sonic hedgehog guides commissural axons along the logitidunal

SONIC HEDGEHOG GUIDES COMMISSURAL
AXONS ALONG THE LOGITIDUNAL AXIS OF
THE SPINAL CORD
Dimitris Bourikas, Vladimir Pekarik, Thomas Baeriswyl, Asa Grunditz,
Réjina Sadhu, Michele Nardo & Ester Stoeckli
RICHARD
&
&
2008/2009
2008/2009
BOURHANE
INTRODUCTION
¾ Durant le développement du système nerveux, les axones croissent,
atteignent des cibles intermédiaires avant de continuer sur leurs
destinations finale, où ils établissent des synapses de contact.
¾ Cet grand mouvement de croissance est fortement sensible aux signaux
attractifs et répulsifs qui agissent comme des signaux de direction
moléculaires pour le développement des neurones.
¾ Le système model le mieux connu est la croissance des axones
commissuraux des neurones localisés dans la moelle épinière dorsale.
¾ Plusieurs protéines sont reconnues être impliquées dans le guidage des
axones commissuraux vers la plaque du planché (la F-spondine, la nectrine1, NrCAM), mais pourquoi ces neurones tournent rostralement une fois
atteint la plaque du plancher?
™Le but de cet article est d’identifier la (les)
protéine(s) principale associée(s) à la plaque
du plancher, impliquée(s) dans la direction
rostrale des axones commissuraux le long de
l’axe longitudinal dans la moelle épinière.
¾Qu’est-ce qu’ils ont fait?
L’hybridation soustractive.
Des expériences in ovo RNAi.
But hybridation soustractive:
Identifier des gènes localisés dans la plaque du plancher exprimés différentiellement
aux stades de développement 20 et 25 pouvant être candidats pour le rôle du guidage
des neurones commissuraux.
Shh
Analyses:
¾ L’expérience a été faite entre le stade 20 et 25.
9 Pourquoi au stade 25?
9 Pourquoi au stade 20?
¾ Ces fragments d’ADNc isolés et amplifiés par PCR pouvaient être
utilisés non seulement pour générer de sondes in situ, mais
directement pour des analyses fonctionnelles utilisant in ovo RNAi.
Les axone commissuraux en sens
opposé tournent dans l’axe
longitudinal de la moelle épinière
dans un contact étroit avec le bord
de la plaque du planché.
Analyse fonctionnelle de Shh par in
ovo RNAi
¾ Injection de dsRNA de Shh dans le canal central de la moelle épinière de
poulet, par électroporation in ovo.
dsRNA 3’-UTR SHH
¾Pas d’effet sur la croissance de
l’axone, sa migration envers et dans la
région de la plaque du planché.
Cependant, plusieurs trainent dans le
site exit de la plaque de plancher.
¾La majorité des cônes de croissance
(élargi) n’ont pas l’air de croitre dans
la direction rostral, ou même tournent
caudalement. Relativement quelques
axones s’étendent le long de l’axe
longitudinal. Parmi lesquels plusieurs
tournent caudalement au lieu de
tourner rostralement.
dsRNA N-ter Shh (après identification de gène)
¾Ce qui n’est pas le cas dans le
contrôle. Même quand les axones
commissuraux étaient analysés chez
des embryons très jeunes, ils ne
montraient jamais une morphologie de
traine.
Conclusion:
9Shh est nécessaire pour la direction rostrale
des axones commissuraux dans la plaque du
planché.
Identification du récepteur de Shh
Ptc et Smo sont des corécepteurs de Shh.
Sont –ils impliqués dans l’effet de Shh sur les axones postcommissuraux?
Coupe transversal au stade 23;
Hybridation in situ
Ni Ptc, ni Smo ne sont exprimés par les neurones commissuraux. Donc
ils ne sont pas requis pour la fonction de Shh dans le guidage des axones
postcommissuraux.
HIP: récepteur de Shh
HIP est une protéine transmembranaire liant directement toutes les
Protéines hedgehog chez tous les vertébrés
Est-ce que HIP pourrait médier l’effet de Shh sur les axones
commissuraux?
Hybridation in situ à différents stades du développement
(stades: 23, 24 et 26).
Stade 23: pas d’expression de HIP
Stade 24: forte expression de HIP
Stade 26: HIP est faiblement exprimée.
Conclusion:
¾HIP est exprimée de manière temporelle et transitoire.
¾HIP pourrait être le RC de Shh responsable du
guidage des Axones commissuraux le long de l’axe
longitudinal de la moelle épinière.
Confirmation du rôle de HIP par in ovo RNAi.
HIP RNAi et Shh RNAi présentent
le même phénotype
Conclusion:
HIP est le récepteur médiant l’effet
De Shh.
Quel est le mode d’action de Shh?
Chimioattractif ou chimiorepulsif?
Hybridation in situ de la moelle épinière( préparation open-book stade 25)
forte
faible
Shh présente un gradiant le long de l’axe restro-caudal.
Shh semble avoir un rôle répulsif sur les axones commissuraux.
Confirmation du rôle répulsif de Shh sur les axones postcommissuraux .
Électroporation in ovo
Thoracic
lumbosacral supérieur
Expression ectopique de Shh
lumbosacral caudal
Expression endogene
Les axones postcommissuraux ne quittent
pas La plaque du planquée lorsqu’ils
rencontrent une forte concentration de SHH
Avec une faible expression ectopique de
Shh Les axones tournent caudalement ou
rostralement.
Une forte expression ectopique de Shh ne
changent pas le comportement des axone
lorsque HIP est absent.
Confirmation in vitro du rôle répulsif de Shh
marquage des axones par DiI
explants de la corde spinale stade 24-25
Culture sur collagène
présence de
Bille Shh
Bille BSA
Lorsqu’ on positionne les billes trempées dans Shh à 200 ou 700 µm de l’explant:
Les axones ne quittent pas la plaque du plancher ou tournent vers les régions opposées
des billes.
Lorsqu'on positionne les billes de Shh à une distance de 900µm, les axones migrent
Normalement jusqu’à une certaine distance( 320) puis elles changent de direction).
Conclusion: Shh à un rôle répusif sur des axones postcommissuraux le long
de l’axe Longitudinal de la corde spinale.
conclusion:
Shh guide les axones commissuraux rostralement le long de l’axe
longitudinal de la corde spinale.
Au stade précoce du développement des axones, Shh a un effet attractant
médié par SMO et Ptc.
Hip est le récepteur qui Médie l’effet répulsif de Shh sur les axones
Commissuraux et il est exprimé dans le temps et dans l’espace.
Hip est une protéine transmembranaire qui manque le domaine intracellulaire.
Comment Hip transmet le signal de Shh?
Peut être Hip est un composent d’un complexe de récepteur dont il serait
le sous unité qui se lie à Shh et qu’il existe Une sous unité non identifiée
qui transmet le signal de Shh.
Hypothèse:
Coopération entre Shh, sfrps (secred frizzled-related proteins) et Wnt4