirect des écorces de
racines de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Dans la section 4.1 nous avons rapporté l’activité antimicrobienne directe (extrait
méthanolique) et indirecte (extrait n-hexanique) des racines de Cordia gilletii. Dans le but
d’isoler les composés responsables de l’activité de ces extraits, ceux-ci ont été fractionnés par
une succession de chromatographies sur colonnes et sur couche mince préparative.
L’extrait méthanolique a ainsi été soumis à un fractionnement bio-guidé, l’activité
antibactérienne étant suivie par la technique de CCM-bioautographie optimisée telle que
décrite à la section 4.2. Ce fractionnement a permis d’isoler un phénylpropanoïde, le
ferulaldéhyde (4-hydroxy-3-méthoxycinnamaldéhyde). Ce composé a montré des effets
antibactérien direct sur des bactéries à gram positif (S. aureus ATCC 6538 et S. aureus
C100459, une souche résistante à la méthicilline) et à gram négatif (E. coli ATCC 25922 et P.
aeruginosa ATCC 9027) avec des CMI allant de 25 à 100 µg/ml. Des propriétés
antiplasmodiale (sur P. falciparum 3D7, IC50 : 24,6 µg/ml) et antioxydante (test au DPPH,
IC50 : 22,6 µg/ml) ont également été observées pour le férulaldéhyde. L’activité biologique
que nous avons observée avec le férulaldéhyde pourrait justifier, d’une part, l’effet de l’extrait
méthanolique décrit à la section 4.1 et, d’autre part, certains usages traditionnels des extraits
polaires des racines de C. gilletii. Cependant nous devons signaler que le férulaldéhyde n’est
pas le seul composé responsable de l’activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique des
racines de C. gilletii. En effet au cours du fractionnement bio-guidé, d’autres composés actifs
ont été détectés par CCM-bioautographie ; ces composés en faible quantité, n’ont pas pu être
isolés, suggérant ainsi que ce sont des composés particulièrement actifs qui méritent une étude
plus poussée.
Le fractionnement de l’extrait n-hexanique a permis d’isoler un composé actif, le lupéol
(triterpène), qui a montré une activité antibactérienne indirecte en réduisant la CMI de
certains antibiotiques d’un facteur allant de 4 à 8 vis-à-vis d’une souche de S. aureus
résistante à la méthicilline. Cet effet justifie l’activité antimicrobienne indirecte observée avec
l’extrait n-hexanique à la section 4.1 et constitue une voie intéressante dans la recherche des
inhibiteurs de mécanismes de résistance aux antibiotiques. Si le présent travail décrit pour la
première fois le lupéol dans C. gilletii, ce composé a cependant déjà été identifié dans une
autre espèce du genre Cordia sous forme d’hétéroside. Plusieurs activités biologiques du
lupéol ont déjà été décrites, notamment les effets anti-inflammatoire, hépato-protecteur,
111
hypotenseur, anticancereux et faiblement antimicrobien. Mais l’activité antimicrobienne
indirecte (effet sur la résistance aux antibiotiques) du lupéol est rapportée pour la première
fois dans ce travail. Dans l’extrait n-hexanique, un autre triterpène, la friedéline, a été isolé ;
ce composé n’a cependant pas montré d’activité antimicrobienne directe ni indirecte.
112
Ferulaldehyde and Lupeol as direct and indirect antimicrobial
compounds from Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae) root barks
Philippe N. Okusa1,2,*, Caroline Stévigny1, Marie Névraumont1, Michel Gelbcke3, Pierre Van
Antwerpen3, Jean Claude Braekman1 and Pierre Duez1,2
1
Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Faculté de Pharmacie, Université
Libre de Bruxelles, CP 205/09, Bld du Triomphe, 1050 Brussels, Belgium
2
Service de Chimie Thérapeutique et Pharmacognosie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de
Mons, 20 Place du Parc, 7000 Mons, Belgium
3
Laboratoire de Chimie Pharmaceutique Organique, Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, CP
205/09, Bld du Triomphe, 1050 Brussels, Belgium
Keywords: Cordia gilletii, Boraginaceae, ferulaldehyde, lupeol, antimicrobial
* Corresponding author. Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Faculté de
Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Bld du Triomphe, CP 205/09, 1050 Brussels, Belgium.
Fax: 0032 2 650 5430.
à soumettre au journal “International Journal of Antimicrobial Agents”.
113
Abstract
Bacterial antibiotic resistance has become a serious problem of public health that concerns
almost all antimicrobial agents and that manifests in all fields of their application.
Consequently, there is an increasing interest in the search for new compounds able to act by a
direct antimicrobial effect or by inhibiting major resistance mechanisms of microorganisms of
medical importance. As medicinal plants nowadays remain a valuable source for this kind of
compounds, Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae), a medicinal plant used against infectious
diseases in Democratic Republic of Congo, was investigated for direct and indirect
antimicrobial properties. On one hand, the methanol extract is active against many pathogenic
bacteria, including resistant strains.
Its bio-guided fractionation led to the isolation of
ferulaldehyde; this compound showed antimicrobial and antioxidant properties that may
support the activity we observed for the methanol extract but also some of C. gilletii
traditional uses. On the other hand, the n-hexane extract of root barks possesses indirect
antimicrobial properties, enhancing the activity of antibiotics against methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA). The fractionation of this extract led to the isolation of
lupeol, which decreases the minimum inhibitory concentration of several antibiotics (4 to 8
folds) against MRSA and contributes to the effects observed for the raw n-hexane extract.
114
1. Introduction
Infectious diseases remain a major public health problem throughout the world. They still
represent the main cause of the high mortality rates recorded in developing countries,
whereas, in industrialized countries, an alarming incidence of antibiotic resistance is
observed. There is then an increasing need for new compounds that can act either by a direct
antimicrobial effect or by inhibiting resistance mechanisms developed by microorganisms of
medical importance [1, 2]. Natural resources, particularly medicinal plants traditionally used
against many infectious diseases, represent a high potential for discovering such compounds
[3]. Indeed, in modern therapeutic, medicinal plants have always been an important source of
lead compounds in the search for new drugs and medicines [4]. Although many studies report
the antimicrobial properties of secondary metabolites isolated from medicinal plants, it is
estimated that less than 10% of these compounds have been characterized [5]. Such
antimicrobial compounds are part of the "vegetal immunity", a complex set of defense
mechanisms evolved by plants as a protection against predation by microorganisms, insects
and herbivores; phenolic compounds and terpenoids from essential oils are notably known for
such direct antimicrobial properties [4]. Moreover, some phytochemical compounds, although
lacking antimicrobial activity, display an indirect effect by interfering with resistance
mechanisms of microorganisms, thus enhancing or restoring the activity of some antibiotics
[6]. Direct and indirect antimicrobials belong to diverse phytochemical groups that have been
uncovered in many botanical families [4].
The leaves and root barks of Cordia gilletii De Wild are traditionally used against infectious
diseases in Democratic Republic of Congo [7]. In the genus Cordia, many compounds
belonging to several phytochemical groups [e.g. alkaloids (gluturamide and pyrrolizidine),
triterpenes, meroterpenoid naphthoquinones, flavonoids, phenylpropanoids] have been
reported [8]. To the best of our knowledge, the only published phytochemical study about C.
gilletii investigated the composition of essential oils extracted from its leaves [9] with no
report so far on root barks chemical compounds. In a previous work from our group, root
barks polar extracts displayed direct antimicrobial and antioxidant effects, whereas apolar
extracts showed indirect antibacterial effect, enhancing or restoring the activity of some
antibiotics against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) [1]; the present paper
deals with the isolation and identification of the major active compounds from these Cordia
gilletii root bark extracts.
115
2. Material and methods
2.1. Plant material
Root barks and leaves of Cordia gilletii De Wild were collected in January 2005 in Kisantu
area (Democratic Republic of Congo; latitude south 05° 07’, longitude east 15° 06’), washed
and dried at ambient temperature in the shade. The plant identity was confirmed by specialists
of the Herbarium of the National Botanical Garden of Meise, Belgium, where a voucher
specimen has been deposited under the number BR-SP.627986.
2.2. Fractionation
Since our previous work has shown that the n-hexane and methanol extracts from root barks
present indirect and direct antimicrobial effects, respectively [1], these two extracts were
chosen for fractionation. Thus1 kg of Cordia gilletii root bark were powdered and
sequentially extracted (percolation) by 4 l of n-hexane (yield, 1.2 g), dichloromethane (yield,
3.2 g), ethyl acetate (yield, 1.6 g) and methanol (yield, 33.1 g).
The n-hexane extract (1.2 g), interesting for its indirect antibacterial effect, was fractionated
by column chromatography over silicagel (40 – 63 µm, i.d. 2.5 x 30 cm, Merck, Germany)
using gradient mixtures of petroleum ether (40-60°C) and diethyl ether (Et2O) of increasing
polarities (0 – 100 % Et2O). The fractions (100 ml each) were monitored by thin-layer
chromatography (TLC) and combined to give ten fractions. Active fractions were submitted to
flash chromatography on pre-packed silicagel (40 – 63 µm) polyethylene cartridge (Super
Flash 15 – 12 g, Interchim, Montluçon, France) eluting with n-hexane and ethyl acetate
gradients (0 – 100 % ethyl acetate). The obtained sub-fractions were finally purified by
preparative TLC on silicagel 60 F 254 (Merck, Germany) with n-hexane : ethyl acetate :
acetic acid (80/20/2) as mobile phase. Compound 1 (32 mg) was isolated from fraction 3,
whereas compound 2 (24 mg) was obtained from fraction 7.
33.1 g of the methanol extract, active against gram positive and gram negative bacteria, were
submitted to a bio-guided (activity against S. aureus ATCC 6538) fractionation over silicagel
(40 – 63 mesh, i.d. 2.5 x 30 cm) using mixtures of dichloromethane and methanol (0 – 100 %
methanol) to yield nine fractions combined upon TLC monitoring. The first five fractions,
active against S. aureus ATCC 6538, were flash chromatographed over silicagel using nhexane and ethyl acetate (0 – 100 % ethyl acetate) for further purification. Thus from the third
fraction, compound 3 (2.1 mg) was isolated and purified by preparative TLC over silicagel 60
116
F 254 (Merck, Germany) using dichloromethane and methanol (90/10) as mobile phase. No
further active compounds could be characterized from the other active fractions, because the
yields were too low.
2.3. Spectral analysis
1
H and 13C (BBD, Dept 135) NMR spectra were recorded on a Bruker Avance 300 at 300 and
75 MHz, respectively, using CDCl3 as solvent and TMS as internal standard. HRESI-MS
were measured on an Agilent 6520 accurate-Mass Q-TOF LC/MS equipped with an ESI
source (positive mode).
2.4. Biological tests
2.4.1. Bacterial strains
The microorganisms used for the antibacterial tests were Gram-positive (Staphylococcus
aureus ATCC 6538 and Staphylococcus aureus C100459) and Gram-negative (Escherichia
coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) bacteria. The ATCC strains
were obtained from the American Type Culture Collection, whereas the S.aureus C100459
was a clinical isolate from the Centre Hospitalier Universitaire of Charleroi, Belgium; this
strain was a confirmed methicillin-resistant S. aureus (MRSA; no inhibition zones were
observed with methicillin and oxacillin).
2.4.2. Antimicrobial activity
The direct antibacterial effect was evaluated by two methods.
(i) Broth microdilution method [1, 10]. Plant extracts or isolated compounds were dissolved
in dimethylsulfoxide (DMSO) and diluted with Mueller Hinton broth to yield a 5%final
DMSO concentration; this solution was transferred in 96-wells plates and serially diluted
(base 2 logarithmic dilutions) with Mueller Hinton broth. 24 h cultures of microbial strains
were stirred with 0.9% NaCl to achieve 0.5 McFarland (108cells/ml), diluted 1/100 to achieve
106 cells/ml and inoculated in the 96-wells plates (100 µl/well). The cultures were incubated
at 37°Cfor 24 h under atmospheric conditions. The minimum inhibitory concentration (MIC)
was the lowest concentration of extract / compound that completely inhibited the growth of
microorganisms in the microdilution wells, the minimum bactericidal concentration (MBC)
was determined by sub-culturing the negative wells on a Mueller Hinton agar plate and was
the lowest concentration that yielded negative sub-cultures.
117
(ii) TLC-bioautography [11]. TLC was performed in duplicate on 10 cm x 5 cm precoated
silicagel 60 F254 glass plates (Merck, Darmstadt, Germany). The plates were developed over
8.5 cm with either dichloromethane or dichloromethane-methanol (90:10 or 80:20), then dried
at 40°C for 2 h. One set of plates was used as the reference chromatogram; spots were
visualized under UV light at 245 nm. For bioautography, 1 ml of 0.5 McFarland
microorganism suspension (approx. 108 cells/ml) was diluted with 9 ml of a mixture of MH
broth and agar 90/10 at 37°C and aseptically distributed over the plate. After solidification of
the medium at ambient temperature, the TLC plate was incubated overnight at 37°C. The
bioautogram was subsequently sprayed with an aqueous solution of MTT 0.8 mg/ml and
incubated at 37°C for 4 h; the MTT is converted to a formazan dye by the microorganisms
and active compounds are indicated by inhibition zones observed as clear spots against a
purple background [10].
2.4.3. Indirect antimicrobial effect
To study the effect on antibiotic resistance (indirect antibacterial effect), the extracts or
compounds with no direct antibacterial activity were dissolved in DMSO and diluted in
Mueller Hinton broth as in 2.4.2. The MICs of different antibiotics against Staphylococcus
aureus C100459, a MRSA clinical isolate, were then determined. Suitable controls were
prepared with media without plant extract [1].
2.4.4. Antioxidant activity
The antioxidant activity was assessed by the measurement of the scavenging ability of the
compounds towards the stable free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH); the radical
DPPH is reduced to the corresponding colorless hydrazine upon reaction with hydrogen
donors [12]. Serial dilutions of plant compounds dissolved in methanol were mixed with
200 µl of methanolic 0.004% DPPH in 96-wells microtiter plates and left for 30 min in the
dark; the absorbances were measured with a LabsystemsiEMS reader/dispenser MF
(Labsystems, Finland) at 540 nm, using methanol as blank. To determine the IC50 (the
concentration of plant compound that quenches 50% of DPPH), all the experimental results
obtained from three separate experiments in quadruplicate were fitted to a parametric function
in Systat 7.1 (Systat Software): N=N0 e−kC, where C is the concentration; N the percentage of
DPPH remaining at concentration C; N0, the percentage of DPPH at concentration 0, and k are
the parameters.
118
3. Results
Isolated compounds
Compound 1 (friedelin): white powder; HRESI-MS: m/z 427.3950 (MH+, calculated mass:
427.3934, error: 3.6 ppm) compatible with C30H51O; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz): see Table
1; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.74 (3H, s), 0.89 (3H, s), 0.91 (3H, s), 0.97 (3H, s), 1.01
(3H, s), 1.03 (3H, s), 1.07 (3H, s), 1.20 (3H, s).
Compound 2 (lupeol): white powder; HRESI-MS: m/z 427.3942 (MH+, calculated mass:
427.3934, error: 1.8 ppm) compatible with C30H51O; 13C NMR (CDCl3, 75 MHz): see Table
1; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ = 0.78 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.85 (3H, s), 0.88 (3H, s), 0.96
(3H, s), 0.99 (3H, s), 1.05 (3H, s), 1.68 (3H, s), 3.21(1H, m), 4.70 (1H, d), 4.58 ppm (1H, d).
Compound 3 (ferulaldehyde): pale yellow oil; HRESI-MS: m/z179.0699 (MH+, calculated
mass: 179.0709, error: 5.6 ppm) compatible with C10H11O3; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz): δ =
9.66 (d, J = 7.7, 1H, H-9), 7.40 (d, J = 15.8, 1H, H-7), 7.13 (dd, J = 8.2, 1.9, 1H, H-6), 7.07
(d, J = 1.8, 1H, H-2), 6.96 (d, J = 8.2, 1H, H-5), 6.60 (dd, J = 15.8, 7.7, 1H, H-8), 5.96 (s,
1H, H-4), 3.95 (s, 3H, H-10).
119
Table 1.13C NMR chemical shifts of compounds 1 and 2.
Position
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
Compound 1 (Friedelin)
δC (ppm)
Multiplicity
22.64
CH2
41.89
CH2
213.58
C
58.58
CH
42.5
C
41.65
CH2
18.59
CH2
53.46
CH
37.8
C
59.83
CH
35.98
CH2
30.86
CH2
40.06
C
38.65
C
32.78
CH2
36.37
CH2
30.35
C
43.15
CH
35.7
CH2
28.53
C
33.13
CH2
39.61
CH2
7.18
CH3
15.01
CH3
18.3
CH3
20.62
CH3
19.02
CH3
32.45
CH3
35.38
CH3
32.15
CH3
Friedelin
Compound 2 (Lupeol)
δC (ppm)
Multiplicity
39.07
CH2
27.78
CH2
79.37
CH
39.22
C
55.66
CH
18.68
CH2
34.64
CH2
41.19
C
50.8
CH
37.53
C
21.29
CH2
25.5
CH2
38.41
CH
43.19
C
27.79
CH2
35.95
CH2
43.36
C
48.66
CH
48.34
CH
151.33
C
30.21
CH2
40.36
CH2
28.35
CH3
15.72
CH3
16.48
CH3
16.34
CH3
14.91
CH3
18.36
CH3
109.67
CH2
19.67
CH3
Lupeol
Ferulaldehyde
Figure 1. Structures of the compounds isolated from Cordia gilletii root barks
120
Direct antimicrobial effect
Compound 3, isolated from the methanol extract, was identified as ferulaldehyde (Figure 1)
by comparison with spectral data reported in the literature [13]. Ferulaldehyde displayed
direct antibacterial effect against S. aureus (sensitive and resistant strains), E. coli and P.
aeruginosa with MICs values ranging between 25 and 100 µg/ml (Table 3). TLCbioautography revealed the effect of ferulaldehyde against S. aureus down to a loading
quantity of 1 µg (Figure 2). Ferulaldehyde displayed also antioxidant effect by scavenging the
DPPH free radical with an IC50 of 22.6 µg/ml, corresponding to 7% of the activity of the
standard quercetin.
Table 3. Direct antimicrobial effects of the raw methanolic extract and ferulaldehyde (3)
Microorganisms
MIC (µg/ml)
Tetracycline
a
Raw methanolic
extract
Ferulaldehyde
1
125
25
1
125
25
2
500
50
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027
8
500
100
Legend: MIC, Minimum inhibitory concentration ; a reference antimicrobial
Figure 2. Compound 3 (Ferulaldehyde); applied quantities are expressed in µg. Left,
detection UV light 254 nm. Right, TLC bioautography revealed by MTT (resistant strain S.
aureus C100459); active compounds appear as clear spots over a purple background.
121
Indirect antimicrobial effect
Compounds 1 and 2 (Figure 1), isolated from the n-hexane extract, have been identified as
friedelin and lupeol respectively by comparison of their spectral data (1H NMR, 13C NMR and
MS) with those reported in the literature [14-16]. Compound 2 showed an interesting indirect
antibacterial effect by decreasing the MICs of penicillin (8 fold), cefotaxim (4 fold) and
streptomycin (4 fold) against MRSA (Table 2). Compound 1 did not show any activity in the
other biological assays evaluated in this study.
Table 2. Minimum inhibitory concentrations of antibiotics against Staphylococcus aureus C100459 in
the absence and in the presence of n-hexane raw extract, compounds 1 (friedelin) and 2 (lupeol)
MICs (µg/ml)a
Antibiotic
Antibiotic
alone
Antibiotic + n-hexane
raw extract
(100 µg/ml)
Antibiotic + friedelin (1)
(20 µg/ml)
Antibiotic + lupeol (2)
(20 µg/ml)
Penicillin
8
1 (8 foldsb)
8
1 (8 folds)
Cefotaxim
8
2 (4 folds)
8
2 (4 folds)
Streptomycin
4
1 (4 folds)
4
1 (4 folds)
a
Bold font indicates a decrease of MICs (MICs for the combination lower than for antibiotic alone).
b
Reduction factor of the antibiotic MIC
4. Discussion
Direct antimicrobial effect
Compound 3, ferulaldehyde, isolated from the methanol extract, showed direct antibacterial
effect against S. aureus (sensitive and resistant strains), E. coli and P. aeruginosa with MICs
values ranging between 25 and 100 µg/ml (Table 3). Other biological activities such as
antiparasitic and antiiflammatory have been reported for this compound (Carpinelle et al.,
2003; Tucsek et al., 2010). Ferulaldehyde is an end-product of polyphenol degradation
(Tucsek et al., 2010) and belongs to the phenylpropanoids (PPs), the largest group of
secondary metabolites produced by plants, mainly in response to biotic or abiotic stresses
such as infections, wounding, exposure to ozone and other hostile environmental conditions.
It is thought that the molecular basis for the protective action of phenylpropanoids in plants
resides in their antioxidant and free radical scavenging properties [17]. PPs are major
biologically active components of traditional medicinal plants but also of human diet,
including spices, aromas, wines, beer, essential oils, propolis. This direct antibacterial effect
observed with compound 3 was bactericidal for Gram-positive bacteria (MBCs = MICs) and
122
bacteriostatic for Gram-negative bacteria (MBCs within four-fold dilutions of the MICs). This
may explain, but only in part, the activity of the methanol extract which displays direct
antimicrobial effect with MICs values from 125 µg/ml to 500 µg/ml (Table 3). Indeed during
the bio-guided fractionation of this extract, other antimicrobial compounds have been detected
by TLC-bioautography. Although they contribute to the activity of the extract, these active
compounds could not be isolated because their yields were too low, suggesting thus that they
are active at very low concentrations. Ferulaldehyde displayed antioxidant effect by
scavenging the DPPH free radical with an IC50 of 22.6 µg/ml, corresponding to 7% of the
activity of the standard quercetin. This antioxidant property can explain at least in part the
observed free radical scavenging effect of the methanol extract and support the use of C.
gilletii for wound healing effect since quenching reactive oxygen species prevents their
deleterious effect on wound healing process [18].
Indirect antimicrobial effect
There is an increasing interest in natural triterpenoids due to their wide spectrum of biological
activities. Triterpens are a widespread group of natural compounds which are important
components of plant membranes. Lupeol is a pentacyclic triterpenoid compound found in
many medicinal plants. In the genus Cordia, its glycosides have already been identified [19],
but this is the first report of the presence of lupeol in the species Cordia gilletii. Several
biological activities of lupeol have been published; this compound shows anti-inflamatory,
hepatoprotective, hypotensive, anticancer and weak antimicrobial properties [20]. But no
indirect antimicrobial property (effect on antibiotic resistance) has been reported so far. The
present work is then the first report of this original and interesting activity of lupeol, in
addition to the many other biological activities already described. The enhancement of
antibiotic activity observed with lupeol may explain the indirect effect observed for the nhexane extract against MRSA [1] and constitutes an interesting finding in the search for
inhibitors of antibiotic resistance.
Some pentacyclic triterpenoids have previously been shown to modulate the antibiotic
resistance of pathogenic bacteria, including oleanolic acid, ursolic acid, α-amyryn, betulinic
acid and betulinaldehyde [21, 22]. If the mechanisms by which these compounds modulate
antibiotic resistance are not known, we must point out that all these five compounds have in
common a hydroxyl group attached to C3 and two methyl groups in C4; the presence of a
carboxylic or an aldehyde function does not seem to be important for this activity (Figure 3).
123
Other triterpenoids warrant further investigation and comparison of potencies to allow
developing a real structure-activity relationship.
Betulinic acid ; R = COOH
α-Amyrin:R1 = R2 = R4 = CH3; R3 = H
Betulinaladehyde ; R = CHO
Oleanolic acid: R1 = H; R2 = R3 = CH3; R4 = COOH
Lupeol : R = CH3
Ursolic acid: R1 = R2 = CH3; R3 = H; R4 = COOH
Friedelin
Figure 3.Comparison of lupeol with triterpenoids reported as modulators of antibiotic
resistance.
The resistance of MRSA to antibiotics is partly attributed to the production of a penicillin
binding protein (PBP) 2a, which interacts with β-lactams, although much less strongly than
other PBPs. The development of efflux pumps and of mechanisms that make it difficult for
antibiotics to penetrate bacterial colonies also contribute to antibiotic resistance [23]. Some
compounds belonging to the phytochemical group of terpenoids have been found to interact
with the expression of PBP2a, reducing thus the resistance of MRSA to β-lactams (totarol)
[24]. Other terpenoids have been shown to present an indirect antimicrobial effect (i) either
through the decrease of the stability of the MRSA cell membrane, which decreases the βlactams MICs (nerolidol) [25]; (ii) or by the inhibition of the major facilitator superfamily
(MFS) efflux pumps, restoring the activity of some antibiotics like erythromycin (carsonic
acid) [26]. All these mechanisms are possible ways by which triterpenoids could also
modulate antibiotic resistance.
The structure of lupeol being not very different from cholesterol, this compound is expected
to be able to enter the microbial membrane, possibly disturbing its architecture and maybe
enhancing its permeability to antibiotics. Indeed, it has been shown that lupeol possesses
indirect antiplasmodial effect; it is able to incorporate and disturb the erythrocyte membrane
irreversibly, shaping human erythrocytes into stomatocytes, unsuitable for parasites growth
[27].
Compound 1, another triterpenoid isolated from C. gilletii and identified as friedelin, did not
show any antimicrobial activity; its chemical structure lack some elements found in
124
pentacyclic triterpenoids modulating antibiotic resistance, hydroxyl and two methyl groups in
C3 and C4 respectively. Although friedelin has not been reported so far in the genus Cordia,
it has been identified in other Boraginaceae species [28] and some biological properties such
as
antiulceric,
antiplasmodial,
anti-inflamatory,
weak
antimicrobial
(direct)
and
anticonvulsivant activities have been reported [29-31].
Conclusion
The present work reports for the first time the phytochemical investigation of direct and
indirect antimicrobial extracts of C. gilletii root barks. The methanol extract, directly active
against many microorganisms, yielded the active compound ferulaldehyde which displayed
antimicrobial and antioxidant effects. These effects are common to many phenylpropanoids,
which are well known to display antimicrobial and antioxidant effects. The fractionation of
the n-hexane extract, interesting for its indirect effect against MRSA, led to the isolation of an
active compound, lupeol, which decreased the MIC of some antibiotics (4 to 8 folds) against
MRSA. Another compound, friedelin, was also isolated from this extract, but this compound
was inactive.
Our results suggest that C. gilletii may help to fight infectious diseases through its direct
antimicrobial effect (with ferulaldehyde) and its indirect activity, enhancing or restoring the
activity of antibiotics against multi-resistant microorganisms (with lupeol); this supports the
notion that medicinal plants can provide not only antimicrobial agents, but also inhibitors of
antibiotic resistance. Finally, we must point out that C. gilletii, although belonging to the
family of Boraginaceae, one of the most important botanical families of plants producing
pyrrolizidine alkaloids (PAs), does not harbor these alkaloids in investigated samples
(detection limit, 2 ppm) [32], excluding thus toxicological risk due to PAs and ensuring a
probable safe use of this plant.
References
1.
2.
3.
4.
5.
Okusa, P.N., et al., Direct and indirect antimicrobial effects and antioxidant activity of Cordia gilletii
De Wild (Boraginaceae). J Ethnopharmacol, 2007. 112(3): p. 476-81.
Okusa, P.N., C. Stévigny, and P. Duez, Medicinal Plants: A Tool to Overcome Antibiotic Resistance?,
in Medicinal Plants Classification, Biosynthesis and Pharmacology, A. Varela and J. Ibañez, Editors.
2009, Nova Science. p. 315-336.
Evans, W.C., Trease and Evans Pharmacognosy. 2009, London: Saunders. 603.
Cowan, M.M., Plant products as antimicrobial agents. Clin Microbiol Rev, 1999. 12(4): p. 564-82.
Schultes, R.E., The Kingdom of plants, in Medecines from the Earth, McGraw-Hill, Editor. 1978,
W.A.R. Thomson ed.: New York. p. 208.
125
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
Cragg, G.M., et al., Ethnobotany and drug discovery: the experience of the US National Cancer
Institute. Ciba Found Symp, 1994. 185: p. 178-90; discussion 190-6.
Kambu, K., Eléments de Phytothérapie comparée: plantes médicinales africaines. 1990, Kinshasa:
C.R.P.
Thirupathi, K., et al., A review of medicinal plants of the genus Cordia: their chemistry and
pharmacological uses. Journal of Natural Remedies, 2008. 8(1): p. 1-10.
Bonesi, M., et al., Chemical composition, antioxidant properties and anti-cholinesterase activity of
Cordia gilletii (Boraginaceae) leaves essential oil. Nat Prod Commun, 2011. 6(2): p. 253-7.
NCCLS, ed. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically.
6th ed. Approved Standard. Vol. M7-A6. 2003: Washington.
Okusa, P.N., et al., Optimization of the Culture Medium Used for Direct TLC–Bioautography.
Application to the Detection of Antimicrobial Compounds from Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae).
Journal of Planar Chromatography-Modern TLC, 2010. 23(4): p. 245-249.
Pandey, M.M., et al., Free radical scavenging potential of Saussarea costus. Acta Pharm, 2005. 55(3):
p. 297-304.
El-Hassan, A., et al., Bioactive constituents of Leptadenia arborea. Fitoterapia, 2003. 74(1-2): p. 184-7.
Mahato, S.B. and A.P. Kundu, 13C NMR spectra of pentacyclic triterpenois - A compilation and some
salient features. Phytochemistry, 1994. 37(6): p. 1517-1575.
Nozaki, H., et al., Antitumour triterpenes of Maytenus diversifolia. Phytochemistry, 1986. 25(2): p. 479485.
Burns, D., et al., Assignment of 1H and 13C spectra and investigation of hindered side-chain rotation in
lupeol derivatives. Magn Reson Chem, 2000. 38(7): p. 488-493.
Korkina, L.G., Phenylpropanoids as naturally occurring antioxidants: from plant defense to human
health. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 2007. 53(1): p. 15-25.
Singh, M., et al., Antimicrobial, wound healing and antioxidant activity of Plagiochasma
appendiculatum Lehm. et Lind. J Ethnopharmacol, 2006. 107(1): p. 67-72.
Tiwari, K.P. and S.S. Srivastava, Chemical investigation of the stem bark of Cordia obliqua. Planta
Med, 1979. 36(2): p. 191-2.
Gallo, M.B.C. and M.J. Sarachine, Biological activities of lupeol. International Journal of Biomedical
and Pharmaceutical Sciences, 2009. 3(1): p. 46-66.
Chung, P.Y., P. Navaratnam, and L.Y. Chung, Synergistic antimicrobial activity between pentacyclic
triterpenoids and antibiotics against Staphylococcus aureus strains. Ann Clin Microbiol Antimicrob,
2011. 10: p. 25.
Kurek, A., et al., Modulation of antibiotic resistance in bacterial pathogens by oleanolic acid and
ursolic acid. Phytomedicine, 2012. 19(6): p. 515-9.
Rice, L.B., D. Sahm, and R.A. Banomo, Mechanisms of resistance to antimicrobial agents, in Manual
of Clinical Microbiology, P.R. Murray, Editor. 2003, American Society of Microbiology: Washington.
p. 1014-1086.
Nicholson, K., G. Evans, and P.W. O’Toole, Potentiation of methicillin activity against methicillin
resistant Staphylococcus aureus by diterpenes. FEMS Microbiology Letters, 1999. 66: p. 233-239.
Hatano, T., et al., Effects of tannins and related polyphenols on methicillin-resistant Staphylococcus
aureus. Phytochemistry, 2005. 66(17): p. 2047-55.
Oluwatuyi, M., G.W. Kaatz, and S. Gibbons, Antibacterial and resistance modifying activity of
Rosmarinus officinalis. Phytochemistry, 2004. 65(24): p. 3249-54.
Ziegler, H.L., et al., In vitro Plasmodium falciparum drug sensitivity assay: inhibition of parasite
growth by incorporation of stomatocytogenic amphiphiles into the erythrocyte membrane. Antimicrob
Agents Chemother, 2002. 46(5): p. 1441-6.
Jain, S.C., B. Singh, and R. Jain, Antimicrobial activity of triterpenoids from Heliotropium ellipticum.
Fitoterapia, 2001. 72(6): p. 666-8.
Queiroga, C.L., et al., Evaluation of the antiulcerogenic activity of friedelan-3beta-ol and friedelin
isolated from Maytenus ilicifolia (Celastraceae). J Ethnopharmacol, 2000. 72(3): p. 465-8.
Tamokou Jde, D., et al., Antimicrobial activities of methanol extract and compounds from stem bark of
Vismia rubescens. J Ethnopharmacol, 2009. 124(3): p. 571-5.
Ngouamegne, E.T., et al., Endodesmiadiol, a friedelane triterpenoid, and other antiplasmodial
compounds from Endodesmia calophylloides. Chem Pharm Bull (Tokyo), 2008. 56(3): p. 374-7.
Okusa, P.N., et al., Absence of pyrrolizidine alkaloids in Cordia gilletii de wild (boraginaceae).
Biochemical Systematics and Ecology, 2012. 41: p. 1-2.
126
4.4. Autres activités biologiques de Cordia gilletii
Dans
les
sections
précédentes,
nous
avons
traité
essentiellement
des
activités
antimicrobiennes directe et indirecte, ainsi que de l’effet antioxydant. Etant donné que les
feuilles et les écorces de racines de Cordia gilletii sont utilisées dans le traitement traditionnel
de la malaria, nous nous sommes intéressé à évaluer in vitro les extraits obtenus à partir de ces
deux drogues sur Plasmodium falciparum, le principal parasite responsable de la malaria.
Dans cette section, nous avons également abordé un aspect original du traitement des
maladies infectieuses consistant, non pas à éliminer les microorganismes, mais à en inhiber la
virulence en modulant l’expression de gènes impliqués dans le quorum sensing, un
mécanisme régulant la production des facteurs de virulence chez certains pathogènes. Une
telle approche, si elle réussit, permet de réduire la pression de sélection exercée généralement
par les antimicrobiens et d'éviter l'apparition de souches résistantes. Nous avons déjà montré
dans la Section 4.2. que les extraits de C. gilletii modulent le quorum sensing de Vibrio
fischerii et l'effet de ces extraits est étudié ici sur le QS de Pseudomonas aeruginosa.
127
4.4.1. Activité antiplasmodiale
L’espèce Cordia gilletii est également utilisée traditionnellement en République
Démocratique du Congo pour combattre la malaria. Dans le but de justifier cet usage, nous
avons évalué l’activité antiplasmodiale des extraits obtenus à partir des feuilles et des écorces
de racines de cette plante par épuisements successifs avec des solvants de polarité croissante.
Les extraits bruts réalisés à l'aide de dicholorométhane, d'acétate d’éthyle et de méthanol ont
montré d’intéressantes activités antiplasmodiales en inhibant la croissance d'une souche
chloroquino-sensible de Plasmodium falciparum (3D7) avec des IC50 allant de 5,1 à
18,6 µg/ml. L’effet observé avec ces extraits permet non seulement de justifier l’usage
traditionnel de cette plante pour traiter la malaria, mais aussi d’envisager d'en poursuivre les
investigations afin d’enrichir l’arsenal thérapeutique contre cette maladie qui fait
annuellement près d’un million de morts à travers le monde.
128
Antiplasmodial activity of Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae).
PRELIMINARY DATA.
Philippe N. Okusa1,2,*, Olivia Jansen3, Caroline Stévigny1, Michel Frédérich3 and Pierre Duez1,2
1
Université Libre de Bruxelles, Laboratoire de pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Bld
du Triomphe, CP 205/09, 1050 Brussels, Belgium
2
Université de Mons, Service de Chimie Thérapeutique et Pharmacognosie, 20 Place du Parc, 7000 Mons,
Belgium
3
Université de Liège, Laboratoire de Pharmacognosie, 1 Avenue de l’Hôpital, 4000 Liège, Belgium
Abstract
Leaves and root barks extracts of a Congolese medicinal plant, Cordia gilletii, were
investigated for antiplasmodial properties. For both plant parts, interesting antiplasmodial
effect was observed with the raw dichloromethane, ethyl acetate and methanol extracts. These
results support the antimalarial traditional use of Cordia gilletii which can be considered as a
possible candidate for further investigations in the field of antimalarial drug discovery.
1. Introduction
Malaria is one of the most important infectious diseases around the world, particularly in
Southern countries. It is caused by Plasmodium sp and transmitted by Anopheles mosquitoes.
According to the World malaria Report 2009, there are almost 250 million malaria cases and
about one million people dying of malaria each year (WHO, 2009). The majority of deaths
from malaria occur in the sub-Saharan African region (89%), particularly in children under 5
years of age (88%). It is estimated that one child dies of malaria every 40 seconds. The
situation is critical as, on one hand, the rural people of sub-Saharan African region have a
limited access to adequate health service and, on the other hand, there is a growing problem of
parasite resistance towards available drugs, particularly chloroquine. It is thus necessary to
continue research for new antimalarial drugs or for drugs that can inhibit resistance of
Plasmodium sp to available medicines. Medicinal plants from traditional pharmacopoeias
129
could lead not only to new antimalarial “lead compounds”, but also to the valorization of
traditional remedies by pharmacological and phytochemical investigations.
In this work, we investigated the antiplasmodial effects of raw extracts from a Congolese
medicinal plant, Cordia gilletii De Wild, whose root barks and leaves are traditionally used
against many diseases, including infections and malaria(Kambu, 1990).
2.1. Plant material and extracts preparation
Root barks and leaves of Cordia gilletii were collected in Kisantu area (Democratic Republic
of Congo) by Mr Nzeza (Jardin Botanique de Kisantu) in January 2005; the identity of the
plant was confirmed by the specialists of the National Botanical Garden of Meise, Belgium,
where a voucher specimen has been deposited under the number BR-SP.627986.
Hundred grams of Cordia gilletii root bark / leaves powder were exhaustively extracted either
with 800 ml of methanol (total extract; yield, 5.6 g / 4.8 g) or successively with solvents of
increasing polarity (percolation) by 800 ml of n-hexane (yield, 0.11 g / 1.3 g),
dichloromethane (yield, 0.35 g / 4.2 g), ethyl acetate (yield, 0.18 g / 1.9 g) and methanol
(yield, 4.17 g / 1.8 g). The evaporation of the solvents under reduced pressure (40°C)
provided the extracts which were dissolved in DMSO to achieve 10 mg/ml.
2.2. Antiplasmodial tests
Continuous cultures of the Plasmodium falciparum, chloroquine-sensitive (3D7) strain were
maintained following the method of Trager and Jensen (Trager et Jensen, 1976). The strain
was obtained from Prof. Grellier (“Museum National d’HistoireNaturelle” in Paris, France).
The Plasmodium falciparum culture was placed in contact with a set of 8 twofold dilutions of
each extract in culture medium (final concentrations ranging from 0.8 to 100 µg/ml;
finalDMSO concentration being ≤ 1%) on 2 columns of a 96-well microplate for 48 h.
Parasite growth was estimated by colorimetric measurement (630 nm) of the parasite lactate
deshydrogenase (pLDH) activity according to a previously described method (Makler et al.,
1993). Chloroquine (Sigma–Aldrich) was used as standard, and infected and uninfected
erythrocytes were added as positive and negative controls, respectively. IC50 values,
indicating the concentration of the drug needed to obtain 50% inhibition of parasite growth,
were calculated by linear regression from a set of eight concentrations tested for each
extract.Each experiment was made in triplicate(Jansen et al., 2010).
130
Total methanol, dichloromethane and ethyl acetate extracts from both leaves and root barks
showed interesting antiplasmodial activity. These two plant parts are traditionally used in the
treatment of infections, including malaria, and for other disorders like skin diseases. There is
no previous report about the antiplasmodial effect of this plant. Nevertheless, in the genus
Cordia, antimalarial compounds such as globiferin, a terpenoid benzoquinone, have
previously been reported in C. globifera W.W. Smith (Dettrakul et al., 2009).
4. Conclusion
Our results support the use of C. gilletii in the treatment of malaria and contribute to the
valorization of the use of this plant in the traditional medicine in Democratic Republic of
Congo. Indeed, the dichloromethane and ethyl acetate extracts from both leaves and root
barks of C. gilletii showed interesting antiplasmodial effect. These extracts can be considered
as candidates for further investigations in the field of antimalarial drug discovery.
Table 1. Antiplasmodial effects of Cordia gilletii extracts
Extracts
IC50(µg/ml)
(mean ± SD)(a)
Leaves
12.0 ± 2.9 (b)
·
Total methanol
·
n-hexane
·
dichloromethane
11.7 ± 3.3
·
ethyl acetate
18.6 ± 7.9
·
methanol
40.2 ± 7.1
>100
Root barks
(a)
(b)
5.1 ± 1.6
·
Total methanol
·
n-hexane
·
dichloromethane
13.7 ± 3.6
·
ethyl acetate
16.8 ± 1.1
·
methanol
76.8 ± 25.7
>100
Data from 3 experiments in duplicate
The antiplasmodial activity of plant extracts is generally classified as follows: IC50 ≤15
µg/ml: promising activity; IC50 = 15–50 µg/ml: moderate activity; IC50 >50 µg/ml:
weak activity; IC50 > 100 µg/ml: inactivity (Jansen et al., 2010)
131
4.4.2. Etude préliminaire de l’activité de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae) sur la
production de facteurs de virulence régulés par le QS chez Pseudomonas
aeruginosa PAO1
Etant donné que, chez de nombreuses bactéries pathogènes, la production de facteurs majeurs
de virulence est régulée par le QS, interférer dans ce mécanisme dans le but d’atténuer leur
virulence représente une stratégie intéressante de lutte qui évite le développement de
résistances. Ainsi les plantes traditionnellement utilisées dans le traitement des maladies
infectieuses
devraient
être
investiguées,
non
seulement
pour
leurs
propriétés
antimicrobiennes, mais aussi pour leur capacité à inhiber les mécanismes de pathogénicité liés
au QS.
C’est dans ce cadre que nous nous sommes proposé d’évaluer l’effet de C. gilletii sur la
production des facteurs de virulence chez P. aeruginosa PAO1. Les extraits de feuilles et de
racines ont été d’abord testés sur la production par P. aeruginosa PAO1 de la pyocyanine, qui
est un facteur de virulence extracellulaire régulé par le QS. Tous les extraits testés ont montré
un effet inhibiteur sur la production de la pyocyanine par rapport au contrôle. Ces extraits ont
ensuite été évalués quant à leur effet sur la transcription de deux gènes impliqués dans le QS,
lasB et rhlA, ainsi que sur la transcription d’un gène contrôle, aceA, qui n’intervient pas dans
le QS, et qui, chez P. aeruginosa, code pour l’isocitrate lyase nécessaire à la croissance de
cette bactérie. Parmi les extraits testés, seul l'extrait dichlorométhane de racines a montré un
effet inhibiteur sur l’expression des deux gènes évalués, sans inhiber celle de aceA, suggérant
ainsi un effet inhibiteur spécifique aux gènes du QS ciblés.
132
Effects of Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae) on the production
of Pseudomonas aeruginosa PAO1virulence factors regulated by
quorum sensing.
PRELIMINARY DATA.
Philippe N. Okusa1,2,*, Tsiry Rasamiravaka3, Olivier Vandeputte3, Caroline Stévigny1,
Mondher El Jaziri3, and Pierre Duez1,2
1
Université Libre de Bruxelles, Laboratoire de pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Bld
du Triomphe, CP 205/09, 1050 Brussels, Belgium
2
Université de Mons, Service de Chimie Thérapeutique et Pharmacognosie, 20 Place du Parc, 7000 Mons,
Belgium
3
Université Libre de Bruxelles, Laboratoire de Biotechnonogie Végétale, 8 Adrienne Bolland, 6041 Gosselies,
Belgium
Abstract
The fight against infectious diseases and antimicrobial resistances needs the exploration of
new active compounds and new strategies. The leaves and root bark extracts of a Congolese
medicinal plant, Cordia gilletii, were investigated for their effect on the production of
Pseudomonas aeruginosa major virulence factors regulated by quorum sensing. The
dichloromethane extract from root barks was found to quench the production of QSdependent virulence factors in P. aeruginosa PAO1, specifically inhibiting the expression of
two QS-regulated genes, lasB and rhlA. The observed reduction of virulence factors
production suggests that this strategy and this herb could be useful in the fight against
antibacterial resistance.
133
1. Introduction
Pseudomonas aeruginosa is one of the major causes of nosocomial diseases; it secretes a
diversity of virulence factors and forms biofilms to ensure the infection success. The
production of key virulence factors in P. aeruginosa and other important pathogenic bacteria
is regulated by a cell-to-cell communication mechanism known as quorum sensing (QS). This
mechanism enables bacteria to detect their population density through the production, release,
and perception of small diffusible molecules called autoinducers and to coordinate gene
expression accordingly (Driscoll et al., 2007). In P. aeruginosa, two QS systems (las and rhl)
drive the production (by the synthetases LasI and RhlI) and the perception (by the
transcription factors LasR and RhlR) of the acyl-homoserinelactones (AHLs) N-(3oxododecanoyl)-L-homoserinelactone
(3-oxo-C12-HSL)
and
N-butanoyl-L-homoserine
lactone (C4-HSL), respectively (Pesci et al., 1997). Once LasR interacts with 3-oxo-C12HSL, it induces the las system (by increasing lasI expression) and triggers the production of
LasB elastase, LasA protease, Apr alkaline protease, and exotoxin A. The development of
biofilms in P. aeruginosa also requires the las system. RhlR interacts with C4-HSL,
resultingin an enhancement of the production of rhamnolipids, pyocyanin, LasBelastase,
hydrogen cyanide, and cytotoxic lectins. Since fundamental virulence processes in many
pathogenic bacteria are regulated by QS systems, an interesting strategy to overcome the
emergence of antibiotic-resistant microorganisms is to interfere with this cell-to-cell
communication mechanism in order to attenuate their virulence (Ruimy et Andremont, 2004).
Thus medicinal plants traditionally used to treat infectious diseases should be screened, not
only for antimicrobial properties, but also for their capacity to inhibit QS mechanisms in
bacteria.
In this work, we investigated the QS inhibitory effects of extracts from a Congolese medicinal
plant, Cordia gilletii De Wild, whose root barks and leaves are traditionally used against
many diseases including infections (Kambu, 1990). Cordia gilletii belongs to the family of
Boraginaceae and, to the best of our knowledge, none of the members of this family has been
screened so far for inhibitory effects on QS, except for an interfering effect in the Vibrio
fischerii bioluminescence (Okusa et al., 2010).
2.1. Plant material and extracts preparation
Root barks and leaves of Cordia gilletii were collected in Kisantu area (Democratic Republic
of Congo) by Mr Nzeza (Jardin Botanique de Kisantu) in January 2005, the identity of the
plant was confirmed by the specialists of the National Botanical Garden of Meise, Belgium,
134
where a voucher specimen has been deposited under the number BR-SP.627986. Powders of
the two plant parts were exhaustively extracted either with methanol (total extract) or
successively with solvents of increasing polarity (n-hexane, dicholoromethane, ethyl acetate
and methanol). The evaporation of solvents yielded extracts which were dissolved in DMSO
to achieve 10 mg/ml.
2.2. Effect on quorum sensing
2.2.1. Bacterial strains, plasmids, and culture conditions.
P. aeruginosa PAO1 was obtained fromthe Pseudomonas Genetic Stock Center (strain
PAO0001 [http://www.pseudomonas.med.ecu.edu/]) and was grown in liquid LB cultures (5
ml) supplemented with 50 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS; pH 7.0) at
37°C.
2.2.2. Quantitative analysis of pyocyanin production in P. aeruginosa
P. aeruginosa PAO1 were grown for 18 h in 5 ml ofLB-MOPS medium (37°C and agitation
at 175 rpm). The cells were washed twice infresh LB-MOPS medium to eliminate the
homoserine lactones, and the pellets weresuspended in LB-MOPS medium. Then, 50 µl
portions of the cell suspension wereadded to 1 ml of LB-MOPS, spectrometrically evaluated
at 600 nm (in order to obtain a A600 ranging between 0.020 and 0.025, corresponding to ~107
CFU/ml) using a SpectraMax M2 device (Molecular Devices) and supplemented with 10 µl of
plant extract dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO; 1% [vol/vol], final concentration).
After 8 h of growth, samples were taken to assess the growth (A600). After centrifugation
(16000 g, 5 min), 900 µl of supernatant were mixed with 500 µl of chloroform in Eppendorf
tube. The organic phase was transferred in a new Eppendorf tube and pyocyanin was
extracted with 300 µl of HCl 0.2 N and quantified spectrometrically at 380 nm. The statistical
significance of each test (n = 4)was evaluated by conducting Student t tests using GraphPad
Prism software, and aP value of ≤ 0.01 was considered significant(Vandeputte et al., 2010).
2.2.3. Expression of reporter genes.
The transcription of the QSgenes was assayed by using PAO1-derived strains harboring
promoter-lacZ fusions. PAO1 reporter strains were prepared as described for pyocyanin
quantification (see below). PAO1 strains (50 µl) were grown in 1 mlof LB medium at 37°C
underagitation (175 rpm), supplemented with 10 µl of plant extract or DMSO (1% [vol/vol],
final concentration) and incubated for 8 and 18 h. After incubation, the cell growth was
assessed as previously and the absorbance of the mediumafter centrifugation of the bacteria
(16000 g, 5 min) was used as a blank.The sample used for cell growth assessment was used to
perform the β-galactosidaseassay with o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside as previously
135
described (Zhang et al., 1995). Promoterless lacZ fusion strains were used as controls. The
A600 values were measured to account forthe differences in cell density (Vandeputte et al.,
2010). All experiments were performed in six replicates(n = 6).
C. gilletii root barks and leaves are traditionally used in the treatment of infectious diseases;
therefore their extracts were investigated for inhibitor effect on QS. Assays were carried out
using P. aeruginosa PAO1 for which the extracellular virulence factor pyocyanin can be
easily detected. As shown in Figure 1, all the extracts from both root barks and leaves
decreased the QS-dependent production of pyocyanin, these extracts having no significant
effect on P. aeruginosa PAO1 growth (data not shown).
Figure 1. Effect of C. gilletii root barks (R) and leaves (L) extracts on pyocyanin production in P. aeruginosa.
Root barks extracts (RH: n-hexane, RD: dichloromethane, RE: ethyl acetate, RM: methanol). Leaves extracts
(LH:
n-hexane,
LD:
dichloromethane,
LE:
ethyl
acetate,
LH:
methanol).
DMSO:
control.
***, Data are statistically different compared to control, P ≤ 0.001 (n = 3).
If this decrease of pyocyanin production was due to an interference of C. gilletii extracts with
QS mechanisms, this should be reflected in the expression of the main regulatory genes
involved in QS in P. aeruginosa PAO1. Therefore the effect of C. gilletii extracts on QS
systems was further characterized by evaluating the expression of the AHL synthetase genes
lasI and rhlI and the QS regular genes lasR and rhlR. Naringenin, a flavanone which is known
to affect QS signaling in P. aeruginosa without affecting bacterial growth (Vandeputte et al.,
136
2011), was used as positive control. The results highlight that the expression of QS genes is
affected by the dichloromethane extract from root barks (Table 1); this reduction of QS
expression was not linked to a drop in cell viability, cell growth retardation or no specific
reduction of the transcription machinery of the bacteria. Indeed, P. aeruginosa PAO1 grown
in the presence of extracts had growth characteristic similar to those of DMSO-treated cells
(data not shown) and more interesting, the dichloromethane extract does not affect the
expression of the control gene aceA (Table 1).
Tableau I. Effets des extraits deCordiagilletii sur l’expression des gènes du QS après 18h d’incubation
Gene expression in Miller units
mean + SD (n=6)
rhlA
lasB
aceA
DMSO
7313 ± 651
7153 ± 192
614 ± 160
Naringenine (10 µg/ml)
5389 ± 857*
3881 ± 221*
862 ± 87
Root barks
·
N-hexane extract
8269 ± 803
nd
799 ± 270
·
Dichlorométhane extract
4089 ± 443*
5409 ± 285*
1049 ± 462
·
8818 ± 848
nd
643 ± 58
·
Methanol extract
6849 ± 1270
nd
1042 ± 193
·
Total methanol extract
5376 ± 876*
6396 ± 342*
920 ± 98
·
N-hexane extract
7847 ± 160
nd
769 ± 189
·
Dichlorométhane extract
8349 ± 418
nd
365 ± 19*
·
7564 ± 1369
nd
238 ± 60*
·
Methanol extract
5181 ± 1131*
6095 ± 159*
475 ± 99*
·
Total methanol extract
4832 ± 494*
6507 ± 230*
418 ± 129*
Leaves
Gene expression was measured as the β-galactosidase activity of the lacZ gene fusions expressed in Miller units.
*, Significance at P<0.05; nd, not determined. Concentration of extracts 100 µg/ml
4. Conclusion
Among all tested extracts, the dichloromethane extract from root barks was found to quench
the production of the two investigated QS-dependent virulence factors in P. aeruginosa; this
effect may help to reduce virulence during infections caused by this microorganism. Further
study is needed in order to screen the activity on other genes involved in QS and to identify
the compounds responsible for these effects.
137
138
4.5. Composition chimique, propriétés antioxydante et anticholinestérase de l’huile
essentielle des feuilles de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Dans le genre Cordia, certaines espèces sont décrites comme contenant des huiles
essentielles, notamment C. verbenacea et C. curassavica. C’est ainsi que nous nous sommes
intéressé à extraire l’huile essentielle des feuilles de Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
afin d’en déterminer la composition chimique et d’en évaluer les propriétés antioxydante et
anticholinestérase.
Les feuilles de C. gilletii contiennent très peu d’huiles essentielles (0,1 % V/P après 3h de
distillation) ; sa composition est typique des plantes pauvres en huiles essentielles avec de très
faibles teneurs en monoterpènes et dérivés aréniques, la distillation entraînant majoritairement
d’autres composés, notamment des produits de dégradation des acides gras. Vingt trois
composés (représentant 90,1% du total de l’huile) ont été identifiés dans cette huile
essentielle, avec 25,6% de dérivés terpéniques et 64,6% de dérivés non terpéniques dont les
aldéhydes (16,5%), des acides gras (18,8%) et des alcanes (23,1%). L’activité antioxydante de
cette huile a été évaluée par les tests de décoloration du DPPH et du β-carotène. L’huile
essentielle a montré une activité antioxydante avec une CI50 de 75 et 130 µg/ml
respectivement sur les tests de décoloration du DPPH et du β-carotène. Cette huile essentielle
a cependant montré un très faible effet inhibiteur sur les cholinestérases avec une CI50 de
106 µg/ml (0,09% d’équivalent physotigminine) et 369 µg/ml (0,05% d’équivalent
physostigmine) respectivement pour l’AchE et la BchE.
Récemment, une attention particulière a été accordée à la muqueuse nasale comme une voie
alternative d’administration de médicaments permettant d’atteindre une absorption élevée et
rapide. Les composés caractérisés par des poids moléculaires faibles et un caractère lipophile
tels que contenus dans les huiles essentielles peuvent être absorbés rapidement après une
administration nasale. Ainsi, les effets antioxydants de l’huile essentielle de C. gilletii
pourraient être exploités par voie nasale pour une action rapide dans la prise en charge des
pathologies où sont impliqués les radicaux libres. La faible activité anticholinestérase suggère
que l’huile essentielle de C. gilletii contient très peu d’inhibiteurs d’Ach et constitue une
sécurité quant à l’usage médicinal de cette huile.
139
NPC
Natural Product Communications
Chemical Composition, Antioxidant Properties and
Anti-cholinesterase Activity of Cordia gilletii (Boraginaceae)
Leaves Essential Oil
2011
Vol. 6
No. 2
253 - 257
Marco Bonesia,*, Philippe N. Okusab,c, Rosa Tundisa, Monica R. Loizzoa, Federica Menichinia,
Caroline Stévignyb, Pierre Duezb,c and Francesco Menichinia
a
Faculty of Pharmacy, Nutrition and Health Sciences, Department of Pharmaceutical Sciences,
University of Calabria, I-87036 Rende (CS), Italy
b
Institut de Pharmacie, Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine,
Université Libre de Bruxelles, CP 205/09, Bld du Triomphe, 1050 Brussels, Belgium
c
Faculté de Médecine et de Pharmacie, Service de Chimie Thérapeutique et Pharmacognosie,
Université de Mons, 20 Place du Parc, 7000 Mons, Belgium
[email protected]
Received: September 7th, 2010; Accepted: January 13th, 2011
This study aimed to investigate for the first time the chemical composition, the antioxidant properties and the acetylcholinesterase (AChE)
and butyrylcholinesterase (BChE) inhibitory activity of the essential oil from the leaves of Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae). The
essential oil, characterized by 23 constituents (90.1% of the total oil), was constituted by terpene derivatives (25.6%) and non-terpene
derivatives (64.5%), among which aldehydes, fatty acids and alkanes were present with the percentage of 16.5%, 18.8% and 23.1%,
respectively. The antioxidant activity of C. gilletii essential oil was screened by two in vitro tests: DPPH and -carotene bleaching test. The
essential oil revealed antioxidant activity with an IC50 value of 75.0 and 129.9 !g/mL on DPPH radical and -carotene decoloration tests,
respectively. Moreover, C. gilletii inhibited AChE enzyme with an IC50 value of 105.6 g/mL.
Keywords: Cordia gilletii, essential oil, GC/MS, antioxidant activity, cholinesterase inhibitory activity.
The genus Cordia (Boraginaceae) contains many species
largely distributed in tropical and subtropical regions of
the world [1]. Some Cordia species are known in
traditional medicine for their biological properties. C.
boissieri, C. myxa, C. verbenacea and C. sebestena are
recorded in the official pharmacopeias of various countries
[1,2]. C. gilletii roots are used in Democratic Republic of
Congo for the treatment of malaria and diarrhoea
(decoction), wounds and skin diseases (topical
application), whereas its leaves decoction is used against
fever [3]. The roots n-hexane, dichloromethane, ethyl
acetate, methanol and water extracts were previously
studied for their antioxidant and antimicrobial activity.
Methanol extract was the most active as antioxidant. This
extract and isolated compounds exhibited a direct
antimicrobial activity against all tested microorganisms
[4]. The chemical composition and antibacterial activity
of Cordia verbenacea essential oil was analysed. The
most abundant constituents were tricyclene (23.9%),
bicyclogermacrene (11.7%), germacrene D (9.9%) and
-caryophyllene (8.2%). The essential oil exhibited an
interesting antibacterial activity against Gram-positive
bacteria Staphylococcus aureus ATCC 6538 and
Enterococcus faecalis ATCC 29212 with a MIC value of
170 and 200 !g/mL, respectively [5].
In recent years, oxygen derived species such as superoxide
radical, hydrogen peroxide, singlet oxygen and hydroxyl
radical have been implicated in the aetiology of a wide
array of human diseases, including Alzheimer’s disease
(AD) [6]. AD is the most common cause of age-associated
memory deficit. One of the therapeutic strategies
developed in the AD treatment is the use of inhibitors of
acetylcholinesterase (AChE), the principal enzyme
involved in the hydrolysis of acetylcholine (ACh).
Moreover, in late AD stage levels of AChE have declined
by up to 85% and butyrylcholinesterase (BChE) represents
the predominant cholinesterase in brain. This enzyme
cleaves ACh in a manner similar to AChE to terminate
its physiological action. Thus restore the level of
ACh through inhibition of both two major forms of
cholinesterase: AChE and BChE remains a useful
therapeutic approach to treat AD and other forms of
dementia [7]. Several species including Salvia, Thymus
and Mentha used in traditional practices of medicine
to enhance the cognitive function were screened to their
140
254 Natural Product Communications Vol. 6 (2) 2011
Bonesi et al.
Table 2: Antioxidant activity of C. gilletii. essential oil.
Table 1: Chemical composition of the essential oil from C. gilletii.
Identified compounds
a
tR (min)
4.8
9.2
10.0
14.0
16.3
16.6
17.0
17.7
#$%&'
18.1
18.6
19.2
19.5
19.8
19.9
21.0
22.2
22.9
23.7
24.3
24.6
25.7
28.6
%
9.6
0.6
5.8
0.8
1.0
1.1
2.8
1.1
0.8
2.8
15.2
0.9
0.8
20.4
0.4
0.8
2.3
0.8
4.5
2.9
0.8
9.2
4.7
ID method
MS
MS, Co-GC
MS
MS, Co-GC
MS
MS
MS, Co-GC
MS
MS
MS
MS, Co-GC
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS, Co-GC
MS
MS
MS
IC50 !g/mL
)Carotene bleaching test
30'min'
60'min'
129.9 ± 3.9
> 1000
1.0 ± 0.01
1.0 ± 0.01
DPPH
Essential oil
Ascorbic acid
Propyl gallate
75 ± 0.8
2.0 ± 0.01
-
IC50 values are mean ± S.D. (n =3).
Essential oil
100
Essential oil
% Inhibition
Compound
(E)-2-Hexenal
"-Pinene
Nonanal
"-Terpinene
1-Heptadecene
Tetradecanal
Myristic acid
6,10,14-trimethyl-2-pentadecanone
Pentadecanoic acid
2-Hydroxy-phenylmethyl ester benzoic acid
Palmitic acid
Farnesol
1-Octadecene
Phytol
1-Eicosene
Tricosane
Pentacosane
Nonadecane
Heptacosane
trans-Caryophyllene
Octadecane
Nonacosane
Eicosane
a
80
60
40
20
0
1000
500
250
125
62.5
!g/ mL
Figure 1: Radical scavenging effects of C. gilletii essential oil on the
DPPH free radical. Data are means ± SD (n= 3).
90.1
MS, mass spectrum; Co-GC: co injection with authentic compound.
neuroprotective effects [8-12]. Particular interest was
focused on volatile constituents of essential oils due to
their small molecular size and lipophilicity, that are able to
cross the blood-brain barrier [13].
Following our previous works in this work the antioxidant
properties and the inhibition of acetylcholinesterase and
butyrylcholinesterase were investigated for the first time
and were related to the chemical composition of the
essential oil from C. gilletii leaves.
A total of twenty-three constituents representing 90.1%
of the total oil were identified in C. gilletii essential oil
(Table 1). The oil was mainly constituted by non-terpene
derivatives (64.5%), particularly aldehydes (16.5%), fatty
acids (18.8%) and alkanes (23.1%). Terpene derivatives
represent the 25.6% of the total oil in which phytol
(20.4%) and trans-caryophyllene (2.9%) were the main
constituents. Palmitic acid (15.2%), (E)-2-hexenal (9.6%),
nonacosane (9.2%), nonanal (5.8%), eicosane (4.7%) and
heptacosane (4.5%) were also identified.
Previous works analysed the chemical composition of
C. verbenacea essential oil. "-Pinene, -phellandrene,
citronellol acetate, !-elemene, trans-caryophyllene, !gurjunene, "-humulene, allo-aromadendrene, bicyclogermacrene, germacrene D, tricyclene, (-cadinene, spatulenol
and epoxycariophyllene were the main constituents [5,14].
According to previous studies our essential oil contain "pinene and trans-caryophyllene among the identified
components. A different composition was evidenced for
the essential oil from C. curassavica, that showed as main
compounds -eudesmol, 4-methyl,4-ethenyl-3-(1-methylethenyl)-1-(1-methyl methanol) cyclohexane, spathulenol
and cadina-4,10(14)-diene [15].
The anti-radical scavenging activity was screened by the
DPPH model system while the antioxidant activity was
evaluated by the -carotene bleaching test. Data are
reported in Table 2 and Figure 1.
The DPPH free radical is a stable free radical, which has
been widely used as tool to estimate free radicalscavenging activity of antioxidants. Antioxidants, on
interaction with DPPH, either transfer electrons or
hydrogen atoms to DPPH, thus neutralizing the free radical
character [16]. C. gilletii essential oil showed a scavenging
effect on DPPH radical with an IC50 value of 75 !g/mL.
The C. gilletii roots n-hexane, dichloromethane, ethyl
acetate, methanol and water extracts were previously
tested for their antioxidant activity [4]. The methanol
extract showed a quite potent antioxidant activity,
efficiently scavenging the DPPH free radical with an IC50
value of 3.2 !g/mL. The other extracts also demonstrated
antioxidant activity with IC50 values in the range 8.1-83.5
!g/mL.
The !-carotene bleaching method is based on the loss of
the yellow color of !-carotene due to its reaction with
radicals which are formed by linoleic acid oxidation in an
emulsion. The rate of !-carotene bleaching can be slowed
down in the presence of antioxidants. This fact is used in
the antioxidant activity evaluation of the C. gilletii
essential oil that exhibited an IC50 value of 129.9 !g/mL
after 30 minutes of incubation.
Several investigations revealed the in vitro antioxidant
activity of monoterpenes ("-terpinene) and diterpenes
(phytol) [17]. However, it is difficult to attribute the
activity of a complex mixture to a single or particular
constituent. Major or trace compounds might give rise to
the biological activities exhibited.
141
Essential oil of Cordia gilletii
Natural Product Communications Vol. 6 (2) 2011 255
Table 3: Anticholinesterase activity of C. gilletii essential oil.
Essential oil
Physostigmine
IC50 !g/mL
AChE
BChE
105.6 ± 2.8
369.3 ± 2.9
0.1 ± 0.003
0.2 ± 0.07
SI (BChE/AChE)
3.4
2.4
IC50 values are mean ± S.D. (n =3).
% Inhibition
100
90
AChE
80
BChE
70
60
50
40
30
20
10
0
1000
500
250
125
62.5
Experimental
General:
Methanol,
ethanol,
chloroform
and
dichloromethane were purchased from VWR International
(Milan, Italy). Acetylcholinesterase (AChE) from
Electrophorus electricus (EC 3.1.1.7, Type VI-S) and
butyrylcholinesterase (BChE) from equine serum (EC
3.1.1.8), physostigmine, 5,5"-dithio-bis(2-nitrobenzoic
acid) (DTNB), acetylthiocholine iodide (ATCI),
butyrylthiocholine iodide (BTCI), 2,2-diphenyl-1picrylhydrazyl radical (DPPH), -carotene, linoleic acid,
Tween 20, ascorbic acid, propyl gallate, "-pinene, "terpinene, trans-caryophyllene, myristic acid and palmitic
acid were purchased from Sigma-Aldrich (Milan, Italy).
31.25
[!g/ mL]
Figure 2: Cholinesterase inhibitory activity of C. gilletii essential oil.
Antioxidant action contributes to prevent deleterious
effects from reactive oxygen species and may explain the
use of C. gilletii-based herbal medicines in the treatment of
wounds. The study of AChE and BChE enzymes revealed
that C. gilletii essential oil inhibit both enzymes in a
concentration-dependent manner (Table 3, Figure 2). The
best result was obtained on AChE inhibition with an IC50
value of 105.6 !g/mL. A lower activity was found on
BChE (IC50 value of 369.3 !g/mL).
Terpenes identified in the essential oil were previously
investigated for cholinesterase inhibitory properties. "Pinene exhibited a strong AChE inhibitory activity with an
IC50 value of 0.4 mM [18]. Whereas, trans-caryophyllene
showed a percentage of inhibition of 32% at concentration
of 0.06 mM against human AChE [5] but exhibited a
strong activity against BChE 78.6 !g/mL [19]. A similar
activity against AChE was observed with "-terpinene
(34% of inhibition at 50 !g/mL) [20]. Generally, the
inhibitory activity of the essential oil generally results
from a complex interaction between its constituents, which
produce both synergistic and antagonistic responses.
Concerning essential oils from other Cordia species, some
interesting biological activities have been reported. For
example, essential oils from Brazilian Cordia species
showed antimicrobial, anti-inflammatory and anti-allergic
properties [14,21].
Recently, focus has been on the nasal mucosa as an
alternate route to achieve higher and faster drug
absorption. Nasal drug delivery offers many advantages
over oral administration such as the fast onset of
therapeutic action due to the rapid absorption [22].
Compounds that are characterized by a low molecular
weight and lipophilic character can be rapidly absorbed
into brain after nasal administration [23]. Therefore,
following nasal administration, C. gilletii essential oil
could be used at lower dosage and have a faster onset of
action in beneficial therapeutic anti-cholinesterase effect.
Plant material: Cordia gilletii leaves were collected in
July 2005 from the Kisantu area (Democratic Republic of
Congo). The plant was identified by the specialists of the
Herbarium of the National Botanical Garden of Meise,
Belgium, where a voucher specimen has been deposited
under the number BR-SP.627986.
Essential oil isolation: The essential oil was obtained by
steam distillation (100 g of dried aerial parts) during 3h in
a Clevenger-type apparatus [24]. The white-yellow oil
sample was collected, dried over anhydrous sodium
sulphate to remove traces of moisture and stored at 4-8°C
in a bottle covered with aluminium foil to prevent the
negative effect of light until tested and analyzed. The
yield of the essential oil was 0.1% (v/w).
GC/MS analysis: GC/MS analysis of the C. gilletii
essential oil were carried out using a Hewlett-Packard
6890 gas chromatograph equipped with an SE-30 capillary
column (30 m length, 0.25 mm i.d., 0.25 m film
thickness) and interfaced with a Hewlett Packard 5973
Mass Selective. Ionization of the sample components was
performed in electron impact mode (EI, 70 eV). The
carrier gas was helium and the analytical conditions
worked with the following program: oven temperature was
5 min isothermal at 50°C, then 50-250°C at a rate of
5°C/min; then held isothermal for 10 min. Injector and
detector were maintained at 250°C and 280°C,
respectively. For analysis, the oil was dissolved in
dichloromethane (ca. 1 mg/mL) and aliquots (1 !L) were
directly injected.
GC analysis: The GC analysis were performed on a
Shimadzu GC17A gas chromatograph equipped with a
flame ionization detector (FID) and controlled by Borwin
Software. The samples were analysed on a fused silica 30
m SE-30 capillary column with an internal diameter of
0.25 mm and a film thickness of 0.25 . Nitrogen was used
as the gas vector. Injector and detector were maintained at
250°C and 280°C, respectively. Column temperature was
initially kept at 50°C for 5 min, then gradually increased to
250°C at 5°C/min rate and finally held for 10 min at
250°C.
142
256 Natural Product Communications Vol. 6 (2) 2011
Identification and quantification of components:
Identification of the essential oil components was carried
out either by comparison of their retention times with those
of the literature or with those of authentic compounds
available in our laboratory [25]. Further tentatively
identification was made by comparison of their mass
spectra with those stored in Wiley 138, Wiley 275 and
NIST98 libraries. The percentage composition of C. gilletii
oil was computed by the normalisation method from the
GC peak areas, related to GC peak area of an external
standard injected into the GC equipment under identical
conditions as above. Percentage of total was obtained by
their addition. All determinations were performed in
triplicate and averaged.
DPPH test: Radical scavenging capacity was determined
according to the technique reported by Loizzo et al. [26].
Briefly, an aliquot of 1.5 mL of 0.25 mM DPPH solution
in ethanol and C. gilletii essential oil at concentrations
ranging from 62.5 !g/mL to 1000 !g/mL were mixed. The
mixture was shaken vigorously and allowed to reach a
steady state at room temperature for 30 min. Decoloration
of DPPH was determined by measuring the absorbance at
#= 517 nm with a UV-Vis Jenway 6003
spectrophotometer. The DPPH radical scavenging activity
was calculated according to the following equation:
scavenging activity = (A0-A1/A0) x 100, where A0 is the
absorbance of the control (blank, without extract) and A1
is the absorbance in the presence of the extract.
-Carotene bleaching test: The rapid evaluation of
antioxidant activity of C. gilletii essential oil was
determined according to the !-carotene bleaching method
with some modification to use 96-well microplates [27].
!-carotene (5 mg) was dissolved in 50 mL of chloroform,
and 3 mL was added to 40 mg of linoleic acid and 400 mg
of Tween 20. Chloroform was removed under a stream of
nitrogen gas. Distilled water (100 mL) was added and
mixed well with the remaining emulsion. Aliquots (300
!L) of the !-carotene/linoleic acid emulsion were mixed
with 12 µL of the essential oil at different concentrations
or standard propyl gallate and incubated in a water bath at
50°C for 60 min. Oxidation of the emulsion was monitored
spectrophotometrically by measuring absorbance at 470
nm using a spectrophotometer (Jenway 6300) against a
blank, consisting of an emulsion without !-carotene. The
measurement was carried out at initial time (t= 0) and
successively at 30 and 60 min. All samples were assayed
in triplicate and averaged. The antioxidant activity (AA)
was measured in terms of successful bleaching !-carotene
by using the following equation: AA= [1- (A0-At)/( A°0A°t) x 100
where A0 and A°0 are the absorbance values measured at
the initial incubation time for samples/standard and
control, respectively, while At and A°t are the absorbance
values measure in the samples/standard and control
respectively at t= 30 min and t= 60 min.
Bonesi et al.
Microtitre
Cholinesterase
inhibition
assay:
Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibiting
activities were measured by slightly modifying the
spectrophotometric method previously developed by
Ellman et al. [28], which is based on the reaction of
released thiocoline to give a colored product with
chromogenic reagent Electrophorus electricus (EC 3.1.1.7,
Type VI-S) AChE and equine serum (EC 3.1.1.8) BChE
were used, while acetylthiocholine iodide and
butyrylthiocholine iodide, respectively, were used as
substrates of the reaction. The 5,5'-dithiobis(2nitrobenzoic-acid) (DTNB) was used for the measurement
of the cholinesterase activity. In this procedure, AChE or
BChE (0.20 U/mL in buffer pH 8) and C. gilletii essential
oil at final concentrations in the test solution ranging from
31.25 to 1000 !g/mL'(20 !L) were added to 2 mL of
buffer pH 8 and pre-incubated in ice bath at 4°C for 30
min. Duplicate tubes were also treated this way with 20 !L
of physostigmine (0.1 mM) to allow interference of the test
substances in the assay to be assessed, and to control for
any hydrolysis of acetylcholine or butyrylcholine not due
to enzyme activity. The reaction was started by adding
DNTB solution (20 !L of 0.05 mM in buffer pH 7) and
acetylthiocholine iodide (ATCI) or butyrylthiocholine
iodide (BTCI) (20 !L 0.018 mM in buffer pH 7) and tubes
were allow in water bath for 20 min at 37°C. The reaction
was halted by placing the assay solution tubes in an ice
bath and adding physostigmine (20 !L 0.018 mM in buffer
pH 7). Blanks were used of reagents without essential oils
and the positive control physostigmine (20 !L 0.018 mM
in buffer pH 7) was added. The hydrolysis of
acetylthiocholine and butyrylthiocholine was monitored by
the formation of the yellow 5-thio-2-nitrobenzoate anion,
as the result of the reaction of DTNB with thiocholine,
released during enzymatic hydrolysis, immediately
recorded on spectrophotometer (Jenway 6300) at 405 nm
and the percentage inhibition was calculated. C. gilletii
essential oil and the positive control physostigmine were
dissolved in 5% methanol which was used for the control.
All the reactions were performed in triplicate. The
inhibition rate (%) was calculated by equation:
Inhibition %= [(Blank-Blank positive control)(Experiment-Experiment control)/(Blank-Blank positive
control)] x 100
Statistical analysis: Differences were evaluated by oneway analysis of variance (ANOVA) test completed by a
multicomparison Dunnett’s test. Differences were
considered significant at ** p< 0.01. The inhibitory
concentration 50% (IC50) was calculated from doseresponse curve obtained by plotting the percentage of
inhibition versus the concentrations with the use of
GraphPad Prism 4.0 Software.
Acknowledgments – Mr. Nzeza (Jardin Botanique de
Kisantu, D.R. Congo) is acknowledged for plant
collection.
143
Essential oil of Cordia gilletii
Natural Product Communications Vol. 6 (2) 2011 257
References
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
Rapisarda A, Iauk L, Ragusa S. (1997) Micromorphological study on leaves of some Cordia (Boraginaceae) species used in
traditional medicine. Economic Botany, 51, 385-391.
Fernandes ES, Passos GF, Medeiros R, da Cunha FM, Ferreira J, Campos MM, Pianowski LF, Calixto JB. (2007) Antiinflammatory effects of compounds alpha-humulene and (-)-trans-caryophyllene isolated from the essential oil of Cordia
verbenacea. European Journal of Pharmacology, 569, 228-236.
Kambu K. (1990) Eléments de Phytothérapie Comparée: Plantes Médicinales Africaines. Centre de Recherche Pédagogique de
Kinshasa, Kinshasa, 148.
Okusa PN, Stévigny C, Devleeschouwer M, Duez P (2010) Optimization of the Culture Medium Used for Direct TLC–
Bioautography. Application to the Detection of Antimicrobial Compounds from Cordia gilletii De Wild Boraginaceae), Journal of
Planar Chromatography, 23, 245-249.
Meccia G, Rojas LB, Velasco J, Díaz T, Usubillaga A, Arzola JC, Ramos S (2009) Chemical composition and antibacterial activity
of the essential oil of Cordia verbenacea from the Venezuelan Andes, Natural Product Communications, 4, 1119-22.
Pratico D, Delanty N. (2000) Oxidative injury in diseases of the central nervous system: focus on Alzheimer's disease. American
Journal of Medicine, 109, 577-585.
Loizzo MR, Tundis R, Menichini F, Menichini F. (2008) Natural products and their derivatives as cholinesterase inhibitors in the
treatment of neurodegenerative disorders: an update. Current Medicinal Chemistry, 15, 1209-1228.
Howes M-JR, Perry NSL, Houghton PJ. (2003) Plants with traditional uses and activities, relevant to the management of
Alzheimer’s disease and other cognitive disorders. Phytotherapy Research, 17, 1-18.
Perry NSL, Houghton PJ, Jenner P, Keith A, Perry EK. (2002) Salvia lavandulaefolia essential oil inhibits cholinesterase in vivo.
Phytomedicine, 9, 48-51.
Loizzo MR, Menichini F, Tundis R, Bonesi M, conforti F, Nadiafi F, Statti GA, Frega N, Menichini F. (2009) In vitro biological
activity of Salvia leriifolia Benth essential oil relevant to the treatment of Alzheimer's disease. Journal of Oleo Science, 58,
443-446.
Jukic M, Politeo O, Maksimovic M, Milos M, Milos M. (2006) In vitro acetylcholinesterase inhibitory properties of thymol,
carvacrol and their derivatives thymoquinone and thymohydroquinone. Phytotherapy Research, 21, 259-261.
Miyazawa M, Watanabe H, Umemoto K, Kameoka H. (1998) Inhibition of acetylcholinesterase activity by essential oils of Mentha
species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46, 3431-3434.
Savelev SU, Okello EJ, Perry EK. (2004) Butyryl- and acetyl-cholinesterase inhibitory activities in essential oils of Salvia species
and their constituents. Phytotherapy Research, 18, 315-324.
De Carvalho Jr. PM, Rodrigues RFO, Sawaya ACHF, Marques MOM, Shimizu MT. (2004) Chemical composition and
antimicrobial activity of the essential oil of Cordia verbenacea D.C. Journal of Ethnopharmacology, 95, 297-301.
Hernandez T, Canales M, Teran B, Avila O, Duran A, Garcia AM, Hernandez H, Angeles-Lopez O, Fernandez-Araiza M, Avila G.
(2007) Antimicrobial activity of the essential oil and extracts of Cordia curassavica (Boraginaceae). Journal of
Ethnopharmacology, 111, 137-141.
Banerjee A, Dasgupta N, De B. (2005) In vitro study of antioxidant activity of Syzygium cumini fruit. Food Chemistry, 90, 727-733.
Grassmann J. (2005) Terpenoids as plant antioxidants. Vitamins and Hormones, 72, 505-535.
Miyazawa M, Yamafuji C. (2005) Inhibition of acetylcholinesterase activity by bicyclic monoterpenoids. Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 53, 1765-1768.
Bonesi M, Menichini F, Tundis R, Loizzo MR, Conforti F, Passalacqua NG, Statti GA, Menichini F. (2010) Acetylcholinesterase
and butyrylcholinesterase inhibitory activity of Pinus species essential oils and their constituents. Journal of Enzyme Inhibition and
Medicinal Chemistry, 25, 622-628.
Miyazawa M, Yamafuji C. (2005) Inhibition of acetylcholinesterase activity by tea tree oil and constituent terpenoids. Flavour and
Fragrance Journal, 20, 617-620.
Passos GF, Fernandes ES, Da Cunha FM, Ferreira J, Pianowski LF, Campos MM, Calixto JB (2007), Anti-inflammatory and antiallergic properties of the essential oil and active compounds from Cordia verbenacea, Journal of Ethnopharmacology, 110,
323–333.
Illum L. (2000) Transport of drugs from the nasal cavity to the central nervous system. European Journal of Pharmaceutical
Sciences, 11, 1-18.
Illum L. (2003) Nasal Drug delivery – possibilities, problems and solutions. Journal of Control Release, 87, 187-198.
Clevenger JF. (1928) Apparatus for the determination of volatile oils. The Journal of the American Pharmacists Association, 17,
341-346.
Adams RP. (2001) Identification of essential oil components by gas chromatography/quadrupole mass spectrometry. Allured: Carol
Stream, IL.
Loizzo MR, Said A, Tundis R, Hawas UW, Rashed K, Menichini F, Frega NG, Menichini F. (2009) Antioxidant and
antiproliferative activity of Diospyros lotus L. extract and isolated compounds. Plant Foods for Human Nutrition, 64, 264-270.
Sarkar A, Bishayee A, Chatterjee M. (1995) Beta-carotene prevents lipid peroxidation and red blood cell membrane protein damage
in experimental hepato carcinogenesis. Cancer Biochemistry Biophysics, 15, 111-125.
Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr., Feath erstone RM. (1961) A new and rapid colorimetric determination of
acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology, 7, 88-95.
144
4.6. Absence d’alcaloïdes pyrrolizidiniques dans Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae)
Après avoir montré que l’espèce Cordia gilletii possède un potentiel thérapeutique intéressant
comme remède antimicrobien (pouvant non seulement combattre directement les agents
infectieux, mais aussi inhiber leur résistance et diminuer leur virulence), antiplasmodial et
antioxydant, nous nous sommes posé la question de l’innocuité des extraits de cette plante,
d’autant plus qu’elle appartient à la famille des Boraginaceae, une famille connue comme une
des principales sources des alcaloïdes pyrrolizidiniques (APs). Les APs sont dangereux pour
la santé humaine quand ils se retrouvent dans les plantes utilisées comme remèdes
traditionnels ou lorsqu’ils contaminent la chaîne alimentaire. Ils sont hépatotoxiques et
génotoxiques, la transformation hépatique des APs insaturés en position 1-2 en agents
alkylants étant responsable de ces effets toxiques. Ainsi la recherche des APs devrait être
systématiquement réalisée, qualitativement et quantitativement, dans les plantes médicinales
appartenant aux quatre familles bien connues pour leurs représentants riches en APs,
notamment les Boraginaceae, les Asteraceae, les Orchidaceae et les Fabaceae.
Les écorces de racines et les feuilles de C. gilletii ont donc été soumises à une extraction
classique permettant d’analyser les APs sous forme de bases libres et de N-Oxydes ; les
extraits obtenus ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse en utilisant les indices de rétention et les masses de fragments
caractéristiques des APs comme paramètres de diagnostic. Cette analyse n’a pas révélé la
présence d’APs dans les écorces de racines ni dans les feuilles de C. gilletii jusqu’à une limite
de détection de 2 ppm. La méthode utilisée dans cette analyse a permis de détecter aisément
les APs de Senecio delphinifolius Vahl, représentant ainsi un contrôle positif (Cfr Annexes).
Bien que cette absence d’APs doive être confirmée sur un plus grand échantillonnage, ces
résultats suggèrent, d’une part, que C. gilletii ne présente pas de toxicité due aux APs et,
d’autre part, ils confirment le fait que le genre Cordia n’est pas un grand producteur d’APs.
En effet, bien que Cordia soit le plus grand genre des Boraginaceae, avec environ 350
espèces, deux espèces seulement ont été reportées comme contenant des APs, C. sinensis Lam
(floridanine) et C. myxa L. (macrophylline).
Cet article a été publié sous forme condensée dans « Biochemical Systematics and Ecology 41 (2012), 1-2»
(Annexe 16)
Un second article sur les alcaloïdes pyrrolizidiniques de Senecio delphinifolius Vahl, utilisée comme
contrôle positif dans ce travail, a été soumis pour publication dans « Natural Product Communications »
(Annexe 17)
145
ABSENCE OF PYRROLIZIDINE ALKALOIDS IN CORDIA GILLETII
DE WILD (BORAGINACEAE)
Philippe N. Okusaa,b,*, Till Beuerlec, Caroline Stévignya, Pierre Dueza,b
a
Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Institut de Pharmacie, Université
Libre de Bruxelles, Bld du Triomphe CP 205/09, 1050 Brussels, Belgium
b
Service de Chimie thérapeutique et Pharmacognosie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de Mons,
Place du Parc 20, 7000 Mons, Belgium
c
Institut für Pharmazeutische Biologie, Technische Universität Braunschweig, Mendelssohnstrasse 1, D-38106
Braunschweig, Germany
Abstract
In a previous work, the Congolese medicinal plant, Cordia gilletii De Wild, largely used
against infectious diseases and in the treatment of wounds, has shown interesting direct and
indirect antimicrobial effects. Nevertheless, this plant belongs to the family of Boraginaceae;
thus it is likely to contain pyrrolizidine alkaloids (PAs). These alkaloids are harmful to human
health when they occur in plants used as traditional remedies or when they contaminate the
human food chain. Thus medicinal plants belonging to the families well-known as sources of
PAs, such as Boraginaceae or Asteraceae, should be systematically investigated for PAs
content both qualitatively and quantitatively. The present GC-MS analysis of root barks and
leaves powder of C. gilletti collected in D.R. Congo did not reveal the presence of PAs
(detection limit, 2 ppm). On one hand, these results suggest a lack of PA-toxicity of Cordia
gilletii in traditional use, and, on the other hand, they support the notion that the genus Cordia
is not a broad producer of PAs. Indeed, although Cordia, with about 350 species, is the largest
genus within the Boraginaceae family, only two species have been reported so far to contain
PAs, C. sinensis Lam (floridanine) and C. myxa L. (macrophylline).
Key words: pyrrolizidine alkaloids, Cordia gilletii
*
Corresponding author: [email protected], Tel: 0032 2 650 5250, Fax: 0032 2 650 5430
146
1. Introduction
Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae) is a medicinal plant widely used in the Democratic
Republic of Congo to treat infectious diseases and for wound healing (Kambu, 1990). In our
previous work, non-polar extracts of its root barks showed indirect antibacterial properties,
enhancing or restoring the activity of some antibiotics against methicillin-resistant strains of
Staphylococcus aureus; whereas its polar extracts showed direct antimicrobial and antioxidant
activities (Okusa et al., 2007). In a preliminary phytochemical screening, the Dragendorff
reaction for alkaloids detection showed a slight positive result for root barks, suggesting the
presence of traces of alkaloids. C. gilletii belongs to the family of Boraginaceae, one of the
most important and well known sources of pyrrolizidine alkaloids (PAs). PAs are known to be
hepatotoxic to human and animals and genotoxic; in particular the liver transformation of 1,2unsaturated PAs into reactive alkylating agents has been demonstrated to be responsible for
these toxic effects (Rosemann, 2006). Thus, the knowledge of the presence of potentially
toxic PAs in plants and food sources used by humans and domestic animals is of major
importance.
Generally, PAs are esters of hydroxylated methyl pyrrolizidines, consisting of a necine base
and one or two necic acid moieties. The necine base can be either 1,2-unsaturated or
saturated. PAs are mainly found in plants as N-oxides, often accompanied by the
corresponding basic PAs. In the classification suggested by Hartmann (Hartmann and Witte,
1995), the alkaloid types predominant in the Boraginaceae family (in about 128 species) are
of the lycopsamine type, necins substituted by monoesters or diesters containing hydroxylated
2-isopropylbutyric acid. About 16 species of Boraginaceae contain another PA type, the
triangularine type, necins mono- or diesterified by C5 acids (mostly angeloyl, tigloyl or
senecioyl residues). PAs are synthesized as N-oxides in the roots of most PA-producing plants
and are translocated to the aerial parts where they are converted into species-specific
alkaloids. PAs are mainly present in the families Boraginaceae (many genera), Asteraceae
(tribes Senecioneae and Eupatorieae), Orchidaceae (ten genera) and Fabaceae (mainly the
genus Crotalaria). More than 95% of the PAs containing plants investigated thus far belonged
to these four families (Ober and Hartmann, 1999). The structural prerequisite for PAs to show
toxicity is the existence of a carbon-carbon double bond in 1,2-position of the necine base
together with an ester functionality in position C-7 or C-9 or both positions. Such PAs can
undergo biotransformation, mainly by liver cytochrome P-450 monooxygenases, into the
corresponding pyrroles which are highly electrophilic and irreversibly react with nucleophilic
147
cell components such as proteins, DNA or amino acids that might cause liver damage;
transport and, consequently, damage to other body tissues is possible as well (Prakash et al.,
1999).
PAs potential risks for human health are likely to come from:
(i)
The use of PAs-containing herbs as traditional remedies, as for example in the case
of Petasites hybridus (L.) Gaertn (Asteraceae) rhizome whose extracts have been
used for more than 2000 years as relaxant to muscles, against gastro-intestinal
colic, spams of the urogenital tract, cough and dysmenorrhea. Sesquiterpenes are
considered major active principles of P. hybridus; as this plant also contains toxic
1,2-unsaturated PAs, the authorities of e.g. Germany and Switzerland have
regulated its long term use, limiting PAs daily intake to 0.1µg/day.(Debrunner and
Meier, 1998); similar measures were taken for other phytopharmaceuticals
containing PAs.
(ii)
A contamination of the human food chain that occurs particularly in the parts of
the world with arid climates and poor rainfall, conditions promoting the growth of
PAs-containing plants, as weeds among cultivated crops (Mohabbat et al., 1976).
Milk produced by animals that have ingested such plants represent the most
frequently encountered sources of residues (Dickinson et al., 1976). Chickens can
also transfer PAs into eggs after eating contaminated grain (Edgar and Smith,
2000) and high levels of PAs have been found in honey, sometimes exceeding
10 mg kg-1 (Deinzer et al., 1977; Kempf et al., 2010). However, PAs are unlikely
to be present in higher concentration in meat, since they are rapidly cleared from
the tissues (Rosemann, 2006).
The toxicity of PAs is proportional to: (i) the fraction of alkaloid that is converted into the
pyrrole structure; (ii) the rate of conversion; and (iii) the chemical reactivity of produced
pyrroles. The toxicity also depends on the exposure time, dosage amount and susceptibility of
the organism (rates of resorption, detoxification, excretion, etc.). One generally needs to
distinguish between acute and chronic toxicity and genotoxicity (Kempf et al., 2010). Acute
toxicity could be correlated with the esterification of both hydroxyl functionalities of the
necine base and the additional presence of an α,β-double bond in the acid substructure of the
PA-ester; acute intoxication leads to life-threatening hepatic vasoocclusion. PAs-exposure
over longer periods of time is mainly known to damage liver, lung or blood vessels or, to a
lesser extent, kidney, gastrointestinal tract, pancreas and bone marrow; this results in liver and
lung venous occlusions, megalocytosis, inhibition of cell division (mitosis) and liver cirrhosis.
148
In addition, following metabolic activation, PAs show a number of genotoxic effects. These
include DNA binding and DNA cross linking, mutagenicity, teratogenicity and
carcinogenicity (Kempf et al., 2010).
Capillary gas chromatography combined with mass spectrometry (GC-MS) is frequently used
for the analysis of complex mixtures of PAs, identifying compounds from retention indices
(RIs) and type-specific MS fragmentation (Witte et al., 1993). The combination of these two
parameters provides sufficient information for unequivocal identification of most PAs for
samples of known plant source and is quite helpful to obtain structural informations on other
PAs. Indeed, the mass spectrum (MS) is dominated by the necine base, resulting in a typical
fragmentation pattern, notably for the toxic 1,2-unsaturated PAs. As, within each PA type,
alkaloids are characterized by structures which are very similar, often differing only by the
side chains, by the necin skeleton C- substitutions or by the stereo-isomery, this facilitates the
detection of unkown structure PAs which can be inferred from MS-similarities with known
PAs (Witte et al., 1993).
Plant material: Root barks and leaves of Cordia gilletii (Boraginaceae) were collected in
January 2005 in the Kisantu area (Democratic Republic of Congo) by Mr Nzeza (Jardin
Botanique de Kisantu). The plant has been identified by Mr Pauwels of the Botanical Garden
of Belgium (Meise, Belgium), where a voucher specimen has been deposited (BRSP.627986).
Extraction (Witte et al., 1993): About 12 g of plant material were defatted with petroleum
ether in a soxhlet apparatus for 6h. The defatted powder was then extracted in the soxhlet
apparatus with methanol for 6h. After the evaporation of the solvent, the residue was
suspended in HCl 1N and washed with CH2Cl2. The water phase was collected and half of the
extract was made basic with 25% NH4OH and applied to an Extrelut® (Merck) column (1 ml
extract / g Extrelut®), PAs were eluted with CH2Cl2; after evaporation of the organic solvent
the residue was re-dissolved in methanol. To investigate for the presence of N-oxides, the
other half was reduced with Zn (about 0.3 g) dust for 4h first and afterwards treated like the
first half (see above).
The obtained extracts were subjected to GC and GC-MS in order to identify and eventually to
quantify the PAs according to the method described by Frölich (Frölich et al., 2006).
Heliotrine was used as standard. Retention Indexes (RI), molecular ions and MS
149
fragmentation patterns were used for the identification of PAs. For GC-MS analysis, a
Hewlett–Packard 5890A gas chromatograph equipped with a 30 m x 0.32 mm (ft 0.25 µm)
analytical column (ZB-1, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) was used. The capillary
column was directly coupled to a TSQ 700 mass spectrometer (Finnigan, Bremen, Germany).
The conditions applied were: Injector and transfer line were set at 250°C; the temperature
program used was: 100°C (3 min) – 6°C/min – 310°C (3 min). The injection volume was 1 µl.
The split ratio was 1:20, the carrier gas flow was 1.6 ml/min He and the mass spectra were
recorded at 70 eV. Routine gas chromatography (GC) was performed as described using a
15 m x 0.25 mm (ft 0.25 µm) fused-silica column (DB1, J&W Scientific); detectors were FID
and NPD. A set of co-injected hydrocarbons (even numbered C14 – C32) was used to
calculate the retention indices by linear extrapolation as described by Frölich (Frölich et al.,
2006).
The root bark powder of C. gilletii has was extracted according to the method described
above, which is the method of choice when analyzing new potential sources of PAs. The Total
Ion Chromatogram (TIC) of each extract was analyzed using retention indices (RIs) and PA
characteristic fragments as parameters of diagnostic. In general, unsaturated pyrrolizidine
diesters yield a “triade of triplets” with fragments at m/z 93-95, 119-121 and 136-139;
whereas saturated necines show typical fragments in the ranges m/z 95-97, 113-115, 122-123
and 138-140, with a characteristic base peak at m/z 82 (Mattocks, 1986; Witte et al., 1993).
Among the TICs from obtained extracts, none of the peaks contained any characteristic
fragments of PAs, thus suggesting the absence of these alkaloids (Table 1).
Table 1. Research of PAs in Cordia gilletii extracts by GC-MS
Ranges of characteristic
fragments (m/z)
Heliotrine
(standard)
Root barks
extract
Leaves
extract
+ (93,120,138)
-
-
-
-
-
Unsaturated PAs
(93-95, 119-121, 136-139)
Saturated PAs
(95-97, 113-115, 122-123, 138-140)
Presence (+) or absence (-) of PAs were determined using the m/z of PA characteristic
fragments for detection
150
Despite the weakly positive response to the Dragendorff’s reaction, no PAs could be detected
down to the detection limit of 2 ppm determined by the internal standard heliotrine. The
Dragendorff’s reaction is well known to give false positive alkaloid reactions with a variety of
nitrogen compounds such as some amides (Murebwayire et al., 2006) but also nonnitrogenous oxygenated compounds like aldehydes, ketones, lactones, ethers, esters, epoxides
and peroxides. These compounds react positively if the oxygen function and the β-carbon
bonded to the oxygen present a high electron density (Habib, 1980).
We also investigated the leaves of C. gilletii, whose extracts are traditionally used against
malaria and showed interesting antiplasmodial effect in vitro (Okusa et al., 2007). The leaves
extract has been analyzed using a Hewlett-Packard 5890 II gas chromatograph equipped with
30 m x 0.32 mm fused-silica column (phenyl-5%-methyl-95%-polysiloxane), coupled to a
mass spectrometer MSD Hewlett-Packard 5972, EI 70 eV. The characteristic ions of PAs
could not be detected in the TICs of all analyzed extracts, thus suggesting the absence of PAs
(Table 1). In addition, the methods used here permitted to detect easily the unsaturated PAs of
Senecio delphinifolius Vahl (Asteraceae), thus representing a positive control for the general
performance of the overall methodology.
The absence of PAs in C. gilletii is not surprising because, among about 350 known species in
the genus Cordia, only two have been reported so far as containing PAs (Wassel et al.,
1987a).
(i)
Cordia sinensis Lam: its leaves contain 0.16% of PAs (free tertiary bases plus Noxides), PA N-oxides representing 18.7% of the total alkaloid content. The major
PA of this plant is floridanine (Fig 1), identified by MS: M+ at m/z 441, and
significant fragments at m/z 426, 426, 397, 383, 168, 152, 151 (100%), 150, 149,
123, 122, 110, 96 and 94 due to its secopyrrolizidine moiety, otonecine (Wassel et
al., 1987b). In the classification suggested by Hartmann, floridanine belongs to
senecionine type, which only exceptionally occurs in Boraginaceae species.
(ii)
Cordia myxa L.: its leaves contain 0.09% of PAs (free tertiary bases plus Noxides), PAs N-oxides representing 33.3% of the total alkaloid content.
Macrophylline has been found as the main alkaloid, identified by MS: M+ at m/z
239 and the characteristic strong peaks at m/z 98, 83 (base peak) and 55 (Wassel et
al., 1987b). Macrophylline is an ester of the saturated 2,9-dihydroxyamino-alcohol
macronecine (Fig 1). It belongs to the group of triangularine type in the
151
classification proposed by Hartmann and Witte (1995), which group occurs in only
16 species of Boraginaceae.
Since the genus Cordia is the most important in the Boraginaceae family, one of the most
important source of PA plants, it is noticeable that there are only two species reported so far
to contain PAs. Most of the published phytochemical investigations of this genus have not
found alkaloids but have been oriented towards other secondary metabolites; various
compounds like flavonoids, phenylpropanoids, triterpenes, tannins and fatty acids possessing
wide range of bioactivities have been isolated from different plant parts of Cordia species
(Thirupathi et al., 2008).
The presence of floridanine and macrophylline in two species of the genus Cordia may
suggest that this genus is likely to provide plants able to synthesize alkaloids, which should be
systematically investigated. It is possible that investigations of PAs in several species of the
genus Cordia led to their absence and were not reported. Recently, an other type of alkaloids,
gluturamide alkaloids named cordiarimides, has been isolated from the roots of Cordia
globifera W.W. Smith (Parks et al., 2010); these alkaloids were also found in the genus
Croton (Euphorbiaceae) and have been reported to display cytotoxic activity (Parks et al.,
2010).
Floridanine
Macrophylline
Figure 1. Chemical structures of the two pyrrolizidine alkaloids previously isolated in the
genus Cordia
152
4. Conclusion
PAs were not detected in the Congolese specimen of Cordia gilletii (detection limit 2 ppm) in
none of the investigated parts (root barks and leaves). This suggests no toxicological risk due
to PAs for Cordia gilletii, which is widely used as medicinal plant in Democratic Republic of
Congo. So far, only for two species in the genus Cordia, C. sinensis and C. myxa, the PAs
floridanine and macrophylline, respectively, are documented in literature.
Further samples from other locations are certainly needed to definitely exclude the presence
of PAs in Cordia gilletii, but the data obtained here and the chemical profiles reported in the
literature for other Cordia species are indicative of a probable safe use of this quite interesting
medicinal plant.
Acknowledgement: The authors are grateful to Mrs Claudine Theuring (University of
Braunschweig, Germany) for technical support.
153
154
5. CONCLUSION GENERALE
155
156
Cordia est le genre le plus important de la famille des Boraginaceae, il contient environ 350
espèces réparties dans les régions tropicales et subtropicales du globe terrestre. Parmi ces
espèces, de nombreuses plantes médicinales possédant diverses propriétés biologiques et
contenant plusieurs classes de composés chimiques sont répertoriées. Dans ce travail nous
nous sommes intéressé à Cordia gilletii De Wild, espèce traditionnellement utilisée en
République Démocratique du Congo contre diverses pathologies, dont les maladies
infectieuses. Ces dernières nécessitent des efforts permanents pour les contrôler car elles sont
la principale cause du taux de mortalité élevé des pays en développement et leur traitement
dans le pays industrialisés fait face au développement alarmant de la résistance des agents
pathogènes aux antibiotiques. Les plantes médicinales utilisées traditionnellement pour
soigner les infections constituent un outil potentiel pour la recherche de composés pouvant
attaquer directement les agents infectieux, moduler la résistance des microorganismes aux
antimicrobiens, voire même atténuer la virulence des agents infectieux. Les poudres de
feuilles et d’écorces de racines ont été soumises à des épuisements successifs avec des
solvants de polarités croissantes (n-hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle, méthanol et
eau), ce qui a permis d’obtenir des extraits dont diverses activités biologiques
(antimicrobiennes directe et indirecte, antiplasmodiale, antioxydante, modulation du quorum
sensing) ont été évaluées.
Concernant l’activité antimicrobienne directe, l’extrait méthanolique des écorces de racines a
montré un effet sur tous les microorganismes testés (aussi bien les bactéries gram positif et
gram négatif que les champignons) avec des CMI allant 250 à 1000 µg/ml ; ces effets étaient
bactéricides (tuant les germes) sur les bactéries à gram positif et bactériostatiques (inhibant la
croissance) sur les bactéries à gram négatif. En plus de son activité directe, cet extrait
présente également un effet synergique avec la tétracycline vis-à-vis des bactéries gram
positif et gram négatif ; cette synergie pourrait être exploitée pour réduire la dose de
l’antibiotique, en minimisant ainsi les effets indésirables. L’effet direct observé avec l’extrait
méthanolique justifie l’usage traditionnel de la plante dans le traitement des maladies
infectieuses. Cet extrait méthanolique a fait l’objet d’un fractionnement bio-guidé (activité sur
S. aureus ATCC 6538) par chromatographie sur colonne, suivi de chromatographies flash.
L’activité antimicrobienne a été suivie par CCM-bioautographie, technique dont nous avons
optimisé la détection des composés actifs en trouvant des proportions adéquates du mélange
de milieux de culture solide et liquide (10/90), permettant ainsi d’éviter les inconvénients de
chacun des milieux utilisés séparément. Un seul composé a pu être purifié, le férulaldéhyde ;
157
celui-ci a montré des propriétés antimicrobiennes sur des bactéries gram positif et gram
négatif, antioxydante et antiplasmodiale (Tableau 5.1). Ceci n’est pas surprenant étant donné
que les dérivés de cinnamaldéhyde sont bien connus pour leurs propriétés antimicrobiennes.
Le férulaldéhyde peut donc être considéré comme un des principes responsables des effets
antimicrobiens et antioxydants de C. gilletii. Les analyses par CCM-bioautographie ont
également permis de détecter d’autres composés antimicrobiens qui n’ont pas pu être isolés,
ces derniers composés contribuent aussi à l’activité de la plante.
Tableau 5.1. Activités biologiques des composés isolés de Cordia gilletii
Composés
Activités biologiques observées
Férulaldéhyde
Effet antibactérien direct
S. aureus ATCC 6538 (CMI: 25 µg/ml)
S. aureus C100459 (CMI: 25 µg/ml)
E. coli ATCC 25922(CMI: 50 µg/ml)
P. aeruginosa ATCC 9027(CMI: 100 µg/ml)
Effet antioxydant
DPPH test (IC50: 22.6 µg/ml)
Effet antiplasmodial
P. falciparum 3D7 (IC50: 24.6 µg/ml)
Friedeline
Activités biologiques décrites
dans la littérature
- antioxydant
- antifongique
- antiparasitaire
- anti-inflammatoire
- actif sur H. pylori
(Carpinella et al., 2003;
Garrett, 2007; Tucsek et al,
2010)
Aucune activité observée
- antiulcéreux
- anticonvulsivant
- fongistatique faible
(Queiroga et al., 2000;
Tamokou Jde et al., 2009)
Lupéol
Effet antibactérien indirect sur MRSA
(S. aureus C100459): diminution de CMI
pénicilline (8 fois)
céfotaxime (4 fois)
streptomycine (4 fois)
- anticancéreux
- hépatoprotecteur
- hypotenseur
- antimicrobien faible
(Sarachine et Gallo, 2009)
L’activité antibactérienne indirecte, étudiée sur des souches résistantes de Staphylococcus
aureus (MRSA), a permis de mettre en évidence l’augmentation ou la restauration de
l’activité de certains antibiotiques (oxacilline, pénicilline G, ampicilline, céfotaxime et
streptomycine) par les extraits hexanique et dichloromethanique. La résistance aux
158
antibiotiques des MRSA est principalement attribuée à la production des PBP 2a qui
réagissent avec les β-lactames mais de façon moins efficace que les autres PBPs. Le
développement de pompes à efflux ainsi que de mécanismes empêchant les antibiotiques
d’entrer dans la cellule contribuent également à la résistance des MRSA.
Figure 5.1. Effet antimicrobien indirect sur le MRSA des extraits de n-hexane et
dichlorométhane d’écorces de racines de C. gilletii.
L’extrait n-hexanique, qui montre la meilleure activité antimicrobienne indirecte (section 4.1)
a été fractionné par chromatographie sur colonne, les fractions obtenues ont été soumises à la
chromatographie flash, ce qui a permis d’isoler deux composés triterpéniques, la friedéline et
le lupéol. Ces deux composés ont été évalués quant à leur activité antimicrobienne indirecte ;
seul le lupéol a montré un effet en diminuant la CMI des β-lactames et de la streptomycine
d’un facteur allant de 4 à 8. Ces deux composés ont déjà été isolés dans plusieurs plantes et
une série d’activités biologiques ont déjà été décrites (Tableau 5.1). Cependant l’effet
antimicrobien indirect du lupéol est décrit pour la première fois dans ce travail. Le lupéol peut
donc être considéré comme responsable de l’effet indirect observé avec l’extrait hexanique ;
le mécanisme de cet effet du lupéol reste à étudier. Toutefois, d’autres triterpénoïdes
pentacycliques modulant la résistance aux antibiotiques vis-à-vis des bactéries pathogènes ont
déjà été décrits, il s’agit notamment de l’acide oléanolique, de l’acide ursolique, de l’αamyryne, de l’acide bétulinique et du bétulinaldéhyde. Si le mécanisme par lequel ils agissent
n’est pas encore élucidé, il y a lieu de signaler que ces composés possèdent en commun avec
159
le lupéol la présence d’un groupe hydroxyle en C3 et de deux méthyls en C4 ; la présence de
groupement carboxyle ou de la fonction aldéhyde ne semble pas importante pour cette activité
(Figure 5.2). Une vraie relation structure-activité nécessite toutefois des investigations plus
poussées et des comparaisons d’activité de plusieurs autres triterpénoïdes.
Betulinic acid ; R = COOH
α-Amyrin:R1 = R2 = R4 = CH3; R3 = H
Betulinaladehyde ; R = CHO
Oleanolic acid: R1 = H; R2 = R3 = CH3; R4 = COOH
Lupeol : R = CH3
Ursolic acid: R1 = R2 = CH3; R3 = H; R4 = COOH
Friedelin
Figure 5.2.Comparaison du lupéol avec les triterpenoïdes modulant la résistance aux
antibiotiques.
Les extraits méthanolique et dichlorométhanique de racines ont montré une certaine activité
antioxydante, bien qu’inférieure à la référence ; ces extraits sont en effet respectivement trois
et dix fois moins actifs que la quercétine. L’activité antioxydante observée avec ces extraits
pourrait expliquer l’utilisation traditionnelle des racines de Cordia gilletii dans le traitement
des plaies. En effet, les espèces réactives de l’oxygène, produites notamment au niveau des
sites inflammatoires, sont connues pour réduire la guérison des plaies par leurs effets néfastes
sur les cellules et les tissus. L’application locale de composés capteurs de radicaux libres
améliore significativement la guérison des plaies et protège les tissus des dommages
oxydatifs. Les extraits de feuilles n’ont pas montré d’activité antioxydante marquée.
Les extraits de feuilles et d’écorces de racines ont également été soumis à l’évaluation de
l’activité antiplasmodiale sur une souche chloroquino-sensible (Plasmodium falciparum 3D7),
les extraits obtenus avec du dichlorométhane et de l’acétate d’éthyle ont montré
d’intéressantes activités. Ce qui justifie l’usage traditionnel de ces deux parties de plante pour
traiter la malaria. Ces extraits méritent d’autres investigations pour isoler et identifier les
molécules douées des propriétés antiplasmodiales.
Dans le but d’explorer d’autres stratégies de traitements des maladies infectieuses, les extraits
de feuilles et d’écorces de racines ont été testés sur l’expression des gènes impliqués dans le
quorum sensing (QS) chez Pseudomonas aeruginosa. Les extraits de feuilles et d’écorces de
160
racines ont montré un effet inhibiteur significatif sur la production par P. aeruginosa PAO1
de pyocyanine, un facteur de virulence extracellulaire régulé par le QS. Ces extraits ont
ensuite été évalués quant à leur effet sur la transcription des gènes impliqués dans le QS, lasB
et rhlA ; la transcription d’un autre gène, aceA, qui n’intervient pas dans le QS, a été évaluée
parallèlement dans le but de déterminer si l’activité inhibitrice éventuellement observée est
spécifique au QS. En effet un extrait intéressant est celui qui inhibe l’expression de lasB et
rhlA, sans inhiber celle de aceA. Parmi les extraits testés, seul l’extrait dichlorométhane
d’écorces de racines a montré un effet inhibiteur sur la transcription des deux gènes du QS
évalués, sans inhiber la transcription de aceA, suggérant ainsi un effet inhibiteur spécifique
aux gènes du QS.
L’analyse de l’huile essentielle extraite des feuilles de C. gilletii a permis de mettre en
évidence la présence de composés terpéniques (25,6%) et non terpéniques (64,6%). Cette
composition est typique des plantes contenant très peu d’huiles essentielles où la distillation
entraîne majoritairement d’autres composés, notamment les produits de dégradation des
acides gras. Cette huile essentielle a montré une activité antioxydante avec une CI50 de 75 et
130 µg/ml respectivement sur les tests de décoloration du DPPH et du β-carotène ; un faible
effet inhibiteur sur les cholinestérases avec une CI50 de 106 µg/ml et 369 µg/ml
respectivement pour l’AchE et la BchE. L’effet antioxydant de l’huile essentielle pourrait être
exploité dans la prise en charge des pathologies où sont impliqués les radicaux libres ; tandis
que la faible activité anticholinestérase suggère une absence de toxicité à cet égard.
Etant donné que Cordia gilletii appartient à la famille des Boraginaceae, une famille connue
comme une des principales sources d’alcaloïdes pyrrolizidiniques (APs), cette espèce est
susceptible de contenir ce type d’alcaloïdes. Les APs sont potentiellement toxiques lorsqu’ils
sont ingérés à partir des plantes utilisées comme médicaments ou aliments. La recherche de
ces alcaloïdes par GC-MS n’a pas permis de déceler leur présence dans les écorces de racines
ni dans les feuilles jusqu’à une limite de détection de 2 ppm. Bien que cette absence d’APs
doive être confirmée sur un plus grand échantillonnage, ces résultats suggèrent, d’une part,
que C. gilletii ne présente pas de toxicité due aux APs et, d’autre part, que le genre Cordia
n’est pas un grand producteur d’APs, en effet seules deux espèces de ce genre ont été
rapportées comme sources d’APs (C. myxa et C. macrophylla). L’absence d’APs est un atout
important pour la sécurité de l’usage de cette plante en médecine traditionnelle.
161
Le présent travail montre que C. gilletii est une plante qui permet de lutter contre les maladies
infectieuses par (i) son action antimicrobienne directe (due entre autre au féruldahéhyde); (ii)
son effet antimicrobien indirect (dû au lupéol), effet permettant d’augmenter ou de restaurer
l’activité des antibiotiques vis-à-vis des souches multi-résistantes ; et (iii) son effet inhibiteur
de l’expression de gènes du quorum sensing, effet permettant d’atténuer la virulence d’agents
infectieux. Ces actions, directe et indirecte, permettent de faire face aux infections dues à des
germes multi-résistants. Ceci suggère que les plantes médicinales peuvent permettre de lutter
contre les infections non seulement dans les pays en développement où la majorité de la
population recourt à la médecine traditionnelle proposant des remèdes essentiellement à base
de plantes ; mais aussi dans les pays industrialisés, où la résistance aux antibiotiques se
développe de façon alarmante, en fournissant des inhibiteurs de la résistance par leur effet
antimicrobien indirect, ainsi que des remèdes pouvant atténuer la sévérité des infections.
162
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
163
164
Ahmad, I. and Beg, A. Z., 2001, Antimicrobial and phytochemical studies on 45 Indian medicinal plants against
multi-drug resistant human pathogens, J Ethnopharmacol 74(2):113-123.
Akhtar, A. H. and Ahmad, K. U., 1995, Anti-ulcerogenic evaluation of the methanolic extracts of some
indigenous medicinal plants of Pakistan in aspirin-ulcerated rats, J Ethnopharmacol 46(1):1-6.
Al-Rehaily, A. J., Albishi, O. A., El-Olemy, M. M. and Mossa, J. S., 2008, Flavonoids and terpenoids from
Helichrysum forskahlii, Phytochemistry 69(9):1910-1914.
Alencar de Menezes, J. E., Lemos, T. L., Pessoa, O. D., Braz-Filho, R., Montenegro, R. C., Wilke, D. V., CostaLotufo, L. V., Pessoa, C., de Moraes, M. O. and Silveira, E. R., 2005, A cytotoxic meroterpenoid
benzoquinone from roots of Cordia globosa, Planta Med 71(1):54-58.
Ali, S. M., Khan, A. A., Ahmed, I., Musaddiq, M., Ahmed, K. S., Polasa, H., Rao, L. V., Habibullah, C. M.,
Sechi, L. A. and Ahmed, N., 2005, Antimicrobial activities of Eugenol and Cinnamaldehyde against the
human gastric pathogen Helicobacter pylori, Ann Clin Microbiol Antimicrob 4:20.
Allen, G. P., Kaatz, G. W. and Rybak, M. J., 2004, In vitro activities of mutant prevention concentration-targeted
concentrations of fluoroquinolones against Staphylococcus aureus in a pharmacodynamic model, Int J
Antimicrob Agents 24(2):150-160.
Almeida, A. A., Farah, A., Silva, D. A., Nunan, E. A. and Gloria, M. B., 2006, Antibacterial activity of coffee
extracts and selected coffee chemical compounds against enterobacteria, J Agric Food Chem
54(23):8738-8743.
Angeh, J. E., Huang, X., Sattler, I., Swan, G. E., Dahse, H., Hartl, A. and Eloff, J. N., 2007, Antimicrobial and
anti-inflammatory activity of four known and one new triterpenoid from Combretum imberbe
(Combretaceae), J Ethnopharmacol 110(1):56-60.
Anonymous, 2000, Text of Biodip leaflet, Chrom Biodip Antibiotics 1.05638
in: Merck, Darmstadt, Germany.
Ayafor, J. F., Sondengam, B. L. and Ngadjui, B. T., 1982, Veprisinium salt, a novel antibacterial quaternary
alkaloid from Vepris louisii, Planta Med 44(3):139-142.
Babajide, O. J., Babajide, O. O., Daramola, A. O. and Mabusela, W. T., 2008, Flavonols and an oxychromonol
from Piliostigma reticulatum, Phytochemistry 69(11):2245-2250.
Bai, J. and I.Cederbaum, A., 2004, Adenovirus mediated overexpression of CYP2E1 increases sensitivity of
HepG2 cells to acetaminophen induced cytotoxicity, Molecular and Cellular Biochemistry 262:165176.
Bairov, G. A., Libov, S. L. and Popov, A. A., 1979, [Ectopia Cordia], Vestn Khir Im I I Grek 122(2):63-66.
Bayeux, M. C., Fernandes, A. T., Foglio, M. A. and Carvalho, J. E., 2002, Evaluation of the antiedematogenic
activity of artemetin isolated from Cordia curassavica DC, Braz J Med Biol Res 35(10):1229-1232.
Begue, W. J. and Kline, R. M., 1972, The use of tetrazolium salts in bioautographic procedures, J Chromatogr
64(1):182-184.
Begum, S., Perwaiz, S., Siddiqui, B. S., Khan, S., Fayyaz, S. and Ramzan, M., 2011, Chemical constituents of
Cordia latifolia and their nematicidal activity, Chem Biodivers 8(5):850-861.
Bonesi, M., Okusa, P. N., Tundis, R., Loizzo, M. R., Menichini, F., Stevigny, C. and Duez, P., 2011, Chemical
composition, antioxidant properties and anti-cholinesterase activity of Cordia gilletii (Boraginaceae)
leaves essential oil, Nat Prod Commun 6(2):253-257.
Botz, L., Nagy, S. and Kocsis, B., 2001, Detection of microbiologically active compounds, in: Planar
Chromatography: A retrospective view for the third millenium (S. Nyiredy, ed.), Springer, Budapest,
pp. 489-516.
Brehm-Stecher, B. F. and Johnson, E. A., 2003, Sensitization of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to
antibiotics by the sesquiterpenoids nerolidol, farnesol, bisabolol, and apritone, Antimicrob Agents
Chemother 47(10):3357-3360.
Bremer, K., Bremer, B. and Thulin, M., 2003, Introduction to Phylogeny and Systematics of Flowering Plants,
Uppsala University, Stockholm, pp. 102.
Bruneton, J., 1993, Pharmacognosie. Phytochimie. Plantes médicinales 3rd edn edn., Tec & Doc, Paris, pp. 1120.
Burns, D., Reynolds, W., Buchanan, G., Reese, P. and Enriquez, P., 2000, Assignment of 1H and 13C spectra
and investigation of hindered side-chain rotation in lupeol derivatives, Magn Reson Chem 38(7):488493.
Butler, M. S., 2008, Natural products to drugs: natural product-derived compounds in clinical trials, Nat Prod
Rep 25(3):475-516.
Buwa, L. V. and van Staden, J., 2006, Antibacterial and antifungal activity of traditional medicinal plants used
against venereal diseases in South Africa, J Ethnopharmacol 103(1):139-142.
Carpinella, M. C., Giorda, L. M., Ferrayoli, C. G. and Palacios, S. M., 2003, Antifungal effects of different
organic extracts from Melia azedarach L. on phytopathogenic fungi and their isolated active
components, J Agric Food Chem 51(9):2506-2511.
165
CDC, Centers for Disease Control and prevention, http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Malaria.htm
Chen, M., Christensen, S. B., Blom, J., Lemmich, E., Nadelmann, L., Fich, K., Theander, T. G. and Kharazmi,
A., 1993, Licochalcone A, a novel antiparasitic agent with potent activity against human pathogenic
protozoan species of Leishmania, Antimicrob Agents Chemother 37(12):2550-2556.
Chen, M., Theander, T. G., Christensen, S. B., Hviid, L., Zhai, L. and Kharazmi, A., 1994, Licochalcone A, a
new antimalarial agent, inhibits in vitro growth of the human malaria parasite Plasmodium falciparum
and protects mice from P. yoelii infection, Antimicrob Agents Chemother 38(7):1470-1475.
Chung, P. Y., Navaratnam, P. and Chung, L. Y., 2011, Synergistic antimicrobial activity between pentacyclic
triterpenoids and antibiotics against Staphylococcus aureus strains, Ann Clin Microbiol Antimicrob
10:25.
Cimanga, K., De Bruyne, T., Lasure, A., Van Poel, B., Pieters, L., Claeys, M., Berghe, D. V., Kambu, K., Tona,
L. and Vlietinck, A. J., 1996, In vitro biological activities of alkaloids from Cryptolepis sanguinolenta,
Planta Med 62(1):22-27.
Connolly, M. A., Gayer, M., Ryan, M. J., Salama, P., Spiegel, P. and Heymann, D. L., 2004, Communicable
diseases in complex emergencies: impact and challenges, Lancet 364(9449):1974-1983.
Cos, P., Vlietinck, A. J., Berghe, D. V. and Maes, L., 2006, Anti-infective potential of natural products: how to
develop a stronger in vitro 'proof-of-concept', J Ethnopharmacol 106(3):290-302.
Costa, S. C., Chavez, C. V., Jubelin, G., Givaudan, A., Escoubas, J. M., Brehelin, M. and Zumbihl, R., 2010,
Recent insight into the pathogenicity mechanisms of the emergent pathogen Photorhabdus asymbiotica,
Microbes Infect 12(3):182-189.
Cowan, M. M., 1999, Plant products as antimicrobial agents, Clin Microbiol Rev 12(4):564-582.
Cushnie, T. P. and Lamb, A. J., 2005, Antimicrobial activity of flavonoids, Int J Antimicrob Agents 26(5):343356.
Dahl, E. L., Shock, J. L., Shenai, B. R., Gut, J., DeRisi, J. L. and Rosenthal, P. J., 2006, Tetracyclines
specifically target the apicoplast of the malaria parasite Plasmodium falciparum, Antimicrob Agents
Chemother 50(9):3124-3131.
Daugelavicius, R., Bakiene, E. and Bamford, D. H., 2000, Stages of polymyxin B interaction with the
Escherichia coli cell envelope, Antimicrob Agents Chemother 44(11):2969-2978.
Davere, M. and Bahadir, M., 1994, Biological monitoring of landfill leachates using plants and luminescent
bacteria, Chemosphere 28:261-271.
de Carvalho, P. M., Jr., Rodrigues, R. F., Sawaya, A. C., Marques, M. O. and Shimizu, M. T., 2004, Chemical
composition and antimicrobial activity of the essential oil of Cordiaverbenacea D.C, J Ethnopharmacol
95(2-3):297-301.
de Menezes, J. E., Machado, F. E., Lemos, T. L., Silveira, E. R., Braz Filho, R. and Pessoa, O. D., 2004,
Sesquiterpenes and a phenylpropanoid from Cordia trichotoma, Z Naturforsch [C] 59(1-2):19-22.
de Souza, G. C., Haas, A. P., von Poser, G. L., Schapoval, E. E. and Elisabetsky, E., 2004,
Ethnopharmacological studies of antimicrobial remedies in the south of Brazil, J Ethnopharmacol
90(1):135-143.
Debrunner, B. and Meier, B., 1998, Petasites hybridus: a tool for interdisciplinary research in phytotherapy,
Pharm Acta Helv 72(6):359-362.
Dellar, J. E., Cole, M. D. and Waterman, P. G., 1996, Antimicrobial abietane diterpenoids from Plectranthus
elegans, Phytochemistry 41(3):735-738.
Desenclos, J. C., 2005, [Surveillance of infectious diseases: principles and organisation in France in 2005], Med
Mal Infect 35(5):232-244.
Desenclos, J. C. and De Valk, H., 2005, [Emergent infectious diseases: importance for public health,
epidemiology, promoting factors, and prevention], Med Mal Infect 35(2):49-61.
Dettrakul, S., Surerum, S., Rajviroongit, S. and Kittakoop, P., 2009, Biomimetic transformation and biological
activities of Globiferin, a terpenoid benzoquinone from Cordia globifera, J Nat Prod 72(5):861-865.
Diallo, M. S. S., Abdoulaye; Sidibe, Kaba; Sylla, Bakary S.; Trepo, Christian R.; Wild, Christopher Paul, 1995,
Prevalence of exposure to aflatoxin and hepatitis B and C viruses in Guinea, West Africa, Natural
Toxins 3(1):6-9.
Dickinson, J. O., Cooke, M. P., King, R. R. and Mohamed, P. A., 1976, Milk transfer of pyrrolizidine alkoloids
in cattle, J Am Vet Med Assoc 169(11):1192-1196.
Drewes, S. E., Khan, F., van Vuuren, S. F. and Viljoen, A. M., 2005, Simple 1,4-benzoquinones with
antibacterial activity from stems and leaves of Gunnera perpensa, Phytochemistry 66(15):1812-1816.
Drewes, S. E., Mudau, K. E., van Vuuren, S. F. and Viljoen, A. M., 2006, Antimicrobial monomeric and dimeric
diterpenes from the leaves of Helichrysum tenax var tenax, Phytochemistry 67(7):716-722.
Driscoll, J. A., Brody, S. L. and Kollef, M. H., 2007, The epidemiology, pathogenesis and treatment of
Pseudomonas aeruginosa infections, Drugs 67(3):351-368.
166
Edgar, J. A. and Smith, L. W., 2000, Transfer of Pyrrolizidine Alkaloids into Eggs: Food Safety Implications, in:
Natural and Selected Synthetic Toxins. Biological Implications (A. T. Tu, and W. Gaffield, eds.),
American Chemical Society, pp. 118-128.
El-Hassan, A., El-Sayed, M., Hamed, A. I., Rhee, I. K., Ahmed, A. A., Zeller, K. P. and Verpoorte, R., 2003,
Bioactive constituents of Leptadenia arborea, Fitoterapia 74(1-2):184-187.
Eloff, J. N., 1998, Which extractant should be used for the screening and isolation of antimicrobial components
from plants?, J Ethnopharmacol 60(1):1-8.
Eloff, J. N., 1999, It is possible to use herbarium specimens to screen for antibacterial components in some
plants, J Ethnopharmacol 67(3):355-360.
Ermel, G., Georgeault, S., Inisan, C. and Besnard, M., 2012, Inhibition of adhesion of uropathogenic Escherichia
coli bacteria to uroepithelial cells by extracts from cranberry, J Med Food 15(2):126-134.
Escobedo-Martinez, C., Cruz-Morales, S., Fragoso-Serrano, M., Rahman, M. M., Gibbons, S. and PeredaMiranda, R., 2010, Characterization of a xylose containing oligosaccharide, an inhibitor of multidrug
resistance in Staphylococcus aureus, from Ipomoea pes-caprae, Phytochemistry 71(14-15):1796-1801.
Evans, W. C., 2009, Trease and Evans Pharmacognosy, Saunders, London, pp. 603.
Eyong, K. O., Krohn, K., Hussain, H., Folefoc, G. N., Nkengfack, A. E., Schulz, B. and Hu, Q., 2005,
Newbouldiaquinone and newbouldiamide: a new naphthoquinone-anthraquinone coupled pigment and a
new ceramide from Newbouldia laevis, Chem Pharm Bull (Tokyo) 53(6):616-619.
Falconer, S. B. and Brown, E. D., 2009, New screens and targets in antibacterial drug discovery, Curr Opin
Microbiol 12(5):497-504.
Ficarra, R., Ficarra, P., Tommasini, S., Calabro, M. L., Ragusa, S., Barbera, R. and Rapisarda, A., 1995, Leaf
extracts of some Cordia species: analgesic and anti-inflammatory activities as well as their
chromatographic analysis, Farmaco 50(4):245-256.
Fogliani, B., Raharivelomanana, P., Bianchini, J. P., Bouraima-Madjebi, S. and Hnawia, E., 2005, Bioactive
ellagitannins from Cunonia macrophylla, an endemic Cunoniaceae from New Caledonia,
Phytochemistry 66(2):241-247.
Friis-Moller, A., Chen, M., Fuursted, K., Christensen, S. B. and Kharazmi, A., 2002, In vitro antimycobacterial
and antilegionella activity of licochalcone A from Chinese licorice roots, Planta Med 68(5):416-419.
Frolich, C., Hartmann, T. and Ober, D., 2006, Tissue distribution and biosynthesis of 1,2-saturated pyrrolizidine
alkaloids in Phalaenopsis hybrids (Orchidaceae), Phytochemistry 67(14):1493-1502.
Frolich, C., Ober, D. and Hartmann, T., 2007, Tissue distribution, core biosynthesis and diversification of
pyrrolizidine alkaloids of the lycopsamine type in three Boraginaceae species, Phytochemistry
68(7):1026-1037.
Gabrielson, J., Hart, M., Jarelov, A., Kuhn, I., McKenzie, D. and Mollby, R., 2002, Evaluation of redox
indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantification of microbial growth
in microplates, J Microbiol Methods 50(1):63-73.
Gallo, M. B. C. and Sarachine, M. J., 2009, Biological activities of lupeol, International Journal of Biomedical
and Pharmaceutical Sciences 3(1):46-66.
Gangoue-Pieboji, J., Baurin, S., Frere, J. M., Ngassam, P., Ngameni, B., Azebaze, A., Pegnyemb, D. E.,
Watchueng, J., Goffin, C. and Galleni, M., 2007, Screening of some medicinal plants from cameroon
for beta-lactamase inhibitory activity, Phytother Res 21(3):284-287.
Garrett, J. K., 2007, Inhibition of Helicobacter pylori by wild blueberry phenolics, Thèse présentée dans le
Virginia Tech, University of Maine, pp. 61.
Geddes, A., 2005, The future of infectious diseases, Antibiotiques (7):75-76.
Gibbons, S., Fallah, F. and Wright, C. W., 2003, Cryptolepine hydrochloride: a potent antimycobacterial alkaloid
derived from Cryptolepis sanguinolenta, Phytother Res 17(4):434-436.
Gibbons, S., Moser, E. and Kaatz, G. W., 2004, Catechin gallates inhibit multidrug resistance (MDR) in
Staphylococcus aureus, Planta Med 70(12):1240-1242.
Goldberg, D. E., Slater, A. F., Cerami, A. and Henderson, G. B., 1990, Hemoglobin degradation in the malaria
parasite Plasmodium falciparum: an ordered process in a unique organelle, Proc Natl Acad Sci U S A
87(8):2931-2935.
Gutierrez, R. M. and Perez, R. L., 2004, Raphanus sativus (Radish): their chemistry and biology, Scientific
World Journal 4:811-837.
Haberer, W., Witte, L., Hartmann, T. and Dobler, S., 2002, Pyrrolizidine alkaloids in Pulmonaria obscura,
Planta Med 68(5):480-482.
Habib, A. A., 1980, False-positive alkaloid reactions, J Pharm Sci 69(1):37-43.
Hamburger, M. O. and Cordell, G. A., 1987, A direct bioautographic tlc assay for compounds possessing
antibacterial activity, J Nat Prod 50(1):19-22.
Haraguchi, H., Tanimoto, K., Tamura, Y., Mizutani, K. and Kinoshita, T., 1998, Mode of antibacterial action of
retrochalcones from Glycyrrhiza inflata, Phytochemistry 48(1):125-129.
167
Hartmann, C., Frolich, M., Krauss, D., Spahn-Langguth, H., Knauf, H. and Mutschler, E., 1990, Comparative
enantioselective pharmacokinetic studies of celiprolol in healthy volunteers and patients with impaired
renal function, Eur J Clin Pharmacol 39(6):573-576.
Hartmann, T., 2004, Plant-derived secondary metabolites as defensive chemicals in herbivorous insects: a case
study in chemical ecology, Planta 219(1):1-4.
Hartmann, T., Theuring, C., Beuerle, T., Bernays, E. A. and Singer, M. S., 2005, Acquisition, transformation and
maintenance of plant pyrrolizidine alkaloids by the polyphagous arctiid Grammia geneura, Insect
Biochem Mol Biol 35(10):1083-1099.
Hartmann, T. and Witte, L., 1995, Chemistry, Biology and Chemoecology of the Pyrrolizidine alkaloids, in:
Alkaloids: chemical and biological perspectives (Vol. 9) (S. W. Pelletier, ed.), Elsevier, pp. 155-233.
Haslam, E., 1996, Natural polyphenols (vegetable tannins) as drugs: possible modes of action, J Nat Prod
59(2):205-215.
Hatano, T., Kusuda, M., Inada, K., Ogawa, T. O., Shiota, S., Tsuchiya, T. and Yoshida, T., 2005, Effects of
tannins and related polyphenols on methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Phytochemistry
66(17):2047-2055.
Hattori, M., Kusumoto, I. T., Namba, T., Ishigami, T. and Hara, Y., 1990, Effect of tea polyphenols on glucan
synthesis by glucosyltransferase from Streptococcus mutans, Chem Pharm Bull (Tokyo) 38(3):717-720.
Hawkey, P. M., 2000, Mechanisms of resistance to antibiotics, Intensive Care Med 26 Suppl 1:S9-13.
Hayashi, K., Hayashi, T., Morita, N. and Niwayama, S., 1990, Antiviral activity of an extract of Cordia
salicifolia on herpes simplex virus type 1, Planta Med 56(5):439-443.
Hentzer, M., Riedel, K., Rasmussen, T. B., Heydorn, A., Andersen, J. B., Parsek, M. R., Rice, S. A., Eberl, L.,
Molin, S., Hoiby, N., Kjelleberg, S. and Givskov, M., 2002, Inhibition of quorum sensing in
Pseudomonas aeruginosa biofilm bacteria by a halogenated furanone compound, Microbiology 148(Pt
1):87-102.
Hernandez, T., Canales, M., Avila, J. G., Duran, A., Caballero, J., Romo de Vivar, A. and Lira, R., 2003,
Ethnobotany and antibacterial activity of some plants used in traditional medicine of Zapotitlan de las
Salinas, Puebla (Mexico), J Ethnopharmacol 88(2-3):181-188.
Heymann, D. L., 2005, Social, behavioural and environmental factors and their impact on infectious disease
outbreaks, J Public Health Policy 26(1):133-139.
Heymann, D. L. and Rodier, G., 2004, Global surveillance, national surveillance, and SARS, Emerg Infect Dis
10(2):173-175.
Holding, P. A. and Snow, R. W., 2001, Impact of Plasmodium falciparum malaria on performance and learning:
review of the evidence, Am J Trop Med Hyg 64(1-2 Suppl):68-75.
Holland, B. I., 2003, Introduction to bacterial ABC proteins, in: ABC proteins: from bacteria to men (B. I.
Holland, P. C. Cole, K. Kuchler, and C. F. Higgins, eds.), Elsevier, London, pp. 149.
Hostettmann, K., Terreaux, C., Marston, A. and Potterat, O., 1997, The role of planar chromatography in the
rapid screening and isolation of bioactive compounds from medicinal plants, Journal of Planar
Chromatography-Modern TLC 10(4):251-257.
Ioset, J. R., Marston, A., Gupta, M. P. and Hostettmann, K., 1998, Antifungal and larvicidal meroterpenoid
naphthoquinones and a naphthoxirene from the roots of Cordia linnaei, Phytochemistry 47(5):729-734.
Ioset, J. R., Marston, A., Gupta, M. P. and Hostettmann, K., 2000a, Antifungal and larvicidal compounds from
the root bark of Cordia alliodora, J Nat Prod 63(3):424-426.
Ioset, J. R., Marston, A., Gupta, M. P. and Hostettmann, K., 2000b, Antifungal and larvicidal cordiaquinones
from the roots of Cordia curassavica, Phytochemistry 53(5):613-617.
Jain, S. C. and Sharma, R., 1987, Antimicrobial activity of pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium ellipticum,
Chem Pharm Bull (Tokyo) 35(8):3487-3489.
Jain, S. C., Singh, B. and Jain, R., 2001, Antimicrobial activity of triterpenoids from Heliotropium ellipticum,
Fitoterapia 72(6):666-668.
Jansen, O., Angenot, L., Tits, M., Nicolas, J. P., De Mol, P., Nikiema, J. B. and Frederich, M., 2010, Evaluation
of 13 selected medicinal plants from Burkina Faso for their antiplasmodial properties, J
Ethnopharmacol 130(1):143-150.
Jeon, C. Y., Haan, M. N., Cheng, C., Clayton, E. R., Mayeda, E. R., Miller, J. W. and Aiello, A. E., 2012,
Helicobacter pylori infection is associated with an increased rate of diabetes, Diabetes Care 35(3):520525.
Kaatz, G. W. and Seo, S. M., 2004, Effect of substrate exposure and other growth condition manipulations on
norA expression, J Antimicrob Chemother 54(2):364-369.
Kambu, K., 1990, Eléments de Phytothérapie comparée: plantes médicinales africaines, C.R.P., Kinshasa.
Katerere, D. R., Gray, A. I., Nash, R. J. and Waigh, R. D., 2003, Antimicrobial activity of pentacyclic triterpenes
isolated from African Combretaceae, Phytochemistry 63(1):81-88.
168
Kaye, K. S., Fraimow, H. S. and Abrutyn, E., 2000, Pathogens resistant to antimicrobial agents. Epidemiology,
molecular mechanisms, and clinical management, Infect Dis Clin North Am 14(2):293-319.
Kayser, F. H., Böttger, E. C., Zinkernagel, R. M., Haller, O., Eckert, J. and Deplazes, 2008, Microbiologie
Médicale, Flammarion, Paris.
Kempf, M., Reinhard, A. and Beuerle, T., 2010, Pyrrolizidine alkaloids (PAs) in honey and pollen-legal
regulation of PA levels in food and animal feed required, Mol Nutr Food Res 54(1):158-168.
Kenmogne, M., Prost, E., Harakat, D., Jacquier, M. J., Frederich, M., Sondengam, L. B., Zeches, M. and WaffoTeguo, P., 2006, Five labdane diterpenoids from the seeds of Aframomum zambesiacum,
Phytochemistry 67(5):433-438.
Kerharo, J., 1973, La Pharmacopée Sénégalaise Traditionnelle: Plantes médicinales et toxiques Vigot Frères
edn., Paris, pp. 1011.
Kerrod, E., Geddes, A. M., Regan, M. and Leach, S., 2005, Surveillance and control measures during smallpox
outbreaks, Emerg Infect Dis 11(2):291-297.
Khan, M. S. and Ahmad, I., 2012, Biofilm inhibition by Cymbopogon citratus and Syzygium aromaticum
essential oils in the strains of Candida albicans, J Ethnopharmacol 140(2):416-423.
Kline, R. M. and Golab, T., 1965, A Simple Technique in Developing Thin-Layer Bioautographs, J Chromatogr
18:409-411.
Korkina, L. G., 2007, Phenylpropanoids as naturally occurring antioxidants: from plant defense to human health,
Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 53(1):15-25.
Kuete, V., Eyong, K. O., Folefoc, G. N., Beng, V. P., Hussain, H., Krohn, K. and Nkengfack, A. E., 2007,
Antimicrobial activity of the methanolic extract and of the chemical constituents isolated from
Newbouldia laevis, Pharmazie 62(7):552-556.
Kuete, V., Ngameni, B., Simo, C. C., Tankeu, R. K., Ngadjui, B. T., Meyer, J. J., Lall, N. and Kuiate, J. R.,
2008, Antimicrobial activity of the crude extracts and compounds from Ficus chlamydocarpa and Ficus
cordata (Moraceae), J Ethnopharmacol 120(1):17-24.
Kumar, S., Guha, M., Choubey, V., Maity, P. and Bandyopadhyay, U., 2007, Antimalarial drugs inhibiting
hemozoin (beta-hematin) formation: a mechanistic update, Life Sci 80(9):813-828.
Kurek, A., Nadkowska, P., Pliszka, S. and Wolska, K. I., 2012, Modulation of antibiotic resistance in bacterial
pathogens by oleanolic acid and ursolic acid, Phytomedicine 19(6):515-519.
Kuroyanagi, M., Kawahara, N., Sekita, S., Satake, M., Hayashi, T., Takase, Y. and Masuda, K., 2003,
Dammarane-type triterpenes from the Brazilian medicinal plant Cordia multispicata, J Nat Prod
66(10):1307-1312.
Kuroyanagi, M., Seki, T., Hayashi, T., Nagashima, Y., Kawahara, N., Sekita, S. and Satake, M., 2001, Antiandrogenic triterpenoids from the Brazilian medicinal plant, Cordia multispicata, Chem Pharm Bull
(Tokyo) 49(8):954-957.
Kuzma, L., Rozalski, M., Walencka, E., Rozalska, B. and Wysokinska, H., 2007, Antimicrobial activity of
diterpenoids from hairy roots of Salvia sclarea L.: salvipisone as a potential anti-biofilm agent active
against antibiotic resistant Staphylococci, Phytomedicine 14(1):31-35.
Lam, K. S., 2007, New aspects of natural products in drug discovery, Trends Microbiol 15(6):279-289.
Landoy, Z., West, T. E., Vladutiu, A. O. and Fitzpatrick, J. E., 1985, Evaluation of a Cordia-IC enzyme-linked
immunosorbent assay kit for the detection of circulating immune complexes, J Clin Microbiol
22(2):279-282.
Lay, F. T. and Anderson, M. A., 2005, Defensins--components of the innate immune system in plants, Curr
Protein Pept Sci 6(1):85-101.
Lenta, B. N., Weniger, B., Antheaume, C., Noungoue, D. T., Ngouela, S., Assob, J. C., Vonthron-Senecheau, C.,
Fokou, P. A., Devkota, K. P., Tsamo, E. and Sewald, N., 2007, Anthraquinones from the stem bark of
Stereospermum zenkeri with antimicrobial activity, Phytochemistry 68(11):1595-1599.
Levand, O. and Larson, H. O., 1979, Some chemical constituents of Morinda citrifolia, Planta Med 36(2):186187.
Liu, Q., Harrington, D., Kohen, J. L., Vemulpad, S. and Jamie, J. F., 2006, Bactericidal and cyclooxygenase
inhibitory diterpenes from Eremophila sturtii, Phytochemistry 67(12):1256-1261.
Livermore, D. M., 1995, beta-Lactamases in laboratory and clinical resistance, Clin Microbiol Rev 8(4):557-584.
Lockwood, N. A. and Mayo, K. H., 2003, The future for antibiotics: Bacterial membrane disintegrators, Drugs of
the Future 28(9):911.
Lohombo-Ekomba, M. L., Okusa, P. N., Penge, O., Kabongo, C., Choudhary, M. I. and Kasende, O. E., 2004,
Antibacterial, antifungal, antiplasmodial, and cytotoxic activities of Albertisia villosa, J
Ethnopharmacol 93(2-3):331-335.
Longanga Otshudi, A., Vercruysse, A. and Foriers, A., 2001, Antidiarrhoeal activity of root extracts from
Roureopsis obliquifoliolata and Epinetrum villosum, Fitoterapia 72(3):291-294.
169
Mackay, M. L., Milne, K. and Gould, I. M., 2000, Comparison of methods for assessing synergic antibiotic
interactions, Int J Antimicrob Agents 15(2):125-129.
Mahato, S. B. and Kundu, A. P., 1994, 13C NMR spectra of pentacyclic triterpenois - A compilation and some
salient features, Phytochemistry 37(6):1517-1575.
Makler, M. T., Ries, J. M., Williams, J. A., Bancroft, J. E., Piper, R. C., Gibbins, B. L. and Hinrichs, D. J., 1993,
Parasite lactate dehydrogenase as an assay for Plasmodium falciparum drug sensitivity, Am J Trop Med
Hyg 48(6):739-741.
Mandal, S. M., Dey, S., Mandal, M., Sarkar, S., Maria-Neto, S. and Franco, O. L., 2008, Identification and
structural insights of three novel antimicrobial peptides isolated from green coconut water, Peptides.
Mandell, G. L., Bennett, J. E. and Dolin, R., 2010, Principles and Practice of Infectious Diseases 7th edition
edn., Elsevier, Philadelphia, pp. 4019.
Manefield, M., de Nys, R., Kumar, N., Read, R., Givskov, M., Steinberg, P. and Kjelleberg, S., 1999, Evidence
that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated
gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein, Microbiology 145 ( Pt 2):283291.
Markham, P. N. and Neyfakh, A. A., 2001, Efflux-mediated drug resistance in Gram-positive bacteria, Curr
Opin Microbiol 4(5):509-514.
Marquez, B., 2005, Bacterial efflux systems and efflux pumps inhibitors, Biochimie 87(12):1137-1147.
Martin, S. K., Oduola, A. M. and Milhous, W. K., 1987, Reversal of chloroquine resistance in Plasmodium
falciparum by verapamil, Science 235(4791):899-901.
Matsuse, I. T., Lim, Y. A., Hattori, M., Correa, M. and Gupta, M. P., 1999, A search for anti-viral properties in
Panamanian medicinal plants. The effects on HIV and its essential enzymes, J Ethnopharmacol
64(1):15-22.
Mattocks, A. R., 1986, Chemistry and Toxicology of Pyrrolizidine Alkaloids Academic Press edn., Harcourt
Brace Jovanovich, pp. 369.
McMichael, A. and Woodruff, R., 2004, Climate change and risk to health, BMJ 329(7480):1416-1417.
McMichael, A. J., 2004, Environmental and social influences on emerging infectious diseases: past, present and
future, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 359(1447):1049-1058.
McMichael, A. J. and Butler, C. D., 2004, Climate change, health, and development goals, Lancet
364(9450):2004-2006.
McMillian, M. K., Li, L., Parker, J. B., Patel, L., Zhong, Z., Gunnett, J. W., Powers, W. J. and Johnson, M. D.,
2002, An improved resazurin-based cytotoxicity assay for hepatic cells, Cell Biol Toxicol 18(3):157173.
Meshnick, S. R., Yang, Y. Z., Lima, V., Kuypers, F., Kamchonwongpaisan, S. and Yuthavong, Y., 1993, Irondependent free radical generation from the antimalarial agent artemisinin (qinghaosu), Antimicrob
Agents Chemother 37(5):1108-1114.
Mikolajczak, K. L., Seigler, D. S., Smith, C. R., Jr., Wolff, I. A. and Bates, R. B., 1969, A cyanogenetic lipid
from Cordia verbenacea DC. seed oil, Lipids 4(6):617-619.
Mims, C. A., Playfair, J. H. L., Roitt, I. M., Wakelin, D. and Williams, R., 1993, Medical Microbiology
Mandarin Offset edn., Mosby Europe, London.
Mobot, 2010, Missouri Botanical Garden,
http://www.mobot.org/mobot/research/apweb/orders/gentianalesweb.htm
Mohabbat, O., Younos, M. S., Merzad, A. A., Srivastava, R. N., Sediq, G. G. and Aram, G. N., 1976, An
outbreak of hepatic veno-occlusive disease in north-western Afghanistan, Lancet 2(7980):269-271.
Molina-Salinas, G. M., Perez-Lopez, A., Becerril-Montes, P., Salazar-Aranda, R., Said-Fernandez, S. and de
Torres, N. W., 2007, Evaluation of the flora of northern Mexico for in vitro antimicrobial and
antituberculosis activity, J Ethnopharmacol 109(3):435-441.
Morel, A. F., Araujo, C. A., da Silva, U. F., Hoelzel, S. C., Zachia, R. and Bastos, N. R., 2002, Antibacterial
cyclopeptide alkaloids from the bark of Condalia buxifolia, Phytochemistry 61(5):561-566.
Mossa, J. S., El-Feraly, F. S. and Muhammad, I., 2004, Antimycobacterial constituents from Juniperus procera,
Ferula communis and Plumbago zeylanica and their in vitro synergistic activity with isonicotinic acid
hydrazide, Phytother Res 18(11):934-937.
Mroczek, T., Ndjoko, K., Glowniak, K. and Hostettmann, K., 2004, On-line structure characterization of
pyrrolizidine alkaloids in Onosma stellulatum and Emilia coccinea by liquid chromatography-ion-trap
mass spectrometry, J Chromatogr A 1056(1-2):91-97.
Murray, P. R., Rosenthal, K. S. and Pfaller, M. A., 2009, Medical Microbiology Elsevier edn., Philadelphia, pp.
960.
Nagy, S., Kocsis, B., Koszegi, T. and Botz, L., 2002, Optimization of conditions for culture of the test bacteria
used for direct bioautography detection. 1. The gram-positive bacterium Bacillus subtilis, Journal of
Planar Chromatography-Modern TLC 15(2):132-137.
170
NCCLS, 2002, Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi,
Approved Standard, Washington.
NCCLS, 2003, Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, in:
Approved Standard, Washington.
Ndjoko, K., Wolfender, J. L., Roder, E. and Hostettmann, K., 1999, Determination of pyrrolizidine alkaloids in
senecio species by liquid chromatography/thermospray-mass spectrometry and liquid
chromatography/nuclear magnetic resonance spectroscopy, Planta Med 65(6):562-566.
Neuwinger, H. D., 2000, African Traditional Medicine, A dictionary of plant use and applications Medpharm
edn., Stuttgart, pp. 589.
Ngouamegne, E. T., Fongang, R. S., Ngouela, S., Boyom, F. F., Rohmer, M., Tsamo, E., Gut, J. and Rosenthal,
P. J., 2008, Endodesmiadiol, a friedelane triterpenoid, and other antiplasmodial compounds from
Endodesmia calophylloides, Chem Pharm Bull (Tokyo) 56(3):374-377.
Nicholson, K., Evans, G. and O’Toole, P. W., 1999, Potentiation of methicillin activity against methicillin
resistant Staphylococcus aureus by diterpenes, FEMS Microbiology Letters 66:233-239.
Nikaido, H., 1994, Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux, Science
264(5157):382-388.
Nissanka, A. P., Karunaratne, V., Bandara, B. M., Kumar, V., Nakanishi, T., Nishi, M., Inada, A., Tillekeratne,
L. M., Wijesundara, D. S. and Gunatilaka, A. A., 2001, Antimicrobial alkaloids from Zanthoxylum
tetraspermum and caudatum, Phytochemistry 56(8):857-861.
Nozaki, H., Suzuki, H., Hirayama, T., Kasai, R., Wu, R. and Lee, K., 1986, Antitumour triterpenes of Maytenus
diversifolia, Phytochemistry 25(2):479-485.
Ober, D. and Hartmann, T., 1999, Homospermidine synthase, the first pathway-specific enzyme of pyrrolizidine
alkaloid biosynthesis, evolved from deoxyhypusine synthase, Proc Natl Acad Sci U S A 96(26):1477714782.
Okunade, A. L., Elvin-Lewis, M. P. and Lewis, W. H., 2004, Natural antimycobacterial metabolites: current
status, Phytochemistry 65(8):1017-1032.
Okunade, A. L., Hufford, C. D., Richardson, M. D., Peterson, J. R. and Clark, A. M., 1994, Antimicrobial
properties of alkaloids from Xanthorhiza simplicissima, J Pharm Sci 83(3):404-406.
Okusa, P. N., Beuerle, T., Stévigny, C. and Duez, P., 2012, Absence of pyrrolizidine alkaloids in Cordia gilletii
de wild (boraginaceae), Biochemical Systematics and Ecology 41:1-2.
Okusa, P. N., Penge, O., Devleeschouwer, M. and Duez, P., 2007, Direct and indirect antimicrobial effects and
antioxidant activity of Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae), J Ethnopharmacol 112(3):476-481.
Okusa, P. N., Stévigny, C., Devleeschouwer, M. and duez, P., 2010, Optimization of the Culture Medium Used
for Direct TLC–Bioautography. Application to the Detection of Antimicrobial Compounds from Cordia
gilletii De Wild (Boraginaceae), Journal of Planar Chromatography-Modern TLC 23(4):245-249.
Okusa, P. N., Stévigny, C. and Duez, P., 2009, Medicinal Plants: A Tool to Overcome Antibiotic Resistance?, in:
Medicinal Plants Classification, Biosynthesis and Pharmacology (A. Varela, and J. Ibañez, eds.), Nova
Science, pp. 315-336.
Oluwatuyi, M., Kaatz, G. W. and Gibbons, S., 2004, Antibacterial and resistance modifying activity of
Rosmarinus officinalis, Phytochemistry 65(24):3249-3254.
OMS, 2002, Rapport sur la Santé du Monde, http://www.who.int/whr/2002/fr/
Omulokoli, E., Khan, B. and Chhabra, S. C., 1997, Antiplasmodial activity of four Kenyan medicinal plants, J
Ooshima, T., Minami, T., Aono, W., Izumitani, A., Sobue, S., Fujiwara, T., Kawabata, S. and Hamada, S., 1993,
Oolong tea polyphenols inhibit experimental dental caries in SPF rats infected with mutans
streptococci, Caries Res 27(2):124-129.
Otshudi, A. L., Apers, S., Pieters, L., Claeys, M., Pannecouque, C., De Clercq, E., Van Zeebroeck, A., Lauwers,
S., Frederich, M. and Foriers, A., 2005, Biologically active bisbenzylisoquinoline alkaloids from the
root bark of Epinetrum villosum, J Ethnopharmacol 102(1):89-94.
Pandey, M. M., Govindarajan, R., Rawat, A. K. and Pushpangadan, P., 2005, Free radical scavenging potential
of Saussarea costus, Acta Pharm 55(3):297-304.
Parks, J., Gyeltshen, T., Prachyawarakorn, V., Mahidol, C., Ruchirawat, S. and Kittakoop, P., 2010, Glutarimide
alkaloids and a terpenoid benzoquinone from Cordia globifera, J Nat Prod 73(5):992-994.
Parvez, S., Venkataraman, C. and Mukherji, S., 2006, A review on advantages of implementing luminescence
inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals, Environ Int 32(2):265-268.
Passador, L., Cook, J. M., Gambello, M. J., Rust, L. and Iglewski, B. H., 1993, Expression of Pseudomonas
aeruginosa virulence genes requires cell-to-cell communication, Science 260(5111):1127-1130.
171
Pauli, A., 2006, Anticandidal low molecular compounds from higher plants with special reference to compounds
from essential oils, Med Res Rev 26(2):223-268.
Paulo, A., Gomes, E. T., Steele, J., Warhurst, D. C. and Houghton, P. J., 2000, Antiplasmodial activity of
Cryptolepis sanguinolenta alkaloids from leaves and roots, Planta Med 66(1):30-34.
Pegnyemb, D. E., Mbing, J. N., de Theodore Atchade, A., Tih, R. G., Sondengam, B. L., Blond, A. and Bodo,
B., 2005, Antimicrobial biflavonoids from the aerial parts of Ouratea sulcata, Phytochemistry
66(16):1922-1926.
Péquignot, F., Micher, E., Le Toullec, A. and Jougla, E., 2002, Surveillance nationale des maladies infectieuses,
in: Mortalités par maladies infectieuses en France. Tendances évolutives et situation actuelle
Institut de veille sanitaire, pp. 27-34.
Pereira, A. P., Ferreira, I. C., Marcelino, F., Valentao, P., Andrade, P. B., Seabra, R., Estevinho, L., Bento, A.
and Pereira, J. A., 2007, Phenolic compounds and antimicrobial activity of olive (Olea europaea L. Cv.
Cobrancosa) leaves, Molecules 12(5):1153-1162.
Perry, C. and Hall, C., 2009, Antibiotic resistance: how it arises, the current position and strategies for the future,
Nurs Times 105(36):20-23.
Pesci, E. C., Pearson, J. P., Seed, P. C. and Iglewski, B. H., 1997, Regulation of las and rhl quorum sensing in
Pseudomonas aeruginosa, J Bacteriol 179(10):3127-3132.
Pieters, L. and Vlietinck, A. J., 2005, Bioguided isolation of pharmacologically active plant components, still a
valuable strategy for the finding of new lead compounds?, J Ethnopharmacol 100(1-2):57-60.
Pieters, L. A., Hartmann, T., Janssens, J. and Vlietinck, A. J., 1989, Comparison of capillary gas
chromatography with 1H and 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy for the quantitation of
pyrrolizidine alkaloids from Senecio vernalis, J Chromatogr 462:387-391.
Playfair, J. and Bancroft, G., 2008, Infection and Immunity 3rd edition edn., Oxford University Press, New
York, pp. 368.
Prakash, A. S., Pereira, T. N., Reilly, P. E. and Seawright, A. A., 1999, Pyrrolizidine alkaloids in human diet,
Mutat Res 443(1-2):53-67.
Queiroga, C. L., Silva, G. F., Dias, P. C., Possenti, A. and de Carvalho, J. E., 2000, Evaluation of the
antiulcerogenic activity of friedelan-3beta-ol and friedelin isolated from Maytenus ilicifolia
(Celastraceae), J Ethnopharmacol 72(3):465-468.
Rajaonson, S., Vandeputte, O. M., Vereecke, D., Kiendrebeogo, M., Ralambofetra, E., Stevigny, C., Duez, P.,
Rabemanantsoa, C., Mol, A., Diallo, B., Baucher, M. and El Jaziri, M., 2011, Virulence quenching with
a prenylated isoflavanone renders the Malagasy legume Dalbergia pervillei resistant to Rhodococcus
fascians, Environ Microbiol 13(5):1236-1252.
Rappuoli, R., 2004, From Pasteur to genomics: progress and challenges in infectious diseases, Nat Med
10(11):1177-1185.
Rastogi, N., Domadia, P., Shetty, S. and Dasgupta, D., 2008, Screening of natural phenolic compounds for
potential to inhibit bacterial cell division protein FtsZ, Indian J Exp Biol 46(11):783-787.
Rice, L. B., Sahm, D. and Banomo, R. A., 2003, Mechanisms of resistance to antimicrobial agents, in: Manual of
Clinical Microbiology 8th edition edn. (P. R. Murray, ed.), American Society of Microbiology,
Washington, pp. 1014-1086.
Rios, J. L. and Recio, M. C., 2005, Medicinal plants and antimicrobial activity, J Ethnopharmacol 100(1-2):8084.
Rios, J. L., Recio, M. C. and Villar, A., 1988, Screening methods for natural products with antimicrobial
activity: a review of the literature, J Ethnopharmacol 23(2-3):127-149.
Rosemann, G. M., 2006, Analysis of pyrrolizidine alkaloids in Crotalaria species by HPLC-MS/MS in order to
evaluate related food health risks, Thèse présentée dans le Faculty of Veterinary Science, University of
Pretoria, Pretoria.
Ruimy, R. and Andremont, A., 2004, Quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa : molecular mechanism,
clinical impact, and inhibition, Réanimation 13:176-184.
Salazar-Aranda, R., Perez-Lopez, L. A., Lopez-Arroyo, J., Alanis-Garza, B. A. and Waksman de Torres, N.,
2009, Antimicrobial and Antioxidant Activities of Plants from Northeast of Mexico, Evid Based
Complement Alternat Med.
Saludes, J. P., Garson, M. J., Franzblau, S. G. and Aguinaldo, A. M., 2002, Antitubercular constituents from the
hexane fraction of Morinda citrifolia Linn. (Rubiaceae), Phytother Res 16(7):683-685.
Sansonetti, P. and Orth, G., 2006, Les maladies infectieuses, mieux comprendre pour mieux maîtriser, in: La
maîtrise des maladies infectieuses: un défi de santé publique, une ambition médico-scientifique EDP
Sciences edn. (P. Sansonetti, and G. Orth, eds.), Académie des Sciences, Les Ulis, pp. 26-47.
Santos, R. P., Silveira, E. R., Lemos, T. L., Viana, F. A., Braz-Filho, R. and Pessoa, O. D., 2005,
Characterization of two minor saponins from Cordia piauhiensis by 1H and 13C NMR spectroscopy,
Magn Reson Chem 43(6):494-496.
172
Sarachine, M. J. and Gallo, M. B. C., 2009, Biological activies of Lupeol, International Journal of Biomedical
and Pharmaceutical Sciences 3(1):46-66.
Sawa, T., Akaike, T., Ichimori, K., Akuta, T., Kaneko, K., Nakayama, H., Stuehr, D. J. and Maeda, H., 2003,
Superoxide generation mediated by 8-nitroguanosine, a highly redox-active nucleic acid derivative,
Biochem Biophys Res Commun 311(2):300-306.
Sawer, I. K., Berry, M. I., Brown, M. W. and Ford, J. L., 1995, The effect of cryptolepine on the morphology
and survival of Escherichia coli, Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae, J Appl Bacteriol
79(3):314-321.
Scalbert, A., 1991, Antimicrobial properties of tannins, Phytochemistry 30(12):3875-3883.
Schultes, R. E., 1978, The Kingdom of plants, in: Medecines from the Earth (McGraw-Hill, ed.), W.A.R.
Thomson ed., New York, pp. 208.
Sertie, J. A., Basile, A. C., Panizza, S., Matida, A. K. and Zelnik, R., 1988, Pharmacological assay of Cordia
verbenacea; Part 1. Anti-inflammatory activity and toxicity of the crude extract of the leaves, Planta
Med 54(1):7-10.
Sertie, J. A., Basile, A. C., Panizza, S., Oshiro, T. T., Azzolini, C. P. and Penna, S. C., 1991, Pharmacological
assay of Cordia verbenacea. III: Oral and topical antiinflammatory activity and gastrotoxicity of a crude
leaf extract, J Ethnopharmacol 31(2):239-247.
Sertie, J. A., Woisky, R. G., Wiezel, G. and Rodrigues, M., 2005, Pharmacological assay of Cordia verbenacea
V: oral and topical anti-inflammatory activity, analgesic effect and fetus toxicity of a crude leaf extract,
Phytomedicine 12(5):338-344.
Shahverdi, A. R., Fazeli, M. R., Rafii, F., Kakavand, M., Jamalifar, H. and Hamedi, J., 2003, Inhibition of
nitrofurantoin reduction by menthol leads to enhanced antimicrobial activity, J Chemother 15(5):449453.
Shahverdi, A. R., Monsef-Esfahani, H. R., Nickavar, B., Bitarafan, L., Khodaee, S. and Khoshakhlagh, N., 2005,
Antimicrobial activity and main chemical composition of two smoke condensates from Peganum
harmala seeds, Z Naturforsch [C] 60(9-10):707-710.
Shahverdi, A. R., Rafii, F., Tavassoli, F., Bagheri, M., Attar, F. and Ghahraman, A., 2004, Piperitone from
Mentha longifolia var. chorodictya Rech F. reduces the nitrofurantoin resistance of strains of
enterobacteriaceae, Phytother Res 18(11):911-914.
Shai, L., L.J. McGaw, L., Masoko, P. and Eloff, J., 2008, Antifungal and antibacterial activity of seven
traditionally used South African plant species active against Candida albicans, South African Journal of
Botany.
Silverstein, R., Basler, G. and Morill, T., 2004, identification spectrométrique de composés organiques, De
Boeck, Brussels, pp. 432.
Singh, B., Sahu, P. M. and Singh, S., 2002, Antimicrobial activity of pyrrolizidine alkaloids from Heliotropium
subulatum, Fitoterapia 73(2):153-155.
Singh, M., Govindarajan, R., Nath, V., Rawat, A. K. and Mehrotra, S., 2006, Antimicrobial, wound healing and
antioxidant activity of Plagiochasma appendiculatum Lehm. et Lind, J Ethnopharmacol 107(1):67-72.
Sinha, A. K., Joshi, B. P., Sharma, A., Kumar, J. K. and Kaul, V. K., 2003, Microwave-assisted rapid synthesis
of methyl 2,4,5-trimethoxyphenylpropionate, a metabolite of Cordia alliodora, Nat Prod Res 17(6):419422.
Smith, K. M., Bu, Y. and Suga, H., 2003, Library screening for synthetic agonists and antagonists of a
Pseudomonas aeruginosa autoinducer, Chem Biol 10(6):563-571.
Smith, R. S. and Iglewski, B. H., 2003, Pseudomonas aeruginosa quorum sensing as a potential antimicrobial
target, J Clin Invest 112(10):1460-1465.
SNHF, 1999, L'essentiel sur les Boraginaceae:68.
Solano, P. J., Belin-Depoux, M. and Dejean, A., 2005, Formation and structure of food bodies in Cordia nodosa
(Boraginaceae), C R Biol 328(7):642-647.
Stamm, L. V., Gherardini, F. C., Parrish, E. A. and Moomaw, C. R., 1991, Heat shock response of spirochetes,
Infect Immun 59(4):1572-1575.
Steenackers, H. P., Levin, J., Janssens, J. C., De Weerdt, A., Balzarini, J., Vanderleyden, J., De Vos, D. E. and
De Keersmaecker, S. C., 2010, Structure-activity relationship of brominated 3-alkyl-5-methylene2(5H)-furanones and alkylmaleic anhydrides as inhibitors of Salmonella biofilm formation and quorum
sensing regulated bioluminescence in Vibrio harveyi, Bioorg Med Chem 18(14):5224-5233.
Stermitz, F. R., Tawara-Matsuda, J., Lorenz, P., Mueller, P., Zenewicz, L. and Lewis, K., 2000, 5'Methoxyhydnocarpin-D and pheophorbide A: Berberis species components that potentiate berberine
growth inhibition of resistant Staphylococcus aureus, J Nat Prod 63(8):1146-1149.
Tamokou Jde, D., Tala, M. F., Wabo, H. K., Kuiate, J. R. and Tane, P., 2009, Antimicrobial activities of
methanol extract and compounds from stem bark of Vismia rubescens, J Ethnopharmacol 124(3):571575.
173
Tateda, K., Comte, R., Pechere, J. C., Kohler, T., Yamaguchi, K. and Van Delden, C., 2001, Azithromycin
inhibits quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa, Antimicrob Agents Chemother 45(6):1930-1933.
Terras, F. R., Schoofs, H. M., De Bolle, M. F., Van Leuven, F., Rees, S. B., Vanderleyden, J., Cammue, B. P.
and Broekaert, W. F., 1992, Analysis of two novel classes of plant antifungal proteins from radish
(Raphanus sativus L.) seeds, J Biol Chem 267(22):15301-15309.
Theisen, L. L. and Muller, C. P., 2012, EPs(R) 7630 (Umckaloabo(R)), an extract from Pelargonium sidoides
roots, exerts anti-influenza virus activity in vitro and in vivo, Antiviral Res 94(2):147-156.
Thevissen, K., Ferket, K. K., Francois, I. E. and Cammue, B. P., 2003, Interactions of antifungal plant defensins
with fungal membrane components, Peptides 24(11):1705-1712.
Thevissen, K., Ghazi, A., De Samblanx, G. W., Brownlee, C., Osborn, R. W. and Broekaert, W. F., 1996, Fungal
membrane responses induced by plant defensins and thionins, J Biol Chem 271(25):15018-15025.
Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P., Cammue, B. P. and Francois, I. E., 2007, Therapeutic potential
of antifungal plant and insect defensins, Drug Discov Today 12(21-22):966-971.
Thevissen, K., Warnecke, D. C., Francois, I. E., Leipelt, M., Heinz, E., Ott, C., Zahringer, U., Thomma, B. P.,
Ferket, K. K. and Cammue, B. P., 2004, Defensins from insects and plants interact with fungal
glucosylceramides, J Biol Chem 279(6):3900-3905.
Thirupathi, K., Kumar, S., Raju, V. S., Ravikumar, B., Krishna, D. R. and Mohan, G., 2008, A review of
medicinal plants of the genus Cordia: their chemistry and pharmacological uses, Journal of Natural
Remedies 8(1):1-10.
Thomma, B. P., Cammue, B. P. and Thevissen, K., 2003, Mode of action of plant defensins suggests therapeutic
potential, Curr Drug Targets Infect Disord 3(1):1-8.
Ticli, F. K., Hage, L. I., Cambraia, R. S., Pereira, P. S., Magro, A. J., Fontes, M. R., Stabeli, R. G., Giglio, J. R.,
Franca, S. C., Soares, A. M. and Sampaio, S. V., 2005, Rosmarinic acid, a new snake venom
phospholipase A2 inhibitor from Cordia verbenacea (Boraginaceae): antiserum action potentiation and
molecular interaction, Toxicon 46(3):318-327.
Tiwari, K. P. and Srivastava, S. S., 1979, Chemical investigation of the stem bark of Cordia obliqua, Planta Med
36(2):191-192.
Tiwari, R. D., Srivastava, K. C., Shukla, S. and Bajpai, R. K., 1967, Chemical examination of the fixed oil from
the seeds of Cordia myxa, Planta Med 15(3):240-244.
Toppel, G. and Hartmann, T., 1986, Pyrrolizidine Alkaloids of Senecio vulgaris are synthesized as N-Oxides in
the roots, Planta Med 52(6):518.
Trager, W. and Jensen, J. B., 1976, Human malaria parasites in continuous culture, Science 193(4254):673-675.
Tsukiyama, R., Katsura, H., Tokuriki, N. and Kobayashi, M., 2002, Antibacterial activity of licochalcone A
against spore-forming bacteria, Antimicrob Agents Chemother 46(5):1226-1230.
Tucsek, Z., Radnai, B., Racz, B., Debreceni, B., Priber, J. K., Dolowschiak, T., Palkovics, T., Gallyas, F., Jr.,
Sumegi, B. and Veres, B., 2011, Suppressing LPS-induced early signal transduction in macrophages by
a polyphenol degradation product: a critical role of MKP-1, J Leukoc Biol 89(1):105-111.
Tyihák, E., Mincsovics, E., Kátay, G., Király-Véghely, Z., Móricz, A. and Ott, P., 2008, BioArena: An unlimited
possibility of biochemical interactions in the adsorbent layer after chromatographic separation, Journal
of Planar Chromatography-Modern TLC 21(1):15-20.
Tytgat, I., Colacino, E., Tulkens, P. M., Poupaert, J. H., Prevost, M. and Van Bambeke, F., 2009, DD-ligases as a
potential target for antibiotics: past, present and future, Curr Med Chem 16(20):2566-2580.
Vanden Berghe, D. A. and Vlietinck, A. J., 1991, Screening methods for antibacterial and antiviral agents from
higher plants, in: Methods in Plant Biochemistry (Vol. 6) Academic Press edn., pp. 47–69.
Vandeputte, O. M., Kiendrebeogo, M., Rajaonson, S., Diallo, B., Mol, A., El Jaziri, M. and Baucher, M., 2010,
Identification of catechin as one of the flavonoids from Combretum albiflorum bark extract that reduces
the production of quorum-sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1, Appl
Environ Microbiol 76(1):243-253.
Vandeputte, O. M., Kiendrebeogo, M., Rasamiravaka, T., Stevigny, C., Duez, P., Rajaonson, S., Diallo, B., Mol,
A., Baucher, M. and El Jaziri, M., 2011, The flavanone naringenin reduces the production of quorum
sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1, Microbiology 157(Pt 7):21202132.
Verma, Y. S., Saxena, V. K. and Nigam, S. S., 1977, Structure of Cordia rothii Roem and Schult mucilage Part
II: Methylation and periodate oxidations studies, Planta Med 32(2):188-194.
Verpoorte, R., Choi, Y. H. and Kim, H. K., 2005, Ethnopharmacology and systems biology: a perfect holistic
match, J Ethnopharmacol 100(1-2):53-56.
Vieira, N. C., Espindola, L. S., Santana, J. M., Veras, M. L., Pessoa, O. D., Pinheiro, S. M., de Araujo, R. M.,
Lima, M. A. and Silveira, E. R., 2008, Trypanocidal activity of a new pterocarpan and other secondary
metabolites of plants from Northeastern Brazil flora, Bioorg Med Chem 16(4):1676-1682.
174
Vishwakarma, R. A., Mehrotra, R., Tripathi, R. and Dutta, G. P., 1992, Stereoselective synthesis and antimalarial
activity of alpha-artelinic acid from artemisinin, J Nat Prod 55(8):1142-1144.
Wagner, H. and Bladt, S., 1996, Plant drug analysis, Springer, Berlin.
Walsh, C., 2003, Antibiotics: actions, origins, resistance, ASM Press, Washington, pp. 117.
Wang, J., Soisson, S. M., Young, K., Shoop, W., Kodali, S., Galgoci, A., Painter, R., Parthasarathy, G., Tang, Y.
S., Cummings, R., Ha, S., Dorso, K., Motyl, M., Jayasuriya, H., Ondeyka, J., Herath, K., Zhang, C.,
Hernandez, L., Allocco, J., Basilio, A., Tormo, J. R., Genilloud, O., Vicente, F., Pelaez, F., Colwell, L.,
Lee, S. H., Michael, B., Felcetto, T., Gill, C., Silver, L. L., Hermes, J. D., Bartizal, K., Barrett, J.,
Schmatz, D., Becker, J. W., Cully, D. and Singh, S. B., 2006, Platensimycin is a selective FabF
inhibitor with potent antibiotic properties, Nature 441(7091):358-361.
Wang, Y., Wang, T., Hu, J., Ren, C., Lei, H., Hou, Y. and Brantner, A. H., 2011, Anti-biofilm activity of
TanReQing, a Traditional Chinese Medicine used for the treatment of acute pneumonia, J
Wassel, G., El-Menshawi, B., Saeed, A., Mahran, G. and El-Merzabani, M., 1987a, Screening of selected plants
for pyrrolizidine alkaloids and antitumor activity, Die Pharmazie 42(10):709.
Wassel, G., El-Menshawi, B., Saeed, A., Mahran, G. and Reisch, J., 1987b, News sources of pyrrolizidine
alkaloids: genus Cordia (Ehretiaceae) and Schismus (Gramineae), Scientia Pharmaceutica 55(3):163166.
WHO, 2002, The world health report 2002 - Reducing Risks, Promoting Healthy Life,
http://www.who.int/whr/2002/en/
WHO, 2009, World Malaria Report, http://www.who.int/malaria/world_malaria_report_2009/en/
WHO, 2010, World Malaria Report, http://www.who.int/malaria/world_malaria_report_2010/en/index.html
WHO, S. w. G., 1996, Resistance to antimicrobial agents, Bulletin of the World Health Organization 71:335336.
Witte, L., Rubiolo, P., Bicchi, C. and Hartmann, T., 1993, Comparative analysis of pyrrolizidine alkaloids from
natural sources by gas chromatography-mass spectrometry, Phytochemistry 32(1):187-196.
Wright, H. T. and Reynolds, K. A., 2007, Antibacterial targets in fatty acid biosynthesis, Curr Opin Microbiol
10(5):447-453.
Yamashita, K., Ouchi, K., Shirai, M., Gondo, T., Nakazawa, T. and Ito, H., 1998, Distribution of Chlamydia
pneumoniae infection in the athersclerotic carotid artery, Stroke 29(4):773-778.
Yates, R. R., 1999, New intervention strategies for reducing antibiotic resistance, Chest 115(3 Suppl):24S-27S.
Yokoyama, S., Kato, K., Koba, A., Minami, Y., Watanabe, K. and Yagi, F., 2008, Purification, characterization,
and sequencing of antimicrobial peptides, Cy-AMP1, Cy-AMP2, and Cy-AMP3, from the Cycad
(Cycas revoluta) seeds, Peptides 29(12):2110-2117.
Zhai, L., Blom, J., Chen, M., Christensen, S. B. and Kharazmi, A., 1995, The antileishmanial agent licochalcone
A interferes with the function of parasite mitochondria, Antimicrob Agents Chemother 39(12):27422748.
Zhao, W. H., Hu, Z. Q., Hara, Y. and Shimamura, T., 2002, Inhibition of penicillinase by epigallocatechin
gallate resulting in restoration of antibacterial activity of penicillin against penicillinase-producing
Staphylococcus aureus, Antimicrob Agents Chemother 46(7):2266-2268.
Ziegler, H. L., Staerk, D., Christensen, J., Hviid, L., Hagerstrand, H. and Jaroszewski, J. W., 2002, In vitro
Plasmodium falciparum drug sensitivity assay: inhibition of parasite growth by incorporation of
stomatocytogenic amphiphiles into the erythrocyte membrane, Antimicrob Agents Chemother
46(5):1441-1446.
Zloh, M., Kaatz, G. W. and Gibbons, S., 2004, Inhibitors of multidrug resistance (MDR) have affinity for MDR
substrates, Bioorg Med Chem Lett 14(4):881-885.
175
176
ANNEXES
177
178
179
FeCl3 – 1 g ; eau distillée – ad 100 ml. Pulvérisation de 10 ml
(a) Vanilline – 1 g ; éthanol – ad 100 ml. (b) acide sulfurique – 10 ml ; éthanol – ad 100 ml. Pulvérisation de 10 ml de solution
(a), puis 10 ml de solution (b) ; chauffage à 105°C
Anisaldéhyde – 0,5 ml ; acide acétique glacial – 10 ml ; méthanol – 85 ml ; acide sulfurique – 5 ml. Pulvérisation de 10 ml,
puis chauffage 15 min à 105°C
KOH – 5 g ; éthanol – ad 100 ml
(a) Diphénylboryloxyéthylamine – 1g ; éthanol – ad 100 ml. (b) Polyéthylène glycol 4000 – 5 g ; éthanol – ad 100 ml.
Pulvérisation de 10 ml de (a) suivi de 8 ml de (b)
(a) Nitrate de bismuth – 0,85 g ; acide acétique glacial – 10 ml ; eau distillée – 40 ml ; chauffage et filtration si nécessaire. (b)
KI – 8 g ; eau distillée – 30 ml. Réactif de pulvérisation : mélange (a)+(b) (1:1) – 1 ml ; acide acétique glacial – 2 ml ; eau
distillée – 10 ml. Pulvérisation de 10 ml
Composition
LB broth - 25 g; MOPS - 10,463 g; eau Millipore - 750 ml; KOH 1M - jusqu’au pH 7,2; eau Millipore – ad 1L.
Milieux de culture
Milieu LB-MOPS
TSA (Tryptic Soy Agar)
Poudre bouillon MH – 21 g ; eau distillée – 1L ; stérilisation à l’autoclave – 15 min à 121°C
Poudre agar MH – 38 g ; eau distillée – 1L ; chauffage à ébullition jusqu’à dissolution complète ; stérilisation à l’autoclave –
15 min à 121°C
Poudre TSA – 40 g ; eau distillée – 1L ; chauffage à ébullition jusqu’à dissolution complète ; stérilisation à l’autoclave – 15
min à 121°C
Na2CO3 - 52,995 g; eau Millipore – ad 500 ml
Solution Stop
Bouillon de Mueller Hinton
Agar de Mueller Hinton
Solution substrat: Na2HPO4 – 4,260 g ; NaH2PO4 – 2,768 g ; β-mercaptoethanol – 1,35 ml; eau Millipore – ad 500 ml. Substrat
o-NPG (o-nitrophényl-β-D-galactoside) : o-NPG – 1g ; solution substrat – 100 ml.
Substrat o-NPG
Solutions utilisées pour la mesure de l’activité β-galactosidase
Tampon de perméabilisation
Na2HPO4 - 7,098 g ; KCl – 0,745 g ; MgSO4 heptahydraté – 0,025 g ; CTAB (hexadecyktrimethylammonium bromide) –
0,400 g ; sodium deoxycholate – 0,200 g ; β-mercaptoethanol – 2,7 ml ; eau Millipore – ad 500 ml
Chlorure ferrique 1%
Réactif de Bornträger
Réactif de Neu
Réactif anisaldéhyde – acide sulfurique
Réactif vanilline – acide sulfurique
Réactifs de révélation CCM
Réactif de Dragendorff
Réactif / milieu
Annexe 1. Composition et préparation des réactifs et milieux utilisés
180
Annexe 2. Schéma de fractionnements
181
Annexe 3. Spectre RMN-C13 de la Friedeline (CDCl3, 75 MHz)
182
Annexe 4. Spectre RMN-C13 de la Friedeline (CDCl3, 75 MHz)
183
Annexe 5. Spectre RMN-C13 de la Friedeline (CDCl3, 75 MHz, DEPT-135)
184
Annexe 6. Spectre RMN-H1 de la Friedeline (CDCl3, 300 MHz)
185
(M + H)+
C30H51O
Annexe 7. Masse exacte de la Friedeline (Agilent 6520 accurate-Mass Q-TOF LC/MS equipped with an ESI source, positive mode)
186
Annexe 8. Spectre RMN-C13 du Lupéol (CDCl3, 75 MHz)
187
Annexe 9. Spectre RMN-C13 du Lupéol (CDCl3, 75 MHz)
188
Annexe 10. Spectre RMN-C13 du Lupéol (CDCl3, 75 MHz, DEPT-135)
189
Annexe 11. Spectre RMN-H1 du Lupéol (CDCl3, 300 MHz)
190
(M + H)+
C30H51O
Annexe 12. Masse exacte du Lupéol (Agilent 6520 accurate-Mass Q-TOF LC/MS equipped with an ESI source, positive mode)
191
Annexe 13. Spectre RMN-H1 du Férulaldéhyde (CDCl3, 300 MHz)
192
Annexe 14. Spectre RMN-H1 du Férulaldéhyde (CDCl3, 300 MHz)
193
(M + H)+
C10H11O3
Annexe 15. Masse exacte du Férulaldéhyde (Agilent 6520 accurate-Mass Q-TOF LC/MS equipped with an ESI source, positive mode)
Annexes 16. Article sur la recherche d’alcaloïdes pyrrolizidiniques
194
Author's personal copy
Biochemical Systematics and Ecology 41 (2012) 1–2
Contents lists available at SciVerse ScienceDirect
Biochemical Systematics and Ecology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/biochemsyseco
Absence of pyrrolizidine alkaloids in Cordia gilletii de wild (boraginaceae)
Philippe N. Okusa a, b, *, Till Beuerle c, Caroline Stévigny a, Pierre Duez a, b
a
Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles, Bld du Triomphe, CP 205/09,
1050 Brussels, Belgium
b
Service de Chimie thérapeutique et Pharmacognosie, Faculté de Médecine et de Pharmacie, Université de Mons, Place du Parc 20, 7000 Mons, Belgium
c
Institut für Pharmazeutische Biologie, Technische Universität Braunschweig, Mendelssohnstrasse 1, D-38106 Braunschweig, Germany
a r t i c l e i n f o
Article history:
Received 13 February 2011
Accepted 3 December 2011
Keywords:
Pyrrolizidine alkaloids
Cordia gilletii
1. Subject and source
Cordia gilletii De Wild (Boraginaceae) is a medicinal plant widely used in the Democratic Republic of Congo to treat
infectious diseases and for wound healing (Kambu, 1990).
Root barks and leaves of C. gilletii (Boraginaceae) were collected in January 2005 in the Kisantu area (Democratic Republic
of Congo) by Mr Nzeza (Jardin Botanique de Kisantu). The plant has been identified by Mr Pauwels of the Botanical Garden of
Belgium (Meise, Belgium), where a voucher specimen has been deposited (BR-SP.627986).
2. Previous work
A preliminary phytochemical screen using the Dragendorff reaction for alkaloids detection showed a slight positive result
for C. gilletii root bark (Okusa et al., 2007). C. gilletii belongs to the family Boraginaceae, a family known to contain pyrrolizidine alkaloids (PAs). Two PAs, floridanine and macrophylline, have been identified from other species of Cordia (Wassel
et al., 1987).
3. Present study
About 12 g of plant material (root barks or leaves powder) were defatted with petroleum ether in a soxhlet apparatus for
6 h. The defatted powder was then extracted in the soxhlet apparatus with methanol for 6 h. After the evaporation of the
solvent, the residue was suspended in HCl 1 N and washed with CH2Cl2. The water phase was collected and half of the extract
was made basic with 25% NH4OH, applied to an Extrelut (Merck) column (1 ml extract/g Extrelut) and then eluted with
CH2Cl2 (Witte et al., 1993); after evaporation of the organic solvent the residue was re-dissolved in methanol. To investigate
for the eventual presence of N-oxides, the other half was reduced with Zn dust (about 0.3 g) for 4 h and afterwards treated like
* Corresponding author. Laboratoire de Pharmacognosie, de Bromatologie et de Nutrition Humaine, Institut de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles,
Bld du Triomphe, CP 205/09, 1050 Brussels, Belgium. Fax: þ32 2 650 5430.
0305-1978/$ – see front matter
doi:10.1016/j.bse.2011.12.002
2011 Elsevier Ltd. All rights reserved.
195
Author's personal copy
2
P.N. Okusa et al. / Biochemical Systematics and Ecology 41 (2012) 1–2
the first half (see above); the efficient reduction of N-oxides was ensured by incubating with additional Zn when no visible
hydrogen bubbles were formed anymore during the reduction process (Witte et al., 1993; Joosten et al., 2010).
The obtained extracts were subjected to GC and GC–MS in order to diagnose for the presence or absence of PAs according
to the method described by Frölich which has a lower detection level of 2 ppm using the PA heliotrine as standard (Frölich
et al., 2006). Retention Indexes (RIs), molecular ions and MS fragmentation patterns were used as diagnostic criteria. For GC–
MS analysis, two apparatus were used: a Hewlett–Packard 5890A gas chromatograph equipped with a 30 m 0.32 mm (ft
0.25 mm) analytical column (ZB-1, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) coupled to a TSQ 700 mass spectrometer (Finnigan,
Bremen, Germany); anda Hewlett–Packard 5890 II gas chromatograph equipped with 30 m 0.32 mm fused-silica column
(phenyl-5%-methyl-95%-polysiloxane, ft 0.25 mm), coupled to a mass spectrometer MSD Hewlett–Packard 5972. The above
methods allowed the detection of the unsaturated PAs of Senecio delphinifolius Vahl (Asteraceae) as previously described
(Pelser et al., 2005), thus representing a positive control for the general performance of the overall methodology.
4. Chemotaxonomy significance
Despite the weakly positive response to the Dragendorff’s reaction, no PAs could be detected in extracts of the root bark
and leaves of the Congolese specimen of C. gilletii. The Dragendorff’s reaction is, however, well known to give false positive
alkaloid reactions with a variety of nitrogen compounds such as some amides (Murebwayire et al., 2006) as well as nonnitrogenous oxygenated compounds like aldehydes, ketones, lactones, ethers, esters, epoxides and peroxides (Habib, 1980).
The genus Cordia contains about 350 species and to date only two species, Cordia sinensis and Cordia myxa, have been
reported to contain the PAs floridanine and macrophylline, respectively (Wassel et al., 1987). The presence of PAs in these
species suggests that other species in this genus may be able to synthesize PAs and a systematic study of the genus is justified
using methods described in this paper. The absence of PAs in C. gilletii suggests no toxicological risk due to PAs for this plant,
which is widely used as medicinal plant in Democratic Republic of Congo. However, it is suggested that further samples of C.
gilletii are obtained from other locations to confirm that the species does not contain PAs.
Acknowledgement
The authors are grateful to Mrs Claudine Theuring (University of Braunschweig, Germany) for technical support.
References
Frolich, C., Hartmann, T., Ober, D., 2006. Phytochemistry 67, 1493.
Habib, A.A., 1980. J. Pharm. Sci. 69, 37.
Joosten, L., Mulder, P.P.J., Vrieling, K., Van Veena, J.A., Klinkhamera, P.G.L., 2010. Phytochem. Anal. 21, 197.
Kambu, K., 1990. Eléments de Phytothérapie comparée. CRPK, Kinshasa, p. 48.
Murebwayire, S., Diallo, B., Luhmer, M., Vanhaelen-Fastre, R., Vanhaelen, M., Duez, P., 2006. Fitoterapia 77, 615.
Okusa, P.N., Penge, O., Devleeschouwer, M., Duez, P., 2007. J. Ethnopharmacol 112, 476.
Pelser, P.B., De Vos, H., Theuring, C., Beuerle, T., Vrieling, K., Hartmann, T., 2005. Phytochemistry 66, 1285.
Wassel, G., El-Menshawi, B., Saeed, A., Mahran, G., Reisch, J., 1987. Scientia Pharmaceutica 55, 163.
Witte, L., Rubiolo, P., Bicchi, C., Hartmann, T., 1993. Phytochemistry 32, 187.
196
Annexe 17. Contrôle positif, Alcaloïdes pyrrolizidiniques de Senecio delphinifolius Vahl
Soumis pour publication dans "Natural Product Communication"
197
NPC
Natural Product Communications
Analysis of pyrrolizidine alkaloids and evaluation of some biological
activities of Algerian Senecio delphinifolius Vahl (Asteraceae)
2012
Vol. 7
No. 0
1-2
Soukaina Tidjania, Philippe N. Okusab, Amar Zellaguia, Laetitia Moreno Y Banulsc, Caroline Stévignyb,
Pierre Duezb and Salah Rhouatia
a
Laboratory of Natural Products and Organic Synthesis, Department of Chemistry, Faculty of Science,
University Mentouri–Constantine, Algeria
b
Laboratory of Pharmacognosy, Bromatology and Human Nutrition, Faculty of Pharmacy,
Université Libre de Bruxelles (ULB), 1050 Brussels, Belgium
c
Laboratory of Toxicology, Faculty of Pharmacy, Université Libre de Bruxelles (ULB), 1050 Brussels, Belgium
[email protected]
Received: July XX, 2012; Accepted: XX, 2012
Although Senecio species are known as sources of potentially toxic pyrrolizidine alkaloids (PAs), some species of this genus are traditionally used as remedies,
notably in Algeria. In this paper, the evaluation of biological activities and the analysis of PAs of Algerian specimens of Senecio delphinifolius Vahl are
reported. The herb butanolic extract showed weak antibacterial effect against Escherichia coli with a MIC of 1 mg/ml, was inactive against Staphylococcus
aureus and Pseudomonas aeruginosa. The butanolic extracts from roots, stems and herb showed a modest antioxidant activity, scavenging the free radical
DPPH with respective IC50 of 55.3, 50.2 and 13.3 µg/ml. A cytotoxic effect against a series of human tumor cell lines was observed with the butanolic extract
from stems (IC50 ranging between 34 and 88 µg/ml). The herb of the evaluated sample contains 140 ppm of PAs (senecionine, seneciphylline, integerrimine,
senkirkine) and PAs-related alkaloids (dehydrosenkirkine and neosenkirkine). As the major PAs belong to the toxic series (1,2-unsaturation in the pyrrolizidine
cycle and macrocyclic diester), the use of Senecio delphinifolius should be discouraged in traditional medicine.
Keywords: Senecio delphinifolius; Asteraceae; pyrrolizidine alkaloids; antioxidant; cytotoxic.
The genus Senecio, which belongs to the tribe Senecioneae, is the
largest and most complex genus in the family of the Asteraceae and
includes more than 1500 species with a worldwide distribution. The
chemical constituents of the genus Senecio notably include
alkaloids,
sesquiterpenoids,
monoterpenoids,
diterpenoids,
triterpenoids, flavonoids and coumarins. The pyrrolizidine alkaloids
(PAs) and the furano-eremophilane sesquiterpenoids are the most
important constituents of this genus. Senecio species are used all
around the world in folk medicine for the treatment of wounds and
as antiemetic, anti-inflammatory, antimicrobial and vasodilator; the
parts mostly used are roots, leaves, stems, flowers, aerial parts, and
whole plants [1]. The genus Senecio is represented in Algeria by
eighteen species, among which S. delphinifolius Vahl (Figure 1), a
plant found endemically in Sicile (Italy) and in North Africa; its
vernacular name in Algeria is "Hachichetettolba".
The apparition of resistances to the major antibiotics gives a high
interest to the development of new antimicrobial compounds and
natural sources are an important potential resource for these. Given
that some Senecio species are traditionally used against infectious
diseases, the n-hexane, dichloromethane and butanol extracts from
S. delphinifolius herb were investigated for activity against S.
aureus (Gram +), E. coli and P. aeruginosa (Gram -). The butanol
extract showed a weak effect against E. coli with a minimum
inhibitory concentration (MIC) of 1 mg/ml, but was inactive against
the other microorganisms (MIC > 2 mg/ml). The other extracts did
not show any antibacterial activity at the highest concentration
tested, 2 mg/ml. These results suggest that the herb of S.
delphinifolius is probably not a good candidate in the search for
antimicrobial compounds.
Figure 1. Senecio delphinifolius Vahl (Asteraceae), flowering stage
(Grareme Mila, Algeria, April 2007)
Antioxidants protect the human body from reactive oxygen species
(ROS) and are reported to delay the progress of many chronic
diseases as well [2]. Also, antioxidants have been widely used as
food additives to provide protection against oxidative degradation
of foods [3]. The antioxidant activity of extracts from S.
delphinifolius root, stem and herb evaluated by a 2,2-diphenyl-1picryhydrazyl (DPPH) assay showed that the n-hexane and
dichloromethane extracts from each plant part were practically
inactive (IC50 > 500 µg/ml) whereas the butanol extracts showed a
modest scavenging effect on the DPPH free radical with an IC50 of
55.3, 50.2 and 13.3 µg/ml (0.02, 0.03 and 0.10 quercetin
equivalents) for root, stem and herb, respectively (Table 1). Since
198
2Natural Product Communications Vol. 7 (0) 2012
phenolic compounds are reported in the genus Senecio [1], the
observed antioxidant activity could be attributed to these
compounds which act, through their redox properties, as reducing
agents, hydrogen donors and quenchers of singlet oxygen. In
addition, they may also possess chelation properties towards redoxcatalyzing metals [3].
Table 1. Antioxidant activity of butanol extracts from different parts of S.
delphinifolius (IC50 + SD)
Butanol Extracts
Root
Stem
Herb
Quercetin
IC50 (µg / ml)
55.3 + 6.9
50.2 + 2.3
13.3 + 2.3
1.31 + 0.03
Tidjani S et al.
Table 3. Identification and profile (%) of pyrrolizidine alkaloids in the reduced alkaloid
extract of Senecio delphinifolius as determined by GC and GC-MS
PAs
Senecionine
Seneciphylline
Integerrimine
Senkirkine
Dehydrosenkirkine
Neosenkirkine
RI
2304
2320
2362
2484
2524
2554
EI-MS (M+)
335
333
335
365
363
365
Ratio
12
22
10
24
24
8
Legend: RI, retention index. EI-MS: Electronic impact mass spectrometry
Quercetin-equivalent
0.02
0.03
0.10
1.00
Only the butanol extract from stem was active against all tested
human tumor cell lines with IC50 ranging between 34 and 88 µg/ml
(Table 2). These results agree with those obtained with other
Senecio species; indeed, cytotoxic activities against tumor cell lines
have been observed with dichloromethane and butanol extracts from
S. leucanthemifolius and a benzoquinone derivative, jacaranone, has
been found as the major active compound [4].
Table 2. Cytotoxic effect of S. delphinifolius extracts on human cancer cell lines
(IC50 in µg/ml).
Extracts
HT29
Cell lines
Hs683
A549
Root
n-hexane
n.d.
n.d.
n.d.
dichloromethane
39
> 100
> 100
n-butanol
> 100
n.d.
n.d.
Stem
n-hexane
> 100
n.d.
n.d.
dichloromethane
> 100
n.d.
n.d.
n-butanol
34
74
88
Herb
n-hexane
> 100
n.d.
n.d.
dichloromethane
> 100
n.d.
n.d.
n-butanol
79
78
> 100
nd: not determined. Cells lines HT29 (colon cancer), Hs683 oligodendroglioma and
A549 non-small-cell lung cancer. The IC50 on cells lines Hs683 and A549 were
determined only when the IC50 growth inhibitory concentration on HT29 cell line was
under 100 µg/ml.
Among the naturally occurring N-containing compounds, the PAs
of the macrocyclic senecionine type constitute an important group.
These pharmacologically active and often toxic constituents, are
present in many plants belonging to the families of Asteraceae,
Boraginaceae and Fabaceae [5]. PAs, composed of a necine base
and a necic acid, are divided into two groups, (i) PAs with a
saturated necine moiety, which are non-toxic; and (ii) PAs with a
1,2-unsaturated necine base, which are hepatotoxic to mammals and
genotoxic [6]. PAs of the macrocyclic senecionine type belong to
the second group and are secondary metabolites characteristic for
most species of the genus Senecio (Asteraceae). These PAs are
deterrent and toxic to most vertebrates and insects and provide
plants with a chemical defense against herbivores [7]. GC-MS
analysis of S. delphinifolius herb showed the presence of
pyrrolizidine alkaloids at an estimated total concentration of 140
ppm (expressed in heliotrine as described in [8]). The qualitative
and quantitative analysis of the alkaloid extract (Table 3, Figure 2)
showed that dehydrosenkirkine and senkirkine were the most
abundant alkaloids (24 % each) followed by seneciphylline (22 %),
senecionine (12 %), integerrimine (10 %) and neosenkirkine (8 %).
These results are in accordance with Pelser et al [9], who identified
these six PAs in a specimen of S. delphinifolius from Tunisia
inalmost the same proportions. This typically toxic alkaloids profile
of S. delphinifolius infers that its use as a traditional medicine may
pose a health risk. PAs are known to be hepatotoxic to human and
Figure 2. Total Ion Chromatogram of alkaloid extract after reduction. H : heliotrine
(standard), 1 : Senecionine (M+ 335), 2 : Seneciphylline (M+ 333), 3: Integerrimine (M+
335), 4: Senkirkine (M+ 365), 5: Dehydrosenkirkine (M+ 363), 6: Neosenkirkine (M +
365)
animals and genotoxic; in particular the liver transformation of 1,2unsaturated PAs into reactive alkylating agents has been
demonstrated to be responsible for these toxic effects. Although
there are many variations in uses, a typical dosage regimen [boiling
a handful (about 10 g) of crushed herb in 1 liter of water and
administering about 100 ml per day] would translate to the
administration of about 1 g herb per day which, based on our data,
would correspond to 0.14 mg total PAs per day. Although PAsinduced hepatotoxicity significantly varies, depending on necine
structures and N-oxidation, recommended dose thresholds are quite
difficult to estimate and to universally extrapolate to all PAs. UK
estimates that the daily dose of unsaturated PAs that can give rise to
liver disease after chronic ingestion is > 1 mg/day for 2 weeks or >
0.1 mg/day for longer periods [10, 11]. In Germany, a much more
stringent regulation states that the dose of herbal products with
proven health benefits is restricted for oral administration to 1 µg
PAs per day (maximum 6 weeks per year) or 0.1 µg per day (over 6
weeks per year). Fetuses and infants being particularly susceptible
to PAs poisoning, pregnant and lactating women are excluded from
this German regulation [12].
Polar extracts from Senecio delphinifolius Vahl showed modest
antioxidant activity; a weak antibacterial effect, and cytotoxic effect
against human tumor cell lines. Nevertheless, the herb of this plant
contains about 140 ppm of unsaturated PAs, potentially
hepatotoxic; thus the use of its extracts should be restricted in
phytomedicine despite the observed activities.
Experimental
Plant material: Senecio delphinifolius was collected in April 2007
(flowering stage) in Grareme Mila, Algeria. The plant was
identified by Dr. Kaabache Mohamed, Department of Biology, Setif
University. A voucher specimen was deposited at the Chemistry
Department, University of Mentouri-Constantine (N° ZA 117) and
at the Herbarium of the National Botanical Garden of Meise,
Belgium (BR0000005333899).
Extract preparation: 100 g of root / stem / herb were exhaustively
and successively extracted by solvents of increasing polarity, the
evaporation of the solvents under reduced pressure yielded the
199
Pyrrolizidine alkaloids of Senecio delphinifolius
extracts: n-hexane (yield, 0.2 g / 0.5 g / 4.4 g), dichloromethane
(yield, 0.3 g / 0.3 g / 5.8 g) and butanol (yield, 3.1 g / 4.6 g / 7.9 g).
Antibacterial activity: The antibacterial activity was evaluated by a
broth microdilution method using the following strains:
Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 25922
and Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (105 cells/well). Plant
extracts were dissolved in DMSO and diluted with Mueller Hinton
broth to achieve 4 mg/ml, the final DMSO concentration being 5%;
this solution was transferred in 96-wells plates, diluted and tested as
previously described [13].
Antioxidant activity: The antioxidant activity was assessed by
colorimetric measurement of the scavenging ability of compounds
towards the stable free radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
(DPPH). Serial dilutions of extracts dissolved in methanol were
mixed with 200 µl of methanolic 0.004% DPPH in 96-wells
microtiter plates and left for 30 min in the dark; the absorbances
were measured with a Lab systems iEMS reader/dispenser MF
(Labsystems, Finland) at 540 nm, using methanol as blank. IC50
were determined from three separate experiments in quadruplicate
by curve fitting as previously described [13]. Results expressed as
quercetin-equivalent (Q-E), calculated as IC50quercetin/IC50 plant
extract.
MTT Cell proliferation assay: The human cancer cell lines include
the Hs683 (ATCC code HTB-138) glioma, the A549 (DSMZ code
ACC107) NSCLC and the HT29 (ATCC code HTB-38) colon
cancer models. The cells were cultured in RPMI 1640 medium
supplemented with 10% heat inactivated fetal bovine serum, 4mM
glutamine, 100µg/ml gentamicin, 200 U/ml penicillin and 200µg/ml
streptomycin (Lonza, Verviers, Belgium). For the 3-(4,5-dimethyl2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) reduction
assay, cells (12 000 cells/ml culture medium) were seeded in 96microwell plates. After 24 h, the medium was replaced by medium
containing increasing concentrations of analyzed drugs and
incubated at 37°C, 5% CO2 for 72 h. The medium was removed and
Natural Product Communications Vol. 7 (0) 20123
100 µl of MTT solution (0.5 mg/ml in RPMI 1640 without phenol
red) were added to each well. The plate was reincubated for 3h30,
the solution was removed and replaced by DMSO (Merck,
Hohenbrunn, Germany). The plate was then gently shaken and the
intensity of the coloration was measured by spectrophotometry
(Biorad model 680XR , Biorad, Nazareth, Belgium) at 570 nm
(with a reference of 630nm) [4].
Analysis of pyrrolizidine alkaloids: About 0.5 g of plant material
was homogenized in 20 ml HCl 1 M for 10 min and the homogenate
left to stand at room temperature for 30 min. After centrifugation,
half of the supernatant was made basic with NH4OH, applied to an
Extrelut® column (1 ml extract / g Extrelut®) and eluted with 40 ml
of CH2Cl2; after evaporation of the solvent, the residue was
redissolved in 200 µl of methanol. To investigate for the presence
of N-oxides, the other half of the acidic extract was reduced with
Zn dust for 4h and similarly treated [8]. The obtained extracts were
analyzed by GC and GC-MS as previously described [8]. Heliotrine
was used as standard. Retention Indices (RI), molecular ions and
MS fragmentation patterns were used for the identification of PAs.
For GC-MS analysis, a Hewlett–Packard 5890A gas chromatograph
equipped with a 30 m x 0.32 mm (ft 0.25 µm) analytical column
(ZB-1, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) was used. The
capillary column was directly coupled to a TSQ 700 mass
spectrometer (Finnigan, Bremen, Germany). Injector and transfer
line were set at 250°C; the temperature program used was: 100°C (3
min) – 6°C/min – 310°C (3 min). The injection volume was 1 µl
with a 1:20 split ratio; the carrier gas flow was 1.6 ml/min He and
the mass spectra were recorded at 70 eV [8, 14].
Acknowledgments – Dr Till Beuerle and Mrs Claudine Theuring
(University of Braunschweig, Germany) are gratefully
acknowledged for help in PAs analysis. Authors are grateful for
partial financial support from The MESRS (Ministère de
l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique) Algeria.
The technical assistance of Marie Faes is gratefully acknowledged.
References
[1] Yang Y, Zhao L, Wang Y, Chang M, Huo C, Gu Y, Shi Q, Kiyota H. (2011) Chemical and Pharmacological Research on Plants from the Genus Senecio.
Chemistry & Biodiversity, 8, 13-72.
[2] Pryor WA. (1991) The antioxidant nutrients and disease prevention--what do we know and what do we need to find out? American Journal of Clinical
Nutrition, 53, 391-393.
[3] Shahidi F. (2000) Antioxidants in food and food antioxidants. Nahrung, 44, 158-163.
[4] Loizzo MR, Tundis R, Statti GA, Menichini F, Houghton PJ. (2005) In-vitro antiproliferative effects on human tumour cell lines of extracts and
jacaranone from Senecio leucanthemifolius Poiret. Journal of Pharmacy and Pharmacology,57, 897-901.
[5] Hartmann T, Witte L. (1995) Chemistry, Biology and Chemoecology of the Pyrrolizidine alkaloids, in Alkaloids: chemical and biological perspectives,
S.W. Pelletier, Editor. Elsevier. 155-233.
[6] Mori H, Sugie S, Yoshimi N, Asada Y, Furuya T, Williams GM.(1985) Genotoxicity of a variety of pyrrolizidine alkaloids in the hepatocyte primary
culture-DNA repair test using rat, mouse, and hamster hepatocytes. Cancer Research, 45, 3125-3129.
[7] Rosemann GM. (2006) Analysis of pyrrolizidine alkaloids in Crotalaria species by HPLC-MS/MS in order to evaluate related food health risks. Thesis,
Faculty of Veterinary Science. University of Pretoria, Pretoria.
[8] Witte L, Rubiolo P, Bicchi C, Hartmann T. (1993) Comparative analysis of pyrrolizidine alkaloids from natural sources by gas chromatography-mass
spectrometry. Phytochemistry, 32, 187-196.
[9] Pelser PB, De Vos H, Theuring C, Beuerle T, Vrieling K, Hartmann T. (2005) Frequent gain and loss of pyrrolizidine alkaloids in the evolution of Senecio
section Jacobaea (Asteraceae). Phytochemistry, 66, 1285 - 1295.
[10] Medicines and Healthcare products Regulatory Agency. (2007) Consultation letter mlx 296: proposals to prohibit the sale, supply or importation of
unlicensed herbal medicinal products for internal use which contain Senecio species, http://www.mhra.gov.uk/ home/idcplg?
IdcService=GET_FILE&dDocName=CON2030749&RevisionSelection Method=Latest Released (consulted on July 5, 2011).
[11] Edgar JA, Roeder E, Molyneux RJ. (2002) Honey from plants containing pyrrolizidine alkaloids: a potential threat to health. Journal of Agricultural Food
Chemistry, 50, 2719-2730.
[12] German Federal Health Bureau. (1992) G.F.H.B., Bundesanzeiger. Deutsche Apotheker Zeitung, 132, 1406-1408.
[13] Okusa PN, Penge O, Devleeschouwer M, Duez P. (2007) Direct and indirect antimicrobial effects and antioxidant activity of Cordia gilletii De Wild
(Boraginaceae). Journal of Ethnopharmacology,112, 476-481.
[14] Okusa PN, Beuerle T, Stévigny C, Duez P. (2012) Absence of pyrrolizidine alkaloids in Cordia gilletii de Wild (Boraginaceae). Biochemical Systematics
and Ecology,41, 1-2.
200
Annexe 18. Schéma de fragmentation des alcaloïdes pyrrolizidiniques
201

Faculté de Pharmacie - de l`Université libre de Bruxelles

Transcription

Documents pareils

Sécurité incendie Container de formation tout équipé

Alarme type 4 radio grande portée

Alarme type 4 radio relais

Alarme autonome pour sortie de secours

L`usage d`une calculatrice est

Paranormal Activity (Interdit -16 ans)

OFFRE D`EMPLOI Titre du poste Entreprise Description du poste

Downloadable PDF of “Chasse au trésor”

The Analysis of Sulfur Compounds in Coffee Aroma by Sulfur

communiqué la pêche, le 12 mars 2013 une 2e arrestation qui mène