Télécharger

Université du Québec
Institut National de la Recherche Scientifique
Centre INRS - Institut Armand-Frappier
Étude de la voie de dénitrification de la souche bactérienne
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 provenant d’un
système de dénitrification d’eau de mer
Par
FLORIAN MAUFFREY
Thèse présentée pour l’obtention du grade
Philosophiae Doctor (Ph. D.) en biologie
Jury d’évaluation
Président de jury et examinateur interne :
Pr. Philippe Constant
INRS – Institut Armand Frappier
Examinateur externe :
Pr. Mohamed Hijri
Université de Montréal
Examinateur externe :
Pr. Sébastien Roy
Université de Sherbrooke
Directeur de recherche :
Pr. Richard Villemur
INRS – Institut Armand Frappier
©droits réservés de Florian MAUFFREY, 2016
RÉSUMÉ
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 est la bactérie dominante d’un
biofilm dénitrifiant nourri au méthanol. Il s’agit d’une méthylotrophe utilisant le méthanol
comme unique source de carbone et d’énergie et capable de réduire le nitrate afin de
croître en conditions anaérobies. Par contre, elle n’est pas capable de réduire le nitrite
en oxyde nitrique, mais possède les éléments génétiques pour réaliser le reste de la
dénitrification. Du fait de son abondance dans le biofilm dénitrifiant, elle jouerait un
grand rôle dans le processus global de dénitrification du biofilm. Elle possède deux
nitrate réductases très similaires lui permettant de réduire le nitrate, trait que l’on ne
retrouve que chez quelques rares espèces bactériennes. Ces deux enzymes (Nar1 et
Nar2) semblent, de plus, avoir une origine différente, ce qui suggère que leurs rôles
pourraient être différents dans la cellule. La création de mutants knockout des gènes
narG1 et narG2 a permis de mettre en évidence une plus grande efficacité de Nar1 dans
la réduction du nitrate et le maintien de la croissance. Nar2 semble moins efficace pour
la croissance de la bactérie, procurant à cette dernière une affinité plus basse pour le
nitrate et une plus faible vitesse de croissance. Néanmoins, Nar2 semble réguler de
manière inconnue la transcription de nar[1] et trouve donc son utilité chez JAM1.
Le génome de la souche JAM1 prédit la présence de deux oxyde nitrique
réductases (Nor1 et Nor2) et une oxyde nitreux réductase (Nos), suggérant la réduction
du NO et de N2O. Des essais en cultures axéniques ont effectivement montré la
capacité de la souche JAM1 de réduire le NO et le N2O. Elle est également capable de
croître en conditions anaérobies avec du N2O comme seul accepteur terminal
d’électrons. Une production de N2O est aussi observée chez la souche JAM1, mais elle
est plus probablement attribuée à des réactions abiotiques avec le nitrite et
l’hydroxylamine.
Les gènes du complexe Nor1 et Nor2 ont également des origines différentes,
suggérant des rôles différents dans la cellule. Tel que les Nar, Nor2 est exprimée à un
plus bas niveau que Nor1 dans la culture pure alors qu’elle est relativement surexprimée
en biofilm, indiquant un possible rôle spécifique à cette condition. On peut conclure que
M. nitratireducenticrescens JAM1 prend très probablement activement part à toutes les
étapes de la dénitrification dans le biofilm, excepté la réduction du nitrite. Elle possède
i
une structure génique particulière au niveau de la dénitrification et des mécanismes
complexes de régulation qui sont certainement inhérents à l’environnement du biofilm.
ii
SUMMARY
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 is the dominant bacterium of a
methanol-fed denitrifying biofilm. It belongs to the methylotrophic bacteria family and
uses methanol as unique carbon and energy source and can reduce nitrate for growth in
absence of oxygen. Although strain JAM1 cannot reduce nitrite into nitric oxide, it
harbours the setup of genes responsible for denitrification. Being the major bacterium in
the denitrifying biofilm, its contribution to the denitrification process of the biofilm is
important. Two similar nitrate reductases are present for the reduction of nitrate, a
characteristic which is only present in few bacterial species. These two enzymes (Nar1
and Nar2) seem to have originated from various species, suggesting a potential different
role in the cell. narG1 and narG2 knockout mutants highlighted a better efficiency of
Nar1 for the reduction of nitrate and bacterial growth. On the other side, Nar2 provided
lower nitrate reduction and growth rates to the bacteria. Nevertheless, Nar2 seems to
regulate nar[1] in an unknown way and thus is useful to strain JAM1. Despite the
incapacity of strain JAM1 to reduce nitrite, it can reduce both NO and N2O with two nitric
oxide reductases (Nor1 and Nor2) and a nitrous oxide reductase (Nos). Strain JAM1 is
also able to grow under anaerobic conditions with N2O as sole electron acceptor. N2O
production can be observed but certainly originates from abiotic reactions of nitrite and
hydroxylamine. Nor1 and Nor2 also have different origins and thus potentially have
different roles in the cell. Like Nar, nor[2] expression is lower than nor[1] in pure culture
but is relatively high in the biofilm, suggesting a different role or regulation. We can
conclude that M. nitratireducenticrescens JAM1 is certainly active at each step of the
denitrification in the biofilm, except the reduction of nitrite. Its denitrification pathway and
its regulation are complex and unique and are certainly due to the original environment
of the bacteria, the biofilm.
iii
REMERCIEMENTS
Je remercie tout d’abord Richard Villemur, mon directeur de recherche, qui m’a
accepté dans son laboratoire et permis de réaliser mon doctorat dans d’excellentes
conditions. Je le remercie pour sa précieuse aide dans la résolution des problèmes et
des énigmes rencontrées sur mon chemin. Finalement, je lui exprime ma gratitude pour
m’avoir toujours encouragé dans ce que j’ai entrepris et de ne pas m’avoir mis de
pression inutile sur les épaules.
Je veux remercier énormément tous les membres de mon laboratoire pour leurs
conseils et l’aide qu’ils m’ont apporté. Je remercie spécifiquement Christine, Céline,
Marc et Karla qui m’ont aidé à démarrer mon projet, suivis et soutenus pendant tout mon
doctorat et prodigué de précieux conseils. Je me suis toujours senti confiant en sachant
que je pouvais compter sur eux en cas de problèmes. Merci énormément !
Je remercie aussi tous les membres du groupe de recherche en microbiologie de
l’environnement pour leur aide et leur présence. Mon environnement de travail fut
extrêmenent agréable et ce fut un plaisir de me rendre à l’insitut tous les jours. Je
remercie plus particulièrement certaines personnes : Marie-Christine, Ahmad et Éric
pour la pénible confection de mes mutants; Sylvain Millot pour son aide et son énergie
pour élaborer des techniques innovantes de HPLC; Quentin et Philippe pour tous leurs
conseils et l’élaboration de mon pipeline de transcriptomique ainsi que pour leur aide
dans mon travail sur les gaz.
Je remercie tous mes amis d’ici et d’ailleurs qui ont souffert et sauté de joie avec
moi pendant tout ce temps et qui m’ont apporté un soutien moral ces quatres dernières
années. Je remercie ma famille qui m’a toujours soutenu dans tout ce que j’ai entrepris,
que ce soit en France ou au Québec. Finalement, je remercie ma chérie Élodie, qui a
toujours été avec moi dans les bons et les mauvais moments et qui a toujours su trouver
les mots pour me donner confiance en moi et me pernettre d’avancer.
iv
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ ...................................................................................................................... i
SUMMARY ................................................................................................................. iii
REMERCIEMENTS .................................................................................................... iv
TABLE DES MATIÈRES ............................................................................................. v
LISTE DES FIGURES .............................................................................................. viii
LISTE DES TABLEAUX ............................................................................................. ix
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS ................................................................... x
Synthèse .....................................................................................................................1
1. PROBLÉMATIQUE ................................................................................................. 2
1.1 Pollution du nitrate dans l’environnement ...................................................................................... 2
1.2 Méthodes de remédiation du nitrate .............................................................................................. 4
1.3 Le cycle de l’azote ............................................................................................................................ 8
1.4 La dénitrification ............................................................................................................................ 10
1.5 Le système de dénitrification au Biodôme de Montréal ............................................................... 11
2. LA RÉDUCTION DU NITRATE ............................................................................. 16
2.1 Généralités sur les nitrate réductases ........................................................................................... 16
2.2 La nitrate réductase assimilative ................................................................................................... 17
2.3 La nitrate réductase périplasmique ............................................................................................... 18
2.4 La nitrate réductase membranaire ................................................................................................ 21
2.5 Le transport du nitrate ................................................................................................................... 24
2.6 Le système de régulation des nitrate réductases .......................................................................... 26
3. LA RÉDUCTION DU NITRITE EN N2 .................................................................... 31
3.1 La réduction du nitrite ................................................................................................................... 31
3.2 La réduction du NO ........................................................................................................................ 35
3.3 La réduction du N2O....................................................................................................................... 38
3.4 Les voies alternatives de production de N2O ................................................................................. 40
4. LES BACTÉRIES MÉTHYLOTROPHES ............................................................... 47
4.1 La méthylotrophie ......................................................................................................................... 47
4.2 Le genre Methylophaga ................................................................................................................. 52
4.3 Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 .............................................................................. 55
5. PRÉSENTATION DE LA THÈSE .......................................................................... 58
5.1 Hypothèses de recherches ............................................................................................................. 58
5.2 Objectifs de l’étude ........................................................................................................................ 59
5.3 Méthodes ....................................................................................................................................... 60
v
Articles ..................................................................................................................... 61
6. Présentation de l’article 1 ................................................................................... 62
6.1 Résumé .......................................................................................................................................... 63
6.2 Summary ........................................................................................................................................ 64
6.3 Introduction ................................................................................................................................... 65
6.4 Materials and Methods.................................................................................................................. 66
6.4.1 Bacterial Strains and Growth Conditions ............................................................................... 66
6.4.2 Construction of the Knockout Mutants .................................................................................. 67
6.4.3 RNA Extraction........................................................................................................................ 68
6.4.4 Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 Transcriptome .............................................. 69
6.4.5 RT-PCR .................................................................................................................................... 70
6.4.6 RT-qPCR Assays....................................................................................................................... 71
6.4.7 Relative Quantification ........................................................................................................... 71
6.4.8 Fnr and NarL DNA-Binding Motifs .......................................................................................... 72
6.5 Results ............................................................................................................................................ 72
6.5.1 The Chromosomic Arrangement of the Denitrification Genes and their Expression under
Anaerobic Conditions ...................................................................................................................... 72
6.5.2 Effects of the Knockout Mutations of narG1 and narG2 on Growth and on Nitrate Reduction
......................................................................................................................................................... 75
6.5.3 Relative Expression Levels of narG1, narG2, narK1, and narK12f .......................................... 79
6.6 Discussion ...................................................................................................................................... 81
6.7 Conclusion ...................................................................................................................................... 84
6.8 Funding .......................................................................................................................................... 85
6.9 Conflict of Interest Statement ....................................................................................................... 85
6.10 Acknowledgment ......................................................................................................................... 85
7. Présentation de l’article 2 ................................................................................... 86
7.1 Résumé .......................................................................................................................................... 87
7.2 Summary ........................................................................................................................................ 88
7.3 Introduction ................................................................................................................................... 89
7.4 Materials and methods .................................................................................................................. 91
7.4.1 Bacterial growth conditions ................................................................................................... 91
15
7.4.2 N-labeling of N2O ................................................................................................................. 92
7.4.3 Measurements of nitrogenous compounds ........................................................................... 93
7.4.4 RNA extraction ....................................................................................................................... 94
7.4.5 Gene expression ..................................................................................................................... 94
7.5 Results ............................................................................................................................................ 96
7.5.1 Reduction of NO and N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1 ........................................... 96
7.5.2 Production of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1 ....................................................... 98
−
−
7.5.3 Role of NO3 and NO2 in N2O production ............................................................................ 101
+
7.5.4 Influence of NH4 in N2O production .................................................................................... 102
7.5.5 Gene expression ................................................................................................................... 105
7.6 Discussion .................................................................................................................................... 105
vi
7.7 Conclusion ....................................................................................................... 110
Funding information .......................................................................................................................... 110
Acknowledgment ............................................................................................................................... 110
8. Résultats supplémentaires ............................................................................... 111
8.1 Matériels et méthodes ................................................................................................................ 111
8.1.1 Cultures et conditions de croissance .................................................................................... 111
8.1.2 Extraction de l’ARN et analyses bioinformatiques ............................................................... 112
8.2 Résultats et discussion ................................................................................................................. 113
9. Discussion ......................................................................................................... 117
10. Conclusion ....................................................................................................... 123
11. Perspectives .................................................................................................... 125
Annexe ................................................................................................................... 126
Script - alignement sur génome ......................................................................................................... 126
Module fastx_tools/0.0.13 ............................................................................................................ 126
Module bowtie/2.2.3 .................................................................................................................... 126
Module SAMtools/0.1.18 .............................................................................................................. 127
Module BEDTools/2.20.1 ............................................................................................................... 127
Script – Normalisation avec R (NOIseq) ............................................................................................. 128
Références ............................................................................................................. 131
vii
LISTE DES FIGURES
Figure 1.1 : Cycle de l’azote ……………………………………………..……………….. p. 9
Figure 1.2 : Système de dénitrification du Biodôme de Montréal et biobille contenant le
biofilm dénitrifiant ………………………………………………………………………….. p. 13
Figure 1.3 : Représentation d’un biofilm en coupe ……………………..……..……… p. 15
Figure 2.1 : Représentation des différentes nitrate réductases ………….....……….. p. 20
Figure 2.2 : Système de régulation des gènes associés à la dénitrification …...…... p. 30
Figure 3.1 : Schéma du processus complet de dénitrification de Paracoccus
denitrificans ……………..……………………………………………………………..…… p. 34
Figure 3.2 : différentes voies enzymatiques et enzymes associées menant à la
production de N2O ………………………………………………………….……………… p. 43
Figure 6.1 : Gene arrangement of the 67 kbp region containing all of the denitrification
genes ……………………………………………………………………………………….. p. 73
Figure 6.2 : N2O reduction by strain JAM1 ………………………...………………….. p. 77
Figure 6.3 : Growth, nitrate reduction and nitrite production in cultures of strain JAM1
and the derivative narG mutants ……………………………………………..………….. p. 78
Figure 6.4 : Specific growth rates ……………………………………………………….. p. 79
Figure 6.5 : Relative expressions of narG1, narG2, narK12f, and narK1 …….…….. p. 85
Figure 7.1 : Reduction of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1 and its growth on
N2O ……………………………………………………………………………………….…. p. 97
Figure 7.2 : Reduction of NO by M. nitratireducenticrescens JAM1……….………. p. 99
Figure 7.3 : Production of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1………..…..... p. 100
Figure 7.4 : Production of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1 in presence of
acetylene………………………………………………………………………….…….…. p. 102
Figure 7.5 : NH4+ concentration in M. nitratireducenticrescens JAM1 cultures ….. p. 104
Figure 7.6 : Hydroxylamine production in M. nitratireducenticrescens JAM1 cultures
………………………………………………………….………..…………………...……. p. 107
Figure 7.7 : Relative transcript levels of norB1, norB2, nnrS, and nosZ. ………….. p. 109
Figure 8.1 : Nombre de gènes dont la régulation est significativement différentes chez
JAM1 dans les cultures en biofilms par rapport à la culture pure …………..………. p. 116
viii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 4.1 : Caractéristiques des différentes espèces de Methylophaga ……..….. p. 54
Table 6.1 : Sequences of potential NarL and ANR binding sites ………………..…… p. 74
Table 6.2 : Relative level of transcriptomic reads of the denitrification genes ……… p. 76
Table 6.3 : Kinetics of growth and nitrate reduction under denitrifying conditions …. p. 80
Table 7.1 : PCR primers …………..………………………………………...…………… p. 95
Table 7.2 : Reduction of nitrate, nitrite and production of N2O by strain JAM1 and the
JAM1ΔnarG1narG2 double mutant …………………………………………………... p. 101
Table 8.1 : Ratio d’expression de différents gènes d’intérêt de JAM1 pour les cultures en
biofilm par rapport à la culture pure ……………………………………………………. p. 115
ix
LISTE DES SIGLES ET ABRÉVIATIONS
ADN : Acide DésoxyriboNucléique
ANR : Arginine Nitrate reduction Regulator
AOA : Ammonium-Oxidizing Archea
AOB : Ammonium-Oxidizing bacteria
ARN : Acide RiboNucléique
ASW : Artificial Sea Water
ATP : Adénosine TriPhosphate
BHIB : Brain Heart Infusion Broth
bis-MGD : bis(Molybdopterin Guanine Dinucleotide)
BLAST : Basic Local Alignment Search Tool
cAMP : cyclic Adenosine MonoPhosphate
CBB : Calvin-Benson-Bassham
DMS : DiMethylSulfide
DMSOR : DiMethylSulfoxide Reductase
DMSP : DiMethylSulfonioPropionate
DNRA : Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium
EPS : Extracellular Polymeric Substance
FAD, FaDH : Flavin Adenine Dinucleotide
FDH : Formate Dehydrogenase
FISH : Fluorescent In Situ Hybridization
FNR : Fumarate Nitrate reduction Regulator
HPI : Hexulosephosphate isomerase
HPS : Hexulosephosphate synthase
HURM : Hydroxylamine-Ubiquinone Redox Module
x
IHF : Integration Host Factor
Ks : Constante de demi-saturation
MADH : Methylamine dehydrogenase
MAR-FISH : MicroAutoRadiography
MDH : Methanol DeHydrogenase
MFS : Major Facilitator Superfamily
MGD : Molybdenum Guanine Dinucleotide
MOB : Methane Oxydizing Bacteria
MQH2 : MenaQuinole
NAD(P)H : Nicotinamide Adenine Dinucléotide Phosphate
NAD+ : Nicotinamide Adenine Dinucléotide
NRA : Nitrate Reductase A
NRZ : Nitrate Reductase Z
PCR : Polymerization Chain reaction
PMS-asc : Phenazine Methosulfate plus ascorbate
RNA-seq : RiboNucleic Acid-sequencing
RuMP : Ribulose Mono-Phosphate
SLM : Saint-Laurent Marin
UQH2 : UbiQuinone
xi
Étude de la voie de dénitrification de la souche bactérienne
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 provenant d’un
système de dénitrification d’eau de mer
Synthèse
1
1. PROBLÉMATIQUE
1.1 Pollution du nitrate dans l’environnement
Le nitrate est un composé inorganique constitué d’un atome d’azote et de trois
atomes d’oxygène (NO3-). On le retrouve naturellement sous forme ionique, associé le
plus souvent à un atome de sodium (Na+) ou de potassium (K+). Les composés à base
de nitrate sont utilisés dans l’alimentation comme agents de conservation empêchant la
croissance de bactéries néfastes pour l’être humain, notamment Clostridium botulinum
(Reichl, 2010). Depuis la découverte de la fixation chimique de l’azote et l’avènement de
l’agriculture intensive au 20e siècle, ceux-ci sont principalement utilisés dans les engrais
chimiques en tant que source d’azote pour la croissance des plantes (Postgate, 1998,
Vitousek et al., 1997). Très solubles, ce sont des polluants importants des eaux
souterraines et de surface, et sont classés seconds dans le classement des polluants
les plus communs dans le monde après les pesticides (Spalding et al., 1993). Les
activités humaines sont la principale cause de pollution par le nitrate et les sources de
pollution sont généralement de nature diffuse avec l’agriculture intensive ou l’irrigation
avec des eaux usées (Bouchard et al., 1992, Mahvi et al., 2005). Le nitrate se retrouvant
en grande quantité dans les sols, il est soumis au lessivage par les eaux de pluie qui le
conduit jusqu’aux nappes phréatiques et cours d’eau (Strebel et al., 1989). De grandes
quantités de nitrate peuvent également venir de rejets industriels directement dans les
cours d’eau ou de déversements de fosses septiques domestiques (Wakida et al.,
2005). Finalement, la décomposition bactérienne de déchets ou de cadavres d’animaux
conduisent également à la production de nitrate. Ce phénomène est particulièrement
problématique dans les systèmes aquatiques fonctionnant en circuit fermé, comme les
aquariums municipaux où le nitrate s’accumule rapidement.
La pollution au nitrate des cours d’eau conduit au phénomène d’eutrophisation
dans de nombreux cas. De fortes concentrations de nitrate en conjonction avec de
grandes concentrations de phosphore (généralement sous forme de phosphate) peuvent
entrainer un apport en nutriments anormal dans des milieux oligotrophes ou
mésotrophes, rendant ces milieux plus eutrophes (V. H. Smith et al., 1999). D’après la
loi de Liebig sur le minimum, le rendement de croissance des plantes d’un milieu est
limité par le nutriment essentiel, que l’on retrouve en plus petite quantité dans ce milieu
2
(von Liebig, 1855). L’azote N et le phosphore P sont les deux principaux éléments qui
limitent le développement des plantes terrestres, mais aussi de certaines plantes
d’écosystèmes aquatiques (Howarth, 1988, V. H. Smith, 1998, Vitousek et al., 1991,
Walker, 1991). Ainsi, un fort apport nutritionnel en nitrate profite au développement du
phytoplancton et d’autres plantes aquatiques, augmentant la turbidité du milieu et
provoquant la mort de nombreux organismes vivants par manque d’oxygène (hypoxie).
La biodiversité de ces milieux s’en trouve alors diminuée, impactant tout l’écosystème
aquatique. Le développement efflorescences algales (cyanobactéries productrices de
toxines) s’est également accéléré et s’est étendu avec l’augmentation de l’eutrophisation
des milieux aquatiques, augmentant la mortalité animale, mais posant également des
problèmes de santé environnementale et financiers (D. M. Anderson et al., 2002, Pitois
et al., 2001).
Le nitrate a également un effet toxique direct sur les organismes vivants. Bien
que beaucoup moins toxique que d’autres molécules azotées comme le nitrite ou
l’ammonium, il présente une certaine toxicité quand il est présent en très forte
concentration (Camargo et al., 2005). La toxicité du nitrate pour les animaux est
principalement due au phénomène d’anoxie. Une fois dans le sang, le nitrate modifie la
forme des transporteurs d’oxygène comme l’hémoglobine, les rendant incapables de
fixer les molécules d’oxygènes (Cheng et al., 2002, J. Conrad, 1990, Jensen, 1996,
Scott et al., 2000). Les muscles et organes reçoivent alors de moins en moins
d’oxygène, conduisant à la mort de l’individu. Ingérer de trop grandes quantités de
nitrate est aussi très dangereux pour l’être humain, notamment les enfants. Le nitrate est
converti en nitrite dans les intestins et, en passant dans le sang, va bloquer les
hémoglobines et provoquer une méthémoglobinémie (Sandstedt, 1990, Wolfe et al.,
2002). De plus, le nitrate contribue à la formation de nitrosamines, molécules
considérées cancérigènes chez les mammifères (Harte et al., 1991).
Dans les eaux de surface, des concentrations excédant 25 mg NO3--N/L (1.8
mM) peuvent être observées. Ces valeurs peuvent aller jusqu’à 100 mg NO3--N/L (7.1
mM) dans les eaux souterraines (Bogardi et al., 1991, Gleick, 1993, Steinheimer et al.,
1998). Dans les aquariums marins et aquacultures, les concentrations en nitrate peuvent
atteindre des valeurs aussi hautes que 500 mg NO3--N /L (35.5 mM) du fait de la remise
en circulation continue de l’eau et d'une bonne oxygénation (De Graaff, 1964).
Malheureusement, aucune concentration limite de nitrate dans l’eau n’est officiellement
3
fixée à ce jour pour la santé animale. Néanmoins, il est admis qu’une concentration
inférieure à 20 mg NO3--N/L (1.4 mM) est nécessaire pour la bonne santé des animaux
aquatiques dans les milieux marins (Spotte, 1979). Par contre, la concentration en
nitrate dans l’eau potable est très surveillée et réglementée. Les concentrations
maximales permises du nitrate dans l’eau potable ont été fixées à 10 mg NO3--N/L (0.7
mM) au Canada et aux États-Unis, ce qui correspond à une valeur de 45 mg/L de nitrate
(EPA, 1986, Guidelines, 2014, Sutton et al., 2011). Cette valeur est de 50 mg/L de
nitrate pour l’Union européenne. En comparaison, les teneurs maximales acceptées
pour le nitrite dans l’eau potable sont de 1 mg/L et 0,5 mg/L de nitrite en Amérique du
Nord et en Europe, respectivement.
1.2 Méthodes de remédiation du nitrate
Afin de maintenir des concentrations aussi basses pour l’eau destinée à la
consommation, différentes méthodes ont été mises au point et se classent en deux
catégories : les traitements physico-chimiques et les traitements biologiques (Dwivedi et
al., 2007). Les traitements abiotiques se composent essentiellement de la séparation sur
membrane, l’échange d’ions, la réduction catalytique, l’électrodialyse et l’osmose
inverse. La séparation sur membrane consiste à séparer le nitrate de l’eau en traversant
une membrane semi-perméable. Cette méthode permet de traiter les eaux souterraines
en la couplant à des techniques d’électrocinétique (Chew et al., 1998). Les coûts élevés
de cette technique et la production de déchets concentrés en nitrate sont les deux
grands désavantages de cette technique (Kruithof et al., 1989). Dans la technique
d’échange d’ions, un des ions chlorure Cl- ou bicarbonate HCO3- placés sur une résine
sont échangés avec les ions nitrate NO3-. Tout comme la séparation sur membrane,
cette technique génère des déchets riches en nitrate, bicarbonate, chlore mais
également sulfate SO42- (Rogalla et al., 1991). La réduction catalytique est la simple
transformation du nitrate en azote gazeux à l’aide d’un catalyseur comme le platine Pt,
le palladium Pd ou encore le rhodium Rh. Une efficacité de réduction accrue est atteinte
si un faible courant électrique est adjoint au processus (Reddy et al., 2000). Le
fonctionnement des membranes dites "osmose inverse" est basé
sur le principe
d’application d’une pression pour compenser la pression générée par le phénomène
d’osmose. L’eau peut ainsi passer à travers la membrane semi-perméable du milieu
4
avec une forte concentration en ions vers le milieu faiblement concentré. Cette
technique est de plus en plus utilisée depuis les 40 dernières années, essentiellement
dans la désalinisation de l’eau de mer (Greenlee et al., 2009). Elle est également utilisée
pour purifier l’eau de contaminants comme le nitrate, notamment dans les zones rurales
(Schoeman et al., 2003). Finalement, l’électrodialyse est une méthode consistant à
séparer les sels contenus dans l’eau à l’aide de membranes échangeuse d’ions en
faisant intervenir un courant électrique (Kesore et al., 1997). Deux électrodes sont
placées de part et d’autre de la membrane séparant en deux cellules le volume d’eau à
traiter. Due à la sélectivité alternative des membranes, le courant généré finit par
entrainer la migration de sels inorganiques dans une des deux cellules, créant ainsi une
cellule riche en sels et une autre pauvre en sels. Malgré la diversité des méthodes
existantes, les coûts élevés et/ou la production de déchets rendent les techniques de
remédiation abiotiques peu attrayantes.
La remédiation biologique, autrement appelée bioremédiation, ne fait pas face à
ces problèmes et repose sur la capacité naturelle des bactéries et des plantes à
consommer le nitrate. La bioremédiation par les plantes (phytoremédiation) repose sur
l’absorption ou la dégradation des contaminants par les plantes. Plusieurs techniques de
phytoremédiation
différentes
existent,
telles
que
la
phytodégradation
ou
la
phytoextraction, et chaque situation requiert un traitement particulier en raison du climat,
de la géologie ou encore de la région concernée (Dwivedi et al., 2007, Lee, 2013). Parmi
les exemples d’applications se trouvent le traitement des eaux usées, des éléments
traces ou des polluants organiques (Raskin et al., 1997, Schnoor et al., 1995, Vymazal,
2002). Les zones humides sont propices à la phytoremédiation, en raison de leurs rôles
de réservoir et de collecteur d’eau (J. B. Williams, 2002). Elles sont utilisées dans le
traitement de nombreux effluents, dont les eaux de ruissellements agricoles chargées en
nitrate et/ou pesticides (Beutel et al., 2009, Maillard et al., 2011). Les plantes sont aussi
capables de stimuler les bactéries de la rhizosphère afin qu’elles dégradent les
polluants. Ce processus est appelé phytostimulation ou encore rhizoremédiation
(Gerhardt et al., 2009). Les microorganismes, et plus particulièrement les bactéries, sont
aussi directement utilisés en bioremédiation pour la dégradation du nitrate (R. L. Smith
et al., 1994). À nouveau, beaucoup de processus existent et chaque situation requiert
une solution appropriée.
La bioremédiation
in situ
consiste à stimuler
les
microorganismes présents dans la zone contaminée, généralement par l’introduction
d’une source de carbone particulière dans le sol afin qu’ils puissent réaliser une
5
dénitrification plus performante. Cela a pour avantage d’avoir un coût de mise en œuvre
peu élevé et une facilité d’utilisation (Cartmell et al., 1998). La source de carbone est
considérée comme limitante dans le développement des bactéries dénitrifiantes, et afin
de stimuler leur activité, des sources de carbone sont directement injectées dans le sol.
Parmi les plus utilisées se trouvent le formate, le méthanol, l’éthanol, l’acétate et le
sucrose. Différentes manières d’injection ont aussi été étudiées, allant de l’injection en
continu à l’injection pulsée.
La stimulation de l’activité bactérienne est pleinement exploitée dans les
systèmes de traitement appelés bioréacteurs. De manière générale, les bioréacteurs
sont des systèmes entretenant une activité bactérienne dans un milieu donné à des fins
de production de biomasse et de métabolites particuliers ou afin d’entretenir un
processus chimique constant. Il existe de nombreux types et déclinaisons de
bioréacteurs qui sont propres à la situation géographique et hydraulique et au traitement
que l’on souhaite appliquer (Schipper et al., 2010). Ici ne sera fait la revue que des
bioréacteurs étant utilisés dans la remédiation du nitrate. Les paramètres communs à
tous les bioréacteurs traitant le nitrate sont l’introduction d’une source de carbone dans
le milieu à traiter, afin de stimuler la croissance bactérienne et les conditions anaérobies
afin de stimuler l'activité dénitrifiante (réduction du nitrate en azote gazeux).
Le premier type de bioréacteur consiste en un mur poreux que l’on introduit dans
le sol, de sorte que le flux d’eau à traiter rentre en contact avec ce mur. Le flux d’eau
n’est que ralenti et passe au travers du mur. Cette méthode permet de traiter les
effluents souterrains peu profonds de manière passive avant qu’ils n’atteignent une
rivière ou une nappe souterraine. Le mur est constitué du matériel jouant le rôle de
source de carbone, généralement du bois sous forme de copeaux ou de sciure mélangé
avec du sol (Fahrner, 2002, Robertson et al., 1995). Cette technologie existe aussi sous
forme de membranes actives perméables, sur lesquelles est fixé le matériel jouant le
rôle de source de carbone (EPA, 1998). Les bioréacteurs en couches fonctionnent sur le
même principe que les murs poreux à la différence qu’ils se composent de différentes
couches, posées à l’horizontale sous la zone à traiter. Ils peuvent être placés sous des
drains de fosses septiques ou sous des terres arables irriguées (Robertson et al., 1995,
Schipper et al., 2008).
La dernière grande catégorie de bioréacteur est représentée par les bioréacteurs
à lit et à membrane. Ce sont de grandes cuves ou citernes dans lesquelles sont ajoutés
6
une source de carbone tels le méthanol ou l’éthanol disponibles en grande quantité et à
faible coût (Delanghe et al., 1994, Ergas et al., 2004) et l’eau à traiter. Les
microorganismes vont alors se développer à l’intérieur des cuves ou l’on maintient
artificiellement des conditions de croissance idéales afin de favoriser la dénitrification.
Dans les bioréacteurs à membrane, l’eau circule dans des fibres laissant diffuser le
nitrate vers un biofilm bactérien dénitrifiant se trouvant sur le contour de ces fibres. Les
bactéries sont ainsi séparées de l’eau sortant du bioréacteur et les populations
bactériennes sont facilement contrôlables en dosant la quantité de source de carbone
injectée (Ergas et al., 2004). Les bioréacteurs à lit se divisent en plusieurs types. Ils sont
qualifiés à lit emballé quand une matrice fixe poreuse sert de support aux bactéries. Le
flux d’eau passe alors au travers de la matrice afin d’être traité (Warnock et al., 2005). Si
le bioréacteur est dit à lit fluidisé, les supports ne sont plus fixes mais mis en
mouvement. Ce sont, par exemple, de petits supports en forme de section de tuyaux
avec une croix à l’intérieur et possédant une grande surface où les bactéries peuvent se
développer. Néanmoins, une grande variété de supports existe. Le mouvement est créé
par le flux d’eau circulant de bas en haut (Godia et al., 1995). Dans les bioréacteurs à lit
mobile, l’eau est mise en mouvement mécaniquement dans la cuve afin de créer un
brassage continu. L’ajout de plus ou moins de supports suffit à contrôler la quantité de
bactéries et à contrôler le processus de dégradation (Rusten et al., 1995).
On distingue également plusieurs façons d’alimenter les bioréacteurs. Le mode
cuvée consiste à remplir le bioréacteur et à laisser séjourner l’eau pendant le temps
nécessaire au traitement, puis à vider complètement la cuve. Celle-ci est lavée et
remplie à nouveau afin de recommencer le processus. En mode continu, une entrée et
une sortie d’eau sont maintenus en permanence. Les rendements atteints sont alors
souvent plus élevés qu’en mode cuvée car on arrête le bioréacteur moins souvent et il
est plus facile de contrôler les paramètres de croissance des bactéries afin de les
ajuster. Il est possible de fixer les bactéries sur différents supports (eux-même fixés ou
libres) afin de perdre le moins de biomasse possible. Finalement, le mode cuvéealimentée est une combinaison des deux modes décrits précédemment. Un apport d’eau
régulier ou périodique est maintenu dans la cuve, mais il n’y a pas de sortie continue
d’eau. La cuve est vidée partiellement ou totalement de manière périodique, dès qu’elle
est pleine ou dès que l’on juge le traitement complet. Cette méthode est la plus
répandue et permet d’atteindre de bons rendements car on peut régler finement les
paramètres de croissance, comme en mode continu (Cinar et al., 2003).
7
1.3 Le cycle de l’azote
L’azote est un élément essentiel de la vie, constituant primordiale de l’ADN et
des protéines, et est présent dans tous les êtres vivants, y compris les bactéries. Afin
de pouvoir utiliser de nombreuses formes de molécules azotées différentes, elles ont
développé différentes stratégies qui ont conduit à la mise en place du cycle de l’azote
(Figure 1.1). Ces réactions assurent un équilibre entre les différentes formes de l’azote
et un recyclage permanent des composés azotés. Le métabolisme de l’azote n’est pas
seulement lié à la production de biomasse, mais également à la production d’énergie.
En effet, si certaines bactéries tendent surtout à produire de l’ammoniac NH3 afin
d’assimiler l’azote, d’autres utilisent le nitrate comme accepteur final d’électrons dans
une réaction d’oxydation produisant de l’ATP (Van Spanning et al., 2005). On peut
globalement diviser le cycle de l’azote en quatre parties distinctes : la réduction du
nitrate/oxydation du nitrite, la dénitrification, la fixation de l’azote gazeux et la
nitrification. D’autres voies s’ajoutent à celles-ci et sont internes au cycle, comme
l’anammox (anaerobic ammonium oxidation) ou l’ammonification du nitrite.
La fixation de l’azote permet aux bactéries de transformer l’azote gazeux N2 en
ammoniac NH3, élément facilement assimilable et source d’azote pour la production de
biomolécules telles que l’ADN, l’ARN et les protéines (Burns et al., 1975). Cette réaction
hautement endothermique est présente chez de nombreuses bactéries aérobies et
anaérobies en vie « libre » ou associées à d’autres organismes tels que les racines des
plantes. Dans les océans, ce sont essentiellement les cyanobactéries qui fixent l’azote
(Zehr, 2011). La nitrification consiste en l’oxydation de l’ammonium en nitrite NO 2-, en
passant par la forme intermédiaire de l’hydroxylamine NH2OH. Ces réactions entrainent
la génération d’énergie sous forme d’électrons stockés dans les quinones (Ferguson,
1998). Cette réaction peut être complétée par l’oxydation du nitrite en nitrate, appelée
nitratation. La nitrification est un phénomène aérobie mais l’oxydation de l’ammonium en
absence d’oxygène est tout de même possible. Il a été prouvé que le nitrate ou le nitrite
pouvait servir à oxyder l’ammonium pour produire de l’azote gazeux dans un processus
appelé l’anammox (Mulder et al., 1995). Ce processus est de plus en plus utilisé dans la
remédiation de l’ammonium dans les systèmes de traitement des eaux (Ni et al., 2013).
La réduction dissimilatrice du nitrate en ammonium (DNRA) produit de l’ammonium à
partir du nitrate en passant par le nitrite (Kraft et al., 2011). La réduction du nitrite permet
8
de transférer huit électrons à la chaîne respiratoire pour générer de l’ATP et l’ammonium
produit n’est pas assimilé. Ce processus prend place quand peu de nitrate est présent
dans le milieu par rapport au carbone organique. La réduction du nitrite en ammonium
est catalysée par la nitrite réductase NrfA alors que la réduction du nitrate est réalisée
grâce à la nitrate réductase périplasmique NapAB dans la majorité des cas. Le nitrite
peut également être réduit en ammonium par l’enzyme Nas ou NirBD afin de pouvoir
assimiler l’azote dans la biomasse. C’est pourquoi ces deux nitrite réductases sont dites
assimilatrices.
Figure 1.1 : Cycle de l’azote dans l’environnement et enzymes associées à chaque transformation. Les
différents processus représentés sont (1) la fixation de l’azote, (2) la dénitrification, (3) la nitrification, (4, 5)
l’ammonification dissimilatoire et assimilatoire du nitrate et (6) l’oxydation anaerobie de l’ammonium
(anammox).
Tiré de Einsle et al. (2004).
9
1.4 La dénitrification
La dénitrification est une des voies métaboliques principales du cycle de l’azote.
Au sens strict, elle est défini comme la réduction du nitrite en azote gazeux (Zumft,
1997). La réduction du nitrate en nitrite n’en fait pas partie car cette réaction est
commune à de nombreuses espèces bactériennes différentes, dont celles qui font la
DNRA. Cependant, il est assez courant d’inclure la réduction du nitrate en nitrite dans la
définition de la dénitrification, et c’est ce qui sera fait ici. La dénitrification est un
processus dissimilatoire faisant partie de l’appareil bioénergétique de la paroi cellulaire
bactérienne. En effet, le rôle de ce processus bactérien est de produire de l’énergie
grâce à la réduction du nitrate en nitrite ou du NO et du N2O en N2. Ce processus peut
être qualifié de respiration alternative car il vient remplacer le processus de respiration
aérobie quand celui-ci n’est pas possible. Concrètement, les différents oxydes d’azote
présents dans ce processus jouent le rôle d’accepteur final d’électron dans les réactions
d’oxydoréduction de la chaîne respiratoire. Un gradient électrochimique se crée à
travers la membrane et entraîne la production d’ATP à partir de d’ATP synthase. C’est
un processus presque exclusivement facultatif, en cela qu’il vient toujours s’additionner
à un autre système de production d’énergie déjà en place dans la cellule. De manière
générale, l’activation de cette voie métabolique se fait en présence d’oxyde d’azote et en
absence d’oxygène; la respiration aérobie produisant plus d’énergie que la dénitrification
est donc privilégiée quand celle-ci est possible. Malgré cela, des bactéries capables de
faire la dénitrification en présence d’oxygène ont été identifiées (Hayatsu et al., 2008).
Paracoccus denitrificans ATCC 35512 a été très étudiée pour sa capacité à pouvoir
réduire le nitrate en nitrite en conditions aérobies. La découverte de nombreuses
bactéries capables de dénitrification aérobie tend à conclure que ce trait est un
caractère particulier de la dénitrification et non pas une rare exception. Certaines
réactions pourraient toutefois être liées préférentiellement à un mécanisme de
détoxification du milieu plutôt qu’à un mécanisme de respiration. En effet, si le nitrate
peut présenter une certaine toxicité comme évoqué précédemment, le nitrite et le NO
produits par les réductions sont des molécules beaucoup plus actives ayant une toxicité
très élevée (Mancinelli et al., 1983).
On retrouve des bactéries dénitrifiantes dans la plupart des environnement (sols,
eaux douces et marines), dont une grande variété appartient à la classe des
protéobactéries (Hurst et al., 2007). Il semble que les espèces dénitrifiantes soient plus
10
fréquentes parmi les alpha- et betaprotéobactéries, bien que cela ne soit pas reconnu
officiellement comme un patron de distribution (Zumft, 1997). De plus, les bactéries
dénitrifiantes sont le plus souvent aérobies et hétérotrophes, mais il existe aussi des
autotrophes et fermenteurs (Maier et al., 2009). Certaines bactéries dénitrifiantes sont
également impliquées dans d’autres réactions du cycle de l’azote en participant à la
fixation du N2 ou la nitrification. Il existe une grande variété de caractères différents au
niveau métabolique et au niveau de l’activité chez les bactéries dénitrifiantes. La
dénitrification peut être complète ou partielle mais, dans un milieu donné, la
dénitrification complète peut être réalisée par plusieurs espèces. Une coopération entre
différentes espèces bactériennes s’opère souvent, chacune participant à une partie du
processus. Cette association inter-espèce dans la réalisation d’un ou plusieurs
processus métabolique est qualifiée de syntrophie (Madigan et al., 1997). Dans une telle
association, l'action d’une espèce est dépendante de celle de l’autre espèce. La
diversité bactérienne d’un milieu a alors un impact important sur les processus
métaboliques, façonnant les interactions inter-espèces. De nombreux cas de
syntrophies ont été étudiés, que ce soit pour la dégradation de xénobiotiques, la
dégradation méthanogène ou la dénitrification (Raghoebarsing et al., 2006, Schink,
1997, D. Smith et al., 2005). Beaucoup d’organismes sont devenus des modèles
d’études pour la dénitrification, du fait principalement des connaissances générales que
l’on possède sur ces organismes et de leur facilité d’étude en laboratoire. Parmi les
organismes les plus étudiés, on retrouve notamment Escherichia coli, Pseudomonas
sp., Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans et Micrococcus denitrificans
(Zumft, 1997). Contrairement à la nitrification, la dénitrification est un trait facultatif,
présent chez de nombreuses espèces bactériennes et qui n’est pas associée à un
métabolisme particulier du carbone. Il est donc impossible d’utiliser ce trait pour définir
spécifiquement des genres et espèces bactériennes. L’étude de cette voie métabolique
et de sa diversité se fait alors au travers de la caractérisation des gènes codant pour
cette voie.
1.5 Le système de dénitrification au Biodôme de Montréal
Le Biodôme de Montréal est un lieu où sont reconstitués les différents biomes
présents en Amérique et où sont hébergées des centaines d’espèces animales et
végétales. Parmi les biomes présents figure le Saint-Laurent marin (SLM), représentant
11
essentiellement la faune aquatique présente dans le fleuve du Saint-Laurent. Plusieurs
espèces de poissons, invertébrés et oiseaux cohabitent dans ce mésocosme marin peu
alimenté en eau fraîche (Parent et al., 2000). Du fait de leurs fonctionnements en circuit
fermé, les aquariums publics et aquacultures font face à des problèmes d’accumulation
de déchets et de contaminants (Hamlin et al., 2008, Parent et al., 2000). Ce fut le cas du
Biodôme de Montréal où la concentration en nitrate augmenta rapidement après la mise
en service en 1992 du SLM pour atteindre 10.7 mM après 3 ans de fonctionnement,
ayant un impact sur la santé des animaux. Une filière de dénitrification fut mise en place
en 1998 afin de traiter les 3 millions de litres d’eau contenus dans le SLM et de diminuer
les concentrations en nitrate ayant atteint les valeurs très élevées de 200 mg NO 3--N/L
(Parent et al., 2000). Le système de dénitrification fut installé pour fonctionner en
parallèle du système de contrôle principal du bassin. Deux cuves de 1m3 chacune
composaient principalement le système, dont un réservoir de désoxygénation et un
réservoir de dénitrification (Figure 1.2.A). Une unité de fractionnement d’écume ainsi
qu’un réservoir de débordement venaient compléter l’installation. La cuve associée à la
dénitrification contenait des supports en libre mouvement pour le développement du
biofilm dénitrifiant. La température maintenue dans le système était comprise entre 16°C
et 24°C et du méthanol était ajouté en tant que source de carbone. Le biofilm s’est
développé au fil du temps par des microorganismes présents naturellement dans l’eau
de mer du Biodôme qui ont trouvé dans le bioréacteur un environnement propice à leur
développement (environnement microaérobie, nitrate et méthanol) (Figure 1.2.B).
Normand Labbé et al. (2003b) démontrèrent qu’en ajoutant un cocktail d’éléments traces
deux fois par jour (370 mg FeSO4 · 7H2O, 130 mg MnSO4 · 4H2O, 20 mg CuSO4 ·
5H2O), les rendements de dénitrification étaient améliorés. Malgré des performances
attestées, la filière de dénitrification fut arrêtée en 2005 pour cause de rendements
insuffisants. Le biofilm du réacteur a pu être conservé par le laboratoire du Prof. Villemur
pour des études subséquentes.
Les biofilms peuvent être définis comme une surface ou une interface sur ou
dans laquelle une communauté de microorganismes interagissent ensemble et se
développent (Allison et al., 2000). Cette communauté est représentée par un ensemble
de populations bactériennes de différentes espèces ayant des interactions telles que
l’échange de matériel génétique, de signaux de communications ou de métabolites. De
plus, une matrice composée d’exopolysaccharides (EPS) est secrétée par les bactéries
composant le biofilm et constitue un microenvironnement dans lequel les bactéries
12
évoluent (Figure 1.3). Ces EPS sont constitués principalement de polysaccharides et de
protéines, mais aussi d’autres constituants tels que de l’ADN, des lipides et des
substances
humiques
(Evans,
2003).
Les
biofilms
se
retrouvent
dans
des
environnements variés où ils se forment la plupart du temps sur une surface à l’interface
solide-liquide. Ils adoptent une forme dépendante du milieu dans lequel ils se trouvent,
allant du filament au tapis bactérien ou sous forme ressemblant à un mycélium fongique
(Hall-Stoodley et al., 2004). La structure interne du biofilm peut également varier d’un
cas à un autre, bien que la distribution à l’intérieur du biofilm ne semble jamais se faire
de manière homogène. L’hétérogénéité des biofilms se manifeste par une distribution
variable des cellules et des agrégats de cellules, par la présence de canaux traversant
le biofilm de part en part ou d’espaces vides d’EPS (Costerton et al., 1995). Les
avantages du mode de vie en biofilm sont nombreux (Hall-Stoodley et al., 2004). La vie
sur une surface apporte une stabilité pour le développement bactérien et une proximité
des cellules favorisant certaines fonctions catalytiques. L’EPS formant le biofilm apporte
également une protection efficace contre de nombreux facteurs environnementaux (pH,
exposition aux UV et agents antimicrobiens, déshydratation et salinité, …). Finalement,
le biofilm pourrait également favoriser l’émergence de sous-populations appelées
« persistantes » présentant un phénotype plus résistant que les populations régulières.
A
B
Figure 1.2 : Photos du système de dénitrification du Biodôme de Montréal. (A) Désoxygénateur (à droite) et
®
dénitrificateur (à gauche); (B) Photo d’une biobille de type Bioflow 9 sur laquelle s’est développé un biofilm.
13
N. Labbé et al. (2003a) étudièrent le biofilm se développant dans le système de
dénitrification du SLM dans le but de caractériser la microflore bactérienne et sa
dynamique. Trois souches appartenant aux alphaprotéobactéries furent isolées à partir
du biofilm et nommées NL8, NL21 et NL23. Ces trois souches furent affiliées
respectivement à la famille des Phyllobacteriaceae, et aux espèces Paracoccus
denitrificans et Hyphomicrobium zavarzinii, les deux dernières espèces ayant déjà été
retrouvées dans d’autres systèmes de dénitrification nourris au méthanol (Lemmer et al.,
1997, Neef et al., 1996). La souche NL23 fut retrouvée avec une plus grande abondance
que les deux autres souches, et l’étude de cette souche démontra son appartenance à
une nouvelle espèce nommée Hyphomicrobium nitrativorans (Martineau et al., 2013b).
Une analyse des gènes de l’ARN ribosomal 16S a permis de mettre en évidence que les
bactéries les plus abondantes dans le biofilm représentaient 15 à 20 espèces
différentes. Le groupe des gammaprotéobactéries se révéla être le plus abondant,
représentant 71% des gènes de l’ARN 16S analysés, affiliés au genre Methylophaga de
la famille des Picirickettsia. Deux nouvelles espèces appartenant au genre
Méthylophaga, JAM1 et JAM7, furent par la suite isolées et nommées respectivement
Methylophaga nitratireducenticrescens et Methylophaga frappieri (Auclair et al., 2010).
Des expériences d’hybridation in situ par fluorescence (FISH) confirmèrent la forte
proportion de Methylophaga spp. dans le biofilm (36-79 %) alors que Hyphomicrobium
spp. ne représentait que 7-8 % de la population totale et n’apparaissait qu’après 22 jours
de colonisation du biofilm (N. Labbé et al., 2007). Les Hyphomicrobium spp. possèdant
une croissance lente, il n’est donc pas surprenant de ne détecter leur présence que tard
dans la croissance du biofilm (Hirsch, 1989). Le FISH révéla également la présence
d’eucaryotes, essentiellement des protistes, dans de fortes proportions dans les
premiers jours de la colonisation du biofilm, mais diminuant en abondance relative avec
le développement du biofilm (Laurin et al., 2008). Auclair et al. (2011) détectèrent par
PCR et séquençage la présence de plusieurs gènes liés à la dénitrification dont narG,
napA, nirK, nirS, cnorB et nosZ. Certaines de ces séquences furent attribuées à M.
nitratireducenticrescens JAM1 et à Hyphomicrobium nitrativorans NL23. Des essais de
qPCR ciblant les gènes narG1 et narG2 appartenant à la souche JAM1 et le gène napA
appartenant à la souche NL23 ont par la suite montré que les deux espèces étaient
aussi abondantes l’une que l’autre dans le biofilm, malgré les résultats obtenus par
FISH. Les conditions de cultures différentes dans les deux expériences pourraient
expliquer les différences d’abondance observées entre les deux espèces. En effet, alors
14
que les qPCR ont été réalisées sur du biofilm issu de supports en libre suspension, le
FISH fut réalisé à partir de lamelles qui étaient placées dans le haut du bioréacteur où la
concentration en oxygène était supérieure. Quoi qu’il en soit, les autres gènes liés à la
dénitrification étant retrouvés de 10 à 10000 fois moins dans le biofilm, il a été suggéré
que les souches JAM1 et NL23 étaient les acteurs majeurs de la dénitrification dans le
biofilm.
Figure 1.3 : représentation d’un biofilm en coupe.
Tiré de Ikuma (2013).
15
2. LA RÉDUCTION DU NITRATE
2.1 Généralités sur les nitrate réductases
La réduction du nitrate est la première étape de la dénitrification. Il existe
plusieurs enzymes différentes qualifiées de nitrate réductases capable de faire cette
réaction (Nar, Nap et Nas) et se composent de deux types différents : les nitrate
réductases assimilatives et les nitrate réductases dissimilatoires ou respiratoires
(Barton, 2005). Les premières permettent à la bactérie de puiser son azote à partir du
nitrate qu’elle transforme en ammonium afin de l’incorporer dans ses différents
constituants cellulaires. Les nitrate réductases dissimilatoires, quant à elles, sont
associées à l’acquisition d’énergie (respiration anaérobie), la détoxification et la
régulation redox du milieu. La réaction catalysée par ces enzymes est la suivante :
NO3- + H2
NO2- + H2O
(ΔG0’ = -163.2 kJ/mol)
Comme la réaction de réduction n’entraîne le transfert que d’un atome d’oxygène, les
nitrate réductases sont qualifiées de monooxygénases. Il a été démontré que les trois
nitrate réductases pouvaient coexister chez certaines bactéries telles que Alcaligenes
eutropha et Paracoccus denitrificans (Sears et al., 1997, Warnecke-Eberz et al., 1993).
D’un point de vue constitutionnel, toutes les nitrate réductases ont en commun le fait
qu’elles requièrent un cofacteur contenant du molybdène interagissant avec la molécule
de nitrate (Moura et al., 1997). Quand il est connu, ce cofacteur se présente souvent
sous forme de dinucléotide guanine molybdoptérine (MGD). Toutes les nitrate
réductases appartiennent à la famille des DMSOR (dimethyl sulfoxide reductase) qui
possède la particularité d’avoir deux fractions de pyranoptérine maintenant l’atome de
molybdène dans le site actif comme une pince (George et al., 1999). Le molybdène
permet alors l’échange d’électrons avec la molécule de nitrate pour la réaction de
réduction avec un potentiel redox très élevé de +433 mV, facilitant grandement la
réaction (Sparacino-Watkins et al., 2014). Bien qu’il ne soit pas rare de retrouver
plusieurs nitrate réductases différentes chez une espèce bactérienne, il est en revanche
plus exceptionnel de voir plusieurs fois le même type de nitrate réductase dans un
génome. Parmi ces rares organismes, on peut citer Escherichia coli (deux Nar et un
Nap), Shewanella piezotolerans (deux Nap) ou encore Rhodobacter sphaeroides (deux
16
Nap) (Bonnefoy et al., 1994, Y. Chen et al., 2011, Hartsock et al., 2011). Chez toutes
ces espèces, chaque nitrate réductase possède un rôle spécifique de l’autre nitrate
réductase du même type. Plus de détails sur ces espèces seront fournis plus bas.
2.2 La nitrate réductase assimilative
Le nitrate ne peut être directement transformé en ammonium à des fins
d’assimilation. Il est dans un premier temps réduit en nitrite, qui est à son tour réduit en
ammonium. La nitrate réductase jouant ce rôle est qualifiée de nitrate réductase
assimilative Nas (Figure 2.1.A). Les gènes et les enzymes responsables de la réduction
assimilative du nitrate sont différents et distincts de ceux responsables de la réduction
dissimilatoire du nitrate, bien que la réaction reste la même (Barton, 2005). De
nombreux organismes possèdent ce trait, mais il a surtout été étudié chez la bactérie
Klebsiella pneumoniae M5aI (Lin et al., 1994). Les gènes codant pour cette enzyme sont
regroupés dans l’opéron nasFEDCBA. L’ordre et la présence des différentes unités sont
dépendantes des espèces ainsi que du rôle de chaque protéine Nas (Gonzalez et al.,
2006). nasFED codent pour un transporteur ABC classique de nitrate/nitrite homologue
à celui du système de transport du nitrate nrt présent chez Synechococcus sp. souche
PCC7942 (Omata et al., 1993). nasFED est responsable d’acheminer le nitrate du
périplasme au cytoplasme où a lieu la réduction en ammonium, localisation appropriée
étant donné que la synthèse des biomolécules s’y déroule. nasA code pour la sous-unité
catalytique de nitrate réductase mais ne contient pas le domaine de fixation du FAD ou
NADH commun à toutes les nitrate réductases (Lin et al., 1993). Elle est couplée à
NasC, une petite sous-unité contenant le FAD, qui va jouer ce rôle. Ces deux gènes
sont nécessaires pour avoir une activité de réduction du nitrate. Les électrons
nécessaires à la réduction du nitrate proviendraient alors du NAD(P)H ou de la
ferrédoxine (Van Spanning et al., 2005). nasB code pour la nitrite réductase NADHdépendante réduisant le nitrite en ammonium. Du point de vue de la régulation, le
mécanisme d’assimilation se met en place lorsque les concentrations d’ammonium
deviennent basses et que du nitrate est disponible dans le milieu. L’oxygène n’a aucun
effet sur la régulation de cet opéron. La détection de ces conditions se fait par
l’intermédiaire de systèmes globaux du contrôle du nitrate (NtrC) et de détecteurs
spécifiques de nitrate/nitrite (Wu et al., 1999).
17
2.3 La nitrate réductase périplasmique
La nitrate réductase périplasmique Nap est le premier type de nitrate réductase
dissimilatoire que l’on retrouve chez les bactéries (Figure 2.1.B). Cette enzyme est liée à
la membrane cytoplasmique de la cellule et tournée vers le périplasme (SparacinoWatkins et al., 2014). Cette enzyme est généralement associée à la respiration
anaérobie, bien que la validité de cette affirmation soit débattue. En effet, afin de
produire de l’énergie, un gradient de protons doit se créer entre le périplasme et le
cytoplasme. Le gradient électrochimique ainsi créé peut être exploité par les ATP
synthases afin de créer de l’ATP. Le complexe receveur d’électron (Nap) et le donneur
d’électron (e.g. formate déshydrogénase) se trouvant tous les deux dans le périplasme,
aucun gradient de protons n’est créé lors de la réduction du nitrate en nitrite car les
protons produits sont tout de suite consommés par réaction de réduction (Jepson et al.,
2007). Cependant, il a été montré qu’un tel gradient peut néanmoins se former si la
réduction du nitrate est couplée avec l’oxydation du formate (Kern et al., 2009). De
manière générale, de nombreuses bactéries utilisent le système Nap afin de faire la
respiration anaérobie du nitrate ou pour encourager la dénitrification. Nap a été isolée et
purifiée pour la première fois chez Paracoccus denitrificans en 1993 et par la suite dans
une grande variété de bactéries (Sears et al., 1993, Sparacino-Watkins et al., 2014).
Cette enzyme est constituée de trois sous-unités NapABC dont les gènes sont compris
dans un même opéron napABC (Richardson et al., 2001). NapAB forme le complexe
catalytique localisé dans le cytoplasme qui est associé avec NapC, protéine
transmembranaire ancrée dans la membrane cytoplasmique. NapA est la sous-unité
catalytique possédant un cluster [4Fe-4S] alors que NapB est un cytochrome c552 à
dihème faisant le transfert des électrons jusqu’à NapA (Breton et al., 1994). Des études
structurales de NapA ont montré des différences au niveau du cycle catalytique de
l’enzyme entre les bactéries Desulfovibrio desulfuricans et Rhodobacter capsulatus (Van
Spanning et al., 2005). Bien que cette différence puisse être due aux méthodes
différentes utilisées dans les deux études, il se peut qu’il existe différentes façons de
réaliser le cycle catalytique de l’enzyme, notamment au niveau de la coordination de
l’oxygène du Mo pendant le cycle catalytique. NapC s’ancre dans la membrane
cytoplasmique grâce à une hélice transmembranaire située en N-terminal avec quatre
hèmes de type c (Roldán et al., 1998). Son domaine périplasmique prend en charge le
transfert des électrons provenant du pool de quinols situé dans la membrane jusqu’au
18
complexe catalytique NapAB (Cartron et al., 2002). Les deux électrons nécessaires à la
réduction du nitrate en nitrite sont transférés par le biais des hèmes présents chez NapB
et du cluster [4Fe-4S] de NapA pour arriver au site catalytique avec bis-MGD de NapA,
catalysant la réaction de réduction.
Excepté Shewanella putrefaciens et Campylobacter jejuni, toutes les bactéries
possédant une nitrate réductase Nap ont en commun les gènes napABCD réunis dans
un opéron (Van Spanning et al., 2005). Ces deux bactéries ne possèdent pas de napC,
mais étant donné le rôle primordial joué par NapC, il a été avancé qu’une autre protéine
ayant des propriétés équivalentes et située autre part dans le génome devait être
utilisée par ces bactéries. NapD, qui est conservée dans tous les opérons nap, a un rôle
de chaperonne et participe à l’assemblage des différentes sous-unités (Potter et al.,
1999a). Par la suite, il est possible de retrouver différents gènes additionnels
(napKEFGH) compris dans l’opéron nap mais leurs positions et leurs apparitions
diffèrent selon les espèces (Van Spanning et al., 2005). De plus, ces protéines ne
semblent pas jouer de rôles essentiels dans la réduction du nitrate par Nap (Potter et al.,
1999a). Selon la combinaison des gènes présents dans l’opéron, on peut classer les
opérons nap dans trois catégories. Dans la première, napGH est présent mais napE est
absent. Les rôles sont inversés dans la deuxième catégorie où napGH est absent et
napE présent. Finalement la troisième catégorie est définie par l’absence de ces gènes
(Van Spanning et al., 2005). Quoi qu’il en soit, il semble qu’il y ait une corrélation entre
l’organisation de l’opéron et la physiologie de la bactérie et/ou même du devenir du
nitrite produit (Potter et al., 2001). Il a été avancé également que les gènes absents de
l’opéron nap pourraient être remplacés par des gènes situés autre part dans le génome
ayant une fonction similaire. La fonction de NapE et NapK reste inconnue à ce jour, ces
deux gènes codant pour des protéines membranaires en petites hélices simples. Peu
d’informations sont disponibles pour NapF et NapG également. NapF pourrait être
localisée dans le cytoplasme, contrairement à NapG, qui semble être destinée au
périplasme, car un signal de transport pour le périplasme est présent dans sa séquence.
NapH est ancrée à la membrane avec ses extrémités C et N faisant face au cytoplasme.
Elle possède les mêmes motifs que NapF et NapG sur son domaine C-terminal. Les
caractéristiques structurales de NapGH suggèreraient un rôle dans l’oxydation de
l’ubiquinol chez E. coli (Brondijk et al., 2002). Les centres métalliques du complexe
NapHGC fourniraient les deux électrons à NapAB grâce à l’oxydation de deux molécules
du pool de quinole UQH2 (ubiquinoles), ce qui a pour effet de transférer deux protons
19
A
B
C
Figure 2.1 : Représentation des différentes sous-unités de (A) la nitrate réductase assimilative, (B) la
nitrate réductase périplasmique et (C) la nitrate réductase membranaire.
Modifié de Gonzalez et al. (2006)
20
H+ du cytoplasme vers le périplasme (Gonzalez et al., 2006). De plus, le transfert
d’électrons entre NapG et NapC entrainerait également le transfert de deux protons du
cytoplasme vers le périplasme, pour un total de quatre protons transférés (Brondijk et
al., 2004). Ainsi la réduction d’une molécule de nitrate par Nap contribuerait quand
même à l’établissement du gradient de proton malgré les deux protons consommés par
Nap pour la réduction du nitrate. Une deuxième voie possible serait que le transfert
d’électrons vers NapAB ne serait pris en charge que par NapC chez les organismes ne
possédant ni NapG ni NapH. Cependant, les électrons fournis proviendraient du pool de
MQH2 (menaquinols) car Nap est incapable d’utiliser UQH2 (Brondijk et al., 2004). Dans
ce cas-ci, seuls deux protons sont transférés dans le périplasme et consommés pour la
réaction de réduction, ne produisant aucun gradient de protons. Les organismes
concernés utilisent alors la réduction du nitrate pour consommer des électrons et réduire
une potentielle accumulation dans le cytoplasme d’équivalents de réduction comme le
NADH et le FADH2 (Gonzalez et al., 2006).
2.4 La nitrate réductase membranaire
La nitrate réductase membranaire Nar est ancrée dans la membrane
cytoplasmique comme Nap, mais son site actif est tourné vers le cytoplasme (Figure
2.1.C). Nar est composée de trois sous-unités, NarGHI (Ballard et al., 1988). NarI est la
sous-unité γ transmembranaire, ancrée à la membrane avec son extrémité N-terminal
faisant face au périplasme. Sur cette partie se trouve le centre hème bl de faible
potentiel énergétique (Rothery et al., 1999). C’est par le centre hème bl que Nar reçoit
les électrons du pool de quinol présent dans la membrane, ce qui est caractéristique des
mécanismes de transfert d’électrons de la respiration. L’oxydation de la quinol dans le
site périplasmique de NarI entraîne le transfert de deux électrons de l’hème bl jusqu’à un
deuxième hème, bh, situé du côté cytoplasme de NarI et qui possède un haut potentiel
énergétique. Ces deux hèmes b forment un plan orthogonal à la membrane et sont
intégrés à NarI avec des résidus histidines (Berks et al., 1995). Pendant le transfert des
électrons, deux protons sont également libérés dans le périplasme, contribuant à la
création d’un gradient de protons au travers de la membrane et faisant de Nar une
enzyme électrogénique. NarG et NarH forment respectivement la sous-unité catalytique
α et la sous-unité β (Ballard et al., 1988). Le complexe NarGH se situe dans le
21
cytoplasme et est relié à NarI par l’extrémité C-terminal de NarH. Cette dernière
possède un centre fer-soufre [3Fe-4S] et trois centres [4Fe-4S] qui lui permettent de
faire le transfert des électrons donnés par NarI jusqu’à NarG, qui possède également
quatre domaines fer-soufre de type α-β. La sous-unité catalytique contient le cofacteur
molybdoptérine bis-MGD qui joue le rôle de centre catalytique, permettant le transfert
final des électrons vers le nitrate pour le réduire en nitrite. Le mécanisme de transfert
des deux électrons catalysé par le molybdène a été déduit des observations faites avec
Nap (Van Spanning et al., 2005). Il est suggéré que la structure du centre bis-MGD
fasse des cycles entre l’état mono-oxo Mo(IV) et des-oxo Mo(V) pendant la réaction.
Nar est codée par l’opéron narGHJI, commun et conservé dans la quasi-totalité
des espèces possédant cette enzyme. NarJ est une protéine chaperonne qui est
nécessaire au bon assemblage et à la maturation de Nar. E. coli possède deux nitrate
réductases membranaires Nar encodées dans les opérons narGHJI (NRA) et narZYWV
(NRZ) (Bonnefoy et al., 1994). Bien que de nombreuses espèces bactériennes
possèdent plusieurs nitrate réductases différentes (Paracoccus denitrificans, Alcaligenes
eutrophus, Klebsiella pneumoniae, etc), posséder deux copies de la même nitrate
réductase est un cas très particulier parmi les microorganismes. Les deux Nar présentes
chez E. coli ont une structure et des propriétés biochimiques très similaires mais
également une très haute homologie de séquences (Blasco et al., 1990). Les deux
enzymes sont en tous points similaires d’un point de vue réactionnel et utilise le même
substrat. Il est également possible d’obtenir une enzyme fonctionelle avec un opéron
formé de sous-unités provenant de NRA et de NRZ (Blasco et al., 1992). La différence
majeure entre NRA et NRZ se situe au niveau de l’expression de leurs gènes relatifs.
NRZ ne semble pas être régulée par les régulateurs communs des nitrate réductases
contrairement à NRA. Son expression semble se faire de manière constitutive et à un
niveau bien plus faible que NRA. Une explication possible serait que NRZ aiderait la
bactérie à s’adapter à des conditions anaérobies lors d’un passage d’un milieu avec
oxygène à un milieu sans oxygène.
D’autres gènes sont retrouvés très fréquemment autour des opérons nar ou
même inclus dans l’opéron. narXL est souvent présent chez les bactéries dénitrifiantes,
que ce soit en amont de narGHJI (E. coli, Pseudomonas spp.) ou en aval (Ralstonia
solanacearum) (Van Spanning et al., 2005). Ces gènes codent pour un système à deux
composants de détection du nitrate qui intervient dans la régulation de différents gènes
22
liés à la dénitrification. Des transporteurs de nitrate et nitrite, tel que narK, se retrouvent
également à proximité des opérons nar. Les transporteurs sont traités plus en détails
plus loin.
Malgré la catalyse de la même réaction, il existe des différences entre Nar et
Nap, découlant de leurs caractéristiques structurales et leurs localisations propres.
Théoriquement, les deux enzymes contribuent de la même manière à la création d’un
gradient de proton (quand cela est possible dans le cas de Nap). Pourtant, Nap est
considérée comme moins productrice d’ATP que Nar. Cependant, cette déficience
pourrait être compensée par la plus grande affinité de Nap pour le nitrate ainsi que par
la variété de sous-unités supplémentaires associées à Nap pouvant être présentes dans
le génome (Potter et al., 2001). E. coli possède une nitrate réductase périplasmique Nap
en plus de ses deux nitrate réductases membranaires (NRA et NRZ). Bien qu’ayant une
efficacité similaire, NRA (nitrate réductase considérée comme principale chez E. coli) et
Nap ont toutefois une affinité très différente pour le nitrate (Potter et al., 1999b). En effet,
la souche mutante n’exprimant que Nap possède un Ks (constante d’affinité) de 15 μM
contre 50 μM pour la souche n’exprimant que NRA. Il a été conclu que Nap était
principalement responsable de la réduction du nitrate dans les conditions de faibles
concentrations de nitrate alors que NRA est la nitrate réductase la plus rapide et efficace
quand le nitrate est présent en excès. Il existe également des différences au niveau du
substrat entre les deux enzymes. En effet, Nap est totalement spécifique au nitrate alors
que Nar peut réduire le nitrate mais également le chlorate et le bromate. Cette spécificité
pour son substrat moins grande de Nar fait que l’enzyme peut être inhibée par
compétition par les azotures alors que Nap y est insensible. Cette propriété démontre
les différences structurales entre les deux enzymes et pourraient être dues à la
présence d’une sérine chez Nar jouant le rôle de ligand à l’atome de molybdène alors
que Nap possède une cystéine (Potter et al., 2001).
23
2.5 Le transport du nitrate
Le nitrate et le nitrite se retrouvent sous forme ionisée dans les milieux aqueux et
possèdent donc une charge qui les empêche de traverser facilement les membranes
des cellules (Moir et al., 2001). Or, si la réduction du nitrite jusqu’en azote gazeux se
passe dans le périplasme, la réduction du nitrate en nitrite par la nitrate réductase
membranaire Nar ou la nitrate réductase assimilatrice Nas a lieu dans le cytoplasme.
Les bactéries assimilant le nitrate ou possédant un système Nar sont donc obligées de
transporter activement le nitrate à l’intérieur des cellules. De même, le nitrite produit par
la réduction du nitrate doit être activement relâché dans le périplasme où il pourra être
réduit. John (1977) a mis en évidence cette nécessité en montrant que la nitrate
réductase purifiée de E. coli et P. denitrificans réduisait le nitrate et le chlorate, alors que
des cultures de ces bactéries n’étaient capables de réduire que le nitrate, le chlorate
n’étant pas importé par la bactérie. Énergétiquement, l’import du nitrate dans la cellule
est défavorable car il doit se faire contre le gradient électrochimique de protons présent
dans la membrane bactérienne (Moir et al., 2001). Différents systèmes de transports du
nitrate se sont donc développés chez les bactéries, dépendamment du type de nitrate
réductase.
Chez les bactéries assimilatrices de nitrate, la dépense d’énergie pour le
transport du nitrate n’est pas un problème, car l’unique but de la réaction est
l’assimilation de l’azote dans l’organisme. Comme cité précédemment, NasFED est un
transporteur de type ABC utilisant l’ATP comme source d’énergie afin de transférer les
molécules de nitrate (et nitrite) à travers la membrane. Ce transporteur a été mis en
évidence chez Klebsiella oxytoca mais est également codé par l’opéron nrtABCD chez
Synechococcus sp. PCC7942 (Omata et al., 1993, Wu et al., 1998). Dans le périplasme,
le nitrate est pris en charge par NasF (ou NrtA), qui a une forte affinité pour le nitrate,
permettant son transport à travers le transporteur ABC. Cependant, ces sous-unités ne
sont pas nécessaires pour le passage du nitrate. Une grande concentration de nitrate
dans le milieu suffit pour permettre son transport par simple phénomène de diffusion.
Ces sous-unités ne deviennent essentielles que pour les faibles concentrations de
nitrate, grâce à leur haute affinité (Omata et al., 1993, Wu et al., 1998). nasE (ou nrtB)
code pour la partie membranaire de l’enzyme comportant les pores permettant au nitrate
et au nitrite de passer la membrane. Finalement, la partie liant l’ATP dans le cytoplasme
est constituée d’un homodimère de NasD ou d’un hétérodimère de NrtC et NrtD.
24
Pour leurs parts, les bactéries possédant un système Nar ne pourraient se
permettre une dépense énergétique dans le transport du nitrate (Figure 2.1.C). En effet,
le but de la respiration sur le nitrate étant la création d’énergie, une dépense d’énergie
rendrait le processus non optimal. Elles utilisent dans ce cas des transporteurs de type
antiporteur nitrate/nitrite qui ont un effet électroneutre sur la cellule en compensant
l’import d’une molécule de nitrate par l’export d’une molécule de nitrite (Rowe et al.,
1994). En plus de permettre le transport du nitrate, ce type de transporteur permet la
relocalisation du nitrite dans le périplasme afin qu’il soit subséquemment réduit pour la
dénitrification (ou l’assimilation chez certaines bactéries comme E. coli) ou afin de
réduire les concentrations cytoplasmiques de nitrite pouvant devenir toxiques pour la
cellule. Un autre type de transporteur de nitrate est le symporteur nitrate/H+ (Moir et al.,
2001). Un proton est transporté du périplasme au cytoplasme en même temps qu’une
molécule de nitrate, ce qui permet de conserver une charge globale neutre. L’existence
de ces deux types de transporteurs de nitrate a été mise en évidence chez Paracoccus
denitrificans, mettant également en avant leurs utilités propres au sein d’un même
organisme (Boogerd et al., 1983). Le symporteur n’ayant pas besoin de la présence de
nitrite pour fonctionner, il joue le rôle d’initiateur du transport dans la mise en place de la
réduction du nitrate. Dès que du nitrite est produit, l’antiporteur peut prendre le relais ou
compléter l’action du symporteur. Cependant, ce fonctionnement a été remis en cause
avec la découverte d’un transporteur fusionné, montrant qu’un symporteur n’est pas
nécessaire au démarrage de l’import du nitrate et que chaque transporteur peut changer
son mode de fonctionnement en fonction des conditions environnantes (Goddard et al.,
2008).
Les transporteurs de nitrate cités précédemment appartiennent à la famille des
NarK, protéines membres des transporteurs transmembranaires de type MFS et plus
précisément le cluster 6 de cette famille (Major Facilitator Superfamily). Deux sous-types
de NarK existent également, le type I et le type II (Moir et al., 2001). Ces deux types se
différencient par leurs affiliations phylogénétiques, formant deux groupes distincts.
L’hypothèse avancée est que le type I serait responsable de l’absorption du nitrate alors
que le type II se chargerait de l’extrusion du nitrite. Plusieurs NarK peuvent être
retrouvés chez les bactéries et de nombreux homologues existent. De plus, au moins un
gène narK est systématiquement retrouvé en amont de l’opéron narGHJI chez toutes les
bactéries dénitrifiantes étudiées jusqu’à présent. Chez Paracoccus denitrificans, un
transporteur est exprimé comme la fusion de 2 transporteurs différents NarK1 et NarK2
25
(Goddard et al., 2008). NarK1 apparaît comme un symporteur nitrate/H+ alors que
NarK2 serait plutôt un antiporteur nitrate/nitrite. Bien que fusionnée, les deux parties
semblent être indépendantes l’une de l’autre, fonctionnant séparément et ayant des
affinités pour le nitrate spécifiques à chacune. Cette fusion pourrait faciliter la régulation
et l’activité de chaque type de transport.
On ne connait pas précisément la structure ni le mode de fonctionnement des
transporteurs NarK. Ils sont majoritairement constitués d’hélices transmembranaires,
douze au total dont deux apparaissant comme moins hydrophobes que les autres du fait
de résidus arginines présent dans leur structure (Moir et al., 2001). Ces deux résidus
arginine sont très conservés chez toutes les protéines du cluster 6 des MFS, qui inclut
les NarK et les transporteurs de nitrate des plantes et champignons. Plusieurs autres
acides aminés sont conservés dans cette structure et les prédictions indiquent que les
extrémités C- et N-terminal du transporteur se trouveraient dans le cytoplasme. E. coli,
une des bactéries les plus étudiées pour le transport du nitrate, possède deux gènes
codant pour des transporteurs de nitrate, narK et narU codant pour un homologue (Jia et
al., 2005). Ces deux protéines partagent 76% d’identité et sont toutes les deux capables
de transporter le nitrate et le nitrite. La structure complète et un mode de fonctionnement
de NarU furent proposés récemment (Yan et al., 2013). Le transporteur suivrait le
modèle « rocker-switch » (Law et al., 2008) suivant lequel un accès alterné au
périplasme et au cytoplasme est opéré par une rotation du domaine N-terminal par
rapport au domaine C-terminal. Ce mouvement permettrait l’ouverture progressive d’un
canal transportant le nitrate après que celui-ci se soit spécifiquement lié au transporteur.
Le même type de mécanisme a été mis en évidence pour NarK (Fukuda et al., 2015).
2.6 Le système de régulation des nitrate réductases
La réduction du nitrate est une réaction secondaire, un mode de respiration
alternatif généralement utilisé par les bactéries seulement quand cela est nécessaire,
c’est-à-dire quand il n’y a pas ou peu d’oxygène dans le milieu et présence de nitrate.
Les bactéries sont donc obligées de réguler leurs systèmes de réduction du nitrate afin
de maximiser l’énergie produite par la respiration. L’oxygène et les oxydes d’azote
apparaissent très logiquement comme les régulateurs majoritaires de ce système. Le
26
système de régulation des nitrate réductases le plus étudié et connu reste celui d‘E. coli.
C’est donc celui-ci qui sera présenté majoritairement dans ce texte. D’autres bactéries
ont aussi été très étudiées pour leurs système de régulation des nitrate réductases, telle
que Pseudomonas aeruginosa (Schreiber et al., 2007) (Figure 2.2).
La détection du nitrate par la bactérie se fait à l’aide d’un système à deux
composantes. Les systèmes à deux composants sont souvent présents chez les
bactéries dans le but de répondre à des facteurs environnementaux. Chez E. coli, ce
système à deux composantes est représenté par NarXL ainsi que NarQP, homologue de
NarXL (Rabin et al., 1993, Stewart et al., 1989). NarX et NarQ jouent le rôle de détecteur
de nitrate et nitrite alors que NarL et NarP possèdent le rôle de régulateur. Cependant,
ces systèmes ne régulent pas les mêmes gènes. Certains gènes répondent à NarL et
d’autres à NarL et NarP. D’une manière générale, ces systèmes régulent positivement
les opérons narGHJI, les différents narK et l’opéron fdnGHI (formate dehydrogenase-N)
mais répriment les opérons frdABCD (fumarate reductase) et dmsABC (trimethylamine
N-oxide reductase) et le gène adhE (alcohol dehydrogenase) (Zumft, 1997). NarX (ou
NarQ) est une protéine transmembranaire avec un domaine périplasmique conservé qui
reconnaît la molécule de nitrate (S. B. Williams et al., 1997). Au repos, NarX est dans
une conformation empêchant l’activité autokinase ainsi que le transfert phosphorylé vers
l’Asp59 de NarL. En présence de nitrate, NarX adopte une conformation différente et
permet l’activité autokinase et la phosphorylation de NarL. C’est cet état phosphorylé de
NarL qui permet l’activation de gènes sous le contrôle de NarXL. La façon dont le nitrate
se lie à NarX n’est toujours pas connue. Grâce à l’étude d’autres protéines liant le
nitrate, notamment l’hémocyanine de Limulus polyphemus et la tyrosine phosphatase de
Yersinia enterocolotica, il est supposé que le nitrate se lie aux atomes d’oxygène d’un
résidu arginine de NarX par des ponts hydrogène (Fauman et al., 1996, Hazes et al.,
1996). D’autres ponts hydrogènes pourraient partir d’un oxygène du nitrate pour se lier à
un autre résidu du détecteur NarX. Ce modèle suggérerait que les liaisons hydrogènes
entre NarX et la molécule de nitrate puissent se faire sans avoir recours à un métal de
transition dans NarX. NarL est composé de deux domaines respectifs, un domaine
receveur permettant de faire le lien avec NarX et un domaine se liant à l’ADN afin
d’activer la transcription (Baikalov et al., 1996). Le premier domaine se situe en Nterminal et sa structure est très similaire au domaine correspondant au régulateur de
chimiotaxie CheY et de NtrC, un régulateur de l’azote. Ce domaine comporte le résidu
Asp59 permettant le transfert du groupement phosphoryle provenant de NarX et le
27
changement de la conformation de la protéine. Non phosphorylée, NarL possède une
conformation présentant un repliement de son domaine liant l’ADN situé en C-terminal,
qui est inactif et ne peut se lier à l’ADN. Ce n'est que lors de la phosphorylation de la
protéine que ce domaine devient accessible et permet à NarL de se lier à sa séquence
cible d’ADN. Cette séquence se compose en heptamère, c’est-à-dire l’enchaînement
précis de sept acides nucléiques différents. Chez E. coli, cette séquence est définie par
T-A-C-Y-N-M-T avec Y pouvant être un C ou un T, M un A ou un C et N n’importe quel
nucléotide (Tyson et al., 1994). Cette séquence peut légèrement varier mais est plutôt
bien conservée parmi les différentes espèces dénitrifiantes. Ces séquences en
heptamère sont situées en amont de plusieurs gènes liés à la dénitrification autre que
les nitrate réductases (Zumft, 1997). Ces séquences ne semblent toutefois pas actives.
De manière générale, les séquences de liaison NarL se retrouvent en plusieurs copies,
dans le même sens ou antisens. L’espace qui les sépare peut également être plus ou
moins grand selon le gène et l’espèce. En amont du narG de E. coli, on peut retrouver
un groupe de cinq heptamères et un groupe de trois heptamères à différentes positions.
On y retrouve également un site de liaison d’un autre type de régulateur, les FNR.
Les protéines de la famille des FNR (Fumarate Nitrate reduction Regulator) sont
des régulateurs et détecteurs d’oxygène (Mazoch et al., 2002). Ils sont utilisés par les
bactéries qui sont amenées à passer de milieux riches en oxygène à des milieux
pauvres en oxygène, en activant de nombreux gènes et en en désactivant d’autres. Les
nitrate réductases sont donc logiquement régulées par ce type de régulateurs. Ceux-ci
furent également découverts et étudiés chez E. coli puis retrouvés dans la majorité des
espèces dénitrifiantes par la suite, appartenant pour la plupart à l’embranchement des
protéobactéries (Mazoch et al., 2002). Sa structure est proche de celle de CRP, protéine
réceptrice de cAMP qui joue le rôle d’activateur catabolique. Le site de fixation des FNR
est une séquence palindromique TTGAT-N4-ATCAA, généralement située entre la
position -40 et -50 (-41.5 chez narGHJI de E. coli) en amont du site de démarrage de la
transcription. Des distances plus grandes sont toutefois possibles avec des
réarrangements topologiques de l’ARN polymérase et de la protéine FNR (Wing et al.,
1995). Ce motif est communément appelé « FNR box ». Selon la localisation de ce
motif, les protéines FNR peuvent agir en tant qu’activateur ou de répresseur. Ces
régulateurs présentent des variations dans leurs fonctions et leurs structures et sont
groupés dans différentes classes (Guest et al., 1996). La protéine prototype est le FNR
de E .coli car elle fut découverte en premier. Il forme le premier groupe avec d’autres
28
protéines telles que FnrA, FnrL et FnrP. Ce premier groupe est divisé en 2 classes, IA et
IB, en fonctions de l’espacement entre les cystéines retrouvées en N-terminal. Un
deuxième groupe (classe IC) représenté par la protéine FixK de Bacillus subtilis est
formé des FNR ne possédant pas de cluster cystéine en C-terminal (Ramos et al.,
1995). P. aeruginosa possède un homologue (51% d’homologie) à la protéine FNR de
E. coli nommée ANR (Sawers, 1991). Elle fut nommée ainsi car elle possède un rôle
dans le catabolisme de l’arginine en plus de la réduction du nitrate et qu’aucune
respiration sur le fumarate n’est possible chez P. aeruginosa. De plus, ANR contrôle
toute les étapes de la dénitrification et semble même être un régulateur global du
métabolisme anaérobie de P. aeruginosa (Ye et al., 1995). La découverte de plusieurs
homologues de FNR et ANR dans diverses pseudomonades et autres espèces
dénitrifiantes suggèrent que la régulation des processus anaérobiques est plus
complexe et ne dépend pas d’un régulateur de type FNR (Zumft, 1997).
On retrouve également des motifs de liaisons NarL et FNR en amont des gènes
narK codant pour les transporteurs de nitrate (Moir et al., 2001). Chez E. coli, il y a un
site de liaison NarL et un site de liaison FNR dans la région promotrice de narK. Zumft
(1997) met également en avant la régulation potentielle des nitrate réductases par
différents métaux tels que le fer (Fe) et le molybdène (Mo). En effet, lorsque le milieu
devient anaérobie, les bactéries ont besoin de synthétiser un grand nombre d’enzymes
dont les nitrate réductases et des cytochromes transférant les électrons. Tel que vu
précédemment, ces enzymes sont riches en fer du fait de la présence de nombreux
hèmes [4Fe-4S] ou [3Fe-4S] et d’un centre catalytique constitué autour d’un atome de
molybdène. ModE est une protéine détectant le molybdène dans le milieu et un
répresseur connu de l’opéron modABCD codant pour un transporteur du molybdène
dans la cellule. Il a été démontré que ModE est également un élément essentiel à la
transcription de l’opéron nar de E. coli (Self et al., 1999). Cette protéine agirait sur la
régulation en venant se lier à une région intergénique narXL-narK. Finalement, un
élément supplémentaire est également nécessaire pour réguler l’activité de nar, il s’agit
de IHF (Integration Host Factor) (Rabin et al., 1992). Cet élément, qui a également été
décrit chez P. aeruginosa (Schreiber et al., 2007), reconnaît une séquence se situant
entre les motifs de liaison en heptamère de NarL et permet un repliement de l’ADN à cet
endroit. Ce repliement a pour conséquences de mettre en contact NarL, le facteur de
transcription FNR et la polymérase afin de permettre la transcription (Zhang et al.,
1996).
29
Figure 2.2 : schémas du système de régulation des gènes associés à la dénitrification chez plusieurs
espèces bactériennes différentes.
Tiré de Spiro (2012).
30
3. LA RÉDUCTION DU NITRITE EN N2
3.1 La réduction du nitrite
Il existe deux types de nitrite réductases intervenant dans la dénitrification : le
cytochrome cd1 constitué de tetrahèmes et codé par le gène nirS, et CuNIR possédant
un atome de cuivre comme dans son centre catalytique et codé par le gène nirK
(Castiglione et al., 2012, Zumft, 1997). Le cytochrome cd1 se retrouve dans les trois
quarts des espèces bactériennes réduisant le nitrite et notamment chez les
pseudomonades (Bothe et al., 2006). On retrouve ces deux nitrite réductases chez
toutes les sous-classes des protéobactéries, sans aucune exclusivité d’un type de nitrite
réductase pour une sous-classe particulière (Zumft, 1992). Bien que les deux types de
nitrite réductases ne sont jamais retrouvés ensemble dans la même espèce bactérienne,
il est possible d’interchanger un type de nitrite réductase pour l’autre. En effet, chez une
Pseudomonas stutzeri ne possédant plus son cytochrome cd1 d’origine, l’activité de
dénitrification a été rétablie en introduisant un nirK (CuNIR) de P. aureofaciens
(Glockner et al., 1993).
Les centres cuivre Cu(II) des CuNIR sont classées dans trois groupes différents
selon leurs propriétés optiques et leurs propriétés de résonnance paramagnétiques
d’électrons (EPR) : le type 1 (bleu), le type 2 (non bleu) et le type 3 (binucléaire et EPRinactif) (Malkin et al., 1970). Les nombreuses CuNIR isolées de différentes espèces
bactériennes présentent de nombreuses différences dans leurs propriétés d’absorbance,
leurs masses moléculaires ou encore leurs activités catalytiques. Malgré cette apparente
hétérogénéité, les structures aux rayons X confirment l’appartenance à la même famille
de toutes ces enzymes. Ces structures ont également démontré que CuNIR est une
enzyme trimèrique (Grossmann et al., 1993). La structure tridimensionnelle de CuNIR fut
résolue pour la première fois chez Achromobacter cycloclastes, montrant l’association
de 3 sous-unités associées autour d’un axe et formant un canal central (Adman et al.,
1995). In vitro, CuNIR transforme le nitrite en NO en utilisant le phenazine methosulfate
plus ascorbate (PMS-asc) comme donneur d’électron. Elle peut également former de
l’ammoniaque et du N2O lors de cette réaction. Certaines CuNIR sont également
capables de former du N2O en associant une molécule de nitrite et d’hydroxylamine et
certaines CuNIR sont même capables de réduire l’O2 (Zumft, 1997). Au niveau de la
31
structure, ce sont les centres cuivres de type 2 qui ont le rôle et la capacité de lier le
substrat dans la réaction de réduction. Afin de réaliser cela, une molécule d’eau est
déplacée du centre cuivre de type 2 et la molécule de nitrite peut alors entrer et se lier à
l’atome de Cu à l’aide de ses atomes d’oxygène (Howes et al., 1994). Les centres cuivre
de type 1, quant à eux, ont pour rôle d’accepter les électrons entrant dans l’enzyme et
de les transférer aux Cu de type 2 (Suzuki et al., 1994). Les donneurs d’électrons
principaux des CuNIR sont l’azurine et la pseudoazurine. Les cytochromes ne semblent
pas être impliqués fréquemment dans cette réaction. Le potentiel redox de ces enzymes
va dépendre de leurs compositions en centres cuivre de type 1 et de type 2. Pour
Achromobacter xylosoxidans, il est de +260 mV à pH 7.2 (Masuko et al., 1984).
Le cytochrome cd1 le plus connu et majoritairement étudié est celui de P.
aeruginosa (Horio et al., 1961). Il fut initialement décrit comme un cytochrome oxydase
et c’est une des enzymes liée à la dénitrification les plus étudiées dans le monde. Le
cytochrome cd1 peut également réduire l’oxygène afin de permettre la respiration chez
Roseobacter denitrificans (Bothe et al., 2006). Toutefois, la réaction est 100 fois plus
lente que la réduction du nitrite. L’enzyme est un homodimère dont les sous-unités sont
constituées de deux hèmes, C et D1, faisant du cytochrome cd1 un tétrahème. La
structure du cristal du cytochrome cd1 d’une Paracoccus sp. révéla une formation en
hélice α du domaine de l’hème C alors que le domaine de l’hème D1 adopte une
structure en hélice β (Fülöp et al., 1995). Le degré de conservation de NirS est élevé
chez les différents genres bactériens le possédant, regroupant toutes ces protéines
dans une famille unique (Zumft, 1997). Le potentiel redox du cytochrome cd1 varie d’une
espèce à une autre et est dépendant des interactions entre les hèmes C et D1 (Silvestrini
et al., 1992). Il est de +290 mV chez P. aeruginosa. Les donneurs d’électrons de cette
enzyme sont spécifiquement l’azurine et le cytochrome c551, ce dernier étant un meilleur
donneur d’électrons que l’azurine (Silvestrini et al., 1982). Comme pour CuNIR, du N2O
peut être formé par l’activité du cytochrome cd1 en bien moindre quantité que le NO et
pourrait être causé par la dimèrisation d’un nitroxyl (Garber et al., 1982). Le cytochrome
cd1 peut également entraîner la nitrosation de l’hydroxylamine, de l’azide et des amines
(Zumft, 1997). La synthèse de cette enzyme est fortement régulée en amont par la
régulation de gènes codant pour la synthèse de ses différents constituants (hemA,
hemN, nirSMCFDLGHEN) avec des combinaisons variantes selon l’espèce. Cependant,
de manière générale, les régulateurs intervenant dans la régulation du cytochrome cd1
et de CuNIR sont ANR/FNR et NarL.
32
Il existe d’autres nitrite réductases, qui ne s’incluent pas dans le mécanisme de
dénitrification car elles sont responsables de la réduction du nitrite en ammonium
(Castiglione et al., 2012). Elles sont également divisées en deux catégories : la nitrite
réductase à multihème NrfA et la nitrite réductase à NAD(P)H NirBD. Seule la première
enzyme est dite dissimilatoire, car elle contribue à la création d’un gradient de protons,
et donc à la création d’énergie (Stewart, 1993). NrfA, aussi désignée par cytochrome
c552, est un cytochrome à pentahèmes présent dans le périplasme chez E. coli. Elle est
codée par un opéron comprenant sept gènes, nrfABCDEFG, dont seul nrfA code pour
l’enzyme (Hussain et al., 1994). Toutefois, l’organisation des gènes ainsi que la
composition de l’opéron peut varier selon l’espèce (Einsle, 2011). Les gènes autres que
nrfA sont indispensables pour l’activité de l’enzyme et ont un rôle dans le transfert des
électrons jusqu’à NrfA ou dans la synthèse de cytochromes requis pour la réaction de
réduction. Certaines bactéries possèdent le gène nrfH inclus dans l’opéron
nrfABCDEFG, également impliqué dans le transfert d’électrons jusqu’à NrfA (Einsle et
al., 2000). Le donneur d’électrons le plus probable est le formate et dans de
nombreuses entérobactéries, cette enzyme est liée au pool de ménaquinole (Einsle,
2011). L’enzyme est également capable de réduire le NO, le N2O et les hydroxylamines
mais surtout les sulfites, créant ainsi un lien entre le cycle de l’azote et celui du soufre.
NrfA forme un homodimère, les hèmes parallèles et perpendiculaires de chaque unité se
retrouvant proches les uns des autres et paquetés ensemble (Bamford et al., 2002). De
par sa localisation et son fonctionnement, le principal rôle attribué à NrfA est la
production d’énergie. Cependant, elle pourrait également jouer un rôle dans
l’assimilation de l’azote par la cellule, l’ammonium pouvant être importé dans le
cytoplasme pour être assimilé (Cole, 1982). Des rôles dans la détoxification et la
réduction des sulfites ont également été envisagés. Pour NirBD, la détoxification et
l’assimilation de l’azote sont les rôles qui lui sont principalement attribués. En effet, c’est
une enzyme cytoplasmique utilisant le NADH comme donneur d’électrons afin de réduire
le nitrite en ammonium, ne générant aucun gradient énergétique de protons (Cole,
1978). Il est aussi possible qu’elle soit utilisée afin de régénérer le pool de NAD+ dans la
cellule. L’enzyme est composée de deux polypeptides : une grande sous-unité
catalytique codée par nirB et une petite sous-unité codée par nirC (Bothe et al., 2006).
Ces deux nitrite réductases ne sont synthétisées que dans les cellules ayant poussé en
absence d’oxygène car sous le contrôle des régulateurs FNR. Le nitrite est aussi un
activateur de la transcription de NrfA (Page et al., 1990). Le rôle de NirBD étant
33
principalement de détoxifier le nitrite issu de la réduction du nitrate, généralement par
Nar, elle se doit d’être active en même temps et sa transcription est aussi activée par la
présence de nitrate par le biais du régulateur NarL chez les entérobactéries. Quand il
est produit dans le cytoplasme et non réduit en ammonium, le nitrite est exporté dans le
périplasme grâce aux antiporteurs nitrate/nitrite tels que décrits plus haut. Mais il est
possible que la bactérie ait besoin d’importer le nitrite dans le cytoplasme afin de le
réduire en ammonium pour l’assimilation (Moir et al., 2001). Chez E .coli, le nitrite est
importé dans la cellule via la protéine NirC, un transporteur bidirectionnel spécifique au
nitrite.
Figure 3.1 : Schéma du processus de dénitrifiation complet de Paracoccus denitrificans. Les lignes en
pointillés représentent le mouvement des oxydes d’azotes. Les lignes pleines représentent le mouvement
des électrons. SDH, succinate dehydrogenase; NDH, NADH dehydrogenase; Q, quinone; bc1, cytochrome
bc1 complex; c550, cytochrome c; paz, pseudoazurin; NAR, membrane-bound nitrate reductase; NAP,
periplasmic nitrate reductase; NIR, cd1-type nitrite reductase; NOR, bc-type NO reductase; NOS, nitrous
oxide reductase.
Tiré de Van Spanning et al. (2005).
34
3.2 La réduction du NO
La réduction du NO est une étape particulière de la dénitrification car c’est celleci qui conduit à la formation de la liaison N-N. Cette liaison se forme à un certain
moment lors de la réaction de réduction du NO en N2O (Tavares et al., 2006). L’enzyme
responsable de cette réaction est l’oxyde nitrique réductase NOR. Malheureusement,
aucune structure 3D n’est connue de cette enzyme et les données structurales
existantes du site actif sont surtout des données spectroscopiques. Il existe trois
différentes classes de NOR dont le site actif possède une forte homologie entre ces
classes. La majeure différence provient du donneur d’électrons qui diffère entre les
classes : cNOR (cytochrome c), qNOR et qCuNOR (quinol). Une autre différentiation est
également possible en fonction de la longueur de la chaîne d’acides aminés, cela
regroupe les différents NORs de la même façon que précédemment. Celle-ci sépare les
oxydes nitriques réductases en deux groupes, celui à chaîne courte scNOR (environ 450
acides aminés) et celui à chaîne longue lcNOR (environ 760 acides aminés) (Zumft,
2005). Les oxydes nitrique réductases ne génèrent pas de gradient de protons au
travers de la membrane car elles utilisent exclusivement les protons présent dans le
périplasme pour la réaction de réduction du NO (Hendriks et al., 2002). Une voie de
transfert des protons jusqu’au centre catalytique doit donc exister et des études mettent
en avant certains résidus qui pourraient être impliqués dans cette fonction (Flock et al.,
2006).
cNOR n’a été retrouvée que dans peu de bactéries dénitrifiantes à ce jour, parmi
lesquelles on retrouve Parococcus denitrificans, P. aeruginosa ou encore Pseudomonas
stutzeri (Heiss et al., 1989, Hoglen et al., 1989, Kumita et al., 2004). L’enzyme est
composée de deux sous-unités : NorB qui est la sous-unité catalytique située dans la
membrane cytoplasmique et qui contient deux hèmes de type b ainsi qu’un atome de fer
non-hème et NorC qui est une sous-unité ancrée dans la membrane cytoplasmique avec
une partie dans le périplasme et contenant un hème de type c. Cet hème de type c est
responsable du transfert d’électrons provenant du cytochrome c jusqu’à NorB (Tavares
et al., 2006). cNOr est codé par deux gènes compris dans un même opéron, norB et
norC. D’autres gènes sont souvent trouvés en cluster autour de norCB et l’organisation
ainsi que la présence de ces gènes diffèrent selon les espèces (Zumft, 2005). Le cluster
le plus souvent retrouvé est norEFCBQD, qui est l’organisation que l’on retrouve chez
les espèces de Pseudomonas (Bedzyk et al., 1999). Cette organisation respecte
35
néanmoins certaines règles : norQ et norD sont toujours présents avec norCB, norD se
retrouvant en aval de norCB et norQ s’intercalant souvent entre norB et norD. La
position de norE et norF est variable et ces gènes sont parfois absents. Les rôles des
protéines codées par ces gènes auxiliaires sont variables; ils peuvent affecter
l’expression et la fonction de norCB ainsi que la réduction du NO et la croissance de la
bactérie (Zumft, 2005).
La structure primaire de qNOR est très similaire à celle de cNOR, mais l’enzyme
se présente sous la forme d’une seule sous-unité, dont les donneurs d’électrons sont les
quinols (Cramm et al., 1999). La grande particularité de cette enzyme est qu’elle n’est
exprimée qu’en absence des autres enzymes liées à la dénitrification, excepté chez
Ralstonia eutropha (Householder et al., 2000). La sous-unité qNOR est composée d’une
partie N-terminale très similaire à la sous-unité NorC alors que sa partie C-terminale
présente des similarités avec NorB. Il a alors été proposé que qNOR soit composée de
la fusion des sous-unités NorB et NorC et ait perdu son centre hème c au profit d’un site
de fixation des quinols (Tavares et al., 2006). qNOR est codé par un seul gène, norZ,
pouvant également être nommé norB chez certains organismes (Zumft, 2005). Aucun
gène auxiliaire particulier n’est retrouvé avec lui à l’inverse de norCB. qCuNOR est une
enzyme exclusive à Bacillus azotoformans qui est formée de deux sous-unités. Elle
possède une sous-unité similaire à NorB, alors que la seconde sous-unité ne possède
pas de centre hème c mais un site cuivre A afin de faire le transfert d’électrons. Ces
électrons proviennent du menaquinol et aussi du cytochrome c551, bien qu’avec quatre
fois moins d’activité qu’avec les menaquinols (Suharti et al., 2004). De ce fait, les
menaquinols sont potentiellement utilisés pour la détoxification du NO.
La réduction de l’oxyde nitrique est une partie intégrante de la dénitrification et
est donc régulée de manière identique, en absence d’oxygène et en présence d’oxydes
d’azote. C’est naturellement le NO qui présente la plus forte régulation des oxydes
nitriques réductases et est même vu comme la molécule signal centrale de l’expression
de tout l’appareil de dénitrification du nitrite, c’est-à-dire de la réduction du nitrite et du
NO (Palmedo et al., 1995, Zumft, 2005, Zumft et al., 1994). NOR n’est pas exprimé en
présence d’oxygène et l’enzyme est donc purifiée à partir de cultures en conditions
anaérobies ou avec une faible concentration d’oxygène. Ce constat est néanmoins
remis en question depuis quelques années car les études mettent en avant de plus en
plus d’espèces aérobies capables de faire la dénitrification telles que Klebsiella
36
pneunomae, Pseudomonas stutzeri ou encore Alcaligenes faecalis (Joo et al., 2005, Pal
et al., 2015, J‐J. Su et al., 2001). Chez ces espèces, une régulation particulière de la
dénitrification a du se mettre en place afin de rendre la dénitrification aérobie possible.
L’expression anaérobie des gènes nor est régulée par des régulateurs de type Crp-FNR,
comme c’est le cas pour les nitrate réductases ainsi que les nitrite réductases. En effet,
des motifs de reconnaissance de ces régulateurs sont présents dans le promoteur nor.
Des régulateurs homologues au Crp-FNR jouent également un rôle dans la régulation
des gènes nor; il s’agit de Dnr, DnrD, NnrR ou Nnr (le nom changeant selon qu’il soit lié
à la régulation du nitrite, l’oxyde nitrique ou la dénitrification). Bien qu’ils soient
homologues aux Crp-Fnr, ils ne possèdent pas de cluster Fe-S servant à la détection de
l’oxygène et à l’activation de la transcription (Zumft, 2005). Ces régulateurs sont
sensibles aux concentrations en NO et activent l’expression des gènes régulés en
présence de NO dans le milieu. La façon dont le NO agit sur ces régulateurs afin qu’ils
puissent activer la transcription est inconnue à ce jour. Dnr et NnrR sont également très
importants pour la régulation et la formation de tout l’appareil de dénitrification du nitrite;
chez Rhodobacter sphaeroides, NnrR régule l’expression de norC et de nirK en
présence de NO et est nécessaire pour établir la voie de respiration du nitrite (Tosques
et al., 1996). Finalement, la présence de motifs palindromiques dans le promoteur des
gènes dnr et nnrR similaires à la Fnr box de E. coli suggère une autorégulation de ces
gènes mais également, dans certains cas, un contrôle hiérarchique des régulateurs.
D’autres enzymes ont été identifiées comme capables de réduire le NO en N2O
mais n’entrent pas dans la dénitrification car leur rôle est plus axé sur la détoxification et
elles ne produisent généralement pas d’énergie pour la bactérie (Poole, 2005). En effet,
le NO se révèle être un des oxydes d’azote les plus toxiques pour les cellules vivantes
de manière générale et donc une des molécules signal les plus fortes dans les systèmes
biologiques (Furchgott, 1999). Le NO a pour effet d’inhiber des enzymes clés telles que
des oxydases et autres enzymes à hèmes liant l’oxygène mais également les enzymes
possédant des centres Fe-S. Le NO peut également réagir avec des anions
superoxydes et générer du peroxynitrite, une molécule possédant des effets encore plus
toxiques que le NO. La nitrosation, création de composés dérivés nitroso- à partir de
molécules organiques, est aussi un des effets toxiques possibles d’une trop forte
concentration de NO dans le milieu. Les organismes ont donc naturellement élaboré des
mécanismes de défense contre le stress nitrosatif et notamment des enzymes réduisant
le NO en N2O afin de maintenir une concentration faible de NO dans le milieu. Poole
37
(2005) dresse une liste non exhaustive de ces enzymes; les deux principales étant la
flavohémoglobine (Hmp) et la flavorubredoxine étudiées principalement chez E. coli.
Cette dernière est une homologue à FrpA se révélant être une enzyme flavo-diiron, et
son rôle protecteur contre le stress nitrosatif a été démontré (Silaghi-Dumitrescu et al.,
2005). Chez Nitrosomonas europaea, le cytochrome c554 s’est révélé posséder des
capacités de détoxification du NO en apportant une réduction lente mais régulière du
NO dans la cellule (Upadhyay et al., 2006). Cette enzyme monomèrique se trouve dans
le périplasme et possède 4 hèmes de type c impliqués dans le transfert des électrons et
permettant la réaction catalytique. Une oxyde nitrite réductase appelé P450nor est
présente chez le champignon Fusarium oxysporum et a également été caractérisée
comme protectrice contre le stress nitrosatif (Daiber et al., 2005). Afin de réaliser la
réduction du NO, l’enzyme utilise directement le NADH présent dans le cytoplasme de la
cellule. En plus de son effet protecteur contre le NO, P450nor aurait également un effet
de protection contre le peroxynitrite.
3.3 La réduction du N2O
Le N2O, oxyde nitreux, est réduit en N2 grâce à l’oxyde nitreux réductase N2OR,
une protéine possédant plusieurs atomes de cuivre dans sa structure (Tavares et al.,
2006). La réduction du N2O n’est pas obligatoirement couplée à la dénitrification et
plusieurs espèces non dénitrifiantes sont connues pour réduire le N2O. La réaction de
réduction du N2O est très exergonique avec un ΔG0’ = -340 kJ.mol-1 du fait de la stabilité
de l’azote gazeux N2. Ainsi, de nombreuses espèces bactériennes sont capables de
croître avec du N2O comme seule source d’énergie. Le processus de réduction du N2O
implique le cytochrome bc1, participant au transfert d’électrons et transférant dans le
même temps des protons au travers de la membrane cytoplasmique (Zumft, 1997). De
manière fortuite, il fut découvert que l’acétylène était un inhibiteur de la réaction de
réduction du N2O (Fedorova et al., 1973). L’acétylène est alors devenu un outil
indispensable dans les études en cultures pures sur le N2O et afin de déterminer le
potentiel de dénitrification des sols. Le mécanisme d’inhibition n’est pas connu à ce jour,
mais on sait qu’il est réversible et non compétitif, et que l’acétylène peut également
inhiber d’autres métalloenzymes (Hyman et al., 1988).
38
Les N2ORs sont des enzymes homodimèriques périplasmiques dont chaque
sous-unité contient un centre cuivre binucléaire CuA et un centre cuivre multinucléaire
CuZ (Einsle et al., 2004). Cela permet à N2OR de conserver l’énergie lors de la réduction,
malgré son caractère soluble. Le centre CuA est similaire à celui retrouvé chez les
cytochromes c oxidases et aurait un rôle dans le transfert des électrons
intramoléculaires. Le centre CuZ est, quant à lui, le centre catalytique de la réaction de
réduction. Les structures tridimensionnelles de N2OR ont montré que la protéine
possédait une large surface de dimérisation entre ses deux sous-unités, qui se retrouve
en position de tête à queue (Brown et al., 2000, Coyle et al., 1985). Cette position
particulière a pour conséquence un fort rapprochement entre le CuA d’un monomère
avec le CuZ de l’autre, permettant le transfert d’électrons du donneur (cytochrome c
monohème ou pseudoazurine) jusqu’à CuZ en passant par CuA (Tavares et al., 2006). Il
est cependant difficile de définir précisément les donneurs d’électrons en jeu car des
voies parallèles de transfert d’électrons peuvent se mettre en place, et certaines fois des
donneurs d’électrons alternatifs peuvent apparaitre, ce qui a pour conséquence que la
réductase ne reçoit pas ses électrons d’un complexe lié à la respiration mais d’un
intermédiaire (Maťchová et al., 1991).
N2OR est encodé par le gène nosZ (Zumft, 1997). Ce gène fait partie d’un cluster
de gènes retrouvés avec nosZ chez toutes les espèces possédant un N2OR.
L’arrangement que l’on retrouve majoritairement est nosRZDFYL, avec nosR pouvant
avoir une position variable, se plaçant après nosZ ou à la fin du cluster (Pauleta et al.,
2013). Chez certaines bactéries dénitrifiantes, surtout des alphaprotéobactéries, un
gène supplémentaire nosX est présent et peut se retrouver au début ou à la fin du
cluster principal. Finalement, il se peut que certains de ces gènes accessoires soient
présents en plusieurs copies. NosR semble être impliqué dans différents aspects de la
synthèse et de l’activité de N2OR. Chez Pseudomonas stutzeri, il contrôle la transcription
de nosZ mais il est également nécessaire pour que N2OR fonctionne à pleine activité et
pour la bonne insertion du centre CuA et CuZ lors de la formation de l’enzyme (Cuypers
et al., 1992, Pauleta et al., 2013). nosDFYL joue très certainement un rôle dans
l’assemblage du centre CuZ qui est assemblé, avec CuA, dans le périplasme. Chez des
mutants nosDFY, les N2ORs isolées ne possèdent que des centres CuA; il fut donc
proposé que NosDFY code pour un transporteur ABC impliqué dans l’assemblage des
centres CuZ (Riester et al., 1989). nosL, bien que généralement cotranscrit avec
nosDFY, n’est pas essentiel à la formation des centre CuZ. NosX est tout aussi
39
nécessaire que NosR afin de maintenir une enzyme pleinement fonctionnelle, mais
n’intervient pas dans l’assemblage des centres CuZ (Pauleta et al., 2013). Il est possible
que NosX joue un rôle dans le transfert des électrons jusqu’à N2OR et maintienne
l’enzyme dans un état catalytique actif. Les epsilonprotéobactéries possèdent deux
gènes supplémentaires, nosH et nosG, codant tous les deux pour des cytochromes c
constituant le système de transport des électrons jusqu’au N2OR cytoplasmique.
La régulation des N2ORs a été très étudiée et donc connue pour de nombreux
organismes. Curieusement, la transcription de nosRZDY n’est que très faiblement
induite par le N2O alors que le NO induit fortement la transcription de l’opéron (Arai et
al., 2003). Une séquence similaire à une FNR box se situe dans le promoteur de
l’opéron, ce qui montre qu’un régulateur de type FNR contrôle également sa
transcription. Ce régulateur est représenté par le facteur Dnr chez P. aeruginosa,
contrôlant la régulation de nosRZDY dépendamment du NO. Chez d’autres bactéries,
des régulateurs homologues ont également ce rôle; il s’agit de Nnr pour P. denitrificans
et de DnrD pour P. stutzeri (Bergaust et al., 2011, Van Spanning et al., 1999). Les
régulateurs de type FNR étant des senseurs d’oxygène, la régulation des N2ORs est
inhibée par l’oxygène. Chez P. denitrificans, FnrP est un senseur d’oxygène ayant
également des propriétés de régulation de la transcription de N2OR (Bergaust et al.,
2011).
3.4 Les voies alternatives de production de N2O
Le N2O est un gaz à effet de serre très puissant et destructeur de la couche
d’ozone. Il est très étudié et surveillé au niveau environnemental et au niveau de ses
voies de production. Il existe différentes voies métaboliques conduisant à la production
de N2O chez les bactéries (Figure 3.2). La voie de dénitrification ainsi que la
détoxification des NOx font partie de ces voies et ont été décrites précédemment. La
dernière voie métabolique est représentée par l’oxydation de l’ammonium par les
microorganismes nitrifiants (Stein, 2011). Toutes ces voies métaboliques sont en
constante compétition dans l’environnement et leur part respective dans le budget total
de N2O dépendent des conditions environnementales. Les bactéries nitrifiantes, comme
leur nom l’indique, utilisent la réaction de nitrification dans leur métabolisme central,
40
mais certaines font cette réaction de manière fortuite dû à du co-métabolisme (Prosser,
1986). La nitrification repose sur l’oxydation de l’ammonium NH4+ en hydroxylamine
NH2OH qui, à son tour, est oxydé en nitrite NO2- ou en oxyde nitrique NO. Ce NO2- ou
NO est ensuite transformé en N2O par des voies de dénitrification ou de détoxification
telles que reportées précédemment. Ce mécanisme de production de N2O est qualifié de
dénitrification nitrifiante (Wrage et al., 2001). Dans l’environnement, le NO2- produit peut
être oxydé en NO3- par un autre type de bactéries qualifiées d’oxydeurs de nitrite
complétant ainsi le processus de nitrification de l’ammonium (Bock et al., 1992). Ces
organismes ne seront pas décrits ici car ils n’interviennent pas dans la production de
N2O. Les AOA, pour « ammonium-oxidizing archea », font partie des organismes
capables de nitrification mais ne seront pas traiter ici. Le premier groupe de bactéries
réalisant la nitrification comprend les bactéries chimiolithotrophes, ne consommant que
des substrats inorganiques pour générer de l’énergie, et certaines fixant le carbone
inorganique. Dans ce groupe, on retrouve les bactéries oxydant l’ammonium appelés
AOB pour « ammonium-oxidizing bacteria » (Wood, 1986). Les AOB ont besoin
d’oxygène pour leur métabolisme de nitrification et de l’hydroxylamine NH2OH est
produit en tant qu’intermédiaire de la réaction. L’oxydation de l’ammonium représente le
métabolisme central de ces bactéries, produisant l’énergie nécessaire à leur croissance.
Certaines AOB sont aussi capables de produire du N2O en conditions microaérophiles
en réduisant le NO2-, certainement à l’aide d’enzymes liées à la dénitrification (Goreau et
al., 1980). Ce processus est appelé dénitrification aérobie et n’a été observé que chez
quelques AOB. De plus, les enzymes et mécanismes impliqués sont inconnus pour le
moment. Le NO2- produit par ces organismes stimule également les autres processus
liés à l’azote comme la production de NH2OH et de N2O (Ralf Conrad, 1996). Une
famille de bactéries proche des AOB du point de vue évolutif est également capable
d’oxyder l’ammonium en nitrite, il s’agit des bactéries oxydant le méthane ou MOB pour
« methane-oxidizing bacteria ». À l’inverse des AOB, cette réaction se fait de manière
co-métabolique et aucune énergie n’en est retirée (Dalton, 1977). Les processus mis en
jeu dans ces réactions sont encore moins connus et caractérisés que pour les AOB,
mais l’importance de ces bactéries dans le budget total de N2O dans l’environnement
pourrait être significatif. Les MOB sont aussi capables de faire d’autres réactions liées
au cycle de l’azote tel que la réduction du NO qui est le mécanisme principal pour la
production de N2O (Krämer et al., 1990, Mandernack et al., 2000). Le deuxième groupe
est représenté par les bactéries hétérotrophes oxydant l’ammonium. Ces bactéries
41
utilisant des sources de carbones organiques pour leur métabolisme principal, elles ne
produisent aucune énergie par l’oxydation de l’ammonium en nitrite (Killham, 1986).
Parmi ces hétérotrophes, de nombreuses espèces produisent du N2O à partir du NO2produit par la voie traditionnelle de dénitrification en conditions microaérophiles
(Castignetti et al., 1984). Toutes ces espèces bactériennes sont naturellement en
compétition dans la nature car elles occupent la même niche. En plus de la réduction du
NO2- en N2O via le NO, du N2O est également produit par l’oxydation du NH2OH qui est
un produit intermédiaire de la nitrification. Mais les quantités de N2O produites de cette
matière sont considérées négligeables car l’oxydation du NH2OH en NO2- est plus rapide
(Whittaker et al., 2000).
La production de N2O chez ces organismes se fait en deux temps, la nitrification
se faisant en conditions aérobies et la dénitrification en conditions anaérobies. Un
continuum
s’est
néanmoins
développé
dans
les
classes
de
ces
bactéries
dépendamment de l’environnement plus ou moins aérobie. Par exemple, des bactéries
hétérotrophes oxydant l’ammonium possèdent des enzymes liées à la dénitrification
ayant une forte activité en présence d’oxygène (I. C. Anderson et al., 1993). L’équilibre
entre les différentes espèces azotées produites peut aussi être influencé par les facteurs
environnementaux comme l’humidité du sol influençant le ratio NO/N2O chez des
chimiolithotrophes oxydant l’ammonium (E. A. Davidson, 1993). Le ratio C/N est
également un facteur contrôlant grandement la production de N2O. Cela est surtout vrai
dans les communautés bactériennes comprenant des populations chimiolithotrophes et
des populations hétérotrophes. En effet, un environnement avec un faible C/N favorise
d’avantage les chimiolithotrophes alors qu’un C/N élevé favorise le métabolisme
d’oxydation de l’ammonium des hétérotrophes (Kuenen et al., 1994). En conditions
dénitrifiantes (anaérobie et présence de nitrate), la disponibilité du nitrate et du carbone
organique détermine si le métabolisme produit plus particulièrement du N2 ou du N2O.
Finalement, le pH possède également un fort effet sur la production de N2O car le NO2peut se décomposer en NO et N2O dans des conditions acides. Cependant, l’influence
du pH ne peut être corrélée simplement à la production de N2O et les effets du pH sur
cette dernière ne sont pas encore bien compris (Stein et al., 2003).
42
Figure 3.2 : différentes voies enzymatiques et enzymes associées menant à la production de N2O.
Tiré de Stein (2011)
Afin de transformer l’ammonium en NH2OH, les AOB et MOB utilisent une
ammonium monooxygénase AMO ou méthane monooxygénase MMO, respectivement
(Wrage et al., 2001). Cette réaction consomme deux électrons afin de réduire l’O 2 en
H2O, ces deux électrons provenant de la réaction suivante, l’oxydation de NH2OH en
NO2-. AMO et MMO sont similaires dans de nombreux aspects, que ce soit au niveau de
la composition des sous-unités, des inhibiteurs ou encore des séquences des gènes
codant l’enzyme (Murrell et al., 1996). Seule AMO sera ici décrite en détail. AMO est
capable de faire la catalyse de nombreux substrats qui vont inhiber l’oxydation de NH4+,
de manière compétitive ou par liaisons covalentes, comme c’est le cas pour l’acétylène
(McCarty, 1999). AMO est une enzyme membranaire constituée de trois polypeptides :
AmoA, AmoB et AmoC (Arp et al., 2002). Parmi les trois sous-unités, c’est AmoA qui
possède le plus certainement la fonction catalytique, et le cuivre semble être un cofacteur important pour cette fonction. Le seul indice prouvant la présence d‘AmoC dans
le polypeptide vient du fait que les trois gènes codant pour les trois sous-unités sont cotranscrits dans un même ARNm. L’opéron contenant ces trois gènes (amoA, amoB et
43
amoC) est présent en deux copies quasiment identiques (>99%) chez N. europaea, et
une troisième copie de AmoC est également présente (McTavish et al., 1993,
Sayavedra-Soto et al., 1998). Le nombre de copies de cet opéron varie selon l’espèce
bactérienne et jusqu’à trois copies ont été retrouvées chez des bactéries autotrophes
(Klotz et al., 1998). Les différentes copies sont actives et fonctionnelles chez N.
europaea et exprimées différemment, suggérant un rôle particulier à chacune. La
transcription des gènes amo n’est induite que par le NH3 et la présence d’inhibiteurs,
AMO ne perturbe pas cette transcription. Il est donc possible que amoABC soit transcrit
alors que l’enzyme ne peut être fonctionnelle. Cela suggère que le NH3 possède deux
rôles, celui de régulateur et celui de source d’énergie (Hyman et al., 1995, SayavedraSoto et al., 1998).
L’hydroxylamine NH2OH produit par l’action de AMO/MMO est ensuite prise en
charge par l’hydroxylamine oxydoréductase HAO et est oxydée en nitrite ou en NO
(Stein, 2011). HAO est un homotrimère périplasmique dont chaque sous-unité contient
huit hèmes de type c (Hendrich et al., 2001). Ces hèmes sont arrangés en clusters et
participent au flux d’électrons au travers de la protéine et à la catalyse de l’oxydation du
NH2OH (Arp et al., 2002). Ce flux d’électrons est dirigé du cytochrome c554 (donneur
d’électrons) jusqu’au cytochrome cm552. Des quatre électrons générés par l’oxydation de
NH2OH, deux sont directement utilisés pour la réaction d’oxydation de NH3 par AMO,
telle que décrite précédemment. Les deux électrons restants sont utilisés pour d’autres
processus cellulaires comme la génération d’ATP (Wood, 1986). HAO est encodée par
un seul gène, haoA, généralement co-transcrit avec un autre gène haoB chez presque
toutes les AOB (Stein, 2011). haoB, originalement nommé orf2, possède un rôle encore
inconnu à ce jour (Poret-Peterson et al., 2008). Chez N. europaea, organisme modèle
chez les AOB, haoB n’est pas présent et le génome de la bactérie comprend trois copies
complètement identiques de hao, très éloignées les unes des autres sur le génome de la
bactérie (Arp et al., 2002). Aucun rôle particulier n’est pour le moment attribué à chaque
copie de hao, des mutants ayant chacun un des hao interrompu ne présentant aucune
différence phénotypique avec la souche sauvage (Hommes et al., 1996). Chaque copie
de haoAB est co-exprimée avec l’opéron cycAB, codant respectivement pour les
cytochromes c554 et cm552 responsables des flux d’électrons des HAO. haoAB et cycAB
forment ensemble le « Hydroxylamine-Ubiquinone Redox Module » (HURM) qui peut
être retrouvé jusque chez les Planctomycètes oxydant l’ammonium (Klotz et al., 2008).
Le cytochrome c554 possède également une activité de réduction du NO in vitro,
44
indiquant qu’il pourrait fonctionner en coopération avec HAO dans la production de N2O
dans la voie d’oxydation aérobie de l’hydroxylamine. Les MOB aussi possèdent les
gènes haoAB et oxydent le NH2OH, mais me possèdent pas cycAB, ce qui explique
qu’ils ne retirent pas d’énergie de cette réaction (Stein, 2011). Comme pour amoABC, la
transcription de hao est induite par NH3 chez N. europaea mais dans une moindre
mesure (Sayavedra-Soto et al., 1996). Aucune information quant à des différences
d’expression entre les différentes copies n’existe à ce jour. Finalement, certaines MOB
sont capables d’oxyder le NH2OH et de produire du N2O, mais ne possèdent pas les
gènes haoAB; les mécanismes utilisés chez ces bactéries ne sont toujours pas
caractérisés pour le moment (Knowles et al., 1988).
La
co-dénitrification
(pour
dénitrification
co-métabolique)
est
une
voie
métabolique produisant du N2O, assez peu étudiée décrite pour la première fois par
Tanimoto et al. (1992). Cette voie a surtout été observée chez différentes espèces de
champignons, mais a également été reportée pour certaines bactéries dénitrifiantes. La
co-dénitrification consiste à utiliser un composé azoté inorganique (e.g. NH4+) ou un
composé azoté organique (e.g. azide) afin de produire du N2O de manière différente à la
dénitrification traditionnelle. Cette réaction se produit dans des conditions qui sont
favorables à la dénitrification, c’est-à-dire une faible concentration en oxygène et la
présence d’oxydes d’azote. De plus, la co-dénitrification n’est induite qu’en présence de
NO2- ou de NO3- alors que les composés co-métabolisés ne peuvent induire cette
réaction. Tanimoto et al. (1992) démontrèrent grâce à des techniques utilisant de l’azote
15
N comme traceur, qu’un des N du N2O provenait du NO2- et le deuxième N provenait
du composé azoté organique ou inorganique, créant ainsi un N2O hybride. Le NH2OH,
impliqué dans la production de N2O par le biais de la nitrification, peut également être
utilisé dans la réaction de co-dénitrification (Spott et al., 2011). La seule enzyme connue
catalysant cette réaction est le cytochrome P450nor qui est aussi responsable de la
réduction du NO en N2O (Nor) chez les champignons (F. Su et al., 2004). Des
mécanismes abiotiques peuvent aussi conduire à la formation de N2O, ou du moins à la
formation de NO pouvant être réduit en N2O par la suite. La chimio-dénitrification est la
réduction chimique du nitrite en NO en présence de NH2OH (Stuven et al., 1992). Chez
un mutant knockout nirK de N. europaea ne pouvant plus réduire le nitrite, la production
de N2O fut attribuée à un phénomène de chimio-dénitrification, le NH2OH étant présent
naturellement dans les cultures de cette souche (Schmidt et al., 2004). Les milieux
complexes sont aussi susceptibles de contenir des composés pouvant potentiellement
45
se dégrader et produire des composés azotés dans certaines conditions. Luckmann et
al. (2014) démontrèrent qu’en présence de nitrite, le milieu BHIB (Brain Heart Infusion
Broth) pouvait se dégrader et conduire à la formation de NO. L’autooxidation des
hydroxylamines est également possible et conduit à la formation d’ions nitoxyl qui se
transforment majoritairement à leur tour en peroxynitrite (Moews et al., 1959).
46
4. LES BACTÉRIES MÉTHYLOTROPHES
4.1 La méthylotrophie
La méthylotrophie est connue depuis le début du 20e siècle en tant que
métabolisme et est devenue par la suite un champ d’étude à part entière de la biochimie
d’un grand nombre d’organismes classés comme méthylotrophes ainsi que les enzymes
et voies métaboliques mises en jeu (Söhngen, 1906). Les méthylotrophes sont, par
définition, des organismes capables d’utiliser des composés carbonés ne contenant
aucune liaison C-C en tant que source d’énergie ni source de carbone (Anthony, 1982).
Ces organismes sont restreints à quelques genres bactériens appartenant aux alpha-,
beta- and gammaprotéobactéries ainsi qu’aux Actinobacteria. De plus, les études
d’organismes modèles ont conduit à la création de catégories de méthylotrophes bien
distinctes : les méthylotrophes facultatifs et les méthylotrophes obligatoires, les
méthanotrophes de type I ou de type II et les hétérotrophes et les autotrophes
(Chistoserdova, 2011). Cependant, la découverte de bactéries méthylotrophes
n’appartenant pas à ces genres et de nouvelles voies métaboliques de la méthylotrophie
remettent en cause ce fondement. Les méthylotrophes ont un rôle important à jouer
dans les cycles de l’azote et du soufre, car parmi les substrats utilisés par ces
organismes, on retrouve du méthane, du méthanol, des amines méthylées, des
méthanes halogénés et des composés soufrés méthylés (Chistoserdova, 2011). On peut
de manière simplifiée schématiser les voies métaboliques de la méthylotrophie en trois
parties distinctes, chacune comportant plusieurs modules différents :

l’oxydation du substrat primaire, entraînant la production de formaldéhyde ou
d’un radical méthyl ou méthylène (généralement du tétrahydrofolate H4F).

l’oxydation du formaldéhyde (ou du méthyl- ou méthylène-H4F) en CO2.

l’assimilation d’un composé en C1 qui peut se situer au niveau du formaldéhyde,
du CO2 ou d’une combinaison de CO2 et méthylène-H4F.
Afin d’être considéré comme méthylotrophe, un organisme se doit de posséder
au moins un module dans chacune des parties décrites précédemment. Ce concept
suggère que la méthylotrophie est de nature modulaire, c’est-à-dire que beaucoup de
possibilités existent au niveau des voies métaboliques et que ses modules sont
interchangeables/remplaçables et quelque fois redondants (Chistoserdova, 2011).
47
Toutefois, la définition de la méthylotrophie a encore besoin de précision car certains
organismes utilisent ces voies métaboliques pour faire du co-métabolisme des
composés en C1 plutôt que de les utiliser pour du métabolisme basé sur les composés
en C1.
Les méthanotrophes sont définis par le fait qu’ils utilisent le méthane CH4 en tant
que substrat primaire dans leurs méthylotrophie. En conditions aérobies, le méthane est
oxydé en méthanol et ensuite en formaldéhyde, rentrant à son tour dans le cycle RuMP
(Ribulose MonoPhosphate) ou dans le cycle de la sérine (décrit plus bas). Cette
différence dans l’utilisation du formaldéhyde classe les méthanotrophes dans le type I
(cycle du RuMP, gammaprotéobactéries) ou dans le type II (cycle de la sérine,
alphaprotéobactéries). Deux enzymes oxydant le méthane en conditions aérobies ont
été très étudiées et caractérisées, la méthane monooxygénase soluble (sMMO) et la
méthane monooxygénase membranaire (pMMO) (Hakemian et al., 2007, Trotsenko et
al., 2008). pMMO se retrouve de manière quasiment universelle chez tous les
méthanotrophes étudiés à ce jour alors que sMMO n’est présent que chez quelques
espèces. L’oxygène est un élément essentiel pour l’oxydation du méthane mais
l’oxydation anaérobie est également possible et a été seulement démontrée chez les
Archaea (Knittel et al., 2009). Il a été proposé que cette voie métabolique s’opère grâce
à une métanogenèse inverse (Thauer et al., 2008). Il n’est pas impossible que cette voie
métabolique particulière soit également présente chez des bactéries méthylotrophes
encore inconnues pour le moment. Un autre substrat utilisé par les méthylotrophes est la
méthylamine CH5N, qui peut oxyder en formaldéhyde par deux voies différentes : soit
par une méthylamine déshydrogénase MADH chez les bactéries Gram-négatives, soit
par la méthylamine oxydase chez les bactéries Gram-positives. Il existe également une
voie métabolique indirecte basée sur le transfert du groupe méthyle suivi par une
oxydation menant probablement à la formation de méthylène-H4F (Chistoserdova et al.,
2009). Parmi ces trois voies, la MADH est le système le plus connu. Les gènes codant
pour cette voie (le cluster mauBEDAGLMN) sont très conservés et toutes les espèces
possédant ces gènes ont été caractérisées comme méthylotrophes par la suite. C’est
pour cela que la MADH est un marqueur caractéristique de la méthylotrophie (V. L.
Davidson, 2004). Le méthanol est également un des substrats caractéristiques des
méthylotrophes. L’enzyme oxydant le méthanol, la méthanol déshydrogénase (MDH), fut
pendant une longue période l’enzyme la plus étudiée pour la méthylotrophie. Tout
comme la MADH, la MDH est un marqueur caractéristique de la méthylotrophie
48
(Anthony, 1982, Anthony, 2004). Isolée et caractérisée pour la première fois chez M.
extorquens, la MDH est codée par le gène mxaF accompagné par plusieurs gènes
accessoires mxaGACKLRS dont les fonctions sont connues pour la plupart (Vuilleumier
et al., 2009). Pourtant, de nombreux échantillons environnementaux ont montré une
activité d’assimilation du méthanol en absence de mxaF, suggérant que d’autres
méthanol déshydrogénases sont à l’œuvre dans la nature (Chistoserdova, 2011). La
MDH2, une méthanol déshydrogénase, fut récemment découverte et possède une faible
similarité avec la MDH (Kalyuzhnaya et al., 2008). Chez certaines bactéries assimilant le
méthanol, ni MDH ni MDH2 n’est présent. Le gène xoxF dont le peptide partage 50%
d’identité avec MxaF a été proposé comme candidat potentiel remplaçant la MDH chez
ces bactéries (Hou et al., 2008). Finalement, il existe d’autres composés méthylés
pouvant servir de substrat aux méthylotrophes que l’on retrouve moins fréquemment
mais qui soulignent encore d’avantage le rôle important que jouent les méthylotrophes
dans les grands cycles de la matière. Parmi ces substrats, on peut trouver le
chlorométhane, bromométhane, dimethylsulfoniopropionate (DMSP), dimethylsulfide
(DMS) ou encore la trimethylamine (Chistoserdova, 2011).
L’oxydation du formaldéhyde est une partie importante dans la méthylotrophie
car elle permet non seulement de générer de l’énergie pour la bactérie, mais elle permet
aussi de garder les concentrations de formaldéhyde basses car c’est un composé
toxique pour la cellule. Les formaldéhyde déshydrogénases FaDH sont un système
simple et efficace d’oxydation du formaldéhyde et ne sont codées que par un seul gène
(Vorholt, 2002). Il apparait comme le système de détoxification majeure du
formaldéhyde de plusieurs bactéries, méthylotrophes comme non méthylotrophes.
Curieusement, il est absent chez la plupart des méthylotrophes au profit d’un autre
système plus élaboré ayant pour cofacteur le tetrahydromethanopterin (H4MPT) et
encodé par au moins vingt gènes (Chistoserdova et al., 1998). Chez M. extorquens, là
où il a été découvert, ce système est indispensable pour la création d’énergie (sous
forme de NAD(P)H) et pour maintenir les concentrations de formaldéhyde à des
concentrations non toxiques. Une voie métabolique analogue à celle-ci et liée au
tetrahydrofolate est présente chez de nombreux méthylotrophes et implique l’enzyme
FolD, une protéine possédant des activités de méthylène-H4F déshydrogénase et
méthylène-H4F cyclohydrolase. La plupart des méthylotrophes dont le génome est
connu et séquencé possèdent cette enzyme dans leur génome (Chistoserdova, 2011).
Le formate généré par l’oxydation du formaldéhyde est à son tour oxydé par une formate
49
déshydrogénase (FDH). On retrouve de nombreuses copies de FDH chez plusieurs
organismes dont les méthylotrophes; M. extorquens en possédant quatre. Ces quatre
FDH sont toutes différentes et sont numérotées de FDH1 à FDH4 (Chistoserdova,
2011). Les FDH sont peu conservées chez les méthylotrophes et semblent être
distribuées de manière aléatoire; des FDH homologues pouvant être largement
distribuées parmi les bactéries méthylotrophes et non méthylotrophes (Ettwig et al.,
2010, Hou et al., 2008). Chez les organismes utilisant le cycle du RuMP, les FDH sont
très peu exprimées; le formaldéhyde étant également utilisé dans ce cycle (Anthony,
1982). Néanmoins, ces organismes ne peuvent se passer de l’oxydation du formate; des
mutants sans FDH n’étant pas viables malgré un cycle du RuMP fonctionnel.
Trois voies d’assimilation différentes existent chez les méthylotrophes et
prennent place à des niveaux différents : le cycle du RuMP utilise le formaldéhyde
généré par l’oxydation du substrat primaire, le cycle de la sérine utilise le méthylène-H4F
et le CO2 et le cycle CBB (Calvin-Benson-Bassham) seulement le CO2 (Chistoserdova,
2011). Il est à noter que si les deux premières voies d’assimilation citées ici sont propres
aux organismes méthylotrophes, le cycle CBB est partagé avec des organismes
autotrophes non méthylotrophes ainsi que les plantes. Le cycle du RuMP permet la
génération de molécules en C3 utilisées pour la biosynthèse et la génération de
NAD(P)H par l’oxydation d’une autre molécule du cycle (Anthony, 1982). Le cycle
démarre par l’ajout d’une molécule de formaldéhyde sur un sucre en C5 (RuMP) et il finit
par la régénération de ce même sucre afin de recommencer le cycle. Des enzymes
courantes sont requises afin de réaliser le cycle : les enzymes de la glycolyse, du cycle
du pentosephosphate et de la voie Entner-Doudoroff. Seules deux enzymes spécifiques
au cycle du RuMP interviennent, il s’agit de l’héxulosephosphate synthase (HPS) et de
l’héxulosephosphate isomérase (HPI). Ces deux enzymes sont considérées comme des
signatures de la méthylotrophie. Toutefois le cycle du RuMP peut également être utilisé
pour la détoxification du formaldéhyde, donc la présence des gènes hps/hpi n’est pas
une preuve de méthylotrophie (Yasueda et al., 1999). Le cycle de la sérine est
également spécifique aux méthylotrophes. Il permet la production de molécules en C3 et
C4 servant pour la synthèse de biomasse et de glycoxylate servant d’accepteur pour le
méthylène-H4F. en assimilant à la fois le CO2 et le méthylène-H4F (Anthony, 1982).
Comme pour le cycle du RuMP, plusieurs enzymes communes provenant d’autres
cycles métaboliques interviennent dans le cycle de la sérine. Les enzymes spécifiques à
ce cycle sont l’hydroxypyruvate réductase et la sérine glyoxylate aminotransférase.
50
(Ward et al., 2004). Afin de pouvoir assimiler des molécules en C1 dans le cycle de la
sérine, le glycoxylate a besoin d’être régénéré. Cela est réalisé à partir d’acétyl-CoA par
la voie de éthylmalonyl-CoA (Peyraud et al., 2009). Cette voie n’est cependant pas
spécifique aux méthylotrophes et peut être utilisée pour le métabolisme des composés
en C2 par des non méthylotrophes et des méthylotrophes facultatifs. Le cycle CBB peut
être retrouvé comme seule voie d’assimilation de composés en C1 chez certaines
bactéries. Dans ce cas, il sert uniquement à assimiler le CO2 afin de permettre la
production de biomasse. Chez d’autres bactéries, il est présent en plus d’un autre cycle
d’assimilation de composés en C1 et son rôle précis est encore inconnu pour le moment
(Chistoserdova et al., 2005). Le gène clé de ce cycle, cbbLS, est probablement soumis
aux transferts latéraux car on a retrouvé plusieurs copies de ce gène dans le génome de
plusieurs bactéries; chaque copie ayant des affiliations à des familles bactériennes
différentes (Kane et al., 2007).
La méthylotrophie peut être reliée à la dénitrification chez certains organismes,
comme chez Paracoccus denitrificans ou les Hyphomicrobium spp., méthylotrophes
dénitrifiant très étudiés (Baker et al., 1998, Betlach, 1982). La nature aérobie de la
méthylotrophie semble incompatible avec la dénitrification essentiellement anaérobie
mais des accepteurs d’électrons autres que l’O2 ont été reconnus pour la
méthylotrophie. Bien qu’aucune souche bactérienne n’ait été isolée pour le moment,
l’oxydation du méthane peut être liée à la dénitrification dans certains bioréacteurs
(Ettwig et al., 2008). Le méthanol fut souvent utilisé comme source de carbone dans les
bioprocédés car il était peu couteux étant donné qu’il s’agit d’un déchet industriel.. Il
permet d’améliorer les rendements de dénitrification dans le traitement des eaux usées.
De nombreux méthylotrophes associés entre autres au genre Hyphomicrobium,
Paracoccus, Methylophilaceae ont été retrouvés dans les boues activées de ces
bioréacteurs, bien que le lien entre ces organismes et la dénitrification opérant dans ces
réacteurs n’ait pas été fait (Chistoserdova et al., 2009). Cependant, il a été démontré
que des méthylotrophes appartenant au genre Methylotenera avaient besoin de nitrate
pour pouvoir croître sur le méthanol, faisant un lien direct entre ces deux métabolismes
(Kalyuhznaya et al., 2009).
51
4.2 Le genre Methylophaga
Le genre Methylophaga fut découvert en 1985 par l’isolement de sa première
espèce, Methylophaga marina (Janvier et al., 1985). Cette découverte entraîna
également la reclassification de la bactérie Methylomonas thalassica en Methylophaga
thalassica. Ces deux espèces ont servi à la réalisation de la première caractérisation du
genre, mais de nouvelles espèces découvertes par la suite et appartenant au genre
Methylophaga ne correspondaient plus tout à fait à la caractérisation faite par Janvier et
al. (1985). Boden (2012) fournit une nouvelle description du genre Methylophaga en
prenant en compte les nouvelles espèces isolées depuis 1985. Cela n’inclue pas
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1, dont la description détaillée a été faite ciaprès. À ce jour, le genre Methylophaga comprend dix espèces distinctes dont le nom a
été validé et publié. En plus de M. nitratireducenticrescens, il y a M. marina, M.
thalassica, M. alcalica, M. amidosulfivorans, M. lonarensis, M. muralis, M. sulfidovorans,
M. thiooxydans et M. frappieri également isolée du biofilm dénitrifiant comme l’espèce
M. nitratireducenticrescens (Antony et al., 2012, Boden et al., 2010, de Zwart et al.,
1996, Doronina et al., 2003, Doronina et al., 2005, Janvier et al., 1985, Kim et al., 2007,
Villeneuve et al., 2013) D’autres souches ont été dénommées Methylophaga par les
auteurs des publications associées, mais ces noms n’ont jamais été validés et publiés.
Ces souches ne sont donc pas prises en compte dans la description donnée par Boden
(2012). Les espèces de Methylophaga forment deux clades séparant les trois espèces
alkaliphiles (M. alcalica, M. lonarensis et M. muralis) des autres espèces dont la
représentante est M. marina. Ce regroupement est cohérent avec le plus faible taux
d’identité de séquence de gène de l’ARNr 16S des espèces du premier clade avec M.
marina.
Les Methylophaga spp. sont des bactéries aérobies strictes à Gram-négative
formant des bâtonnets. Elles sont non-sporulantes et peuvent se déplacer à l’aide d’un
unique flagelle polaire. Elles sont typiquement isolées à partir de milieux aqueux
oligotrophes comme les environnements marins. L’espace périplasmique est fin et ne
mesure que 20-30 nm. Ce sont des espèces halophiles modérées, dont certaines
alcaliphiles, ne pouvant pas croître en l’absence de NaCl. Certaines espèces sont
auxotrophes à la vitamine B12 tandis que d’autres sont capables de réduire le nitrate en
nitrite et sont incapables de l’utiliser pour leur croissance. Le milieu de culture commun à
toutes ces espèces est le milieu 1403 (ATCC), et aucune n’est capable de croître sur un
52
milieu complexe. La quinone dominante du système respiratoire est UQ-8, et toutes les
Methylophaga spp. utilisent des composés en C1 dans l’assimilation du carbone et
comme source d’énergie via une variante du cycle du RuMP. Le méthane ne fait
cependant pas partie des composés en C1 assimilables par ces bactéries mais
certaines espèces peuvent utiliser des composés multicarbonés comme le fructose.
Aucune Methylophaga spp. n’est capable de croissance autotrophe et certaines sont
chimiolithohétérotrophes. Finalement, le contenu G+C de l’ADN des Methylophaga varie
de 42 à 50 mol%. La description détaillée de chaque espèce est présentée dans le
tableau 4.1.
53
54
Tableau 4.1 : Caractéristiques des différentes espèces de Methylophaga. Espèce: 1, M. alcalica; espèce 2, M. aminisulfidivorans; espèce 3, M. lonarensis; espèce
4, M. marina; espèce 5, M. muralis; espèce 6, M. sulfidovorans; espèce 7, M. thalassica; espèce 8, M. thiooxydans.
Tiré de Boden (2012).
4.3 Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1
La souche JAM1 associée au genre Methylophaga fut isolée à partir du biofilm
dénitrifiant provenant du système de dénitrification du Biodôme de Montréal par Auclair
et al. (2010). La présence de Methylophaga spp. dans un milieu anaérobie ou du moins
micro-aérophile parut surprenant du fait de la nature aérobie stricte de ce genre
bactérien. La souche fut par la suite caractérisée et identifiée par Villeneuve et al.
(2012), Villeneuve et al. (2013) et prit le nom de Methylophaga nitratireducenticrescens.
La séquence du gène de l’ARNr 16S révéla une forte identité (96%) avec celle de M.
alcalica. C’est une gammaprotéobactérie qui possède les caractéristiques attribuées aux
Methylophaga spp. excepté qu’elle est aérobie facultative et non stricte. Sur gélose
nutritive, elle forme de petites colonies beiges et lisses d’un diamètre de 2-3 mm
(Villeneuve et al., 2013). En culture liquide, la bactérie possède une forte tendance à
floculer, et de manière plus accentuée en conditions aérobies. Elle est positive pour la
catalase et l’oxydase ainsi que l’estérase (C4), la leucine arylamidase, la naphtol-AS-BIphosphohydrolase et l’activité phosphatase alcaline. Les optimum de croissance se
situent à 30°C (15 à 37°C), à pH 8 (6 à 11) et à 3% NaCl (0.5 à 8%). La souche requiert
la vitamine B12 pour sa croissance, comme plusieurs autres Methylophaga spp., mais
aussi une certaine concentration d’ions Na+ dans son milieu. Son unique source
d’énergie et de carbone est le méthanol, la source de carbone utilisée dans le
bioréacteur du Biodôme. Elle est sensible à plusieurs antibiotiques dont la gentamicine,
la kanamycine, la streptomycine, la tétracycline et la triméthoprime, et résistante au
chloramphénicol et à l’ampicilline jusqu’à 500 μg.ml-1.
M. nitratireducenticrescens se distingue des autres Methylophaga spp. par sa
capacité à réduire le nitrate en nitrite mais surtout par sa capacité à croître sur le nitrate
en conditions anaérobies (Auclair et al., 2010). Toutefois, la souche démontre une
croissance plus forte en conditions aérobies; l’oxygène fournissant plus d’énergie que le
nitrate. Le nitrite produit n’est pas consommé et s’accumule de manière équimolaire
dans le milieu. Le nitrite est toxique pour la cellule et quand de faibles concentrations
sont présentes initialement dans les cultures pures, inhibant sa croissance. Cette
réduction de nitrate a également lieu quand il y a présence d’oxygène dans le milieu. Le
séquençage du génome de M. nitratireducenticrescens a montré que la réduction du
nitrate reposait sur deux enzymes Nar (Nar1 et Nar2) codées par les opérons
nar[1]GHJI et nar[2]GHJI (Villeneuve et al., 2012). narG1 et narG2 possèdent 61%
55
d’identité au niveau de la séquence d’acides nucléiques et 55% d’identité pour la
séquence d’acides aminés (65% de similarité). NarG1 est affilié au NarG de la
betaprotéobactérie Thiobacillus denitrificans avec un haut degré d’identité et de
similarité (88% et 93%, respectivement) alors que NarG2 est affilié au genre
gammaprotéobactérie (Auclair et al., 2010). Cela suggère que Nar1 aurait été acquise
par transfert horizontal de gènes. Le faible degré de similarité entre narG1 et narG2
(<67%) renforce cette idée d’origine différente (Palmer et al., 2009). L’expression de ces
deux gènes est potentiellement constitutive; en effet des ARNm de narG1 et narG2 ont
été détectés en conditions anaérobies et aérobies avec ou sans nitrate dans le milieu.
Aucun gène codant pour une nitrite réductase (nirK ou nirS) n’est présent, ce qui
expliquerait l’incapacité de la souche à réduire le nitrate. Deux opérons nor sont
également présents dans le génome. De la même manière que nar1, nor2 est affilié aux
betaprotéobactéries et semble avoir été acquis par transfert horizontal. Un opéron nos
codant pour la réduction du N2O est aussi présent dans le génome, faisant de M.
nitratireducenticrescens un détenteur d’une voie de dénitrification coupée en deux
parties. Finalement, trois transporteurs de nitrate narK sont retrouvés dans le génome,
dont deux situés en aval de nar1. Tous les gènes de la dénitrification de M.
nitratireducenticrescens sont situés très proches les uns des autres, sur un îlot
génomique de 67 kpb, ce qui est une particularité en soit (Voir article 1, Fig 1). Sur cet
îlot génomique, on peut également retrouver les gènes codant pour une protéine de
biosynthèse pour le cofacteur molybdène mogA, une protéine de biosynthèse pour le
cofacteur molybdène A moaA, le senseur de nitrate narXL et la protéine de réponse au
stress induit par le NO nnrS. D’autres gènes présents dans le génome sont à noter
comme l’opéron mxaDEFJGIRACKL codant pour la méthanol déshydrogénase, tous les
gènes codant pour la glycolyse et ceux de la variante Entner-Douderoff de la voie du
RuMP.
M. nitratireducenticrescens a été caractérisée comme une des deux bactéries les
plus abondantes dans le biofilm dont elle est issue (Auclair et al., 2010, N. Labbé et al.,
2003a). Bien que M. nitratireducenticrescens ne réduise pas le nitrite dans son milieu,
aucune accumulation de nitrite n’est observée dans des cultures du biofilm dénitrifiant,
indiquant que les autres microorganismes présents prennent en charge le reste de la
dénitrification
(Auclair
et
al.,
2010).
Hyphomicrobium
nitrativorans
NL23
est
potentiellement l’espèce majoritaire responsable de la réduction du nitrite car elle est
également présente en abondance dans le biofilm et possède une voie de dénitrification
56
complète (Martineau et al., 2013a). Il est possible qu’une association étroite (syntrophie)
s’opère entre ces deux organismes dans le biofilm afin de réaliser la dénitrification
complète. Cette association pourrait même aller au-delà de la dénitrification, les
interactions inter-espèces étant très nombreuses et profondes au sein des
communautés microbiennes (James et al., 1995). En effet, il est intéressant de mettre
en avant la faible tolérance au NaCl de la souche H. nitrativorans (1% maximum) en
culture pure alors que cette concentration est de 2.4% dans le milieu originel du biofilm
(Martineau et al., 2013b). M. nitratireducenticrescens possède dans son génome le gène
permettant la synthèse d’ectoine, une molécule ayant un fort pouvoir osmoprotectant
(Villeneuve et al., 2013). L’ectoine relâchée dans le biofilm pourrait ainsi protéger les
espèces bactériennes peu tolérantes au sel comme H. nitrativorans, renforçant les
relations entre ces deux espèces. Finalement, ces deux bactéries utilisent le méthanol
comme source de carbone et d’énergie et pourraient échanger des métabolites associés
à l’oxydation du méthanol bien qu’elles ne partagent pas le même cycle d’assimilation
du carbone. En effet, les Hyphomicrobium spp. utilisent le cycle de la sérine contre la
voie RuMP chez les Methylophaga spp.
57
5. PRÉSENTATION DE LA THÈSE
5.1 Hypothèses de recherches
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 est une bactérie unique du genre
Methylophaga pour sa capacité à croître sur le nitrate et possède une voie de
dénitrification très particulière car coupée en deux parties, et comprenant deux versions
des enzymes Nar et Nor. En outre, elle est issue d’un biofilm, milieu complexe où se
côtoient de nombreuses espèces bactériennes interagissant les unes avec les autres
dans la réalisation de voies métaboliques telle que la dénitrification. L’étude de la voie
de dénitrification de Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 possède une portée
scientifique significative en apportant des connaissances sur plusieurs plans.
Premièrement, elle apportera de nouvelles données sur les bactéries marines
dénitrifiants qui restent encore peu étudiées. Pourtant, les milieux marins, qu’ils soient
naturels ou artificiels, sont autant touchés par la pollution par les nitrates que les milieux
d’eau douce. Ensuite, cela permettra d’augmenter les connaissances sur les voies de
dénitrification existantes et les cycles biochimiques de l’azote. Finalement, ces
connaissances s’intégreront parfaitement dans l’étude globale du biofilm dénitrifiant.
Représentant l’espèce la plus abondante du biofilm, la compréhension de son
fonctionnement (de manière générale mais particulièrement au niveau de la
dénitrification) en sera affinée. Deux hypothèses ont été émises afin de caractériser
cette voie de dénitrification :

les nitrate réductases Nar1 et Nar2 jouent un rôle équivalent dans la cellule pour
la réduction du nitrate.

Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 est capable de réduire le NO et le
N2O malgré son incapacité à réduire le NO2-.
58
5.2 Objectifs de l’étude
Afin de répondre aux hypothèses précédentes, différents objectifs ont été
établis :
Hypothèse 1

Créer des mutants knockout des gènes narG1 et narG2 de la souche JAM1

Étudier la croissance et la capacité à réduire le nitrate de chaque souche JAM1
(sauvage et mutantes) dans différentes conditions de culture

Calculer les taux de croissance spécifiques pour chaque souche JAM1 (sauvage
et mutantes)

Étudier l’expression et la régulation des gènes liés à la réduction du nitrate pour
chaque souche JAM1 (sauvage et mutantes) dans différentes conditions de
culture
Hypothèse 2

Étudier et mesurer la capacité à réduire le NO de la souche JAM1

Étudier et mesurer la capacité à réduire le N2O de la souche JAM1

Étudier l’expression et la régulation des gènes liés à la réduction du NO et du
N2O à différentes phases d’une culture

Étudier les voies de production du N2O chez la souche JAM1 (ajouté pendant
l’étude)
59
5.3 Méthodes
Afin de répondre à la première hypothèse, des mutants knockout narG1, narG2
et narG1narG2 de Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 furent créés. L’étude
des souches mutantes et de la souche sauvage s’est ensuite faite en suivant leur
croissance et leur capacité à réduire le nitrate dans différentes conditions de croissance
à l’aide de spectrophotomètrie et de chromatographie ionique, respectivement.
L’expression de ces gènes ainsi que d’autres gènes liés à la réduction du nitrate comme
les transporteurs NarK ont été suivis par RT-qPCR dans différentes conditions de
culture afin d’observer l’influence des facteurs environnementaux (O2 et NO3-) sur leurs
expressions. L’influence des mutations fut également observée sur l’expression de ces
gènes en comparant les mutants à la souche sauvage. Des recherches de sites de
régulation dans les promoteurs ont également été réalisées préalablement afin de mieux
déterminer les mécanismes de la régulation de la réduction du nitrate. Afin d’avoir une
vue générale de la transcription des gènes de la souche JAM1, son transcriptome fut
établit par assemblage sur génome.
Pour la deuxième hypothèse, des suivis de la réduction de N2O par la souche
JAM1 ont été effectués à l’aide d’une chromatographie gazeuse dans plusieurs
conditions de culture. La réduction du NO fut attestée par insertion de NO dans les
cultures de la souche JAM1 et observation de la production de N2O qui découlait de
cette réduction. La production de N2O sans ajout de NO ayant également été observée,
l’influence de divers paramètres environnementaux (O2, NO3-, C2H2, NH4+) fut étudiée.
L’origine du N2O produit fut déterminée à l’aide d’expériences avec de l’azote marqué
15
N permettant de faire un traçage du NO3- et du NH4+. Les mesures des ratios
isotopiques du N2O produit furent réalisées par un laboratoire extérieur. Finalement,
l’expression des gènes impliqués dans la production de N2O (norB1, norB2, nos, nnrS)
fut suivie pendant les différentes phases de production/consommation de N2O.
Des expériences complémentaires de transcriptomiques ont été effectuées en
séquençant les ARNm produits par le biofilm dans différents conditions de culture. Le
transcriptome de la souche JAM1 dans le biofilm fut élaboré à partir des jeux de
données d’expression et comparé au transcriptome de la souche JAM1 en culture
axénique. Les changements d’expression des différentes voies métaboliques de la
souche ont pu être calculés entre les cultures pures et le biofilm.
60
Étude de la voie de dénitrification de la souche bactérienne
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 provenant d’un
système de dénitrification d’eau de mer
Articles
61
6. Présentation de l’article 1
Importance of the Two Dissimilatory (Nar) Nitrate Reductases in the Growth and Nitrate
Reduction of the Methylotrophic Marine Bacterium Methylophaga
nitratireducenticrescens JAM1
L’importance de deux nitrate réductases (Nar) dans la croissance et la reduction du
nitrate chez la bactérie méthylotrophe marine Methylophaga nitratireducenticrescens
JAM1
Florian Mauffrey, Christine Martineau et Richard Villemur
FM : contribution principale à l’élaboration et la réalisation des expériences et à la
rédaction de l’article.
CM : élaboration des expériences et rédaction de l’article.
RV : élaboration des expériences et rédaction de l’article.
Publié dans Frontiers in Microbiology le 24 Décembre 2015
Mention sur les changements exigés par le comité de revue
L’article fut accepté avec corrections mineures. La plupart des commentaires ne
demandaient aucun ou de légers ajouts dans le texte après explications avec les
réviseurs. Les données de transcriptomiques furent déposées dans une banque de
données en ligne tel que demandé par les réviseurs afin de les rendre publiques.
62
6.1 Résumé
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 est la seule espèce du genre
Methylophaga capable de croître dans des conditions anaérobies avec du nitrate
comme accepteur d’électrons. Dans son génome se trouve une voie de dénitrification
tronquée, qui se compose de deux nitrate réductases, Nar1 et Nar2; deux oxyde nitrique
réductases, Nor1 et Nor2; et une oxyde nitreux réductase, Nos; mais pas de nitrite
réductase (NirK ou NirS). Le transcriptome de la souche JAM1 cultivée dans des
conditions anaérobies en présence de nitrate et de méthanol a montré que tous ces
gènes étaient exprimés. Nous avons étudié l’importance de Nar1 et de Nar2 en créant
des mutants knockout de narG1 et/ou narG2. Les mesures du taux de croissance
spécifiques et du taux de réduction de nitrate spécifique des mutants knockout
JAM1ΔnarG1 (Nar1) and JAM1ΔnarG2 (Nar2) ont clairement démontré que les deux
systèmes Nar contribuent à la croissance de la souche JAM1 en conditions anaérobies,
chacun à des niveaux différents. Le mutant JAM1ΔnarG1 a montré une importante
diminution du taux de réduction de nitrate, influençant en conséquence sa croissance
dans des conditions de culture anaérobies. Chez le mutant JAM1ΔnarG2, la mutation a
induit un retard de 20h avant d’atteindre un taux de réduction du nitrate similaire à celui
de la souche JAM1. La mutation de narG1 n’a pas affectée pas l’expression de narG2.
Par contre, l’expression du système Nar1 fut fortement sous-régulée en présence
d’oxygène chez le mutant JAM1ΔnarG2. Ces résultats indiquent que Nar1 est la nitrate
réductase la plus active chez la souche JAM1 mais que Nar2 semble réguler
l’expression de Nar1.
63
6.2 Summary
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 is the only reported Methylophaga
species capable of growing under anaerobic conditions with nitrate as electron acceptor.
Its genome encodes a truncated denitrification pathway, which includes two nitrate
reductases, Nar1 and Nar2; two nitric oxide reductases, Nor1 and Nor2; and one nitrous
oxide reductase, Nos; but no nitrite reductase (NirK or NirS). The transcriptome of strain
JAM1 cultivated with nitrate and methanol under anaerobic conditions showed the genes
for these enzymes were all expressed. We investigated the importance of Nar1 and
Nar2 by knocking out narG1, narG2 or both genes. Measurement of the specific growth
rate and the specific nitrate reduction rate of the knockout mutants JAM1ΔnarG1 (Nar1)
and JAM1ΔnarG2 (Nar2) clearly demonstrated that both Nar systems contributed to the
growth of strain JAM1 under anaerobic conditions, but at different levels. The
JAM1ΔnarG1 mutant exhibited an important decrease in the nitrate reduction rate that
consequently impaired its growth under anaerobic conditions. In JAM1ΔnarG2, the
mutation induced a 20-h lag period before nitrate reduction occurred at specific rate
similar to that of strain JAM1. The disruption of narG1 did not affect the expression of
narG2. However, the expression of the Nar1 system was highly downregulated in the
presence of oxygen with the JAM1ΔnarG2 mutant. These results indicated that Nar1 is
the major nitrate reductase in strain JAM1 but Nar2 appears to regulate the expression
of Nar1.
64
6.3 Introduction
Methylophaga sp. are methylotrophic Gammaproteobacteria that are typically
isolated from marine environments or brackish waters. They have a strict requirement for
Na+ for growth and use one-carbon compounds such as methanol or methylamine (but
not methane) as sole carbon and energy sources with carbon assimilation proceeding
via the 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate (KDPG) aldolase-variant of the ribulose
monophosphate (RuMP) pathway (Boden, 2012). They all are strictly aerobic with the
exception of Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1, which can grow under
anaerobic conditions by reducing nitrate into nitrite but does not reduce nitrite further
(Auclair et al., 2010, Villeneuve et al., 2013). M. nitratireducenticrescens JAM1 was
isolated from a denitrifying biofilm developed inside of the methanol-fed fluidized
denitrification system used to treat seawater at the Montreal Biodome in Canada (Auclair
et al., 2010).
The nitrate-reducing activity of M. nitratireducenticrescens JAM1 is correlated
with the presence and expression of two distinct dissimilatory Nar nitrate reductases
(Nar1 and Nar2; Auclair et al., 2010; Villeneuve et al., 2013). Nar nitrate reductases are
membrane-bound enzymes in which the catalytic subunit faces the cytoplasm and
catalyzes the reduction of nitrate into nitrite for energy production (Bonnefoy et al.,
1994). They are multimeric enzymes typically encoded by the narGHJI operon with
narGHI encoding the subunits of the enzyme (Gonzalez et al., 2006). The expression of
the narGHJI operon is induced by a high concentration of nitrate and low concentration
of oxygen. However, many counterexamples exist. In M. nitratireducenticrescens JAM1,
the narG1 and narG2 genes have been shown to be expressed in the presence or
absence of nitrate and oxygen in pure cultures, which indicates putative constitutive
expressions of these genes under these conditions. However, only narG1 expression
was observed in the biofilm, which suggests differential expression mechanisms and
roles for these two Nar systems (Auclair et al., 2012). Although open reading frame
(ORF) encoding a nitrite reductase (NirS- or NirK-type) was absent in strain JAM1
genome, gene clusters encoding two nitric oxide reductases (Nor1 and Nor2) and one
nitrous oxide reductase (Nos) were found. The gene clusters encoding for these five
reductases (Nar1, Nar2, Nor1, Nor2 and Nos) and constituting an incomplete
denitrification pathway are located in close proximity in a 67 kb chromosomic region
(Villeneuve et al., 2013).
65
The importance of each Nar system in nitrate reduction and growth in M.
nitratireducenticrescens JAM1 was assessed by generating narG1 and narG2 knockout
mutants of strain JAM1. These mutants were tested for their abilities to grow and reduce
nitrate under different conditions. Changes in the expression levels of the two narGs
were then measured by reverse transcription-real-time PCR (RT-qPCR). We also
measured the effects of such mutations on the expression levels of the nitrate
transporter genes narK. Our results revealed that the two Nar systems contribute to
growth and nitrate reduction but at different levels. Furthermore, the transcriptome of M.
nitratireducenticrescens JAM1 that was grown under anaerobic conditions was derived
to assess the expression level of the denitrification genes. Our results showed that the
nar1 gene cluster was eight times more expressed than the nar2 gene cluster.
Determination of the importance to these two nitrate reductases will help to decipher
some of the mechanisms of denitrification in a marine environment.
6.4 Materials and Methods
6.4.1 Bacterial Strains and Growth Conditions
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 (ATCC BAA-2433T, DSM 25689T)
and the knockout mutants were cultured in the Methylophaga medium 1403 (Villeneuve
et al., 2013). This medium contained 37 mM ammonium chloride. After autoclaving,
methanol, solution T, Wolf’s mineral solution, vitamin B12 and nitrate were added under
sterile conditions. Aerobic cultures were made in 200-ml Erlenmeyer flasks with constant
shaking at 350 rpm. For the cultures under anaerobic conditions, 30 ml of non-sterile
1403 medium was dispensed into 70-ml serum bottles, which were then flushed for 15
min with N2 to remove oxygen from the headspace. The bottles were sealed with rubber
stoppers and metal seals and autoclaved. Inoculum was made of fresh aerobic culture
without nitrate to reach an optical density (OD600nm) of 0.025. Nitrate was added as
sodium nitrate (NaNO3) at a final concentration of 40 mM. Biological replicates were
conducted for all growth experiments and experiments were repeated once on a different
day. The maximum specific growth rates were derived by non-linear regression with the
Monod equation (Healey, 1980).
66
Bacterial growth was monitored by spectrophotometry (OD600nm). Samples were
homogenized prior to measurements with a Potter-Elvehjem homogenizer to disperse
flocs, which appeared in aerobic cultures of all strains. Nitrate and nitrite concentrations
were determined by ion chromatography using the 850 Professional IC (Metrohm,
Herisau, Switzerland) with a Metrosep® A Supp 5 analytical column (250 mm × 4.0 mm).
For the N2O reduction culture assays, strain JAM1 was cultured under anaerobic
conditions with 40 mM NaNO3 and 100 μmol N2O injected in the headspace (3500
ppmv). Headspace accounted for approximately 40 ml, half of the total volume of the
flask. N2O concentration in the headspace was determined by gaseous chromatography
using an Agilent 7890B series GC Custom (SP1 option 7890-0504/0537) with a Haye
Sep Q80/100 column. N2O was detected with an electron capture detector.
6.4.2 Construction of the Knockout Mutants
A protocol modified from Thongdee et al. (2008) was used to construct the
JAM1ΔnarG1 and the JAM1ΔnarG2 mutants. The upstream and downstream regions of
narG1 and narG2 were amplified and subsequently fused together with two rounds of
PCR (Supplementary Image S1). The JAM1ΔnarG1narG2 double mutant was obtained
using the same protocol with JAM1ΔnarG1 as the host strain.
The first round of PCR was performed in a 50-μl reaction volume with the
ThermoPol® Buffer (New England Biolab), 10 μg bovine serum albumin (BSA), 200 μM
deoxynucleotide triphosphate (dNTP), 100 pmol of each primer (Supplementary Table
S1), 100 ng of strain JAM1 DNA and 1.25 U of Taq DNA polymerase. PCR was
performed at 95°C for 30 s, followed by 30 cycles at 95°C for 30 s, 63.5°C or 64°C for 45
s for the ΔnarG1 or ΔnarG2 constructions, respectively, 68°C for 30 s (Supplementary
Table S1), and a final extension period of 10 min at 68°C. The second round of PCR
was performed with the same PCR reagents, 50 ng of each of the first round amplicons
and 100 pmoles of the narG1-upF/narG1-dnR or narG2-upF/narG2-dnR primers
(Supplementary Table S1). However, these primers were added only after the third PCR
cycle to allow the two amplicons to join together. PCR was then performed as in the first
PCR round. The expected DNA fragments were extracted by agarose gel
electrophoresis and purified using Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System
67
(Promega). The fragments were ligated into the pEX18Gm plasmid vector (Hoang et al.,
1998) via SacI and BamHI for the narG1 knockout mutant and EcoRI and PstI for the
narG2 knockout mutant. The DNA constructions were then cloned in Escherichia coli
DH5α (Sambrook et al., 2001) and screened for gentamicin-resistant clones. Plasmid
DNA was extracted from the representative clones, and the presence of the insert in the
plasmid was verified by enzymatic digestion with SacI and BamHI or EcoRI and PstI.
The respective constructions were electroporated in strain JAM1 (or in the
JAM1ΔnarG1 mutant for the double mutant) using the following protocol: strain JAM1
was cultured for 24 h to reach an OD600nm of 0.6; 1 ml of the culture was centrifuged at
12,000 × g for 1 min; the cells were washed five times with 300 mM of a sucrose solution
to remove all salts and then concentrated in 100 μl of sucrose solution; the
electroporation was performed on ice with 100 μl of bacterial cells and 100 ng of plasmid
DNA at 2500 V; after the electric shock, the cells were transferred in the 1403 medium
and incubated at 30°C for 4 h and then centrifuged and plated on 1403 agar medium
supplemented with gentamicin (50 μg/ml); the resistant colonies were transferred in
1403 medium supplemented with 50 μg/ml of gentamicin; and the simple recombinants
were plated on 1403 agar medium supplemented with sucrose (10%) to isolate the
double recombinants using the sucrose sensitivity gene sacB of pEX18Gm. The gene
arrangements of the knockout mutants were confirmed by PCR. Attempts to do
complementation assays in the mutants by electroporation or by conjugation with the
MiniCTX1, MiniCTX2, and pUC18-miniTn7 integrative vectors were unsuccessful.
6.4.3 RNA Extraction
To measure the transcriptional level of narG1, narG2, narK1, and narK12f by RTqPCR, total RNA was extracted from strain JAM1 and the JAM1ΔnarG1 and
JAM1ΔnarG2 mutants that were cultivated under the following conditions: (1) aerobic
without nitrate, (2) aerobic with nitrate and (3) anaerobic with nitrate. Total RNA from
strain JAM1 (anaerobic conditions with nitrate) was also used to investigate the possible
co-transcription of narK1narK2 and nar[1]GHJI, of nar[2]GHJI and ppi, and of ppi and
narK12f. In all cases, samples (5–30 ml) were taken during the exponential growth
phase (20–24 h of incubation). The bacteria were centrifuged and dispersed in the
68
extraction solution (composed of 500 μl of phenol-Tris-HCl, pH 4.3 and 1.5 ml of 50 mM
Tris-HCl, 100 mM EDTA, and 150 mM NaCl) and placed into 2-ml tubes containing 250
mg of 0.2 mm glass beads. The samples were then flash frozen in liquid nitrogen and
stored at -80°C until extraction.
After thawing, RNA was extracted by bead beating twice for 20 s with a
FastPrep-24® (MPTM) set at 4.0. The tubes were then centrifuged at 16,000 × g for 15
min at 4°C, and 500 μl of the upper phase was extracted three times with a
phenol/chloroform/isoamyl alcohol mix (25:24:1) and one time with chloroform/isoamyl
alcohol (24:1). The RNA was then recovered by precipitation with 100 μl of 10 M
ammonium acetate and 800 μl of 100% ethanol. After centrifugation at 16,000 × g for 15
min at 4°C, the supernatant was discarded, and the pellet was dried at room
temperature. Finally, the RNA was dissolved in DEPC-treated water and stored at 4°C.
The RNA extracts were treated twice with TurboTM DNase (Ambion) for 30 min to
remove all contaminant DNA. The absence of DNA was verified by end-point PCR.
Extractions were made separately from three independent samples.
6.4.4 Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 Transcriptome
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 transcriptome was derived from
total RNA extracted of anaerobic cultures with methanol and 40 mM nitrate. RNA was
sent to McGill University and Génome Quebec Innovation Centre for RNA sequencing
by Illumina method. The Ribo-ZeroTM rRNA Removal Kits (Meta-Bacteria; Epicentre,
Madison, WI, USA) were used to deplete total RNA of the ribosomal RNA. The RNA was
then treated with the TruSeq Stranded mRNA Sample Prep Kit (Illumina Inc, San Diego,
CA, USA). A total of 51,351,358, 49,962,176, and 52,021,554 reads were obtained for
the three replicates after sequencing. All computations were made on the
supercomputer Briarée from the Université de Montréal, managed by Calcul Québec and
Compute Canada. Raw RNA-seq files have been deposited in the NCBI database
(accession number SRP066381). Raw reads were filtered to remove low quality reads
using FASTX toolkit1 by discarding any reads with more than 10% nucleotides with a
PHRED score <20. Reads were then aligned with the reference genome M.
nitratireducenticrescens JAM1 (GenBank accession number CP003390) using Bowtie (v
69
2.2.3) with default parameters. SAMtools (v 0.1.18) and BEDtools (v 2.20.1) were used
for the generation of sam and bam files, respectively. The GC content of JAM1 genes
was also calculated using BEDtools (v 2.20.1), prior to normalization. Normalization of
the read count was done using the RPKM normalization function of the NOIseq package
in R (Tarazona et al., 2011). To exclude features with low read counts, a low count filter
was applied using a CPM method with a CPM value of 1 and a cutoff of 100 for the
coefficient of variation.
Non-ribosomal RNA reads were associated with 3,095 of 3,096 annotated genes.
The number of reads in corresponding genes between replicate cultures varied in the
percentage of standard variation (%SD: SD*100/average number of reads) from 0 to
107%, with an average %SD of 12.2% and a median %SD of 9.7%. Only 48 annotated
genes showed %SD above 40%. These results showed that, for the vast majority of
genes, the expression pattern between replicates was consistent. Because methanol
dehydrogenase is a key element of the metabolism in methylotrophs, the expression
level of the reported genes in this study was normalized to the level of mxaF (10130
normalized reads), which was arbitrarily set at 100.
6.4.5 RT-PCR
One step RT-PCRs were performed using QIAGEN® OneStep RT-PCR Kits
following the manufacturer’s protocol with 200 ng of total RNA extracted from strain
JAM1 and 100 pmoles of the primers narK2-narG1-F/narK2-narG1-R, narI2-Ppi-F/narI2Ppi-R, or Ppi-narK12f-F/Ppi-narK12f-R (Supplementary Table S2). Briefly, the reaction
began with a reverse transcription step of 30 min at 50°C followed by an initial PCR
activation step of 15 min at 95°C. Next, 30 cycles of 45 s at 94°C, 45 s at 60°C and 1
min at 72°C were performed with a final extension step of 10 min at 72°C. The
amplicons were visualized by agarose gel electrophoresis and revealed by ethidium
bromide staining. Negative controls were RT-PCR carried out with no template.
70
6.4.6 RT-qPCR Assays
cDNAs were generated from the RNA using hexameric primers and the Reverse
Transcription System from Promega (Madison, WI, USA) with 1 μg of RNA extract. Realtime quantitative PCR assays were performed with the PerfeCTa® SYBR® Green
SuperMix ROXTM (Quanta). The final volumes of all reactions were 20 μl, and the
amplification mix was composed of 10 μl of PerfeCTa® SYBR® Green SuperMix, 0.4 μl
of each primer (40 pmoles; Supplementary Table S2), 4.2 μl of RNA-free water and 5 μl
of cDNA (25 ng). All reactions were performed in a Rotor-Gene 6000 real-time PCR
machine (Corbett Life science). PCR began with an initial denaturation step of 10 min at
95°C followed by 40 cycles of 10 s at 95°C, 15 s at 60°C, and 20 s at 72°C. To confirm
the purity of the amplified products, a melting curve was performed by increasing the
temperature from 65 to 95°C in increments of 1°C per step with a pause of 5 s for each
step. The reference genes used were dnaG (primase; locus tag: Q7A_342), rpoD (sigma
factor, Q7A_343) and rpoB (RNA polymerase β subunit, Q7A_2329; Supplementary
Table S2). These genes were retrieved from the strain JAM1 genome sequence
(GenBank accession number CP003390). All genes for each sample were tested in a
single run. The amplification efficiency was tested for each set of primer pairs by qPCR
with a dilution of strain JAM1 DNA as the template. The amplification efficiencies for all
primer pairs varied between 0.9 and 1.1.
6.4.7 Relative Quantification
Relative quantifications were performed according to the ΔΔCT method (Livak et
al., 2001). For each quantification calculation, only one reference gene was used as a
control. The reference gene was chosen from among the three genes tested based on
the lowest variability according to geNorm (Vandesompele et al., 2002), Normfinder
(Andersen et al., 2004), BestKeeper (Pfaffl et al., 2004) and the comparative ΔΔCT
method (Silver et al., 2006). A final recommended comprehensive ranking was created
from the geometrical means of the weights assigned by the four tests to allow for the
selection of the appropriate control gene. The Prism software (version 5.00) was used
for the statistical analyses, and significance was determined according to Student t-tests
of the ΔCTs (α value = 0.05).
71
6.4.8 Fnr and NarL DNA-Binding Motifs
The genomic sequence of M. nitratireducenticrescens JAM1 was analyzed in the
upstream sequence of the narX, narK1, narG2, and narK12f for potential transcription
factor binding sites (TFBSs) of Fnr/Anr and NarL regulators using the Virtual Footprint
software of PRODORIC (Munch et al., 2005). Briefly, the software allowed the analysis
of promoter sequences with position weight matrices (PWMs) of known TFBSs from the
PRODORIC database2. A score was assigned to hits depending on the degrees of
matches with the PWM. Potential regulator binding sequence scores were calculated
with PWM. Threshold scores of 3.7, 5.0, and 7.0 were considered according to mean
scores of PWMs for NarL (E. coli), NarL (Pseudomonas aeruginosa), and Fnr (E. coli),
respectively.
6.5 Results
6.5.1 The Chromosomic Arrangement of the Denitrification Genes
and their Expression under Anaerobic Conditions
The two narGHJI operons (nar[1]GHJI and nar[2]GHJI) that encode the Nar1 and
Nar2 systems, respectively, are in close proximity and in opposite directions (Figure 6.1).
Two ORFs encoding NarK transporters were found upstream of the nar[1]GHJI operon,
and they corresponded, respectively, to the NarK1-type and NarK2-type transporters.
NarK1 is a nitrate/proton symporter that uses the proton motive force to transport nitrate
molecules into the cytoplasm, whereas NarK2 is a nitrate/nitrite antiporter that is able to
uptake a nitrate molecule into the cytoplasm by releasing a nitrite molecule into the
periplasm (Moir et al., 2001). The narK genes can be found upstream of the narGHJI
operon in a large number of denitrifiers, and some species have a pair of narKs at this
position, as in strain JAM1 (Schreiber et al., 2007). Another ORF encoding a fused
NarK1-NarK2 transporter (here named narK12f) is located downstream of the
nar[2]GHJI operon (Goddard et al., 2008). Between the narK12f and the nar[2]GHJI
operons is an ORF encoding a parvulin-like peptidyl-prolyl isomerase (ppi). This type of
protein is known to be involved in protein folding (Gothel et al., 1999). To highlight the
potential co-transcription of narK1narK2 and nar[1]GHJI, of nar[2]GHJI and ppi, and of
72
ppi and narK12f, pairs of primers were designed to target the intergenic sequences of
narK2-narG1 (40 nt), narI2-ppi (17 nt) and ppi-narK12f (18 nt) with RT-PCR. RT-PCR
products were obtained for the intergenic regions of narK2-narG1 but not for the
intergenic region of narI2-ppi and of ppi-narK12f (Supplementary Image S2), which
suggests
co-transcription
of
narK1narK2
with
nar[1]GHJI.
Upstream
of
narK1narK2nar[1]GHJI are two ORFs that encode a two-component system similar to
the nitrate/nitrite sensor system NarXL. The expressions of many genes are under
control of this two-component system in E. coli, including the nitrate transporter narK and
narGHJI (Li et al., 1994). NarL potential binding sites were found upstream of
narK1narK2nar[1]GHJI, nar[2]GHJI, and narXL (Table 6.1). Strain JAM1 contains, in
addition to the two nar gene clusters, two gene clusters predicted to encode two nitric
oxide reductases (Nor) and one nitrous oxide reductase (Nos; Figure 6.1). Based on
automated annotation, we reported previously that a small ORF (Q7A_474) encodes a
truncated NirK (Villeneuve et al., 2013). Scrupulous analyses of this sequence revealed
that it encodes a 137 amino acid protein with a cytochrome c binding site (CXXCH).
Among the most related sequences are some NirK that contain this domain (Ellis et al.,
2007). However, we did not find any related domains (e.g., copper binding sites) specific
to NirK, which suggested that this ORF encodes cytochrome c. Sequence homology
analyses in databases were negative for potential NirS/NirK in the strain JAM1 genome.
Figure 6.1: Gene arrangement of the 67 kbp region containing all of the denitrification genes
Sequences and annotations are from GenBank accession number CP003390.2. The numbers above the
gene arrangement are the tag locus numbers (Q7A_0430 to Q7A_488).
∗ The corresponding narG that were mutated to derive the knockout mutants. See Supplementary Table S3
for the description of the 58 genes and the relative level of transcript reads.
73
Based on the transcriptome analysis, the gene expression level of the nar1 gene
cluster under anaerobic conditions is approximately eightfold higher than the nar2 gene
cluster and narK12f (Table 6.2). Despite the absence of a gene encoding nitrite
reductase to generate NO, gene clusters encoding Nor1 and Nos were expressed at
higher levels than the two nar gene clusters (Table 6.2). These results suggested that
strain JAM1 can reduce NO and N2O. Indeed, strain JAM1 cultured under anaerobic
conditions with nitrate and N2O can completely reduce N2O in 24 h (Figure 6.2). Genes
involved in the NO stress response, nsrR (two ORFs), nnrS (three ORFs) and dnrN,
were found (Table 6.2), and all were expressed. NsrR is a transcriptional repressor from
the Rrf2 family and it regulates the expression of multiple genes, such as norB in
response to NO (Spiro, 2011, Wang et al., 2008). NnrS and DnrN are involved in
protection against NO damage (Heurlier et al., 2008, Stern et al., 2013). These results
suggested that strain JAM1 possesses different mechanisms, already expressed under
anaerobic conditions, in response to potential NO damage.
Table 6.1: Sequences of potential NarL and ANR binding sites
74
6.5.2 Effects of the Knockout Mutations of narG1 and narG2 on
Growth and on Nitrate Reduction
The investigation of the importance of each Nar system in strain JAM1 was
possible by establishing a knockout mutation protocol. The construction of single gene
knockout mutants of the two narGs and a narG1narG2 double mutant was achieved.
The effects of each mutation on growth and nitrate reduction were investigated under
three different conditions: aerobic without nitrate, aerobic with nitrate and anaerobic with
nitrate (Figure 6.3). Under aerobic conditions with nitrate (Figures 6.3A–C), strain JAM1
and the three mutants exhibited similar growth patterns (Figure 6.3A). Only the
JAM1ΔnarG1narG2 double mutant cultures presented with a higher growth yield in the
stationary phase. This growth yield was also reached by all strains when they were
cultured under aerobic conditions without nitrate (Figure 6.3A). The deletion of narG1
(JAM1ΔnarG1) resulted in an 81% decrease in the nitrate specific reduction rate relative
to strain JAM1, and the deletion of narG2 (JAM1ΔnarG2) resulted in a 36% reduction.
In contrast to the observations under aerobic conditions, strain JAM1 and the
three mutants exhibited distinct growth patterns when cultured under anaerobic
conditions (Figure 6.3D). The JAM1ΔnarG1narG2 double mutant exhibited a minimal
level of growth which was also observed in the anaerobic nitrate-free culture controls
(Figure 6.3D). Therefore, this growth was likely the result of residual O 2 contained in the
complement solution or introduced during sampling. The lack of the narG2 gene led to a
lower growth rate of the JAM1ΔnarG2 mutant, but the growth yield reached by this
mutant was similar to that of strain JAM1. The JAM1ΔnarG1 mutant also exhibited a
much lower growth rate, and did not reach the same maximum growth yield reached by
the JAM1ΔnarG2 mutant and strain JAM1 after 55 h of culture. All cultures reached the
stationary phase after 31 h of incubation.
The nitrate consumption of each strain appeared to be correlated to growth
(Figure 6.3E). Strain JAM1 reduced all of the nitrate contained in the medium within only
40 h with no delay, although the precultures were grown under aerobic conditions
without nitrate. The JAM1ΔnarG2 mutant only began to reduce nitrate after 20 h of
incubation, which corresponded to the beginning of its exponential growth phase. Total
nitrate reduction was achieved after 55 h of incubation. The JAM1ΔnarG1 mutant also
exhibited a delay in nitrate reduction, which began after 23 h of incubation. The
reduction of nitrate was still occurring during the late stationary phase. In all conditions,
75
nitrite accumulated proportionally to nitrate reduction (Figures 3C,F). Finally, no
reduction of nitrate or the production of nitrite was observed for the JAM1ΔnarG1narG2
double mutant under aerobic or anaerobic conditions, which demonstrated that no other
dissimilatory nitrate reduction enzymes were active in strain JAM1, as predicted by the
genome sequence.
Table 6.2: Relative level of transcriptomic reads of the denitrification genes
Reads: Number of normalized reads
*based on mxaF (10130 normalized reads) set at 100
NnrS: protein involved in response to NO; NsrR: Nitrite-sensitive transcriptional repressor;
Anr: transcriptional regulator; DnrN or NorA: Nitric oxide-dependent regulator
Information was based on GenBank annotations (CP003390)
76
Mass balance analysis of nitrate reduction and nitrite accumulation in strain
JAM1 and the single mutants cultured under anaerobic conditions (Figure 6.3) showed
7% decrease in average nitrite concentration over 55 days (0.05 mM NO 3-NO2 reduced
h-1), with no apparent decrease in the abiotic controls. This slight decrease could be the
result of the nitrate assimilation pathway present in strain JAM1 genome, and concurred
with the low number of reads corresponding to this pathway present in the transcriptome
(data not shown).
Strain JAM1 and the JAM1ΔnarG1 and JAM1ΔnarG2 mutants were cultured
under anaerobic conditions with different concentrations of nitrate to derive the
maximum specific growth rates and the half-saturation constants of nitrate for growth
(μmax and Ks; Figure 6.4). The μmax of the JAM1ΔnarG1 and JAM1ΔnarG2 mutants
were 3.2 and 2.2 times lower than the μmax of strain JAM1, respectively (Table 6.3),
which suggest additive effect of both Nar systems for growth. To assess the affinities of
strain JAM1 and the mutants toward nitrate for growth, the μmax/Ks ratios were
calculated (Healey, 1980). These ratios were in same order of magnitude ranging from
1.0 to 3.1.
Figure 6.2: N2O reduction by strain JAM1
Strain JAM1 was cultured in triplicate under anaerobic conditions with nitrate (40 mM) and N 2O (circle). A
control with no biomass was also conducted (square).
77
Figure 6.3: Growth, nitrate reduction and nitrite production in cultures of strain JAM1 and the
derivative narG mutants.
Strain JAM1 and the narG mutants were cultured under aerobic conditions without nitrate (A, dot lines),
under aerobic conditions with nitrate (A–C, solid lines) or under anaerobic conditions with nitrate (D–F), solid
lines). Control with strain JAM1 and no nitrate was also conducted under anaerobic conditions (D, diamond
with dash line). (A) and (D) : Growth. (B) and (E): nitrate reduction. (C) and (F): nitrite production
78
6.5.3 Relative Expression Levels of narG1, narG2, narK1, and narK12f
Strain JAM1 and the JAM1ΔnarG1 and JAM1ΔnarG2 mutants were cultivated
under aerobic conditions with or without nitrate and under anaerobic conditions, and the
biomasses were collected at the end of the exponential phase when nitrate reduction
activity was present in all strains. RT-qPCR assays were then performed to measure the
relative transcript levels of the two nar gene clusters and narK1 and narK12f. The
transport of nitrate into the cytoplasm is a key parameter in nitrate reduction by
membrane-bound nitrate reductases because the efficiency of nitrate reduction depends
on their presence (Bonnefoy et al., 1992, Clegg et al., 2006, Ferguson, 1994, Moir et al.,
2001, Sohaskey et al., 2003).
Figure 6.4: Specific growth rates
The specific growth rates of strain JAM1 and the narG mutants were derived from triplicate cultures of the
same inoculum under anaerobic conditions.
79
The cultivation of strain JAM1 under aerobic conditions with nitrate led to a
fourfold decrease in narG1 and narK1 expression (Figure 6.5A) relative to aerobic
conditions without nitrate (reference culture set at one), whereas narG2 and narK12f
were expressed at a significantly greater level (eight and sevenfold increase,
respectively) under anaerobic conditions. There were no significant differences in narG2
expression levels between strain JAM1 and JAM1ΔnarG1 under any of the culture
conditions (Figure 6.5B), whereas slight significant variations occurred in the expression
of narK12f. The narK1 expression in JAM1ΔnarG1 cultivated under anaerobic conditions
with nitrate decreased by 11-fold relative to strain JAM1 cultivated under the same
conditions. In JAM1ΔnarG2 cultivated under aerobic conditions with or without nitrate,
the level of narG1 and narK1 transcripts was much lower (25- and 27-fold decrease for
narG1 and 20-and 4-fold decrease for narK1, respectively) than those in strain JAM1
cultivated under the same conditions (Figure 6.5C). Finally, no significant change was
observed in the expression levels of narK12f between JAM1ΔnarG2 and strain JAM1
cultivated under any conditions (Figure 6.5C).
Table 6.3: Kinetics of growth and nitrate reduction under denitrifying conditions
µmax: maximum specific growth rates. Ks: half-saturation constants of nitrate for growth. Values between
parentheses are standard deviation of triplicates.
80
6.6 Discussion
Genetic tools are essential for deciphering the different mechanisms of action of
organisms. These tools are rarely readily available with new environmental bacterial
species and they have to be derived from other systems or developed entirely. In this
study, the investigation of the importance of the two Nar systems in strain JAM1 were
possible by establishing a knockout mutation protocol. The strategy of building the narG
gene knockout mutants was derived from that of Hoang et al. (1998), and this strategy
has been successfully applied in P. aeruginosa (Colvin et al., 2011, Deziel et al., 2004,
Jain et al., 2014). This study is the first report of Methylophaga gene knockout mutants.
The targeting strategy developed in our study will certainly allow for the determination of
the involvements of different Methylophaga genotypes in future studies. However, other
genetic tools such as integrative vectors for gene complementation or autonomous
plasmids for gene regulation studies have still to be developed.
The presence of the two Nar systems could allow strain JAM1 to reduce more
nitrate in a defined time, which produces more energy for the cells and thus allows faster
growth. The inactivation of each of the two Nar systems clearly showed that both
systems contributed to the growth of strain JAM1 under anaerobic conditions, but at
different levels. The differences between the two mutants in growth rate and nitrate
reduction could be explained by differences in specific activity of the two nitrate
reductases, by higher concentration of the Nar1 system in the membrane, or both. The
calculated μmax/Ks ratios of the two mutants suggest that both Nar systems have similar
specific activity toward nitrate for growth. On the other hand, the transcriptome of strain
JAM1 cultivated under anaerobic conditions showed that the nar1 gene cluster was eight
times more expressed than the nar2 gene cluster, suggesting higher concentration of the
Nar1 system during these growth conditions. Interestingly, the Nar2 system seems to
have another effect to the nitrate reduction dynamics as the lack of Nar2 action in
JAM1ΔnarG2 induced the 20-h lag time prior to nitrate reduction that occurred in this
mutant by the Nar1 system when cultured under anaerobic conditions.
Strain JAM1 demonstrated a large capacity in nitrate reduction, even under
aerobic conditions. This would suggest a constitutive expression of genes involved in
nitrate reduction or the lack of a functional oxygen regulation response. The single
mutants and the wild strain cultured under aerobic conditions without nitrate reached
81
higher growth yield than under aerobic conditions with nitrate (Figure 6.3A). These
observations suggest that the nitrate and oxygen respiration systems in strain JAM1
compete with each other. This has also been suggested for P. aeruginosa (F. Chen et
al.,
2003).
This
would
explain
the
highest
growth
yield
reached
by
the
JAM1ΔnarG1narG2 double mutant in aerobic cultures with or without nitrate (Figure
6.3A) as, without functional nitrate respiration, the oxygen respiration produced energy
more efficiently. Competition between both respiration systems may explain the
significant decrease of the narG1 transcripts in strain JAM1 cultured under aerobic
conditions with nitrate. Another suggestion would be that nitrite toxicity limits the growth
of strain JAM1. Indeed, Auclair et al. (2010) showed a fourfold decrease in biomass
when strain JAM1 was cultured aerobically in presence of 0.36 mM nitrite (no nitrate) at
the beginning of the culture, and no growth occurred in the presence of 0.71 mM nitrite.
Oxygen and nitrate are known to regulate Nar expression in several bacteria.
Fumarate and nitrate reductase regulation (FNR) protein family, an oxygen responsive
transcription regulator, is known to be a major nitrate reductase regulator in several
bacteria (Gunsalus et al., 1994, Jordan et al., 1997, Philippot et al., 1999). Strain JAM1
encodes in its genome an ANR protein (Table 6.2), and one potential ANR binding site
was found upstream of narXL (Table 6.1). Transcriptional regulation consistent with the
presence of ANR/NarL was observed with the nar2 gene cluster and narK12f under
anaerobic conditions in strain JAM1, with an eightfold increase of their transcriptional
level relative to the aerobic conditions (Figure 6.5A). Such a pattern was not observed
with the nar1 gene cluster, where narG1 and narK1 were not upregulated under
anaerobic conditions compared to the aerobic conditions without nitrate. The high nitrate
reduction capacity of strain JAM1 under both aerobic and anaerobic conditions suggests
high level of the basal expression of nitrate reductases, in particular the Nar1 system
(Table 6.2). However, in absence of the Nar2 system (JAM1ΔnarG2), gene expression
of narG1 and narK1 (both are co-transcribed) was deeply affected (ca. 25-fold decrease)
by the presence of oxygen. In presence of oxygen and nitrate, gene expression of narG1
and narK1 of strain JAM1 was also down regulated but at a lower extend (fourfold
decrease). These results suggest that the Nar2 system contributes in the regulation of
the expression of the Nar1 system in the presence of oxygen in strain JAM1. How this
regulation occurs (directly or indirectly) is unknown. There is still the possibility that this
effect is an artifact created by the gene deletion. Regulation by cis- or trans-regulatory
elements from the vector was excluded, because the three mutants were generated by
82
double recombination and that no trace of the vector was found. Attempts to generate
complement strains failed with three integrative vectors that were successfully used with
other Gammaproteobacteria.
Figure 6.5: Relative expressions of narG1, narG2, narK12f, and narK1
Strain JAM1 (A), JAM1ΔnarG1 (B) and JAM1ΔnarG2 (C) were cultured in triplicate of the same inoculum
under aerobic conditions with or without nitrate and under anaerobic conditions with 40 mM nitrate. Biomass
was collected during the exponential phase, and total RNA was extracted for RT-qPCR assays. (A) Changes
in the levels of narG1, narG2, narK12f, and narK1 transcripts in strain JAM1 cultures under aerobic with
nitrate and anaerobic conditions were calculate d relative to their expressions under aerobic conditions
without nitrate (set to one, white column). (B,C) Changes in the levels of narG1, narG2, narK12f, and narK1
transcripts in the JAM1ΔnarG1 and JAM1ΔnarG2 cultures under the three conditions were calculated
relative to their expressions in the strain JAM1 cultures under the respective conditions. Error bar represents
standard deviation of triplicate values.
∗ 0.05 < P < 0.01; ∗∗ 0.01 < P < 0.001; ∗∗∗ P << 0.001
While it is not infrequent to find multiple nitrate reductases in a single bacterial
species, the presence of multiple nitrate reductases of the same type has been reported
only rarely in previous studies (Bonnefoy et al., 1994, Chang et al., 1999, Y. Chen et al.,
2011, Hartsock et al., 2011, Potter et al., 1999b). For instance, E. coli expresses two
different cytoplasmic membrane nitrate reductases, nitrate reductase A (NRA) and
nitrate reductase Z (NRZ), which are encoded by two different operons, narGHJI and
narZYWV, respectively (Bonnefoy et al., 1994). The roles of these two Nar systems in
the cell appear to be distinct because NRA reduction activity accounts for 98% of all of
the nitrate reduction activity of E. coli. The expression of narGHJI is positively controlled
by nitrate concentration through the NarXL two-component system and is strongly
repressed by oxygen. Unlike what was observed in strain JAM1, growth of the E. coli
ΔnarZ mutant expressing only the NRA system is similar to that of the wild type strain in
minimal medium in which nitrate is the sole final electron acceptor, while the E. coli
ΔnarG mutant expressing only the NRZ system is unable to grow under these conditions
83
(Potter et al., 1999b). In Hyphomicrobium zavarzinii that also encodes two Nar systems,
the expression of only one nar gene cluster was deeply downregulated by oxygen
(Martineau et al., 2015).
Although in pure culture, strain JAM1 accumulated nitrite, in the denitrifying
biofilm, where it was isolated, nitrite is most likely processed by other denitrifying
bacteria such as H. nitrativorans NL23, the second most represented bacteria in the
biofilm (Auclair et al., 2012, N. Labbé et al., 2007, Martineau et al., 2013b). Both bacteria
are methylotroph, but assimilate differently the carbon. Methylophaga sp. process
methanol via the RuMP pathway, whereas Hyphomicrobium sp. via the serine pathway.
Other denitrifying bacteria were found in the biofilm but they represented less than 1% of
total bacteria (data not shown). One model is that syntrophy was established in the
biofilm between M. nitratireducenticrescens JAM1 and H. nitrativorans NL23 for
denitrification. Also, because Methylophaga sp. are known to produce the osmoprotectant ectoine (Doronina et al., 2010), strain NL23 would have been protected
against osmotic stress as it is intolerant to seawater in pure culture (Martineau et al.,
2015, Martineau et al., 2013b). Genes involved in the production of ectoine were found
among the most expressed in strain JAM1 pure culture (ectABC: 35–49 relative to
mxaF).
6.7 Conclusion
The transcriptional level of nar1 was higher than nar2 in strain JAM1 cultured
under anaerobic conditions. The absence of the Nar1 system had a more negative effect
on the growth rate and nitrate reduction rate than the absence of Nar2. These results
suggested that the Nar1 system is the major nitrate reductase in strain JAM1. However,
the Nar2 system appears to contribute in the regulation of the expression of the Nar1
system. Its absence induced a 20-h lag time in nitrate reduction. At the gene level, the
nar1 gene cluster is deeply downregulated by oxygen in the absence of the Nar1
system. In contrast, the absence of the Nar1 system did not affect the level of the nar2
transcripts. New knowledge generated in this study about the importance of the two
dissimilatory (Nar) nitrate reductases in M. nitratireducenticrescens JAM1 could allow for
84
a better understanding of the denitrification pathway within the biofilm microbial
population where strain JAM1 was isolated.
6.8 Funding
This project was financially supported by a grant to RV from the Natural Sciences
and Engineering Research Council of Canada and by scholarships to CM from the
Fondation Universitaire Armand-Frappier and the Fonds de Recherche du Québec
Nature et Technologies. Supercomputer infrastructure of Calcul Québec and Compute
Canada was funded by the Canada Foundation for Innovation, Ministère de l’Économie,
de l’Innovation et des Exportations du Québec and the Fonds de Recherche du Québec
- Nature et technologies (FRQ-NT).
6.9 Conflict of Interest Statement
The authors declare that the research was conducted in the absence of any
commercial or financial relationships that could be construed as a potential conflict of
interest.
6.10 Acknowledgment
We thank Karla Vasquez and Marie-Christine Groleau for their technical
assistance.
85
7. Présentation de l’article 2
Reduction of nitric oxide (NO) and nitrous oxide (N2O) by the methylotrophic, marine
bacterium Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1
Réduction de l’oxyde nitrique (NO) et de l’oxyde nitreux (N2O) par la bactérie marine et
méthylotrophe Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1
Florian Mauffrey, Philippe Constant, and Richard Villemur
FM : contribution principale à l’élaboration et la réalisation des expériences et à la
rédaction de l’article.
PC : aide sur l’élaboration des expériences et conseils.
RV : élaboration des expériences et rédaction de l’article.
Soumis après corrections à Applied and Environmental Microbiology
86
7.1 Résumé
Methylophaga nitratireducenticescens JAM1 est une bactérie marine isolée à
partir d’un biofilm marin. Elle peut croître en conditions anaérobies en réduisant le nitrate
en nitrite. Le nitrite produit n’est pas réduit en oxyde nitrique (NO), ce qui est corrélé
avec l’absence d’une nitrite réductase dissimilatoire. Par contre, le matériel génétique
nécessaire à la réduction de l’oxyde nitrique (Nor1 et Nor2) et de l’oxyde nitreux (N2O;
Nos) est présent dans son génome. Dans cette étude, nous avons démontré que la
souche JAM1 était capable de réduire le NO et le N2O en conditions aérobies et
anaérobies. De plus, la souche JAM1 était aussi capable de croître en conditions
anaérobies avec du N2O comme seule source d’énergie. Pendant l’étude, nous avons
observés la capacité de la souche JAM1 à produire du N2O en phase stationnaire quand
elle est mise en culture avec du nitrate. Nous avons trouvé que le nitrite était un
intermédiaire clé de cette production. De même, de l’hydroxylamine est produite par la
souche JAM1 et est liée à la production de N2O. Des expériences de marquage
isotopique avec des cultures supplémentées en
15
NO3-- ou
15
NH4+ que plus de 95 % du
N2O produit par la souche JAM1 provenait du nitrite. Par ailleurs, nous avons démontré
que la succession des phases de production et de consommation du N2O en conditions
anaérobies est corrélée avec des changements dans les niveaux d’expression des
gènes nor et nos. Nos résutlats suggèrent que M. nitratireducenticrescens JAM1 peut
participer à la réduction du NO et du N2O dans le biofilm.
87
7.2 Summary
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 is a marine methylotrophic
bacterium isolated from a denitrifying biofilm. It can sustain growth under anaerobic
conditions by reducing nitrate into nitrite. Nitrite is not reduced in nitric oxide (NO), which
correlates with the absence of dissimilatory nitrite reductase. However, the genetic
material necessary for the reduction of nitric oxide (Nor1 and Nor2) and of nitrous oxide
(N2O; Nos) is present in its genome. In this study, we demonstrated that the reduction of
NO and N2O occurred in strain JAM1 cultures under both aerobic and anaerobic
conditions. Furthermore, strain JAM1 was also able to grow under anaerobic conditions
using N2O as the sole energy source. During the investigation, we observed the ability
of strain JAM1, when cultured with nitrate, to produce N2O during the stationary phase.
Nitrite was found to be the key intermediate of this production. Additionally,
hydroxylamine was produced by strain JAM1 cultures and was linked to N2O production.
Isotopic labeling assays with
15
NO3−- or
15
NH4+-supplemented cultures revealed that
more than 95 % of N2O produced by strain JAM1 originated from nitrite. Furthermore, we
demonstrated that the succession of N2O-production and -consumption phases under
anaerobic conditions correlated with changes in nor and nos gene expression levels.
Our results suggest that M. nitratireducenticrescens JAM1 can participate in the
reduction of NO and N2O in the biofilm.
88
7.3 Introduction
Denitrification describes the successive reduction of nitrate (NO3−) into nitrite
(NO2−), nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O), and nitrogen (N2) (Van Spanning et al.,
2005). This dissimilatory process is used by bacteria for respiration in environments with
low oxygen concentration and NO3− as the electron acceptor. The process is driven by
the metalloenzymes NO3− reductase (Nar), NO2− reductase (Nir), NO reductase (Nor),
and N2O reductase (Nos) (Einsle et al., 2004). As a facultative trait, denitrification is
widespread across environments and performed by bacteria with diverse origins (Zumft,
1997). Although complete denitrification pathways exist in many organisms, some
bacterial species are only capable of partial or incomplete denitrification. For example,
Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 can reduce all nitrogen oxides, except NO2−, while
Neisseria meningitidis can only reduce NO2− and NO (Van Spanning et al., 2005). Other
bacteria, such as Nitrosomonas europaea, have N2O as the final product of
denitrification, which can be problematic in the environment, as N2O is a powerful
greenhouse gas (K. A. Smith, 2010). The significance of an incomplete pathway is
unclear and may depend upon the original habitat and environment of each bacterial
strain. The intermediate NO is also a problem in denitrification because the molecule is
highly toxic to microorganisms, inducing nitrosative stress in the cell (Poole, 2005). The
reduction of NO is a key step in denitrification and is highly regulated by diverse sensors
and regulators. No energy is usually produced from this reaction, and bacteria usually
reduce NO for detoxification purposes (Mancinelli et al., 1983), although recent studies
revealed that Nor could be coupled to proton transfer pathway and be electrogenic (AlAttar et al., 2015, Matsumoto et al., 2012).
We have studied for many years the microbial ecology of a naturally occurring,
multispecies-denitrifying biofilm that developed in a methanol-fed, fluidized denitrification
system treating NO3−-contaminated sea water. This biofilm is composed at least 15
bacterial species (among the most abundant) and numerous protozoan (N. Labbé et al.,
2003a, Laurin et al., 2008). Among these bacteria, Methylophaga spp. and
Hyphomicrobium spp. composed more than 70% of the biofilm (N. Labbé et al., 2007).
Two strains affiliated to these genera were isolated, characterized, and their genome
sequenced.
Hyphomicrobium
nitrativorans
NL23
is
a
methylotrophic
Alphaproteobacterium that can perform complete reduction of NO3− into N2 (Martineau et
al., 2013b). This correlates with the complete set of gene clusters found in its genome to
89
perform denitrification (Martineau et al., 2015, Martineau et al., 2013a). Methylophaga
nitratireducenticrescens JAM1 is a marine methylotrophic Gammaproteobacterium that
can grow under anaerobic conditions by the reduction of nitrate into nitrite (Villeneuve et
al., 2013). Two Nar gene clusters are present in its genome, which we showed they both
contribute to the nitrate reduction during strain JAM1 growth (Mauffrey et al., 2015).
Nitrite reduction was never recorded in strain JAM1 cultures, which correlates with the
absence of gene cluster encoding NO-forming nitrite reductase (nirK or nirS) in its
genome (Auclair et al., 2010, Villeneuve et al., 2012). However, strain JAM1 genome
contains gene clusters encoding the assimilatory, cytoplasmic NAD(P)H-NO3− and -NO2−
reductases (NasA-NirBD), for the reduction of NO3− into ammonium (NH4+). In addition
to NO3−-reduction systems, the strain JAM1 genome contains the genetic material
required for NO and N2O reduction via two cNor (norQDBCRE and norCBQD clusters)
and a Nos (nosRZDFYYL cluster). These gene clusters were shown to be transcribed
(Mauffrey et al., 2015). These data suggest that M. nitratireducenticrescens JAM1 can
reduce NO and N2O into N2.
In this study, we investigated more thoroughly the capacity of strain JAM1 to
reduce NO and N2O in pure culture, and use N2O as a source of energy for its growth.
During this investigation, we noticed that strain JAM1 cultures generated N2O during the
stationary phase. We further analyzed this phenomenon and found that NO 2− is a key
intermediate of this production. Finally, we assessed the influence of N2O reduction and
production on the gene expression level of the two norB, nosZ and nnrS, which encoded
for a NO-sensitive regulator. Our results pointed out for the capacity of M.
nitratireducenticrescens JAM1 to participate in the reduction of NO and N2O in the
original denitrifying biofilm.
90
7.4 Materials and methods
7.4.1 Bacterial growth conditions
M. nitratireducenticrescens JAM1 and the JAM1ΔnarG1narG2 double mutant
were cultured in the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)
Methylophaga medium 1403 (Mauffrey et al., 2015, Villeneuve et al., 2013). When
needed, NO3− (NaNO3; Fisher, Ottawa, ON, Canada), NO2− (NaNO2; Fisher, Ottawa, ON,
Canada), or hydroxylamine (NH2OH · HCl; Fisher, Ottawa, ON, Canada) were added to
the medium. Medium (40 mL) was dispensed in a 720-mL bottle (680-mL head space),
screwed with caps equipped with septum and autoclaved. After autoclaving, these filtersterilized solutions were added in the bottles: 120 µL methanol (final concentration 0.3%;
74.3 mM), 800 µL solution T [composed per 100 mL: 0.7 g KH2PO4, 10 g NH4Cl, 10 g
Bis-Tris, 0.3 g ferric ammonium citrate (pH 8)], 400 µL Wolf’s mineral solution (ATCC;
pH 8), and 40 µL vitamin B12 (0.1 mg/mL). The final concentration of ammonium (NH4+)
in the regular 1403 medium was 21 mg-N vial-1 (20.9 mg-N.vial-1 from NH4Cl and 0.1 mgN vial-1 from ferric ammonium citrate). For anaerobic cultures, bottles were flushed with
nitrogen for 20 min prior to autoclaving. When needed, N2O (purity 99.9%, Praxair,
Mississauga, ON, Canada) and acetylene (10% vol/vol of headspace; (Praxair,
Mississauga, ON, Canada) were injected in headspace before autoclaving. Acetylene is
an inhibitor of nitrous oxide reductase and has been extensively used in N2O studies in
order to observe N2O production in cells (Fedorova et al., 1973). Inoculum was made of
fresh aerobic culture without NO3− to reach an optical density (OD600) of 0.025. Culture
bottles were shaken at 150 rpm and 30°C in the dark.
The capacity of strain JAM1 to reduce NO was tested with sodium nitroprusside
(Sodium NitroPrusside hypochloride (SNP), purity ≥ 99.0 %, Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, USA) as the NO source. Strain JAM1 was cultured in Methylophaga 1403 medium
under aerobic conditions without NO3−, for 24 h. The cells were then centrifuged (8000 X
g 5 min) and dispersed in fresh medium supplemented with 2 mM, 5 mM, or no SNP.
Culture medium with 5 mM SNP and no biomass was also performed as control.
Cultures were incubated under aerobic conditions, and N2O production was monitored.
To investigate the potential role of NH4+ in N2O production, NH4Cl-free cultures were
carried out under aerobic and anaerobic conditions using solution T containing no
NH4Cl. Prior to inoculation, cells from start-up cultures were centrifuged and washed
91
three times with saline solution in order to remove any residual traces of NH4+.
Bacterial growth was monitored by spectrophotometry (OD600). Bacterial flocs
were dispersed with a Potter homogenizer prior to measurements, especially under
aerobic conditions.
Oxygen concentration in the headspace was monitored in cultures under aerobic
conditions by gas chromatography equipped with a temperature conductivity detector
(7890B series GC Custom, SP1 option 7890-0504/0537; Agilent Technologies,
Mississauga, ON, Canada).
7.4.2 15N-labeling of N2O
Strain JAM1 cultures were made with 22 mg-N.vial-1Na15NO3 (Sigma-Aldrich, St.
Louis, MO, USA) in NH4Cl-free medium or with 22 mg-N.vial-1 Na14NO3 and 20.7 mgN.vial-1
15
NH4Cl (Sigma-Aldrich). Both cultures were carried out under anaerobic
conditions, and 10% acetylene was added to allow N2O to accumulate. Cultures were
made in triplicate. After 14 days of incubation, the headspace of each replicate was
pooled, and 100 mL of the gaseous phase was sampled in Tedlar bags. N2O-isotope
measurement was performed at the Environmental Isotope Laboratory (Earth &
Environmental Sciences; University of Waterloo, ON, Canada) using a Trace Gas-GVI
IsoPrime-Isotope Ratio Mass Spectrometry (TG-IRMS). Commercial N2O (purity 99.9%;
Praxair, Mississauga, ON, Canada) was also analyzed as a control.
Isotopic ratios of
45
[N2O]/44[N2O] and
46
[N2O]/44[N2O] were calculated for the
condition with 22 mg-N.vial-1 Na14NO3 and 20.7 mg-N.vial-1
peak intensity measured for
46
[N2O],
45
[N2O] and
15
NH4Cl according to the
44
[N2O]. Isotopic ratio of
15
N/14N was
derived from the previous results with Eq. 1.
15
Rs =
where Rs is the sample isotopic ratio (%),
N45+2[ 15N46 ]
(1)
2 [ 14N44]+ 14N45
14
N45 is the quantity of
92
14
N in
45
[N2O] (mole),
15
N45 is the quantity of
15
N in
45
[N2O] (mole),
14
N44 is the quantity of
14
N in
44
[N2O]
(mole) and 15N46 is the quantity of 15N in 46[N2O] (mole).
7.4.3 Measurements of nitrogenous compounds
NO3− and NO2− concentrations were determined by ion chromatography using the
850 Professional IC (Metrohm, Herisau, Switzerland) with a Metrosep A Supp 5
analytical column (250 mm × 4.0 mm).
N2O concentration was determined by gas chromatography. Headspace samples
(10 mL) were collected with a Pressure Lok gastight glass syringe (VICI Precision
Sampling Inc., Baton Rouge, LA, USA) and injected through the injection port of a gas
chromatograph equipped with an electron-capture detector (7890B series GC Custom,
SP1 option 7890-0504/0537; Agilent Technologies, Mississauga, ON, Canada).
Reproducibility of the N2O analyses was assessed before each set of measurements by
repeated analysis of certified N2O standard gas with standard deviations <5%. N2O
standards (500 ppm and 250 ppm) were made by dilutions from 10,000 ppm N2O stock
standard. The 10,000 ppm stock standard was obtained by injecting 1% of pure N2O
(Praxair) in a 720 mL gastight bottle. Detection limit of the N 2O was <10 ppbv,
corresponding to 0.3 nmol/vial in our bioassays. No significant N2O production was
observed for blank experiments involving sterile media or empty glass bottles. The total
quantity of N2O in the culture bottle (aqueous phase and headspace) (XN2O in µmole vial1
) was calculated according to Eq. 2.
𝑋𝑁2𝑂 = 𝐻𝑎𝑃𝑎𝑉𝑙 +
𝑉
𝑉
𝑉𝑛 𝑔
(2)
where Ha is the Henry constant for N2O (0.025 M/atm), Pa is the N2O partial pressure
(atm), Vl is the volume of the liquid phase (0.04 L), V is the partial volume of N2O, Vn is
the specific molar volume of the gas at atmospheric pressure and 20°C (24.055 L/mol),
and Vg is the volume of the gaseous phase (0.68 L). XN2O was then converted (eq.3) in
93
mg-N vial-1 for easier calculation of mass balance with the other nitrogenous
compounds:
𝑋𝑁 = 𝑋𝑁2𝑂 ×
Hydroxylamine
concentration
was
2𝑁
(3)
𝑁2 𝑂
measured
using
the
indirect
kinetic
spectrophotometric determination technique from Afkhami et al. (2006). NH4+
concentration was determined by spectrophotometry with the following reaction: 100 µL
sample, 1.7 mL deionized water, 0.1 mL 6% EDTA, 0.4 mL sodium salicylate/SNP
solution (3.9 g NaC7H5O3 and 0.05 g Na2Fe(CN)5NO.2H2O in 100 mL deionized water),
and 0.2 mL buffered hypochlorite [0.74 g NaOH, 1.3 g Na2HPO4, and 1.2 mL NaOCl 5%
in 25 mL deionized water (pH 13)]. After 20-min incubation at 37°C, absorbance was
read at 667 nm.
7.4.4 RNA extraction
Anaerobic cultures of strain JAM1 were made in an NH4Cl-free 1403 medium
supplemented with 22 mg-N.vial-1 NO3−. Cells were harvested at specific times, and RNA
was immediately extracted using the PureLink RNA mini kit (Ambion Thermo Fisher
Scientific, Burlington, ON, Canada). RNA extracts were treated twice with TurboDNase
(Ambion), and RNA quality was verified by agarose gel electrophoresis. Absence of
remaining DNA was checked by end-point polymerase chain reaction (PCR)
amplification of the 16S rRNA gene using RNA extracts as the template.
7.4.5 Gene expression
cDNAs samples were generated from the RNA using hexameric primers and the
Reverse Transcription System from Promega (Madison, WI, USA) with 1 μg of RNA.
Real-time quantitative PCR (qPCR) assays were performed with the Faststart SYBR
Green Master (Roche, Basel, Switzerland) according to manufacturer instructions. All
94
reactions were performed in a Rotor-Gene 6000 real-time PCR machine (Corbett Life
Science, Concorde, New South Wales, Australia), and each reaction contained 25 ng of
cDNA and 300 nM of primers (Table 7.1). Genes tested were norB1 and norB2
(encoding the catalytic sub-units of nitric oxide reductase 1 and 2, respectively), nosZ
(encoding the catalytic sub-unit of nitrous oxide reductase) and nnrS (encoding the NOsensitive regulator). PCR began with an initial denaturation step of 10 min at 95°C,
followed by 40 cycles of 10 s at 95°C, 15 s at 60°C, and 20 s at 72°C. To confirm the
purity of the amplified products, a melting curve was performed by increasing the
temperature from 65°C to 95°C in increments of 1°C per step with a pause of 5 s for
each step. All genes for each sample and standard were tested in a single run. The
amplification efficiency was tested for each set of primer pairs by qPCR using a dilution
of strain JAM1 genomic DNA as the template. The amplification efficiencies for all primer
pairs varied between 0.9 and 1.1.Copy number of each gene was calculated according
to standard curves using dilutions of strain JAM1 genomic DNA. In order to normalize
gene expression of the different growth phases, results were expressed as copy number
per dnaG copy number in each sample. Based on previous study (Mauffrey et al., 2015)
dnaG had the lowest variability among the reference genes tested (dnaG, rpoD and rpoB
in strain JAM1. dnaG encodes for a DNA primase and is present in one copy in strain
JAM1 genome. RNA extraction and qPCR were performed with three independent
biological replicates. The significance of the results was tested for each phase against
pre-culture phase with a Student t-test.
Table 7.1: PCR primers
Primers
norB1-510f
norB1-635r
norB2-334f
norB2-449r
nosZ-826f
nosZ-952r
dnaG-774f
dnaG-894r
nnrs-749f
nnrs-848r
Target gene
norB1
norB2
nosZ
dnaG
nnrS
Sequence (3'-5')
CCTGATCGGTTTGGCTCTC
CCCATGATCAATTCCCAGAC
GGCAACAAGCTATTGGAGCA
GTGGTGGTAAAGCGACCAGA
GAGCGTGACTGGGTAGTCGT
GTGTCAACTCGCTCCCTTTG
CATCCTGATCGTGGAAGGTT
GCTGCGAATCAACTGACGTA
TGTTCGCCATTTCAGCAATA
TAACCGATGTGCAAAGACCA
95
Source
Mauffrey
et al., 2015
Mauffrey
et al., 2015
Mauffrey
et al., 2015
Mauffrey
et al., 2015
This study
7.5 Results
7.5.1 Reduction of NO and N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1
Strain JAM1 was cultured with N2O under aerobic conditions with or without
NO3−,
or under anaerobic conditions in the presence of NO3− (Fig. 7.1A). A complete
consumption of N2O was observed within 24 h of incubation in all cultures. Growth
pattern of the two types of aerobic cultures was similar and reached a maximum OD600nm
of ~1.3, whereas the anaerobic cultures reached a maximum OD600nm of ~0.35 (Fig.
7.1B). Although vials were capped in the aerobic cultures, the O2 concentration in the
headspace (680 ml) did not show a significant decrease (T0hr = 20.4 ± 0.3 %; T100hr =
19.7 ± 0.9 %). Strain JAM1 was also cultured under anaerobic conditions without NO 3−
and with high level of N2O as the sole energy source. Growth was observed, reaching a
maximum OD600 of 0.22 ± 0.03 after 24 h of incubation (Fig. 7.1B). Control cultures
under anaerobic conditions without NO3- showed a slight growth with a maximum
OD600nm of ~0.09 (Fig 7.1B).
In order to verify NO reduction by strain JAM1, N2O generation was monitored in
aerobic cultures without NO3− supplemented with SNP used as the NO donor (Fig. 7.2).
N2O started to accumulate in both 2 mM and 5 mM SNP-supplemented media after 24 h
of incubation, reaching 7.9 ± 0.5 μg-N vial-1 and 14.5 ± 0.4 μg-N vial-1, respectively, after
168 h. Almost no N2O production was observed in strain JAM1 cultures without SNP or
in the controls with non-inoculated culture medium supplemented with SNP or inoculated
with autoclaved biomass.
96
Figure 7.1: Reduction of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1 and its growth on N2O.
(A) Strain JAM1 was cultured with ~3-5 mg-N vial
-1
-1
N2O under aerobic conditions with (22 mg-N vial ;
−
−
square) or without (triangle) NO3 , or under anaerobic conditions with NO3 (circle). N2O concentration was
measured at different time intervals. Controls were performed with non-inoculated culture medium
-
-1
(diamond). (B) Strain JAM1 was cultured under (i) aerobic conditions with NO 3 (22 mg-N vial ; square), (ii)
-
−
anaerobic conditions with NO3 (triangle), (iii) anaerobic conditions without NO3 but with N2O-saturated
-
atmosphere (circle), and (iv) anaerobic conditions without NO 3 (diamond). Optical density was measured at
different time intervals. Results were from triplicate cultures
97
7.5.2 Production of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1
After total consumption of N2O in 24 h in all cultures described in Figure 7.1, a
net production of N2O was observed under aerobic and anaerobic conditions when NO3−
was present. Under anaerobic conditions and after a period of N2O accumulation, net
N2O consumption was observed again. Under aerobic conditions, N2O slowly and
gradually accumulated. No N2O production was observed when NO3− was absent. To
further investigate this phenomenon, M. nitratireducenticrescens JAM1 was cultured
under aerobic or anaerobic conditions with 22 mg-N vial-1 NO3− for 4–5 days. Under
aerobic conditions, N2O was detected during the stationary phase after 24 h of
incubation and slowly accumulated in the medium afterward (Fig. 7.3A). No net N2O
reduction was observed during this phase (production could have been higher than
reduction), and the final concentration reached 0.14 mg-N vial-1 after 96 h of incubation.
Under anaerobic conditions, N2O production started at the beginning of the stationary
growth phase (~30 h) and reached 0.79 mg-N vial-1 after 60 h of incubation (Fig. 7.3B).
Unlike aerobic cultures, N2O was completely reduced after 120 h. No significant
reduction of NO2− was observed under these conditions. In the presence of 10%
acetylene, no further N2O reduction was observed in anaerobic cultures due to the
inhibition by acetylene, and N2O accumulated. However, the N2O production rate was
lower relative to that observed in acetylene-free cultures, with a N2O production of 0.66
mg-N vial-1 after 250 h (Fig. 7.4).
98
Figure 7.2: Reduction of NO by M. nitratireducenticrescens JAM1
−
Strain JAM1 was cultured under aerobic conditions without NO3 and with 2 mM (square), 5 mM (triangle),
or no (circle) sodium nitroprusside. N2O concentration was measured at different time intervals. Controls
with 5 mM SNP in non-inoculated culture medium (diamond) and in culture medium inoculated with
autoclaved biomass (white diamond) were also performed. Results were from triplicate cultures.
99
−
-1
−
same conditions. Results were from triplicate cultures. In panel D, asterisks indicate the sampling times for RNA extraction (see Figure 7).
(circle), NO2 (triangle), and N2O (square) concentrations were measured at different time intervals. Growth patterns were similar to that observed in Figure 1B under the
−
Strain JAM1 was cultured under aerobic or anaerobic conditions with NO 3 (22 mg-N vial ) in regular 1403 medium (A, B) or in NH4Cl-free 1403 medium (C, D). NO3
Figure 7.3: Production of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1.
100
7.5.3 Role of NO3− and NO2− in N2O production
Strain JAM1 and the JAM1ΔnarG1narG2 double mutant were cultured with 16.8
mg-N vial-1 NO3− under aerobic conditions. The JAM1ΔnarG1narG2 mutant lacks
functional Nar-type NO3− reductases and cannot grow under anaerobic conditions
(Mauffrey et al., 2015). Growth of strain JAM1 and the mutant was similar to that
observed for strain JAM1 in Figure 7.1B under the same conditions. After 96 h of
incubation, strain JAM1 completely reduced NO3− into NO2− and produced 0.14 mg-N
vial-1 of N2O (Table 7.2). As expected, NO3− was not reduced, and NO2− was not
produced by JAM1ΔnarG1narG2. Contrary to the wild type strain, the mutant did not
produce N2O.
The influence of NO2− was also tested. Because toxicity of NO2− was attested
from 0.36 mM (0.2 mg-N vial-1) for strain JAM1 (Auclair et al., 2010), strain JAM1 and the
mutant were cultured without NO3− under aerobic conditions to allow biomass growth.
After 24 h, 4.7 mg-N vial-1 NO2− was added to the cultures and incubated for another 72
h. Both strains produced 0.11 mg-N vial-1 and 0.18 mg-N vial-1 of N2O, respectively,
which was similar to N2O concentrations produced by strain JAM1 under aerobic
conditions with NO3− (Table 7.2).
Table 7.2: Reduction of nitrate, nitrite and production of N2O by strain JAM1 and the
JAM1ΔnarG1narG2 double mutant.
-1
Concentrations of nitrate, nitrite and nitrous oxide (mg-N vial ) were measured after 96 h (OD600nm ~ 1.2) of
incubation in strain JAM1 and JAM1ΔnarG1narG2 cultures under aerobic conditions with (A) 16.8 mg-N vial
1
−
-1
−
NO3 added at T0h or (B) 4.7 mg-N vial NO2 added at T24h. Results are from triplicate cultures.
Strain
JAM1
JAM1ΔnarG1narG2
JAM1
JAM1ΔnarG1narG2
Conditions
A
A
B
B
Nitrate
0.17 ± 0.06
17.1 ± 0.1
0
0
101
Nitrite
16.6 ± 0.7
0.22 ± 0.22
4.25 ± 0.09
4.87 ± 0.39
N2O
0.14 ± 0.01
0.004 ± 0.002
0.11 ± 0.03
0.18 ± 0.02
-
Figure 7.4: Production of N2O by M. nitratireducenticrescens JAM1 in presence of acetylene.
−
-1
Strain JAM1 was cultured under anaerobic conditions with NO3 (22 mg-N vial ) and 10% acetylene in
regular 1403 medium (triangle), and N2O concentrations were measured at different time intervals. Controls
were performed with non-inoculated culture medium (square). Results were from triplicate cultures.
7.5.4 Influence of NH4+ in N2O production
The original 1403 medium recommended by the ATCC for culturing
Methylophaga spp. contained 20.9 mg-N vial-1 NH4Cl. In order to investigate the
influence of NH4+ on N2O production, strain JAM1 was cultured with 22 mg-N vial-1 NO3−
under aerobic or anaerobic conditions in 1403 medium containing no NH4Cl. The only
other source of NH4+ in the medium was from ferric ammonium citrate (0.13 mg-N vial-1).
Even in absence of NH4Cl in the culture medium, growth in both conditions was similar
to that observed in Figure 7.1B. Under aerobic conditions, N2O was observed after 48 h
of incubation in NH4Cl-free cultures (Fig. 7.3C), after which it slowly accumulated and
reached a concentration of 0.05 mg-N vial-1. Unlike regular cultures (Fig. 7.3A), NO3−
was not completely reduced under NH4Cl-free conditions, and N2O production was 67%
lower. No significant reduction of NO2− was observed. Nitrogen assimilation by the
102
biomass could account for the difference in mass balance between nitrate (22 mg-N vial1
) and nitrite (13 mg-N vial-1), as nitrate was the only nitrogen source in the medium.
Under anaerobic conditions, NH4Cl-free cultures showed a net N2O production
and reduction profile similar to the N2O profile observed in regular cultures (Fig. 7.3D),
although with lower N2O concentrations being detected during the accumulating phase.
NO2− reduction was observed in NH4Cl-free cultures, contrary to the regular cultures,
with 37% reduction after 168 h.
NH4+ concentration was measured in strain JAM1 cultures under aerobic or
anaerobic cultures in NH4Cl-free medium (Fig. 7.5). No measurements were performed
on the regular 1403 medium, as NH4+ is present in excess in this medium. No NH4+ was
present after 24 h of incubation under anaerobic conditions, and decreased from 0.07
mg-N vial-1 to 0.04 mg-N vial-1 in 24 h under aerobic conditions. Under aerobic
conditions, NH4+ concentration increased from 24 h to 48 h to reach a level of ~0.16 mgN vial-1 after 100 h of incubation. Under anaerobic conditions, NH4+ concentration
increased from 24 h to 48 h and was maintained at ~0.07 mg-N vial-1 until the end of the
experiment.
The concentration of hydroxylamine (NH2OH) was measured in strain JAM1
cultured in the regular 1403 medium under different conditions. Barely any NH 2OH was
detected when strain JAM1 was cultured under aerobic conditions without NO3− (Fig.
7.6). In the presence of 22 mg-N vial-1 NO3− (and eventually NO2−), both aerobic and
anaerobic conditions led to the production of NH2OH up to 0.81 and 0.96 mg-N vial-1,
respectively. This represented approximately 3.7% and 4.4% of the starting NO 3concentration. Then, NH2OH concentrations stabilized with ~0.8 and ~0.65 mg-N vial-1
for aerobic and anaerobic conditions, respectively. Strain JAM1 was then cultured with 8
mg-N vial-1 NH2OH under aerobic conditions in the regular 1403 medium without NO3−.
Under these conditions, N2O was produced, with an accumulation of 0.25 mg-N vial-1
after 72 h (data not shown).
Isotopic labeling with
15
NH4+ was performed to assess the involvement of NH4+ in
the generation of N2O under anaerobic conditions, as suggested by the results with
hydroxylamine. Strain JAM1 was cultured under anaerobic conditions with 22 mg-N vial-1
NO3−, 20.7 mg-N vial-1
15
NH4+, and acetylene to block the reduction of N2O into N2.
Unfortunately, strain JAM1 cannot be cultured without NO3− under anaerobic conditions.
The
45
[N2O]/44[N2O] and
46
[N2O]/44[N2O] ratios were 0.008 and 0.0165, respectively; with
103
the isotopic ratio of
15
N/14N of 0.020418. As nitrate was provided in the medium, the
proportion of labeled N2O that originated from
15
NO3− naturally present in sodium nitrate
was calculated. We considered the preferential reduction of
14
N-NOx by denitrification
enzymes as negligible in our calculations (delta values ranging from -10 ‰ and -40 ‰)
(Snider et al., 2009). By subtracting the natural isotopic ratio of the supplemented NO3−
(15N/14N = 0.0036765) from that of the culture (15N/14N = 0.020418), the isotopic ratio
issued from
15
NH4+ is 0.0167415, which represent 1.65% of total N2O. As control, strain
JAM1 cultured under anaerobic conditions with
15
NO3− in NH4Cl-free medium with
acetylene showed, as expected, all N2O recovered in 46[N2O].
+
Figure 7.5: NH4 concentration in M. nitratireducenticrescens JAM1 cultures.
Strain JAM1 was cultured under aerobic (circle) or anaerobic (square) conditions in NH 4Cl-free 1403
+
medium, and NH4 concentration was determined at different time intervals. Results were from triplicate
cultures.
104
7.5.5 Gene expression
Strain JAM1 was cultured in NH4Cl-free medium with 22 mg-N vial-1 NO3− and
under anaerobic conditions. For RNA extraction, cells were harvested at four different
phases (Fig. 7.3B): 1) T0 in the pre-cultures, 2) during the growth phase with no N2O
production, 3) during the N2O-production phase, and 4) during the N2O-consumption
phase (Fig. 7.3D). The relative transcript levels of norB1, norB2, nnrS, and nosZ were
quantified in these samples. NnrS is a NO-sensitive regulator implicated in the regulation
of NO-response proteins such as nitric oxide reductases (Bartnikas et al., 2002, Stern et
al., 2013)
The norB1 and nnrS expression patterns were similar, with the highest
expression levels being observed during the N2O-production phase (Fig. 7.7). The norB2
expression level was stable, except during the initial phase, where it was significantly
lower. Except for the pre-cultures, the norB2 transcript level was always lower than
those detected for norB1. The most highly expressed gene among the four tested in the
pre-culture and during the initial phase was nosZ, but no significant changes in its
expression level were reported.
7.6 Discussion
Our results demonstrated that M. nitratireducenticrescens JAM1 can reduce NO
and N2O, as predicted by the genome sequence (Mauffrey et al., 2015, Villeneuve et al.,
2013) and by the detection of norB and nosZ transcripts using qPCR or transcriptome
analysis (Mauffrey et al., 2015). N2O reduction occurred under both aerobic and
anaerobic conditions during the growth phase, and strain JAM1 was also able to grow
under anaerobic conditions using N2O as the sole energy source. Many bacteria grow on
N2O, including Wolinella succinogenes and Pseudomonas denitrificans being the first
bacterium reported to grow with N2O as the sole electron acceptor (Bazylinski et al.,
1986, Koike et al., 1975, Yoshinari, 1980). M. nitratireducenticrescens JAM1 was
thought to participate uniquely in the reduction of NO3− into NO2− in the denitrifying
biofilm portion of the denitrification system. It was previously proposed that NO 2−
reduction to N2 was carried out by H. nitrativorans NL23, the second most represented
bacterium in the biofilm (Auclair et al., 2012, N. Labbé et al., 2007). The ability of strain
JAM1 to reduce NO and N2O and to grow on N2O suggests that the bacterium could
105
participate in the reduction of NO and N2O during the denitrification process occurring in
the biofilm.
During the investigation of N2O reduction by strain JAM1 under anaerobic
conditions and in the presence of NO3−, we observed the resurgence of N2O during the
stationary phase after its complete reduction during the growth phase. This production
also occurred when NO3− was present in the culture medium in absence of N2O during
the stationary phase under both aerobic and anaerobic conditions. This characteristic
was found in several other N2O-producing bacteria, such as Escherichia coli and
Serratia marcescens (Bleakley et al., 1982). Contrary to the anaerobic cultures with
NO3−, where the produced N2O was subsequently reduced, such reduction did not occur
under aerobic conditions during the stationary phase, and N2O slowly accumulated in the
aerobic cultures. However, the N2O production was lower under aerobic conditions
relative to anaerobic conditions, suggesting that oxygen could inhibit both N2O
production and reduction during the stationary phase. The successive reduction of NO3−,
NO2−, NO, and N2O during the denitrification process is highly regulated by oxygen and
nitrogen oxides concentration in the environment, and especially by NO3−/ NO2− and NO
(Zumft, 1997).
Gilberthorpe et al. (2008) demonstrated that Salmonella enterica serovar
typhimurium produced significant levels of NO from NO2− under anaerobic conditions
and that the Nar system (narGHJI) was involved under the control of the oxygen sensor
FNR. This has also been demonstrated for other bacteria, including E. coli (Corker et al.,
2003, Ji et al., 1988). This mechanism seems unlikely in strain JAM1, as the doubleknockout mutant JAM1ΔnarG1narG2, lacking the two dissimilatory NO3− reductases, was
still able to produce N2O under aerobic conditions when only NO2− was added to the
cultures. Rowley et al. (2012) suggested that N2O could be produced during NO3−
reduction into NO2− by the Nar system in Salmonella enterica serovar typhimurium. This
mechanism could occur in strain JAM1 but would represent a minor source of N2O.
Indeed, the level of N2O production in the cultures supplemented with nitrate was similar
to that supplemented with only nitrite (Table 7.2). Our results suggest that, NO3- is not
directly involved in the N2O production process unlike NO2- which appears essential for
N2O production.
106
Figure 7.6: Hydroxylamine production in M. nitratireducenticrescens JAM1 cultures.
−
Strain JAM1 was cultured under aerobic conditions without (circle) or with NO 3 (square), and under
−
anaerobic conditions with NO3 (triangle), and hydroxylamine concentration was measured at different time
intervals. Results were from triplicate cultures.
NH4+ is also present in the Methylophaga 1403 medium and could have
influenced the production of N2O. Production and reduction of N2O was similar in NH4Clfree cultures to that observed in regular cultures under aerobic and anaerobic conditions,
although N2O production was lower in the NH4Cl-free cultures, suggesting that NH4+ may
influence this production. The reduction of NO2- in NH4Cl-free medium under anaerobic
conditions could be explained by the activities of the assimilatory, cytoplasmic NAD(P)HNO3− and -NO2− reductases (NasA-NirBD), which are encoded in strain JAM1 genome.
Indeed, NH4+ accumulation was observed in the stationary phase in NH4Cl-free cultures.
NO2− reduction was not observed in strain JAM1 cultured in the regular 1403 medium
probably because this medium contains high level of NH4+, which is known to inhibit the
assimilatory pathway (Flores et al., 2005).
We observed NH2OH production under both anaerobic and aerobic growth
conditions when NO2− (from NO3− reduction) was present, and N2O was produced when
107
NH2OH was added to the medium without the presence of NO2−. N2O can be generated
as a by-product of hydroxylamine oxydoreductase (HAO) activities in ammonia oxidizing
bacteria (Stein, 2011). We did not expect strain JAM1 to exhibit nitrification activities
because it required aerobic conditions, and information from the strain JAM1 genome
did not reveal the presence of gene clusters encoding putative HAO. Furthermore, the
isotopic labeling assays with
15
NH4+ clearly showed that NH4+ is not a preferential
intermediate of N2O production. However, a small proportion (1.65%) of labeled N2O
originated from
15
NH4+. Tanimoto et al. (1992) described a biotic phenomenon called co-
denitrification, involving inorganic NH4+ and NO2− to form N2O. This occurs in the strict
presence of NO3− or NO2− and leads to hybrid N2O, where the N atoms are derived from
NH4+ and NO2−. Such reactions could have occurred in strain JAM1 cultures, as the
45
[N2O]/44[N2O] ratio was 0.008. However, other types of NH4+ transformation into N2O
were occurring, given that the
46
[N2O]/44[N2O] ratio at 0.0165 was considerably higher
than the natural isotopic signature of nitrogen and two-fold higher than the
45
[N2O]/44[N2O] ratio. Therefore, the production of N2O by strain JAM1 appeared to occur
through a combination of different pathways, with NO2− serving as an obligate reagent.
NO2− can be reduced into NH4+ via the assimilatory, cytoplasmic NAD(P)H- or
ferodoxin- NO2− reductase. In this process, NO and hydroxylamine are intermediates
during the reduction. As mentioned before, the strain JAM1 genome contains a gene
cluster encoding the NAD(P)H-NO3− and -NO2− reductases (NasA-NirBD). NO and
hydroxylamine could have been produced in strain JAM1 cultures by incomplete NO2−
reduction into NH4+ by the NasA-NirBD system (Kuznetsova et al., 2004, Stach et al.,
2000). However, we cannot rule out that unknown oxidoreductases carry these activities
in strain JAM1 (Maia et al., 2015).
The expression of genes of interest was monitored during four different phases
under anaerobic culture conditions. NnrS is a protein involved in defense against
nitrosative stress in cells and is positively regulated by the presence of NO (Bartnikas et
al., 2002, Stern et al., 2012, Stern et al., 2013). Therefore, nnrS expression reflects NO
concentration in the medium and can be used as a marker of NO presence. Higher
expression of nnrS during N2O production strongly suggests that NO is produced during
this phase. This correlated with higher expression of norB1, which can also be regulated
by NO-sensitive regulators such as NnrS or NorR (Spiro, 2012). Moreover, the increase
in norB1 expression can be directly linked to the observed N2O production. During the
108
N2O-reduction phase, only norB1 expression was decreased and could have changed
the balance between N2O production and reduction. As nosZ expression is mainly
triggered by the presence of O2, the stable expression of this gene under constant
anaerobic conditions was not surprising (Spiro, 2012). Interestingly, norB2 expression
was not affected by the presence of NO, unlike norB1. This suggests a putative different
regulation mechanism for this gene, such as observed with narG1 and narG2 in a
previous study (Mauffrey et al., 2015). Finally, the succession of the different phases of
N2O production/reduction correlates with the presence of NO through an increased
expression of nnrS, which strongly suggest that NO is an intermediate in N2O production
in strain JAM1.
Figure 7.7: Relative transcript levels of norB1, norB2, nnrS, and nosZ.
-1
−
Strain JAM1 was cultured under anaerobic conditions in NH4Cl-free 1403 medium with 22 mg-N vial NO3 .
Growth patterns were similar to that observed in Figure 1B under the same conditions with regular 1403
medium. Samples were taken from the pre-culture and during the growth phase (no N2O production), the
N2O-production phase, and the N2O-consumption phase (see Figure 3D), from which total RNA was
extracted. Gene expression levels of norB1, norB2, nnrS and nosZ were reported as gene copy number per
copy of dnaG (reference gene). Student tests were performed for each phase in comparison to pre-culture
phase. *: 0.05<P<0.01; **: 0.01<P<0.001. Results were from triplicate cultures from different inoculum.
109
7.7 Conclusion
In addition to reduced NO3− into NO2−, M. nitratireducenticrescens JAM1 is
capable of NO and N2O reduction. N2O production in strain JAM1 could originate from
abiotic transformations of NO2− into NO or by incomplete NO2− reduction into NH4+ by the
assimilatory, cytoplasmic NAD(P)H-NO2− reductase. Nevertheless, a small portion of the
N2O produced appeared to originate from NH4+; however, the actors in this pathway
remain unknown. Our results enable a better understanding of the ecophysiology role of
M. nitratireducenticrescens JAM1 in the original denitrifying biofilm. H. nitrativorans NL23
was believed to be the main actor in the sequential reduction of NO 2− to N2. With the
present results, it appears that M. nitratireducenticrescens JAM1 had a more important
role in the denitrification process by participating in the reduction of NO3-, NO and N2O in
the biofilm.
Funding information
This project was financially supported by a grant to RV from the Natural Sciences
and Engineering Research Council of Canada (#155558).
Acknowledgment
We thank Karla Vasquez for her technical assistance.
110
8. Résultats supplémentaires
M. nitratireducenticrescens JAM1 est la bactérie dominante du biofilm. Elle
possède donc un grand rôle dans son fonctionnement, que ce soit au niveau de la
dénitrification ou d’autres voies métaboliques. Les articles précédents s’appuient sur des
cultures axéniques et ciblent la voie de dénitrification en particulier. Or le comportement
d’une bactérie (par rapport à l’expression de ses gènes) n’est pas le même d’une culture
pure à une vie en communauté dans un biofilm. De plus, il est supposé que la souche
JAM1 ait un rôle important dans la défense contre le stress osmotique grâce à la
synthèse d’ectoine et dans la production d’EPS servant de matrice au biofilm. Grâce aux
méthodes de transcriptomiques décrites précédemment, il est possible d’étudier
la
transcription des gènes de la souche JAM1 parmi toutes les espèces bactériennes
présentes dans le biofilm et de la comparer à la transcription de ses gènes en culture
pure.
8.1 Matériels et méthodes
8.1.1 Cultures et conditions de croissance
Les conditions de culture axénique sont décrit dans Mauffrey et al. (2015). Le
protocole de transcriptomique est détaillé dans les annexes.
Pour les cultures en biofilm, le milieu de culture utilisé était le milieu d’eau de mer
artificiel (ASW; 1L de milieu) : 27.5 g NaCl, 10.68 g MgCl2*6H2O, 2 g MgSO4*7H2O, 1 g
KCl, 0.5 g CaCl2, 456 μL de FeSO4*7H2O 4 g/L, 5 mL de KH2PO4 51,2 g/L, 5 mL de
Na2HPO4 34 g/L. Des éléments (FeSO4*7H2O 0.9 g/L, CuSO4*5H2O 0.03 g/L et
MnSO4*H2O 0.2 g/L) ont été ajoutés et le pH ajusté à 8. Du méthanol filtré et stérilisé
(Fisher Scientific) a été ajouté dans chaque culture de manière à respecter un ratio C/N
de 1.5. Soixante ml de milieu stérile furent distribués dans des vials sérologiques stériles
contenant 20 supports neufs « Bioflow 9 mm » (Rauschert, Steinwiessen, Allemagne)
préalablement lavés avec du HCl 10% (v/v) pendant 3 heures puis rincés avec de l’eau
et autoclavés. Les vials ont été purgés de tout oxygène présent pendant 10 min avec de
l’azote gazeux (Praxair) et scellés avec des bouchons stériles munis de septums.
111
De la biomasse a été prélevée sur des supports à biofilm provenant du Biodôme
et dispersée dans le milieu ASW à 0.08 g (poids sec)/mL. Celle-ci (5 mL/vial, 0.4 g de
biofilm) a été ensuite distribuée à l’aide d’une seringue et d’une aiguille 18G11/2 dans les
vials contant les 60 mL d’ASW et les 20 supports à biofilm. Les vials furent ensuite
cultivés selon les conditions de culture suivantes : milieu S3 (300 mg-N, 23°C), milieu S4
(900 mg-N, 30°C) et milieu S5 (300 mg-N, 30°C, 0% NaCl). En moyenne une fois par
semaine, les 20 supports furent prélevés, lavés avec précautionsafin de retirer l’excès
de milieu et les bactéries non attachées au biofilm, puis transférés dans un vial
contenant du milieu frais avec les mêmes conditions. Du méthanol et du nitrate furent
ajoutés quand nécessaire si le nitrate était complètement consommé.
8.1.2 Extraction de l’ARN et analyses bioinformatiques
Pour la condition de culture axénique, l’ARN a été extrait de 3 cultures différentes
tel que décrit dans Mauffrey et al. (2015). Pour la condition de culture en biofilm, la
biomasse a été prélevée de 3-4 supports, pour chaque condition de culture, après 5
étapes de repiquages et dispersée dans une solution d’extraction. Chaque conditions de
culture du biofilm présente donc un seul réplicat. Les étapes d’extractions sont décrites
dans Mauffrey et al. (2015). L’ARN extrait a été envoyé pour séquençage par Illumina
(Genome Quebec Innovation Center, Montreal QC, Canada). L’analyse bioinformatique
a été réalisée sur le serveur Briarée de l’Université de Montréal, géré par Calcul Québec
et Compute Canada. L’alignement sur génome ainsi que la standardisation (RPKM) a
été réalisé selon le protocole le pipeline situé en annexe. Pour la condition en culture
axénique, les reads de chaque gène ont été moyenné entre les 3 réplicats afin de
n’avoir qu’un réplicat que l’on puisse comparer avec les conditions de culture en biofilm.
Le test statistique NOISeq-SIM a été utilisé afin de comparer les expressions des
différentes conditions en simulant des réplicats. Le protocole est décrit dans le pipeline
situé en annexe. Un facteur q de 0,9 a été choisit comme limite pour la significativité des
expressions différentielles. Finalement, KeggArray a été utilisé afin de déterminer le
nombre de gène surexprimés ou sousexprimés dans différents métabolismes. Un
facteur d’expression différentielle supérieur à 2 ou inférieur à 0,5 a été choisit afin de
considérer la différence d’expression biologiquement significative.
112
8.2 Résultats et discussion
Les expressions relatives des gènes d’intérêts sont listées dans le Tableau 1. La
condition « culture axénique » a été considérée comme référence. On peut voir que de
manière générale, la voie de réduction du nitrate était surexprimée dans les trois
conditions de culture en biofilm. Seul l’opéron narK1K2GHJI[1] était 4.5 fois moins
exprimé dans la condition S4 par rapport à la culture pure. Par contre, narXL était
environ 2 fois moins exprimé dans toutes les conditions de culture des biofilms. La
baisse d’expression de narXL est probablement due à une faible concentration en nitrate
au moment du prélèvement de biomasse. Cela est contradictoire avec l’augmentation
d’expression observé pour les nitrate réductases et suggère que d’autres facteurs de
régulation interviennent dans le biofilm. La voie d’assimilation du nitrite par NirBD était
très fortement surexprimée dans toutes les conditions de culture. L’ammonium, essentiel
à la croissance bactérienne, est présent en grande quantité dans le milieu 1403 utilisé
dans les cultures pures. Dans le milieu ASW, aucun NH4+ n’est ajouté, obligeant les
bactéries à chercher leurs NH4+ dans une autre source azotée comme le nitrate et le
nitrite. Il n’est donc pas étonnant de voir nirBD fortement surexprimé dans ces
conditions. Une légère surexpression a été observée pour le système de réduction de
l’oxyde nitrique alors que les régulateurs nnrS et norR ont présenté une légère baisse
d’expression. Cela suggère que le NO ne s'accumule pas plus dans le biofilm que dans
la souche JAM1. Cependant, la souche JAM1 semble avoir une activité plus forte de
réduction du NO, ce qui suggère à nouveau la présence d’un régulateur présent dans le
biofilm et pas dans la culture pure. Cela conforte également l’hypothèse stipulant que la
souche JAM1 participe à la réduction du NO dans le biofilm. nosZ a présenté une faible
baisse d’expression, ce qui est en accord avec une plus faible expression de nnrS, qui
est un régulateur connu de la réduction du N2O. Aucun changement significatif n’a été
observé dans la voie de synthèse de l’EPS. Cela suggère que la souche JAM1 ne
synthétiserait pas plus d’EPS en biofilm qu’en culture pure. Cependant, les extractions
ont été réalisées sur des biofilms matures dont la croissance était plus ou moins
achevée. Il est donc possible que la souche JAM1 participe plus activement à la mise en
place de la matrice extracellulaire lors de la croissance du biofilm. La méthanol
déshydrogénase présente une expression similaire dans les biofilms et dans la souche
sauvage, démontrant une utilisation identique du méthanol dans toutes ces conditions.
Le gène de l’ectoine-L-synthase est moins exprimé dans toutes les conditions de culture
113
du biofilm par rapport à la culture pure mais présente une forte variabilité. Cela est
logique, car l’ectoine est une molécule ayant des effets osmo-protecteurs. Or le milieu
1403 et le milieu AW sont deux milieux concentrés en sels, ce qui signifie que la souche
JAM1 a le même besoin d’ectoine dans les deux cas. La légère baisse d’expression
peut être attribuée à une protection supplémentaire apportée par la structure même du
biofilm. Par contre, il est surprenant d’observer une plus forte expression dans le milieu
S5 (0% NaCl) par rapport aux milieux S3/S4 (concentration normale en NaCl).
On peut également considérer le nombre de gènes surexprimés ou sousexprimés afin d’avoir une vision plus générale de l’impact des conditions de culture sur
la bactérie (Fig. 8.1). Globalement, on peut voir que les métabolismes liés à l’azote, au
carbone, les transporteurs ABC et les systèmes à deux composants sont plus exprimés
en conditions biofilm qu’en cultures pures. Cela démontre une plus grande activité de la
bactérie dans le biofilm, potentiellement liée à des interactions spécifiques avec son
milieu et avec les autres membres de la communauté microbienne. Étant issu du biofilm
à l’origine, il est possible que des facteurs présents dans ce milieu, et pas en culture
pure, stimulent différents métabolismes chez la souche JAM1. A l’inverse, on peut voir
que le métabolisme des peptides et la maintenance cellulaire étaient sous-régulés dans
les biofilms. Ces deux métabolismes étant reliés à la croissance bactérienne, il n’est pas
surprenant d’observer cette différence, étant donné que de la biomasse mature fut
prélevée pour le biofilm (peu ou pas de croissance), alors que pour la culture pure, le
prélèvement fut effectué en fin de période de croissance. On peut également remarquer
un plus grand nombre de gènes surexprimés dans le milieu S5 par rapport à S3 et S4,
au niveau du métabolisme de l’azote, mais surtout au niveau du système de sécrétion.
Hyphomicrobium nitrativorans NL23 est une bactérie ne tolérant pas les fortes
concentrations de sel (Martineau et al., 2013b) et s'est donc mieux développé dans le
milieu S5 (0% NaCl). Il y a donc une plus grande production d’oxydes d’azote dans ce
milieu (N2O mais surtout NO), ce qui pourrait stimuler plus fortement tout le métabolisme
lié à l’azote de la souche JAM1. Le système de sécrétion est surement stimulé à cause
du manque de sel, le manque inhabituel de sel obligeant la souche JAM1 à secréter des
molécules dans son milieu pour compenser.
114
Table 8.1 : Ratio d’expression de différents gènes d’intérêt de JAM1 pour les cultures en biofilm par rapport
à la culture pure.
Fonctions
Protéines
Milieux biofilm
S3
S4
S5
Nitrate
NarK1K2GHJI[1]
Q7A_444 a Q7A_449
1,06
0,22
2,66
NarK12f
Q7A_479
2,38
2,59
2,20
NarGHJI[2]
Q7A_481 a Q7A_484
3,51
3,52
2,85
NarXL
Q7A_441, Q7A_442
0,59
0,58
0,63
NirBD
Q7A_2620, Q7A_2621
17,8
31,0
41,3
NsrR
Q7A_409
2,73
1,90
2,13
NsrR
Q7A_67
1,27
1,47
0,17
NorBC[1]
Q7A_433, Q7A_434
1,11
1,24
0,23
NorBC[2]
Q7A_487, Q7A_488
3,25
4,72
2,76
NnrS
Q7A_438
0,87
0,87
0,87
NorR
Q7A_435
0,63
0,64
0,13
Q7A_459
0,60
0,55
0,39
Q7A_2765
1.15
0.98
0.94
Q7A_2032
0,90
0,98
0,83
1,27
1,34
1,17
0,93
1,40
1,52
0,61
0,64
0,48
0,14
0,26
0,74
Nitrite
Oxyde nitrique
Oxyde nitreux
NosZ
Carbone
Méthanol déshydrogénase
EPS
Conversion du glucose
Polymérisation sucre
Q7A_678, Q7A_792, Q7A_1018, Q7A_1023, Q7A_1062,
Q7A_1085, Q7A_1138, Q7A_1140, Q7A_2895, Q7A_219
Q7A_791, Q7A_1016, Q7A_1093, Q7A_1094,
Q7A_1104, Q7A_1108, Q7A_1109, Q7A_1411,
Q7A_1413, Q7A_1417, Q7A_1420, Q7A_1421,
Q7A_1424, Q7A_1425, Q7A_1432, Q7A_1435,
Q7A_1436, Q7A_2382, Q7A_2388, Q7A_2434, Q7A_705
Q7A_2356, Q7A_2893, Q7A_153, Q7A_2302, Q7A_2335
Ectoine
Ectoine-L-synthase
Q7A_1477
Synthèse d'UDP-Glc
Transfert des sucres
115
Système à
Transporteurs Métabolisme Métabolisme
deux
composants
ABC
carbone
azote
S3
Maintenance Métabolisme Système de
cellulaire des peptides secrétion
S3
S4
S5
S3
S4
S5
S3
S4
S5
S3
S4
Surexprimés
S5
Sous-exprimés
S4
S5
S3
S4
S5
S3
S4
S5
-40
-20
0
20
40
60
80
Figure 8.1 : Nombre de gènes dont la régulation est significativement différentes (q > 0,9 ; NOISeq-SIM)
chez JAM1 dans les cultures en biofilms par rapport à la culture pure.
116
9. Discussion
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 est une bactérie qu'on ne peut pas
qualifier de dénitrifiante car elle est incapable de réduire le nitrite en NO, coupant ainsi
sa voie de dénitrification en deux parties. Elle possède néanmoins une grande capacité
à réduire le nitrate et à pouvoir croître grâce à cette réaction, ce qui (entre autres
choses) fait d’elle une espèce unique du genre Methylophaga. Les mutants knockout de
narG1 et narG2 ont permis d’en apprendre plus sur le rôle particulier de chacune des
nitrate réductases de la souche JAM1 (article 1). Malheureusement l’étude n’est pas
complète car il fut impossible de complémenter les souches mutantes du fait de
l’incompatibilité des plasmides testés, mais aussi de la taille de l’opéron à intégrer.
Néanmoins, il est permis de penser que la complémentation de ces souches n’aurait pas
apporté beaucoup d’informations complémentaires, les nitrate réductases étant très bien
caractérisées (Einsle et al., 2004, Zumft, 1997). La seule information utile qu’il aurait été
possible de retirer d’une complémentation est l’impact des transporteurs dans le taux de
réduction du nitrate. En effet, la mutation du gène narG1 pourrait potentiellement
affecter la transcription des transporteurs narK1K2 situés en amont dans le même
opéron (Maloy et al., 1993). Malgré cela, d’autres transporteurs sont également présents
dans le génome, et leur nombre pourrait être suffisant pour assurer une efficacité
maximale au niveau du transport du nitrate et du nitrite (Moir et al., 2001).
Les différences d’efficacité entre les deux nitrate réductases soulignent leurs
probables origines différentes (Fig. 6.3). Elles contribuent néanmoins toutes les deux à
la croissance cellulaire. Si on regarde le taux de croissance spécifique (μmax/ks) de
chaque mutant, on retrouve des valeurs similaires à celles de la souche sauvage (Table
6.3). Cette différence d’efficacité peut finalement s’expliquer par un plus grand nombre
de Nar1 que de Nar2 dans la cellule, comme démontré par l’étude transcriptomique
(Table 6.2). Il est aussi très probable que Nar1 et Nar2 agissent à différents niveaux
dans la bactérie et ne soient pas équivalentes. C’est ce que l’on retrouve chez d’autres
bactéries comme E. coli et Hyphomicrobium zavarzinii ayant aussi plusieurs copies
d’une nitrate réductase, où les deux enzymes n’agissent pas de la même manière sur la
réduction du nitrate (Bonnefoy et al., 1994, Chang et al., 1999, Y. Chen et al., 2011,
Hartsock et al., 2011, Potter et al., 1999a). Par contre, il est certain que Nar1 et Nar2 ont
une synergiedans la bactérie car l’association des deux enzymes semble plus efficace
117
que l’addition des effets des enzymes séparées (Fig. 6.4). Chez les bactéries citées
précedemment, les nitrate réductases similaires ont également une régulation propre à
chacune, et chacune ne permet pas toujours la croissance de la bactérie.
Le système de réduction du nitrate de la souche JAM1 réagit également de façon
particulière aux facteurs environnementaux. De manière générale, nar[2] et narK12f ont
une régulation conforme au schéma classique FNR/NarL, alors que ce n’est pas le cas
de nar[1]. Il est curieux de constater que seuls des sites de régulation NarL sont
présents dans les séquences promotrices de nar[1] et nar[2] (Table 6.1). On peut voir
que l’oxygène ne réprime l’expression que de l’opéron nar[2] malgré l’absence de sites
de type FNR/ANR dans le promoteur, et que le nitrate ne joue le rôle d’activateur ni pour
nar[1] ni pour nar[2], alors que des sites NarL sont présents (Fig. 6.5-A). Le nitrate
semble même avoir un effet de répression sur nar[1] en conditions aérobies. Cela est
difficilement explicable car cet effet va à l’encontre de la régulation connue pour les
nitrate réductases et ne semble être présent qu’en milieu aérobie (Gunsalus et al.,
1994). Il est possible que cette baisse d’expression soit induite par le nitrite produit par
la réduction du nitrate. Auclair et al. (2010) montra qu’avec 0.36 mM de nitrite dans le
milieu de départ, la croissance de la souche JAM1 était grandement diminuée du fait de
la toxicité du nitrite. Cette concentration augmente jusqu’à 30 mM dans les cultures de la
souche JAM1 (Fig. 6.3). La toxicité du nitrite pourrait alors être responsable de la baisse
d’expression de narG1, en accord avec l’observation d’une croissance plus faible de la
souche JAM1 en conditions aérobies avec nitrate par rapport aux conditions aérobies
sans nitrate (Fig. 6.3-A). Cela reste cependant très peu probable car les autres gènes
étudiés (narG2 et narK12f) ne présentent pas de baisse significative de leurs
expressions dans ces conditions (Fig. 6.5-A). La baisse d’expression de narG1 en
l’absence de narG2 n’est pas explicable non plus (Fig. 6.5-C). Cela suggère une
régulation de l’expression de narG1 par narG2, un phénomène jamais décrit dans la
littérature à ce jour. De plus, ce mécanisme semble se mettre en place uniquement en
présence d’oxygène. Il est possible que narG2 agisse sur une voie de régulation
indirecte impliquant l’oxygène.
De manière absolue, narG1 est 5 fois plus exprimé que narG2 dans la culture
pure (Table 6.2). Cette donnée est en accord avec l’impossibilité de détecter des ARNm
de narG2 dans le biofilm (Auclair et al., 2011), amenant l’hypothèse d’une régulation
différente entre narG1 et narG2. Les données de transcriptomiques récentes ne sont
118
pas totalement en accord avec les résultats trouvés précédemment. On peut voir que
dans les conditions de culture S3 et S4, nar[1] est moins ou, au mieux tout autant,
exprimé qu’en culture pure, alors que nar[2] est plus de 3 fois plus exprimé en biofilm
qu’en culture pure (Table 8.1). Cela ramène nar[1] et nar[2] à des niveaux d’expression
absolue plus proches dans le biofilm. Ces données mettent en avant une régulation
particulière de nar[2] dans le biofilm et potentiellement un rôle spécifique de cette nitrate
réductase. La communication intercellulaire et inter-espèce est un facteur contrôlant
grandement la régulation de l’expression de nombreux gènes (Toyofuku et al., 2016). Le
biofilm est un milieu propice à une proximité élevée entre différentes espèces
bactériennes et influence le comportement de ces dernières. Il se peut donc que nar[2]
soit régulé en partie par la communication intercellulaire et inter-espèce. Cette différence
d’expression pourrait également être causée par un facteur environnemental dû au
changement du milieu de culture. En effet, la culture pure est réalisée avec le milieu
1403, alors que les cultures de biofilm sont faites dans le milieu ASW, un milieu d’eau de
mer artificielle. Par exemple, on peut voir que l’expression de nirBD est plus de 17 fois
plus élevée dans le biofilm par rapport à la culture normale. Ceci s’explique par
l’absence de NH4+ dans le milieu ASW, alors que le milieu 1403 est supplémenté avec
une grande quantité de NH4+. De tels facteurs pourraient également influencer
l’expression de nar[2], tel que le nitrite qui s’accumule en culture pure mais pas dans le
biofilm. Seul le milieu S5 montre une surexpression similaire pour nar[1] et nar[2],
gardant les rapports d’expression absolue des deux opérons au même niveau (Table
8.1). On observe une situation équivalente pour nor[1] et nor[2]. En effet, nor[1] est affilié
aux gammaprotéobactéries alors que nor[2] est affilié aux betaprotéobactéries. En
culture pure, nor[1] est exprimé environ 9 fois plus que nor[2], suggérant un rôle et une
régulation différente pour ces deux opérons (Table 6.2). En présence de NO dans le
milieu, on peut voir que nor[1] est fortement surexprimé alors que nor[2] ne l’est pas,
indiquant clairement une différence de régulation entre les deux opérons (Fig. 7.7).
Finalement, de la même manière que nar[1] et nar[2], nor[2] est en moyenne 3,5 fois
plus exprimé dans le biofilm par rapport à la culture pure, alors que l’expression de
nor[1] reste la même (Table 8.1). nar[2] et nor[2] ont donc une régulation différente dans
le biofilm par rapport à la culture pure. Un facteur de régulation absent chez la souche
JAM1 est potentiellement présent dans le biofilm et agirait sur l’expression de ces 2
opérons. Il est possible que ce facteur de régulation soit produit chez une autre bactérie
119
du biofilm et secrété dans le milieu, ayant pour conséquence l’activation de ces opérons
chez la souche JAM1.
La souche JAM1 est capable de réduire le nitrate en nitrite avec toutes les
particularités liées à ses nitrate réductases comme on l’a vu précédemment. Elle est
également capable de réduire le NO et le N2O (Fig. 7.1-A et 7.2). La réduction du NO est
cependant déduite de manière indirecte par la détection du N2O produit à partir de la
réduction de ce NO, l’appareillage pour la mesure directe du NO n’étant pas disponible.
Le NO n’étant pas facilement manipulable, l’introduction de NO dans les cultures de
JAM1 est réalisée à l’aide de nitroprusside de sodium qui se dégrade naturellement et
relâche du NO dans le milieu. Afin de voir l’apparition de N2O dans le milieu, les cultures
ont été réalisées en conditions aérobies car la réduction du N2O s’arrête en phase
stationnaire en conditions aérobies (Fig. 7.1-A). L’acétylène, un bloqueur naturel de la
réduction du N2O, peut également être utilisé en conditions anaérobies. Cette production
de N2O, bien que significative, est lente et pourrait être due seulement à la toxicité du
nitroprusside (Joannou et al., 1998) ou à de faibles taux de dégradation de cette
molécule dans le milieu 1403. La capacité de réduire le NO et le N2O de la souche JAM1
implique qu’elle est très probablement un des acteurs de ces réductions dans le biofilm.
La capacité de la souche JAM1 à croître en utilisant le N2O comme seul accepteur
d’électron renforce cette idée (Fig. 7.1-B). La croissance maximale atteinte dans ces
conditions est plus faible qu’avec du nitrate en tant qu’accepteur final d’électrons malgré
la saturation de la phase gazeuse en N2O. La réduction du N2O est productrice
d’énergie pour la cellule malgré la nature soluble de l’enzyme Nos (Zumft, 1997).
Cependant, elle l’est moins qu’une nitrate réductase. De plus, la souche JAM1 possède
deux Nar et une seule Nos. Il n’est donc pas surprenant que la croissance de la souche
JAM1 avec du N2O soit plus lente qu’avec du nitrate.
Une production de N2O a été également observée chez la souche JAM1 en
phase stationnaire, que ce soit en conditions aérobies ou anaérobies (Fig. 7.1-A).
Différentes bactéries, comme Serratia marcescens ou E. coli, sont capables de produire
du N2O sans passer par la voie de la dénitrification (Bleakley et al., 1982). Cette
production
s’effectue
par
la
voie
de
nitrification
grâce
à
la
présence
d’ammonium/méthane monooxygénase et d’hydroxylamine oxydoréductase codés par
les gènes amo et hao, respectivement. Ces gènes ne sont pas présents chez la souche
JAM1; pourtant la production de NH2OH a été confirmée et ne peut se faire qu’en
120
présence de nitrite (Fig. 7.6). Le délai d’apparition du nitrite et de l’hydroxylamine dans
le milieu n’est certainement responsable de la production du N2O qu’en phase
stationnaire. L’activation du gène nnrS pendant la phase de production du N2O met en
avant la présence de NO pendant cette phase, démontrant que le N2O est produit à
partir du NO grâce aux Nor, eux aussi actifs dans cette phase (Fig. 7.7). Les cultures
dans les milieux sans NH4Cl démontrent quant à eux que l’ammonium faisait bien partie
du processus de production du N2O (Fig. 7.3). Des tests de marquage au 15N ont montré
que le N2O était majoritairement produit à partir du NO2- accumulé dans le milieu, mais
également un peu à partir du NH2OH. Une production abiotique du N2O est l’hypothèse
la plus probable, mettant en jeu des réactions de chimio-dénitrification et d’oxydation de
l’hydroxylamine (Butterbach-Bahl et al., 2013, Chalk et al., 1983). Par contre, l’oxydation
de l’ammonium par la souche JAM1 reste inexpliquée, car aucune réaction abiotique
oxydant l’ammonium en hydroxylamine n’est connue dans la littérature de microbiologie.
Il est possible que la réaction conduisant l’ammonium à être oxydé en NH2OH soit
causée par du co-métabolisme.
La souche JAM1 est la bactérie dominante du biofilm dénitrifiant et a donc un
rôle important à jouer, que ce soit au niveau de la dénitrification mais aussi au niveau
d’autres métabolismes. Une caractéristique majeure d’un biofilm est sa matrice d’EPS
qui constitue le milieu dans lequel évoluent les bactéries (De Beer et al., 2006). La
souche JAM1 possède dans son génome les gènes nécessaires à la synthèse d’EPS et
forme des flocs en culture liquide qui sont, entre autres, constitués de biopolymères
comme l’EPS. Ainsi, il est possible que la souche JAM1 soit la principale responsable de
la mise en place de la matrice d’EPS dans le biofilm et que la voie de synthèse de l’EPS
soit surexprimée dans ces conditions de culture. Pourtant, les niveaux d’expression des
gènes participant à cette synthèse sont à peu près les mêmes entre la culture pure et le
biofilm (Table 8.1). Alors que le transcriptome de la culture pure a été réalisé sur des
bactéries en pleine croissance, celui du biofilm a été réalisé sur des biofilms mûrs afin
de récolter assez de biomasse. De manière générale, la production d’EPS est régulée
par des facteurs liés à la communication cellulaire comme le quorum sensing (Nadell et
al., 2008). Certaines bactéries synthétisent plus d’EPS pendant la phase de croissance,
alors que d’autres le feront plutôt en phase stationnaire (Sutherland, 2001). L’aération
de la culture est également un facteur pouvant influencer cette production. En culture
pure, on peut observer que la souche JAM1 possède une plus grande tendance à
floculer en présence d’oxygène et pendant sa phase de croissance. Les flocs se
121
désagrègent généralement en phase stationnaire. Ceci pourrait expliquer pourquoi on
retrouve des expressions similaires pour les gènes liés à la synthèse de l’EPS entre le
biofilm mature et la culture pure en croissance.
Un autre aspect important du biofilm dénitrifiant est sa protection contre les
niveaux élevés de sel du milieu. Cet aspect est mis en avant par la simple présence
d‘Hyphomicrobium nitrativorans NL23 dans le biofilm (Auclair et al., 2011). Cette
bactérie ne peut croître dans un milieu avec une salinité supérieure à 1% (Martineau et
al., 2013b). Elle est pourtant une des espèces bactériennes majoritaires du biofilm, alors
que le milieu de culture ASW utilisé pour le cultiver possède un taux de salinité de
2.75%. L’ectoine est une molécule ayant des propriétés osmoprotectantes (Jebbar et al.,
1992). La souche JAM1, qui possède le gène de synthèse de l’ectoine, participe
potentiellement à la protection des espèces sensibles aux sels dans le biofilm en
secrétant de l’ectoine dans le milieu. Mais on peut voir que l’expression ce gène est plus
faible dans les cultures en biofilm par rapport aux cultures pures (Table 8.1). Tel que
pour l’EPS, les stades de croissance différents entre les deux conditions pourraient être
à l’origine de cette baisse d’expression. De plus, on peut remarquer que l’expression de
ce gène est plus élevée dans le milieu S5 (0% NaCl) que dans les milieux S3 et S4,
alors qu’il serait plus logique d’observer le contraire.
Finalement, on peut voir que les gènes liés aux métabolismes du carbone et de
l’azote, aux transporteurs ABC et aux systèmes à deux composants sont en majorité
plus exprimés dans le biofilm par rapport à la culture pure (Fig. 8.1). Cela suggère que la
souche JAM1 est plus stimulée par les conditions abiotiques et biotiques dans le biofilm
que dans la culture pure malgré les différences au niveau des phases de croissance
évoquées précédemment. À l’inverse, les gènes liés aux systèmes de sécrétion, au
métabolisme des peptides et à la maintenance cellulaire sont majoritairement moins
exprimés dans le biofilm. Cela suggère que la souche JAM1 possède une croissance
plus lente dans le biofilm, ce qui est en accord avec la nature mature du biofilm par
rapport à la culture pure en pleine phase de croissance. Il n’est pas surprenant que la
souche JAM1 soit plus active dans le biofilm car c’est son milieu d’origine. Cela souligne
une nouvelle fois son importance dans le fonctionnement du biofilm de manière globale.
122
10. Conclusion
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1 est une espèce singulière par bien
des aspects. Elle possède une place importante dans un biofilm dénitrifiant et y joue un
rôle fondamental. Sa voie de dénitrification est également particulière. La souche JAM1
semble être la bactérie responsable de la réduction du nitrate dans le biofilm, étape clé
étant donné que le rôle premier du biofilm est la réduction du nitrate. Cette capacité à
réduire le nitrate repose sur la présence de deux nitrate réductases. Nar1, probablement
acquise par transfert horizontal de gènes, est la plus efficace et la plus exprimée chez la
souche JAM1. Nar2 ne permet pas une croissance et une réduction du nitrate aussi
efficace que Nar1, mais régule l’expression de cette dernière. Un tel mécanisme n’a
jamais été observé chez une autre espèce bactérienne et est donc une particularité
propre à la souche JAM1. De plus, son système de réduction du nitrate ne semble pas
être régulé par les facteurs environnementaux de manière classique. La réduction du
nitrite en NO est impossible chez la souche JAM1, mais cette dernière est capable de
réduire le nitrite en ammonium par une voie de réduction assimilative. Toutefois, les
capacités de réduction du NO et du N2O de la souche JAM1 ont été démontrées ainsi
que la capacité à croître sur le N2O. La réduction du NO est une étape clé de la
dénitrification car cette molécule est extrêmement toxique pour les bactéries. En
réduisant le NO et le N2O, la souche JAM1 apparaît une nouvelle fois à une place
importante dans le biofilm. Elle possède deux oxyde nitrique réductases afin de réduire
le NO, maximisant l’efficacité de la réaction. Nor1 est l’oxyde nitrique réductase la plus
exprimée et est particulièrement surexprimée en présence de NO, certainement par
l’intermédiaire du senseur de NO NnrS lui aussi surexprimé dans les mêmes conditions.
À l’inverse, Nor2, acquise par transfert horizontal, ne réagit pas à la présence de NO.
Son rôle est certainement différent de celui de Nor1, tout comme Nar1 et Nar2.
Participant au début et à la fin de la dénitrification et étant la plus abondante, la souche
JAM1 peut être considérée comme une des bactéries la plus importante pour la
dénitrification du biofilm. Elle ne peut cependant compléter seule cette réaction et
s’appuie sur sur la présence d’autres espèces du biofilm afin de la compléter,
notamment Hyphomicrobium nitrativorans NL23. L’importance de la souche JAM1 dans
le biofilm est soulignée par la grande activité de ses différents métabolismes. Au-delà de
la dénitrification, la souche JAM1 joue certainement un rôle primordial dans d’autres
123
aspects du biofilm, comme ses mécanismes d’assimilation du méthanol qu’elle partage
avec d’autres membres du biofilm. Elle est également capable de synthétisait de l’EPS
qui est la structure même du biofilm alors que la souche NL23 n’en est pas capable.
Cela suggère que la souche JAM1 serait l’espèce formant structuralement le biofilm
dans lequel elle se trouve. Finalement, sa grande tolérance aux sels est due à sa
capacité à produire de l’ectoine. Très sensible aux fortes concentrations de sels, la
souche NL23 se développe néanmoins aisément dans le biofilm qui évolue dans un
milieu marin. Il est possible, qu’en plus de la structure même du biofilm, la souche JAM1
apporte une protection aux bactéries sensibles aux sels en excrétant son ectoine dans
le biofilm, soulignant une fois de plus l’importance de la souche JAM1 dans le biofilm.
124
11. Perspectives
La dénitrification est une partie importante du cycle biogéochimique de l’azote et
impacte notre société à plusieurs nivaux (agriculture, pollution des sols et de
l’atmosphère). La compréhension de ce processus dans son ensemble revet donc un
grand intérêt. Les données apportées par cette thèse ont permis de mettre en évidence
une voie de dénitrification particulière et des mécanismes de régulation nouveaux.
Cependant, la nature de ces mécanismes est encore inconnue et seule l’implication de
narG2 à été mise à jour. De plus profondes études sur cette régulation pourraient
conduire à la découverte de nouveaux régulateurs des nitrate réductases et ainsi
parfaire la compréhension de la dénitrification.
Cette étude apporte également une meilleure compréhension du phénomène de
dénitrification chez les bactéries marines, domaine peu étudié et couvert dans la
littérature. Elle permet également une meilleure compréhension des systèmes à double
nitrate réductases qui sont peu communs parmi les bactéries dénitrifiantes. La souche
JAM1 possède également deux oxides nitriques réductases, ce qui participe au
caractère unique de la bactérie. Généralement, la réduction du NO est très efficace et
rapide compte tenu du caractère très toxique du composé. La présence de deux oxides
nitriques réductases est d’autant plus surprenante. Une étude équivalente à celle faite
sur les nitrate réductases pourrait être réalisée afin de comprendre le rôle de chaque
enzyme.
Finalement, cette thèse apporte une meilleure compréhension du fonctionnement
du biofilm dénitrifiant, en étudiant un de ses principaux acteurs. Ces connaissances
pourront servir à l’amélioration des systèmes de dénitrification biologique d’eau de mer
et potentiellement à l’élaboration de nouveaux systèmes reposant en partie sur
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1. Pour cela, l’étude des relations entre les
différentes bactéries peuplant le biofilm est primordiale car le processus de
dénitrification repose sur une syntrophie entre plusieurs bactéries. Ainsi, une étude des
interractions entre la souche JAM1 et NL23 pour faire la dénitrification pourrait servir à
identifier des facteurs favorisant le processus. Les espèces minoritaires du biofilm
peuvent également revêtir une grande importance pour le bon fonctionnement du biofilm
et leur étude permettrait d’achever le portrait général du biofilm.
125
Annexe
Script - alignement sur génome
Tous les calculs ont été effectués sur le serveur Briarée de Calcul Québec en utilisant
les modules disponibles. Le pipeline suivant a été créé en suivant les conseils et
indications présents à l’adresse http://rnaseq.uoregon.edu/#analysis
Module fastx_tools/0.0.13
Transformation des séquences de l’ensemble R2
fastx_reverse_complement
sequenceR2_revcomp.fastq
–Q33
–v
–i
sequenceR2.fastq
Réunion des deux ensembles
cat sequenceR1.fastq sequenceR2_revcomp.fastq > sequence.fastq
Filtrage des reads par qualité
fastq_quality_filter –Q33 -q 20 -p 90 -i sequence.fastq -o sequence.filtered.fastq
-
sequenceR1.fastq et sequenceR2.fastq : fichiers de séquençage Illumina
contenant les reads.
Module bowtie/2.2.3
Construction du répertoire et alignement sur le génome
bowtie2-build $SCRATCH/repertoire/génome.fasta nom_bactérie
bowtie2 –x nom_bactérie –U sequence.filtered.fastq –S alignement.sam
-
génome.fasta : génome de la bactérie (NCBI)
-
sequence.filtered.fastq : fichier de reads généré précédemment
126
–o
Module SAMtools/0.1.18
Conversion de .sam en .bam
samtools view -S -b alignement.sam > alignement.bam
Tri et indexation
samtools sort alignement.bam aligenement.sorted
samtools index alignement.sorted.bam
-
alignement.sam : fichier d’alignement généré précédemment.
Module BEDTools/2.20.1
Annotation
bedtools multicov –bams aligenement.sorted.bam –bed annotation.gff > fichier.txt
Calcul du contenu GC
bedtools nuc –fi génome.fasta –bed annotation.gff > resultats.txt
-
alignement.sorted.bam : fichier d’alignement généré précédemment.
-
annotation.gff : fichier d’annotation des gènes correspondant au génome étudié
(NCBI)
127
Script – Normalisation avec R (NOIseq)
Ce script a été réalisé selon les recommandations décrites dans le document disponible
à l’adresse suivante :
https://www.bioconductor.org/packages/3.3/bioc/vignettes/NOISeq/inst/doc/NOISeq.pdf
Les informations sur les types de fichier à utiliser et le fonctionnement du package sont
dans ce document.
Installation des packages requis
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite()
source("http://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite(NOISeq)
Chargement des packages nécessaires
library(BiocGenerics)
library(Biobase)
library(splines)
library(NOISeq)
Définition du répertoire de travail
setwd("C:\\Users\\Name\\Desktop\\Dossier\\NOIseq analysis")
Création des différents fichiers de données
data <- read.table(file = "fichier.txt", header = FALSE)
Qcounts = data.frame(counts1 = data[,2], counts2 = data[,3], row.names = data[,1])
Qfactors = data.frame(Condition = c("condition1", "condition2"))
Qlength = data.frame(length = data[,5], row.names = data[,1])
128
QLvector = as.vector(t(Qlength))
QGC = data.frame(length = data[,4], row.names = data[,1])
Création du Read data
Qdata <- readData(data = Qcounts, factors = Qfactors, length = Qlength, gc = QGC,
biotype = NULL, chromosome = NULL)
Analyse de la qualité des séquences
Qsaturation = dat(Qdata, k=0, ndepth = 7, type = "saturation" )
explo.plot (Qsaturation, toplot = 1, samples = 1:2, yrightlim = NULL)
Analyse des biais de longueur
Qlengthbias = dat(Qdata, factor = "Condition", type = "lengthbias" )
explo.plot(Qlengthbias, sample = NULL, toplot = "global")
show(Qlengthbias)
Analyse des biais GC
QGCbias = dat(Qdata, factor = "Condition", type = "GCbias")
explo.plot(QGCbias, sample = NULL, toplot = "global")
Standardisation
QRPKM = rpkm(assayData(Qdata)$exprs, long = QLvector, k = 0, lc = 1)
Filtrage pour enlever les transcrits peu présents
sink("C:\\Users\\ Name\\Desktop\\Dossier\\NOIseq analysis\\Expression_report.txt",
append=FALSE, split=FALSE)
129
Qfilt = filtered.data(Qcounts, factor = Qfactors$Condition, norm = FALSE, depth = NULL,
method = 1, cv.cutoff = 100, cpm = 1)
sink()
NOISeq-sim (test statistique avec réplicats simulés)
Qresults = noiseq(Qdata, factor = "Condition", k=NULL, norm = "n", pnr = 0.2, nss = 5,
v=0.02, lc = 1, replicates = "no")
head(Qresults@results[[1]])
DE.plot(Qresults, q=0.9, graphic="expr", log.scale=TRUE)
Rapport d’expression après NOISeq-simsink("C:\\Users\\
Name\\Desktop\\Dossier\\NOIseq analysis\\Expression_report.txt", append=TRUE,
split=FALSE)
Qresults.deg = degenes(Qresults, q = 0.9, M = NULL)
Qresults.deg = degenes(Qresults, q = 0.9, M = "up")
Qresults.deg = degenes(Qresults, q = 0.9, M = "down")
sink()
Exportation des résultats dans un fichier texte (Bazylinski et al., 1986)
write.table(Qresults@results[[1]], file = "Myresults.txt", append = FALSE, quote = TRUE,
sep = "\t", eol = "\n", na = "NA", dec = ".", row.names = TRUE, col.names = TRUE,
qmethod = c("escape", "double"), fileEncoding = "")
130
Références
Adman ET, Godden J & Turley S (1995) The structure of copper-nitrite reductase from
achromobacter cycloclastes at five pH values, with NO− 2 bound and with type II copper
depleted. Journal of Biological Chemistry 270(46):27458-27474.
Afkhami A, Madrakian T & Maleki A (2006) Indirect kinetic spectrophotometric determination of
hydroxylamine based on its reaction with iodate. Analytical Sciences 22(2):329-331.
Al-Attar S & de Vries S (2015) An electrogenic nitric oxide reductase. FEBS letters 589(16):20502057.
Allison DG, Gilbert P, Lappinscott HM & Wilson J (2000) Community structure and co-operation
in biofilms. in Fifty-ninth symposium of the society for general microbiology, Édit Allison
DG, Gilbert P, Lappinscott HM & Wilson J (The press syndicate of the university of
cambridge, University of Exeter).
Andersen CL, Jensen JL & Orntoft TF (2004) Normalization of real-time quantitative reverse
transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes
suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets. Cancer Res
64(15):5245-5250.
Anderson DM, Glibert PM & Burkholder JM (2002) Harmful algal blooms and eutrophication:
Nutrient sources, composition, and consequences. Estuaries 25(4b):704-726.
Anderson IC, Poth M, Homstead J & Burdige D (1993) A comparison of NO and N2O production
by the autotrophic nitrifier Nitrosomonas europaea and the heterotrophic nitrifier
Alcaligenes faecalis. Applied and Environmental Microbiology 59(11):3525-3533.
Anthony C (1982) Biochemistry of methylotrophs. Academic Press,
Anthony C (2004) The quinoprotein dehydrogenases for methanol and glucose. Archives of
biochemistry and biophysics 428(1):2-9.
Antony CP, Doronina NV, Boden R, Trotsenko YA, Shouche YS & Murrell JC (2012) Methylophaga
lonarensis sp. nov., a moderately haloalkaliphilic methylotroph isolated from the soda
lake sediments of a meteorite impact crater. International Journal of Systematic and
Evolutionary Microbiology 62(Pt 7):1613-1618.
Arai H, Mizutani M & Igarashi Y (2003) Transcriptional regulation of the nos genes for nitrous
oxide reductase in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 149:29-36.
Arp DJ, Sayavedra-Soto LA & Hommes NG (2002) Molecular biology and biochemistry of
ammonia oxidation by Nitrosomonas europaea. Archives of microbiology 178(4):250255.
Auclair J, Lepine F, Parent S & Villemur R (2010) Dissimilatory reduction of nitrate in seawater by
a Methylophaga strain containing two highly divergent narG sequences. Isme Journal
4(10):1302-1313.
Auclair J, Parent S & Villemur R (2011) Functional diversity in the denitrifying biofilm of the
methanol-fed marine denitrification system at the montreal Biodome. Microbial Ecology
10.1007/s00248-011-9960-2.
Auclair J, Parent S & Villemur R (2012) Functional diversity in the denitrifying biofilm of the
methanol-fed marine denitrification system at the Montreal Biodome. Microbial Ecology
63(4):726-735.
131
Baikalov I, Schröder I, Kaczor-Grzeskowiak M, Grzeskowiak K, Gunsalus RP & Dickerson RE (1996)
Structure of the Escherichia coli response regulator NarL. Biochemistry 35(34):1105311061.
Baker SC, Ferguson SJ, Ludwig B, Page MD, Richter O-MH & van Spanning RJM (1998) Molecular
genetics of the genus Paracoccus: metabolically versatile bacteria with bioenergetic
flexibility. Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(4):1046-1078.
Ballard AL & Ferguson SJ (1988) Respiratory nitrate reductase from Paracoccus denitrificans.
European Journal of Biochemistry 174(1):207-212.
Bamford VA, Angove HC, Seward HE, Thomson AJ, Cole JA, Butt JN, Hemmings AM & Richardson
DJ (2002) Structure and spectroscopy of the periplasmic cytochrome c nitrite reductase
from Escherichia coli. Biochemistry 41(9):2921-2931.
Bartnikas TB, Wang YS, Bobo T, Veselov A, Scholes CP & Shapleigh JP (2002) Characterization of
a member of the NnrR regulon in Rhodobacter sphaeroides 2.4.3 encoding a haemcopper protein. Microbiology 148:825-833.
Barton LL (2005) Metabolism of nitrogen and sulfur. Structural and Functional Relationships in
Prokaryotes:680-720.
Bazylinski DA, Soohoo CK & Hollocher TC (1986) Growth of Pseudomonas aeruginosa on nitrous
oxide. Applied and Environmental Microbiology 51(6):1239-1246.
Bedzyk L, Wang T & Rick WY (1999) The periplasmic nitrate reductase in Pseudomonas sp. strain
G-179 catalyzes the first step of denitrification. Journal of bacteriology 181(9):28022806.
Bergaust L, van Spanning RJM, Frostegård Å & Bakken LR (2011) Expression of nitrous oxide
reductase in Paracoccus denitrificans is regulated by oxygen and nitric oxide through
FnrP and NNR. Microbiology:826-834.
Berks BC, Ferguson SJ, Moir JWB & Richardson DJ (1995) Enzymes and associated electron
transport systems that catalyse the respiratory reduction of nitrogen oxides and
oxyanions. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics 1232(3):97-173.
Betlach MR (1982) Evolution of bacterial denitrification and denitrifier diversity. Antonie Van
Leeuwenhoek Journal of Microbiology 48(6):585-607.
Beutel MW, Newton CD, Brouillard ES & Watts RJ (2009) Nitrate removal in surface-flow
constructed wetlands treating dilute agricultural runoff in the lower Yakima Basin,
Washington. Ecological Engineering 35(10):1538-1546.
Blasco F, Iobbi C, Ratouchniak J, Bonnefoy V & Chippaux M (1990) Nitrate reductases of
Escherichia coli - Sequence of the 2nd nitrate reductase and comparison with that
encoded by the narGHJI operon. Molecular & General Genetics 222(1):104-111.
Blasco F, Nunzi F, Pommier J, Brasseur R, Chippaux M & Giordano G (1992) Formation of active
heterologous nitrate reductases between nitrate reductases A and Z of Escherichia coli.
Molecular microbiology 6(2):209-219.
Bleakley BH & Tiedje JM (1982) Nitrous-oxide production by organisms other than nitrifiers or
denitrifiers. Applied and Environmental Microbiology 44(6):1342-1348.
Bock E & Koops H (1992) The genus Nitrobacter and related genera. Balows A, Tr€ uper HG,
Dworkin M, Harder W, Schleifer KH, editors. The prokaryotes. New York: Springer:23022309.
Boden R (2012) Emended description of the genus Methylophaga Janvier et al. 1985.
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 62(7):1644-1646.
Boden R, Kelly DP, Murrell JC & Schäfer H (2010) Oxidation of dimethylsulfide to tetrathionate
by Methylophaga thiooxidans sp. nov.: a new link in the sulfur cycle. Environmental
Microbiology 12(10):2688-2699.
132
Bogardi I, Kuzelka RD & Ennenga W (1991) Nitrate contamination. Springer-Verlag Berlin
Heidelberg, 1. 520 p
Bonnefoy V & Demoss JA (1992) Identification of functional cis-acting sequences involved in
regulation of narK gene-expression in Escherichia coli. Molecular microbiology
6(23):3595-3602.
Bonnefoy V & Demoss JA (1994) Nitrate reductases in Escherichia coli. Antonie Van
Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology 66(1-3):4756.
Boogerd FC, Vanverseveld HW & Stouthamer AH (1983) Dissimilatory nitrate uptake in
paracoccus denitrificans via a delta-mu-H+-dependent system and a nitrate-nitrite
antiport system. Biochimica Et Biophysica Acta 723(3):415-427.
Bothe H, Ferguson SJ & Newton WE (2006) Biology of the nitrogen cycle. Elsevier,
Bouchard DC, Williams MK & Surampalli RY (1992) Nitrate combination of groundwater sources
and potential health effects. Journal of the American Medical Association 7:85-90.
Breton J, Berks BC, Reilly A, Thomson AJ, Ferguson SJ & Richardson DJ (1994) Characterization of
the paramagnetic iron-containing redox centres of Thiosphaera pantotropha periplasmic
nitrate reductase. FEBS letters 345(1):76-80.
Brondijk THC, Fiegen D, Richardson D & Cole JA (2002) Roles of NapF, NapG and NapH, subunits
of the Escherichia coli periplasmic nitrate reductase, in ubiquinol oxidation. Molecular
microbiology 44(1):245-255.
Brondijk THC, Nilavongse A, Filenko N, Richardson D & Cole JA (2004) NapGH components of the
periplasmic nitrate reductase of Escherichia coli K-12: location, topology and
physiological roles in quinol oxidation and redox balancing. Biochemical Journal 379:4755.
Brown K, Tegoni M, Prudêncio M, Pereira AS, Besson S, Moura JJ, Moura I & Cambillau C (2000)
A novel type of catalytic copper cluster in nitrous oxide reductase. Nature Structural &
Molecular Biology 7(3):191-195.
Burns RC & Hardy RW (1975) Nitrogen fixation in bacteria and higher plants. Springer Verlag.,
Butterbach-Bahl K, Baggs EM, Dannenmann M, Kiese R & Zechmeister-Boltenstern S (2013)
Nitrous oxide emissions from soils: how well do we understand the processes and their
controls? Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences
368(1621).
Camargo JA, Alonso A & Salamanca A (2005) Nitrate toxicity to aquatic animals: a review with
new data for freshwater invertebrates. Chemosphere 58(9):1255-1267.
Cartmell E, Clark L, Oakes D, Smith S & Wheater H (1998) The feasibility of in situ bioremediation
of groundwater nitrate. Contaminated Soil '98, Vols 1 and 2:1117-1118.
Cartron M, Roldan M, Ferguson SJ, Berks B & Richardson D (2002) Identification of two domains
and distal histidine ligands to the four haems in the bacterial c-type cytochrome NapC;
the prototype connector between quinol/quinone and periplasmic oxido-reductases.
Biochemical Journal 368:425-432.
Castiglione N, Rinaldo S, Giardina G, Stelitano V & Cutruzzola F (2012) Nitrite and nitrite
reductases: from molecular mechanisms to significance in human health and disease.
Antioxidants & redox signaling 17(4):684-716.
Castignetti D & Hollocher TC (1984) Heterotrophic nitrification among denitrifiers. Applied and
Environmental Microbiology 47(4):620-623.
Chalk PM & Smith CJ (1983) Chemodenitrification. Gaseous Loss of Nitrogen from Plant-Soil
Systems, (Developments in Plant and Soil Sciences: 9), Freney JR & Simpson JR (Édit.)
Springer Netherlands. p 65-89.
133
Chang L, Wei LLC, Audia JP, Morton RA & Schellhorn HE (1999) Expression of the Escherichia coli
NRZ nitrate reductase is highly growth phase dependent and is controlled by RpoS, the
alternative vegetative sigma factor. Molecular microbiology 34(4):756-766.
Chen F, Xia Q & Ju LK (2003) Aerobic denitrification of Pseudomonas aeruginosa monitored by
online NAD(P)H fluorescence. Applied and Environmental Microbiology 69(11):67156722.
Chen Y, Wang F, Xu J, Mehmood MA & Xiao X (2011) Physiological and evolutionary studies of
NAP systems in Shewanella piezotolerans WP3. The ISME journal 5(5):843-855.
Cheng SY & Chen JC (2002) Study on the oxyhemocyanin, deoxyhemocyanin, oxygen affinity and
acid-base balance of Marsupenaeus japonicus following exposure to combined elevated
nitrite and nitrate. Aquatic Toxicology 61(3-4):181-193.
Chew CF & Zhang TC (1998) In-situ remediation of nitrate-contaminated ground water by
electrokinetics iron wall processes. Water Science and Technology 38(7):135-142.
Chistoserdova L (2011) Modularity of methylotrophy, revisited. Environmental Microbiology
13(10):2603-2622.
Chistoserdova L, Kalyuzhnaya MG & Lidstrom ME (2009) The expanding world of methylotrophic
metabolism. Annual Review of Microbiology 63:477-499.
Chistoserdova L, Vorholt JA & Lidstrom ME (2005) A genomic view of methane oxidation by
aerobic bacteria and anaerobic archaea. Genome Biology 6(2):208.
Chistoserdova L, Vorholt JA, Thauer RK & Lidstrom ME (1998) C1 transfer enzymes and
coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic Archaea. Science
281(5373):99-102.
Cinar A, Parulekar SJ, Undey C & Birol G (2003) Batch fermentation: modeling: monitoring, and
control. CRC Press,
Clegg SJ, Jia W & Cole JA (2006) Role of the Escherichia coli nitrate transport protein, NarU, in
survival during severe nutrient starvation and slow growth. Microbiology 152(7):20912100.
Cole JA (1978) The rapid accumulation of large quantities of ammonia during nitrite reduction by
Escherichia coli. FEMS microbiology letters 4(6):327-329.
Cole JA (1982) Independent pathways for the anaerobic reduction of nitrite to ammonia by
Escherichia coli. Biochemical Society Transactions 10(6):476-478.
Colvin KM, Gordon VD, Murakami K, Borlee BR, Wozniak DJ, Wong GCL & Parsek MR (2011) The
pel polysaccharide can serve a structural and protective role in the biofilm matrix of
Pseudomonas aeruginosa. Plos Pathogens 7(1).
Conrad J (1990) Nitrate pollution and politics. Aldershot, Avebury
Conrad R (1996) Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4,
OCS, N2O, and NO). Microbiological reviews 60(4):609-640.
Corker H & Poole RK (2003) Nitric oxide formation by Escherichia coli - Dependence on nitrite
reductase, the NO-sensing regulator FNR, and flavohemoglobin Hmp. Journal of
Biological Chemistry 278(34):31584-31592.
Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, Korber DR & Lappinscott HM (1995) Microbial
biofilms. Annual Review of Microbiology 49:711-745.
Coyle CL, Zumft WG, Kroneck PM, Körner H & Jakob W (1985) Nitrous oxide reductase from
denitrifying. European Journal of Biochemistry 153(3):459-467.
Cramm R, Pohlmann A & Friedrich B (1999) Purification and characterization of the singlecomponent nitric oxide reductase from Ralstonia eutropha H16. FEBS letters 460(1):610.
134
Cuypers H, Viebrock-Sambale A & Zumft WG (1992) NosR, a membrane-bound regulatory
component necessary for expression of nitrous oxide reductase in denitrifying
Pseudomonas stutzeri. Journal of bacteriology 174(16):5332-5339.
Daiber A, Shoun H & Ullrich V (2005) Nitric oxide reductase (P450 nor) from Fusarium
oxysporum. Journal of Inorganic Biochemistry 99(1):185-193.
Dalton H (1977) Ammonia oxidation by the methane oxidising bacterium Methylococcus
capsulatus strain Bath. Archives of microbiology 114(3):273-279.
Davidson EA (1993) Soil water content and the ratio of nitrous oxide to nitric oxide emitted from
soil. Biogeochemistry of Global Change, Springer. p 369-386.
Davidson VL (2004) Electron transfer in quinoproteins. Archives of biochemistry and biophysics
428(1):32-40.
De Beer D & Stoodley P (2006) Microbial biofilms. The Prokaryotes, Vol 1. p 904-937.
De Graaff F (1964) Maintenance problems in large public aquaria. Archives Néerlandaises de
Zoologie 16:142-143.
de Zwart JM, Nelisse PN & Kuenen JG (1996) Isolation and characterization of Methylophaga
sulfidovorans sp. nov.: an obligately methylotrophic, aerobic, dimethylsulfide oxidizing
bacterium from a microbial mat. FEMS Microbiology Ecology 20(4):261-270.
Delanghe B, Nakamura F, Myoga H & Magara Y (1994) Biological denitrification with ethanol in a
membrane bioreactor. Environmental Technology 15(1):61-70.
Deziel E, Lepine F, Milot S, He JX, Mindrinos MN, Tompkins RG & Rahme LG (2004) Analysis of
Pseudomonas aeruginosa 4-hydroxy-2-alkylquinolines (HAQs) reveals a role for 4hydroxy-2-heptylquinoline in cell-to-cell communication. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 101(5):1339-1344.
Doronina NV, Darmaeva TD & Trotsenko YA (2003) Methylophaga alcalica sp. nov., a novel
alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium from an East
Mongolian saline soda lake. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology 53(1):223-229.
Doronina NV, Ezhov VA, Beschastnyi AP & Trotsenko YA (2010) Biosynthesis of the bioprotectant
ectoin by aerobic methylotrophic bacteria from methanol. Applied Biochemistry and
Microbiology 46(2):173-176.
Doronina NV, Lee TD, Ivanova E & Trotsenko YA (2005) Methylophaga murata sp. nov.: a
haloalkaliphilic aerobic methylotroph from deteriorating marble. Microbiology
74(4):440-447.
Dwivedi UN, Mishra S, Singh P & Tripathi RD (2007) Nitrate pollution and its remediation.
Environmental Bioremediation Technologies, Media SSB (Édit.). p 363-377.
Einsle O (2011) Structure and function of formate-dependent cytochrome c nitrite reductase,
NrfA. Methods in Enzymology 496:399-422.
Einsle O & Kroneck PM (2004) Structural basis of denitrification. Biological chemistry
385(10):875-883.
Einsle O, Stach P, Messerschmidt A, Simon J, Kröger A, Huber R & Kroneck PM (2000)
Cytochrome c nitrite reductase from wolinella succinogenes structure at 1.6 Å
resolution, inhibitors binding, and heme-packing motifs. Journal of Biological Chemistry
275(50):39608-39616.
Ellis MJ, Grossmann JG, Eady RR & Hasnain SS (2007) Genomic analysis reveals widespread
occurrence of new classes of copper nitrite reductases. JBIC Journal of Biological
Inorganic Chemistry 12(8):1119-1127.
EPA (1986) Quality criteria for water. U.S. Environmental Protection Agency, Office of Water
Regulations and Standards,
135
EPA (1998) Permeable reactive barrier technologies for contaminant remediation.
Ergas SJ & Rheinheimer DE (2004) Drinking water denitrification using a membrane bioreactor.
Water Research 38(14-15):3225-3232.
Ettwig KF, Butler MK, Le Paslier D, Pelletier E, Mangenot S, Kuypers MM, Schreiber F, Dutilh BE,
Zedelius J & De Beer D (2010) Nitrite-driven anaerobic methane oxidation by oxygenic
bacteria. Nature 464(7288):543-548.
Ettwig KF, Shima S, De Pas‐Schoonen V, Katinka T, Kahnt J, Medema MH, Op Den Camp HJ,
Jetten MS & Strous M (2008) Denitrifying bacteria anaerobically oxidize methane in the
absence of Archaea. Environmental Microbiology 10(11):3164-3173.
Evans LV (2003) Biofilms: recent advances in their study and control. CRC press,
Fahrner S (2002) Groundwater nitrate removal using a bioremediation trench. Honours,
University of Western Australia.
Fauman EB, Yuvaniyama C, Schubert HL, Stuckey JA & Saper MA (1996) The X-ray crystal
structures of Yersinia tyrosine phosphatase with bound tungstate and nitrate
mechanistic implications. Journal of Biological Chemistry 271(31):18780-18788.
Fedorova R, Milekhina E & Il'iukhina N (1973) Possibilities of the method of" gas exchange" for
detecting extraterrestrial life--identification of nitrogen-fixing microorganisms. Izvestiia
Akademii nauk SSSR. Seriia biologicheskaia 6:797.
Ferguson SJ (1994) Denitrification and its control. Antonie van Leeuwenhoek 66(1-3):89-110.
Ferguson SJ (1998) Nitrogen cycle enzymology. Current Opinion in Chemical Biology 2(2):182193.
Flock U, Reimann J & Adelroth P (2006) Proton transfer in bacterial nitric oxide reductase.
Biochemical Society Transactions 34(1):188-190.
Flores E, Frías JE, Rubio LM & Herrero A (2005) Photosynthetic nitrate assimilation in
cyanobacteria. Photosynthesis Research 83(2):117-133.
Fukuda M, Takeda H, Kato HE, Doki S, Ito K, Maturana AD, Ishitani R & Nureki O (2015) Structural
basis for dynamic mechanism of nitrate/nitrite antiport by NarK. Nature
communications 6.
Fülöp V, Moir JW, Ferguson SJ & Hajdu J (1995) The anatomy of a bifunctional enzyme:
structural basis for reduction of oxygen to water and synthesis of nitric oxide by
cytochrome cd1. Cell 81(3):369-377.
Furchgott RF (1999) Endothelium‐derived relaxing factor: discovery, early studies, and
identifcation as nitric oxide (nobel lecture). Angewandte Chemie International Edition
38(13‐14):1870-1880.
Garber E & Hollocher TC (1982) Positional isotopic equivalence of nitrogen in N2O produced by
the denitrifying bacterium Pseudomonas stutzeri. Indirect evidence for a nitroxyl
pathway. Journal of Biological Chemistry 257(9):4705-4708.
George GN, Hilton J, Temple C, Prince RC & Rajagopalan K (1999) Structure of the molybdenum
site of dimethyl sulfoxide reductase. Journal of the American Chemical Society
121(6):1256-1266.
Gerhardt KE, Huang XD, Glick BR & Greenberg BM (2009) Phytoremediation and
rhizoremediation of organic soil contaminants: Potential and challenges. Plant Science
176(1):20-30.
Gilberthorpe NJ & Poole RK (2008) Nitric oxide homeostasis in Salmonella typhimurium - Roles
of respiratory nitrate reductase and flavohemoglobin. Journal of Biological Chemistry
283(17):11146-11154.
Gleick PH (1993) Water in crisis: a guide to the world's fresh water ressources. Oxford University
Press, New York, 1
136
Glockner AB, Jüngst A & Zumft WG (1993) Copper-containing nitrite reductase from
Pseudomonas aureofaciens is functional in a mutationally cytochrome cd 1-free
background (NirS−) of Pseudomonas stutzeri. Archives of microbiology 160(1):18-26.
Goddard AD, Moir JWB, Richardson DJ & Ferguson SJ (2008) Interdependence of two NarK
domains in a fused nitrate/nitrite transporter. Molecular microbiology 70(3):667-681.
Godia F & Sola C (1995) Fluidized-bed bioreactors. Biotechnology Progress 11(5):479-497.
Gonzalez PJ, Correia C, Moura I, Brondino CD & Moura JJ (2006) Bacterial nitrate reductases:
Molecular and biological aspects of nitrate reduction. Journal of Inorganic Biochemistry
100(5-6):1015-1023.
Goreau TJ, Kaplan WA, Wofsy SC, McElroy MB, Valois FW & Watson SW (1980) Production of
NO2-and N2O by nitrifying bacteria at reduced concentrations of oxygen. Applied and
Environmental Microbiology 40(3):526-532.
Gothel SF & Marahiel MA (1999) Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, a superfamily of
ubiquitous folding catalysts. Cellular and Molecular Life Sciences 55(3):423-436.
Greenlee LF, Lawler DF, Freeman BD, Marrot B & Moulin P (2009) Reverse osmosis desalination:
water sources, technology, and today's challenges. Water Research 43(9):2317-2348.
Grossmann JG, Abraham ZH, Adman ET, Neu M, Eady RR, Smith BE & Hasnain SS (1993) X-ray
scattering using synchrotron radiation shows nitrite reductase from Achromobacter
xylosoxidans to be a trimer in solution. Biochemistry 32(29):7360-7366.
Guest JR, Green J, Irvine AS & Spiro S (1996) The FNR modulon and FNR-regulated gene
expression. Regulation of gene expression in Escherichia coli, Springer. p 317-342.
Guidelines C- (2014) Guidelines for canadian drinking water quality: guideline technical
document.
Gunsalus RP & Park SJ (1994) Aerobic-anaerobic gene regulation in Escherichia coli - Control by
the Arcab and Fnr regulons. Research in Microbiology 145(5-6):437-450.
Hakemian AS & Rosenzweig AC (2007) The biochemistry of methane oxidation. Annual Review
Biochemistry 76:223-241.
Hall-Stoodley L, Costerton JW & Stoodley P (2004) Bacterial biofilms: from the natural
environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology 2(2):95-108.
Hamlin HJ, MichaelS JT, Beaulaton CM, Graham WF, Dutt W, Steinbach P, Losordo TM, Schrader
KK & Main KL (2008) Comparing denitrification rates and carbon sources in commercial
scale upflow denitrification biological filters in aquaculture. Aquacultural Engineering
38(2):79-92.
Harte J, C. H, Schneider B & Shirley C (1991) Toxics A to Z: a guide to everyday pollution hazards.
University of California Press, Berkeley
Hartsock A & Shapleigh JP (2011) Physiological roles for two periplasmic nitrate reductases in
Rhodobacter sphaeroides 2.4. 3 (ATCC 17025). Journal of bacteriology 193(23):64836489.
Hayatsu M, Tago K & Saito M (2008) Various players in the nitrogen cycle: Diversity and
functions of the microorganisms involved in nitrification and denitrification. Soil Science
and Plant Nutrition 54(1):33-45.
Hazes B, Magnus KA, Kalk KH, Bonaventura C & Hol WG (1996) Nitrate binding to Limulus
polyphemus subunit type II hemocyanin and its functional implications. Journal of
molecular biology 262(4):532-542.
Healey F (1980) Slope of the Monod equation as an indicator of advantage in nutrient
competition. Microbial Ecology 5(4):281-286.
137
Heiss B, Frunzke K & Zumft WG (1989) Formation of the NN bond from nitric oxide by a
membrane-bound cytochrome bc complex of nitrate-respiring (denitrifying)
Pseudomonas stutzeri. Journal of bacteriology 171(6):3288-3297.
Hendrich MP, Petasis D, Arciero DM & Hooper AB (2001) Correlations of structure and electronic
properties from EPR spectroscopy of hydroxylamine oxidoreductase. Journal of the
American Chemical Society 123(13):2997-3005.
Hendriks JH, Jasaitis A, Saraste M & Verkhovsky MI (2002) Proton and electron pathways in the
bacterial nitric oxide reductase. Biochemistry 41(7):2331-2340.
Heurlier K, Thomson MJ, Aziz N & Moir JW (2008) The nitric oxide (NO)-sensing repressor NsrR
of Neisseria meningitidis has a compact regulon of genes involved in NO synthesis and
detoxification. Journal of bacteriology 190(7):2488-2495.
Hirsch P (1989) Genus Hyphomicrobium. Bergey's manual of systematic bacteriology, Williams
and Wilkins Baltimore-London, Vol 3. p 1895-1904.
Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, Kutchma AJ & Schweizer HP (1998) A broad-host-range FlpFRT recombination system for site-specific excision of chromosomally-located DNA
sequences: application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants.
Gene 212(1):77-86.
Hoglen J & Hollocher T (1989) Purification and some characteristics of nitric oxide reductasecontaining vesicles from Paracoccus denitrificans. Journal of Biological Chemistry
264(13):7556-7563.
Hommes NG, Sayavedra-Soto LA & Arp DJ (1996) Mutagenesis of hydroxylamine oxidoreductase
in Nitrosomonas europaea by transformation and recombination. Journal of
bacteriology 178(13):3710-3714.
Horio T, Higashi T, Yamanaka T, Matsubara H & Okunuki K (1961) Purification and properties of
cytochrome oxidase from Pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry
236(3):944-951.
Hou S, Makarova KS, Saw J, Senin P, Ly BV, Zhou Z, Ren Y, Wang J, Galperin MY & Omelchenko
MV (2008) Complete genome sequence of the extremely acidophilic methanotroph
isolate V4, Methylacidiphilum infernorum, a representative of the bacterial phylum
Verrucomicrobia. Biology Direct 3(11).
Householder TC, Fozo EM, Cardinale JA & Clark VL (2000) Gonococcal nitric oxide reductase is
encoded by a single gene, norB, which is required for anaerobic growth and is induced
by nitric oxide. Infection and immunity 68(9):5241-5246.
Howarth RW (1988) Nutrient limitation of net primary production in marine ecosystems. Annual
Review of Ecology and Systematics 19:89-110.
Howes BD, Abraham ZH, Lowe DJ, Bruser T, Eady RR & Smith BE (1994) EPR and electron nuclear
double resonance (ENDOR) studies show nitrite binding to the type 2 copper centers of
the dissimilatory nitrite reductase of Alcaligenes xylosoxidans (NCIMB 11015).
Biochemistry 33(11):3171-3177.
Hurst CJ, Crawford RL, Garland JL & Lipson DA (2007) Manual of environmental microbiology.
American Society for Microbiology Press,
Hussain H, Grove J, Griffiths L, Busby S & Cole JA (1994) A seven-gene operon essential for
formate-dependent nitrite reduction to ammonia by enteric bacteria. Molecular
microbiology 12:153-153.
Hyman MR & Arp DJ (1995) Effects of ammonia on the de novo synthesis of polypeptides in cells
of Nitrosomonas europaea denied ammonia as an energy source. Journal of bacteriology
177(17):4974-4979.
138
Hyman MR & Daniel A (1988) Acetylene inhibition of metalloenzymes. Analytical biochemistry
173(2):207-220.
Ikuma K, Decho AW & Lau BL (2013) The extracellular bastions of bacteria-A biofilm way of life.
Nature Education Knowledge 4(2):2-19.10.
Jain R & Kazmierczak BI (2014) A conservative amino acid mutation in the master regulator FleQ
renders Pseudomonas aeruginosa aflagellate. PLoS One 9(5).
James G, Beaudette L & Costerton J (1995) Interspecies bacterial interactions in biofilms. Journal
of Industrial Microbiology 15(4):257-262.
Janvier M, Frehel C, Grimont F & Gasser F (1985) Methylophaga marina gen-nov, sp-nov and
Methylophaga thalassica sp-nov, marine methylotrophs. International Journal of
Systematic Bacteriology 35(2):131-139.
Jebbar M, Talibart R, Gloux K, Bernard T & Blanco C (1992) Osmoprotection of Escherichia coli by
ectoine: uptake and accumulation characteristics. Journal of bacteriology 174(15):50275035.
Jensen FB (1996) Uptake, elimination and effects of nitrite and nitrate in freshwater crayfish
(Astacus astacus). Aquatic Toxicology 34(2):95-104.
Jepson BJ, Mohan S, Clarke TA, Gates AJ, Cole JA, Butler CS, Butt JN, Hemmings AM &
Richardson DJ (2007) Spectropotentiometric and structural analysis of the periplasmic
nitrate reductase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 282(9):64256437.
Ji XB & Hollocher TC (1988) Reduction of nitrite to nitric-oxide by enteric bacteria. Biochemical
and Biophysical Research Communications 157(1):106-108.
Jia W & Cole JA (2005) Nitrate and nitrite transport in Escherichia coli. Biochemical Society
Transactions 33:159-161.
Joannou CL, Cui X-Y, Rogers N, Vielotte N, Martinez CLT, Vugman NV, Hughes MN & Cammack R
(1998) Characterization of the bactericidal effects of sodium nitroprusside and other
pentacyanonitrosyl complexes on the food spoilage bacterium Clostridium sporogenes.
Applied and Environmental Microbiology 64(9):3195-3201.
John P (1977) Aerobic and anaerobic bacterial respiration monitored by electrodes. Journal of
general microbiology 98(1):231-238.
Joo H-S, Hirai M & Shoda M (2005) Characteristics of ammonium removal by heterotrophic
nitrification-aerobic denitrification by Alcaligenes faecalis No. 4. Journal of Bioscience
and Bioengineering 100(2):184-191.
Jordan PA, Thomson AJ, Ralph ET, Guest JR & Green J (1997) FNR is a direct oxygen sensor
having a biphasic response curve. FEBS letters 416(3):349-352.
Kalyuhznaya MG, Martens‐Habbena W, Wang T, Hackett M, Stolyar SM, Stahl DA, Lidstrom ME
& Chistoserdova L (2009) Methylophilaceae link methanol oxidation to denitrification in
freshwater lake sediment as suggested by stable isotope probing and pure culture
analysis. Environmental microbiology reports 1(5):385-392.
Kalyuzhnaya MG, Hristova KR, Lidstrom ME & Chistoserdova L (2008) Characterization of a novel
methanol dehydrogenase in representatives of Burkholderiales: implications for
environmental detection of methylotrophy and evidence for convergent evolution.
Journal of bacteriology 190(11):3817-3823.
Kane SR, Chakicherla AY, Chain PS, Schmidt R, Shin MW, Legler TC, Scow KM, Larimer FW, Lucas
SM & Richardson PM (2007) Whole-genome analysis of the methyl tert-butyl etherdegrading beta-proteobacterium Methylibium petroleiphilum PM1. Journal of
bacteriology 189(5):1931-1945.
139
Kern M & Simon J (2009) Electron transport chains and bioenergetics of respiratory nitrogen
metabolism in Wolinella succinogenes and other Epsilonproteobacteria. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics 1787(6):646-656.
Kesore K, Janowski F & Shaposhnik V (1997) Highly effective electrodialysis for selective
elimination of nitrates from drinking water. Journal of membrane science 127(1):17-24.
Killham K (1986) Heterotrophic nitrification.
Kim HG, Doronina NV, Trotsenko YA & Kim SW (2007) Methylophaga aminisulfidivorans sp. nov.,
a restricted facultatively methylotrophic marine bacterium. International Journal of
Systematic and Evolutionary Microbiology 57(9):2096-2101.
Klotz MG & Norton JM (1998) Multiple copies of ammonia monooxygenase (amo) operons have
evolved under biased AT/GC mutational pressure in ammonia-oxidizing autotrophic
bacteria. FEMS microbiology letters 168(2):303-311.
Klotz MG & Stein LY (2008) Nitrifier genomics and evolution of the nitrogen cycle. FEMS
microbiology letters 278(2):146-156.
Knittel K & Boetius A (2009) Anaerobic oxidation of methane: progress with an unknown
process. Annual Review of Microbiology 63:311-334.
Knowles R & Topp E (1988) Some factors affecting nitrification and the production of nitrous
oxide by the methanotrophic bacterium Methylosinus trichosporium OB3b. Current
Perpectives in Environmental Biogeochemistry:383-393.
Koike I & Hattori A (1975) Energy yield of denitrification: an estimate from growth yield in
continuous cultures of Pseudomonas denitrificans under nitrate-, nitrite-and nitrous
oxide-limited conditions. Microbiology 88(1):11-19.
Kraft B, Strous M & Tegetmeyer HE (2011) Microbial nitrate respiration - Genes, enzymes and
environmental distribution. Journal of Biotechnology 155(1):104-117.
Krämer M, Baumgärtner M, Bender M & Conrad R (1990) Consumption of NO by
methanotrophic bacteria in pure culture and in soil. FEMS microbiology letters
73(4):345-350.
Kruithof JC & Koppers HMM (1989) Experiences with ground water treatment and disposal of
the eliminated substances in the Netherlands. Aqua 38(3):207-216.
Kuenen JG & Robertson LA (1994) Combined nitrification-denitrification processes. FEMS
Microbiology Reviews 15(2):109-117.
Kumita H, Matsuura K, Hino T, Takahashi S, Hori H, Fukumori Y, Morishima I & Shiro Y (2004) NO
reduction by nitric-oxide reductase from denitrifying bacterium Pseudomonas
aeruginosa characterization of reaction intermediates that appear in the single turnover
cycle. Journal of Biological Chemistry 279(53):55247-55254.
Kuznetsova S, Knaff DB, Hirasawa M, Lagoutte B & Sétif P (2004) Mechanism of spinach
chloroplast ferredoxin-dependent nitrite reductase: spectroscopic evidence for
intermediate states. Biochemistry 43(2):510-517.
Labbé N, Juteau P, Parent S & Villemur R (2003a) Bacterial diversity in a marine methanol-fed
denitrification reactor at the Montreal biodome, Canada. Microbial Ecology 46(1):12-21.
Labbé N, Laurin V, Juteau P, Parent S & Villemur R (2007) Microbiological community structure
of the biofilm of a methanol-fed, marine denitrification system, and identification of the
methanol-utilizing microorganisms. Microbial Ecology 53(4):621-630.
Labbé N, Parent S & Villemur R (2003b) Addition of trace metals increases denitrification rate in
closed marine systems. Water Research 37(4):914-920.
Laurin V, Labbé N, Parent S, Juteau P & Villemur R (2008) Microeukaryote diversity in a marine
methanol-fed fluidized denitrification system. Microbial Ecology 56(4):637-648.
140
Law CJ, Maloney PC & Wang D-N (2008) Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters.
Annual Review of Microbiology 62:289.
Lee JH (2013) An overview of phytoremediation as a potentially promising technology for
environmental pollution control. Biotechnology and Bioprocess Engineering 18(3):431439.
Lemmer H, Zaglauer A, Neef A, Meier H & Amann R (1997) Denitrification in a methanol-fed
fixed-bed reactor. Part 2: Composition and ecology of the bacterial community in the
biofilms. Water Research 31(8):1903-1908.
Li J, Kustu S & Stewart V (1994) In-vitro interaction of nitrate-responsive regulatory protein Narl
with DNA target sequences in the Fdng, Narg, Nark and Frda operon control regions of
Escherichia coli K-12. Journal of molecular biology 241(2):150-165.
Lin JT, Goldman B & Stewart V (1993) Structures of genes nasA and nasB, encoding assimilatory
nitrate and nitrite reductases in Klebsiella pneumoniae M5al. Journal of bacteriology
175(8):2370-2378.
Lin JT, Goldman BS & Stewart V (1994) The nasFEDCBA operon for nitrate and nitrite
assimilation in Klebsiella pneumoniae M5al. Journal of bacteriology 176(9):2551-2559.
Livak KJ & Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using real-time
quantitative PCR and the 2(T)(-Delta Delta C) method. Methods 25(4):402-408.
Luckmann M, Mania D, Kern M, Bakken LR, Frostegard A & Simon J (2014) Production and
consumption of nitrous oxide in nitrate-ammonifying Wolinella succinogenes cells.
Microbiology 160:1749-1759.
Madigan MT, Martinko JM, Parker J & Brock TD (1997) Biology of microorganisms. prentice hall
Upper Saddle River, NJ,
Mahvi AH, Babaei AA & Nabizadeh R (2005) Agricultural activities impact on groundwater nitrate
pollution. International Journal of Environmental Science & Technology 2(1):41 - 47.
Maia LB & Moura JJ (2015) Nitrite reduction by molybdoenzymes: a new class of nitric oxideforming nitrite reductases. Journal of Biological Inorganic Chemistry 20(2):403-433.
Maier RM, Pepper IL & Gerba CP (2009) Environmental microbiology. Academic press,
Maillard E, Payraudeau S, Faivre E, Gregoire C, Gangloff S & Imfeld G (2011) Removal of
pesticide mixtures in a stormwater wetland collecting runoff from a vineyard
catchment. Science of the Total Environment 409(11):2317-2324.
Malkin R & Malmström BG (1970) The state and function of copper in biological systems.
Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology, Volume 33:177-244.
Maloy S & Stewart V (1993) Autogenous regulation of gene-expression. Journal of bacteriology
175(2):307-316.
Mancinelli RL & Mckay CP (1983) Effects of nitric-oxide and nitrogen-dioxide on bacterialgrowth. Applied and Environmental Microbiology 46(1):198-202.
Mandernack KW, Kinney CA, Coleman D, Huang YS, Freeman KH & Bogner J (2000) The
biogeochemical controls of N2O production and emission in landfill cover soils: the role
of methanotrophs in the nitrogen cycle. Environmental Microbiology 2(3):298-309.
Martineau C, Mauffrey F & Villemur R (2015) Comparative analysis of denitrifying activities of
Hyphomicrobium nitrativorans, Hyphomicrobium denitrificans, and Hyphomicrobium
zavarzinii. Applied and Environmental Microbiology 81(15):5003-5014.
Martineau C, Villeneuve C, Mauffrey F & Villemur R (2013a) Complete genome sequence of
Hyphomicrobium nitrativorans strain NL23, a denitrifying bacterium isolated from
biofilm of a methanol-fed denitrification system treating seawater at the Montreal
Biodome. Genome Announcement 2(1).
141
Martineau C, Villeneuve C, Mauffrey F & Villemur R (2013b) Hyphomicrobium nitrativorans sp
nov., isolated from the biofilm of a methanol-fed denitrification system treating
seawater at the Montreal Biodome. International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology 63:3777-3781.
Masuko M, Iwasaki H, Sakurai T, Suzuki S & Nakahara A (1984) Characterization of nitrite
reductase from a denitrifier, Alcaligenes sp. NCIB 11015. A novel copper protein. Journal
of biochemistry 96(2):447-454.
Maťchová I & Kučera I (1991) Evidence for the role of soluble cytochrome c in the dissimilatory
reduction of nitrite and nitrous oxide by cells of Paracoccus denitrificans. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics 1058(2):256-260.
Matsumoto Y, Tosha T, Pisliakov AV, Hino T, Sugimoto H, Nagano S, Sugita Y & Shiro Y (2012)
Crystal structure of quinol-dependent nitric oxide reductase from Geobacillus
stearothermophilus. Nature Structural & Molecular Biology 19(2):238-245.
Mauffrey F, Martineau C & Villemur R (2015) Importance of the two dissimilatory (Nar) nitrate
reductases in the growth and nitrate reduction of the methylotrophic marine bacterium
Methylophaga nitratireducenticrescens JAM1. Frontiers in microbiology 6.
Mazoch J & Kučera I (2002) Control of gene expression by FNR-like proteins in facultatively
anaerobic bacteria. Folia microbiologica 47(2):95-103.
McCarty G (1999) Modes of action of nitrification inhibitors. Biology and Fertility of Soils 29(1):19.
McTavish H, Fuchs J & Hooper A (1993) Sequence of the gene coding for ammonia
monooxygenase in Nitrosomonas europaea. Journal of bacteriology 175(8):2436-2444.
Moews PC & Audrieth L (1959) The autoxidation of hydroxylamine. Journal of Inorganic and
Nuclear Chemistry 11(3):242-246.
Moir JWB & Wood NJ (2001) Nitrate and nitrite transport in bacteria. Cellular and Molecular Life
Sciences 58(2):215-224.
Moura I, Bursakov S, Costa C & Moura JJ (1997) Nitrate and nitrite utilization in sulfate-reducing
bacteria. Anaerobe 3(5):279-290.
Mulder A, Van de Graaf AA, Robertson L & Kuenen J (1995) Anaerobic ammonium oxidation
discovered in a denitrifying fluidized-bed reactor. FEMS Microbiology Ecology 16
(3):177-183.
Munch R, Hiller K, Grote A, Scheer M, Klein J, Schobert M & Jahn D (2005) Virtual footprint and
PRODORIC: an integrative framework for regulon prediction in prokaryotes.
Bioinformatics 21(22):4187-4189.
Murrell JC & Holmes AJ (1996) Molecular biology of particulate methane monooxygenase.
Microbial Growth on C1 Compounds, Springer. p 133-140.
Nadell CD, Xavier JB, Levin SA & Foster KR (2008) The evolution of quorum sensing in bacterial
biofilms. PLoS Biol 6(1):14.
Neef A, Zaglauer A, Meier H, Amann R, Lemmer H & Schleifer K-H (1996) Population analysis in a
denitrifying sand filter: conventional and in situ identification of Paracoccus spp. in
methanol-fed biofilms. Applied and Environmental Microbiology 62(12):4329-4339.
Ni S-Q & Zhang J (2013) Anaerobic ammonium oxidation: from laboratory to full-scale
application. BioMed research international 2013.
Omata T, Andriesse X & Hirano A (1993) Identification and characterization of a gene cluster
involved in nitrate transport in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC7942.
Molecular and General Genetics MGG 236(2-3):193-202.
142
Page L, Griffiths L & Cole JA (1990) Different physiological roles of two independent pathways
for nitrite reduction to ammonia by enteric bacteria. Archives of microbiology
154(4):349-354.
Pal RR, Khardenavis AA & Purohit HJ (2015) Identification and monitoring of nitrification and
denitrification genes in Klebsiella pneumoniae EGD-HP19-C for its ability to perform
heterotrophic nitrification and aerobic denitrification. Functional & integrative genomics
15(1):63-76.
Palmedo G, Seither P, Körner H, Matthews JC, Burkhalter RS, Timkovich R & Zumft WG (1995)
Resolution of the nirD Locus for Heme d1, Synthesis of Cytochrome cd1,(Respiratory
Nitrite Reductase) from Pseudomonas Stutzeri. European Journal of Biochemistry
232(3):737-746.
Palmer K, Drake HL & Horn MA (2009) Genome-derived criteria for assigning environmental
narG and nosZ sequences to operational taxonomic units of nitrate reducers. Applied
and Environmental Microbiology 75(15):5170-5174.
Parent S & Morin A (2000) N budget as water quality management tool in closed aquatic
mesocosms. Water Research 34(6):1846-1856.
Pauleta SR, Dell'Acqua S & Moura I (2013) Nitrous oxide reductase. Coordination Chemistry
Reviews 257(2):332-349.
Peyraud R, Kiefer P, Christen P, Massou S, Portais J-C & Vorholt JA (2009) Demonstration of the
ethylmalonyl-CoA pathway by using 13C metabolomics. Proceedings of the National
Academy of Sciences 106(12):4846-4851.
Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C & Neuvians TP (2004) Determination of stable housekeeping
genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper - Excelbased tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters 26(6):509-515.
Philippot L & Hojberg O (1999) Dissimilatory nitrate reductases in bacteria. Biochimica Et
Biophysica Acta-Gene Structure and Expression 1446(1-2):1-23.
Pitois S, Jackson MH & Wood BJB (2001) Sources of the eutrophication problems associated with
toxic algae: An overview. Journal of Environmental Health 64(5):25-32.
Poole R (2005) Nitric oxide and nitrosative stress tolerance in bacteria. Biochemical Society
Transactions 33(1):176-180.
Poret-Peterson AT, Graham JE, Gulledge J & Klotz MG (2008) Transcription of nitrification genes
by the methane-oxidizing bacterium, Methylococcus capsulatus strain Bath. The ISME
journal 2(12):1213-1220.
Postgate J (1998) Nitrogen fixation. Cambridge University Press, 3e
Potter LC, Angove H, Richardson D & Cole JA (2001) Nitrate reduction in the periplasm of gramnegative bacteria. Advances in microbial physiology 45:51-112.
Potter LC & Cole JA (1999a) Essential roles for the products of the napABCD genes, but not
napFGH, in periplasmic nitrate reduction by Escherichia coli K-12. Biochemical Journal
344:69-76.
Potter LC, Millington P, Griffiths L, Thomas GH & Cole JA (1999b) Competition between
Escherichia coli strains expressing either a periplasmic or a membrane-bound nitrate
reductase: does Nap confer a selective advantage during nitrate-limited growth?
Biochemical Journal 344:77-84.
Prosser J (1986) Nitrification, Vols. 20. Washington, DC: IRL.
Rabin RS, Collins LA & Stewart V (1992) In vivo requirement of integration host factor for nar
(nitrate reductase) operon expression in Escherichia coli K-12. Proceedings of the
National Academy of Sciences 89(18):8701-8705.
143
Rabin RS & Stewart V (1993) Dual response regulators (Narl and Narp) interact with dual sensors
(Narx and Narq) to control nitrate-regulated and nitrite-regulated gene-expression in
Escherichia-coli K-12. Journal of bacteriology 175(11):3259-3268.
Raghoebarsing AA, Pol A, Van de Pas-Schoonen KT, Smolders AJ, Ettwig KF, Rijpstra WIC,
Schouten S, Damsté JSS, den Camp HJO & Jetten MS (2006) A microbial consortium
couples anaerobic methane oxidation to denitrification. Nature 440(7086):918-921.
Ramos HC, Boursier L, Moszer I, Kunst F, Danchin A & Glaser P (1995) Anaerobic transcription
activation in Bacillus subtilis: identification of distinct FNR-dependent and-independent
regulatory mechanisms. The EMBO journal 14(23):5984.
Raskin I, Smith RD & Salt DE (1997) Phytoremediation of metals: Using plants to remove
pollutants from the environment. Current Opinion in Biotechnology 8(2):221-226.
Reddy KJ & Lin JP (2000) Nitrate removal from groundwater using catalytic reduction. Water
Research 34(3):995-1001.
Reichl F-X (2010) Guide pratique de la toxicologie. 2e
Richardson D, Berks B, Russell D, Spiro S & Taylor C (2001) Functional, biochemical and genetic
diversity of prokaryotic nitrate reductases. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS
58(2):165-178.
Riester J, Zumft WG & Kroneck PM (1989) Nitrous oxide reductase from Pseudomonas stutzeri.
European Journal of Biochemistry 178(3):751-762.
Robertson WD & Cherry JA (1995) In-situ denitrification of septic-system nitrate using reactive
porous-media barriers - field trials. Ground Water 33(1):99-111.
Rogalla F, de Larminat G, Coutelle J & Godart H (1991) Experience with nitrate-removal methods
from drinking water. Nitrate Contamination, (NATO ASI Series, Bogárdi I, Kuzelka R &
Ennenga W (Édit.) Springer Berlin Heidelberg, Vol 30. p 369-383.
Roldán MD, Sears HJ, Cheesman MR, Ferguson SJ, Thomson AJ, Berks BC & Richardson DJ (1998)
Spectroscopic characterization of a novel multihemec-type cytochrome widely
implicated in bacterial electron transport. Journal of Biological Chemistry
273(44):28785-28790.
Rothery RA, Blasco F, Magalon A, Asso M & Weiner JH (1999) The hemes of Escherichia coli
nitrate reductase A (NarGHI): potentiometric effects of inhibitor binding to NarI.
Biochemistry 38(39):12747-12757.
Rowe JJ, Ubbink‐Kok T, Molenaar D, Konings WN & Driessen AJ (1994) Nark is a nitrite‐extrusion
system involved in anaerobic nitrate respiration by Escherichia coli. Molecular
microbiology 12(4):579-586.
Rowley G, Hensen D, Felgate H, Arkenberg A, Appia-Ayme C, Prior K, Harrington C, Field SJ, Butt
JN, Baggs E & Richardson DJ (2012) Resolving the contributions of the membrane-bound
and periplasmic nitrate reductase systems to nitric oxide and nitrous oxide production in
Salmonella enterica serovar Typhimurium. Biochemical Journal 441:755-762.
Rusten B, Hem LJ & Ødegaard H (1995) Nitrogen removal from dilute wastewater in cold climate
using moving-bed biofilm reactors. Water Environment Research 67(1):65-74.
Sambrook J, MacCallum P & Russell D (2001) Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, New York, 3rd
Sandstedt CA (1990) Nitrates: sources and their effects upon humans and livestock. American
University,
Sawers R (1991) Identification and molecular characterization of a transcriptional regulator from
Pseudomonas aeruginosa PAO1 exhibiting structural and functional similarity to the FNR
protein of Escherichia coli. Molecular microbiology 5(6):1469-1481.
144
Sayavedra-Soto LA, Hommes NG, Alzerreca JJ, Arp DJ, Norton JM & Klotz MG (1998)
Transcription of the amoC, amoA and amoB genes in Nitrosomonas europaea and
Nitrosospira sp. NpAV. FEMS microbiology letters 167(1):81-88.
Sayavedra-Soto LA, Hommes NG, Russell SA & Arp DJ (1996) Induction of ammonia
monooxygenase and hydroxylamine oxidoreductase mRNAs by ammonium in
Nitrosomonas europaea. Molecular microbiology 20(3):541-548.
Schink B (1997) Energetics of syntrophic cooperation in methanogenic degradation.
Microbiology and Molecular Biology Reviews 61(2):262-280.
Schipper LA & McGill A (2008) Nitrogen transformation in a denitrification layer irrigated with
dairy factory effluent. Water Research 42(10-11):2457-2464.
Schipper LA, Robertson WD, Gold AJ, Jaynes DB & Cameron SC (2010) Denitrifying bioreactorsAn approach for reducing nitrate loads to receiving waters. Ecological Engineering
36(11):1532-1543.
Schmidt I, van Spanning RJM & Jetten MSM (2004) Denitrification and ammonia oxidation by
Nitrosomonas europaea wild-type, and NirK- and NorB-deficient mutants. Microbiology
150:4107-4114.
Schnoor JL, Licht LA, Mccutcheon SC, Wolfe NL & Carreira LH (1995) Phytoremediation of
organic and nutrient contaminants. Environmental Science & Technology 29(7):A318A323.
Schoeman J & Steyn A (2003) Nitrate removal with reverse osmosis in a rural area in South
Africa. Desalination 155(1):15-26.
Schreiber K, Krieger R, Benkert B, Eschbach M, Arai H, Schobert M & Jahn D (2007) The
anaerobic regulatory network required for Pseudomonas aeruginosa nitrate respiration.
Journal of bacteriology 189(11):4310-4314.
Scott G & Crunkilton RL (2000) Acute and chronic toxicity of nitrate to fathead minnows
(Pimephales promelas), Ceriodaphnia dubia, and Daphnia magna. Environmental
Toxicology and Chemistry 19(12):2918-2922.
Sears HJ, Ferguson SJ, Richardson DJ & Spiro S (1993) The identification of a periplasmic nitrate
reductase in Paracoccus denitrificans. FEMS microbiology letters 113(1):107-111.
Sears HJ, Little PJ, Richardson DJ, Berks BC, Spiro S & Ferguson SJ (1997) Identification of an
assimilatory nitrate reductase in mutants of Paracoccus denitrificans GB17 deficient in
nitrate respiration. Archives of microbiology 167(1):61-66.
Self WT, Grunden AM, Hasona A & Shanmugam K (1999) Transcriptional regulation of
molybdoenzyme synthesis in Escherichia coli in response to molybdenum: ModEmolybdate, a repressor of the modABCD (molybdate transport) operon is a secondary
transcriptional activator for the hyc and nar operons. Microbiology 145(1):41-55.
Silaghi-Dumitrescu R, Ng KY, Viswanathan R & Kurtz DM (2005) A flavo-diiron protein from
Desulfovibrio vulgaris with oxidase and nitric oxide reductase activities. Evidence for an
in vivo nitric oxide scavenging function. Biochemistry 44(9):3572-3579.
Silver N, Best S, Jiang J & Thein SL (2006) Selection of housekeeping genes for gene expression
studies in human reticulocytes using real-time PCR. Bmc Molecular Biology 7.
Silvestrini MC, Cutruzzola F, D'Alessandro R, Brunori M, Fochesato N & Zennaro E (1992)
Expression of Pseudomonas aeruginosa nitrite reductase in Pseudomonas putida and
characterization of the recombinant protein. Biochemical Journal 285:661-666.
Silvestrini MC, Tordi MG, Colosimo A, Antonini E & Brunori M (1982) The kinetics of electron
transfer between Pseudomonas aeruginosa cytochrome c-551 and its oxidase.
Biochemical Journal 203:445-451.
145
Smith D, Alvey S & Crowley D (2005) Cooperative catabolic pathways within an atrazinedegrading enrichment culture isolated from soil. FEMS Microbiology Ecology 53(2):265273.
Smith KA (2010) Nitrous Oxide and Climate Change, Smith KA (Édit.) London: Earthscan, UK. p 14.
Smith RL, Ceazan ML & Brooks MH (1994) Autotrophic, hydrogen-oxidizing, denitrifying bacteria
in groundwater, potential agents for bioremediation of nitrate contamination. Applied
and Environmental Microbiology 60(6):1949-1955.
Smith VH (1998) Cultural eutrophication of inland, estuarine, and coastal waters. Successes,
Limitations, and Frontiers in Ecosystem Science:7-49.
Smith VH, Tilman GD & Nekola JC (1999) Eutrophication: impacts of excess nutrient inputs on
freshwater, marine, and terrestrial ecosystems. Environmental Pollution 100(1-3):179196.
Snider DM, Schiff SL & Spoelstra J (2009) 15 N/14 N and 18 O/16 O stable isotope ratios of
nitrous oxide produced during denitrification in temperate forest soils. Geochimica et
Cosmochimica Acta 73(4):877-888.
Sohaskey CD & Wayne LG (2003) Role of narK2X and narGHJI in hypoxic upregulation of nitrate
reduction by Mycobacterium tuberculosis. Journal of bacteriology 185(24):7247-7256.
Söhngen N (1906) Über bakterien, welche methan als kohlenstoffnahrung und energiequelle
gebrauchen. Zentrabl Bakteriol Parasitenk Infektionskr 15:513-517.
Spalding RF & Exner ME (1993) Occurrence of Nitrate in Groundwater - a Review. Journal of
Environmental Quality 22(3):392-402.
Sparacino-Watkins C, Stolz JF & Basu P (2014) Nitrate and periplasmic nitrate reductases.
Chemical Society Reviews 43(2):676-706.
Spiro S (2011) Nitric oxide metabolism: physiology and regulatory mechanisms. Nitrogen Cycling
in Bacteria (Moir, J., ed.):177-197.
Spiro S (2012) Nitrous oxide production and consumption: regulation of gene expression by gassensitive transcription factors. Philosophical Transactions of the Royal Society BBiological Sciences 367(1593):1213-1225.
Spott O & Stange CF (2011) Formation of hybrid N2O in a suspended soil due to co-denitrification
of NH2OH. Journal of Plant Nutrition and Soil Science 174(4):554-567.
Spotte S (1979) Fish and invertebrate culture: water management in closed system. Wiley, 2
Stach P, Einsle O, Schumacher W, Kurun E & Kroneck PM (2000) Bacterial cytochrome c nitrite
reductase: new structural and functional aspects. J Inorg Biochem 79(1):381-385.
Stein LY (2011) Surveying N2O-Producing pathways in bacteria. Methods in Enzymology:
Research on Nitrification and Related Processes, Vol 486, Part A 486:131-152.
Stein LY & Yung YL (2003) Production, isotopic composition, and atmospheric fate of biologically
produced nitrous oxide. Annual Review of Earth and Planetary Sciences 31:329-356.
Steinheimer TR, Scoggin KD & Kramer LA (1998) Agricultural chemical movement through a field
size watershed in Iowa: Surface hydrology and nitrate losses in discharge. Environmental
Science & Technology 32(8):1048-1052.
Stern AM, Hay AJ, Liu Z, Desland FA, Zhang J, Zhong ZT & Zhu J (2012) The NorR Regulon is
critical for Vibrio cholerae resistance to nitric oxide and sustained colonization of the
intestines. Mbio 3(2).
Stern AM, Liu BB, Bakken LR, Shapleigh JP & Zhu J (2013) A novel protein protects bacterial irondependent metabolism from nitric oxide. Journal of bacteriology 195(20):4702-4708.
Stewart V (1993) Nitrate regulation of anaerobic respiratory gene-expression in Escherichia coli.
Molecular microbiology 9(3):425-434.
146
Stewart V, Parales J & Merkel S (1989) Structure of genes narL and narX of the nar (nitrate
reductase) locus in Escherichia coli K-12. Journal of bacteriology 171(4):2229-2234.
Strebel O, Duynisveld WHM & Bottcher J (1989) Nitrate pollution of groundwater in WesternEurope. Agriculture Ecosystems & Environment 26(3-4):189-214.
Stuven R, Vollmer M & Bock E (1992) The impact of organic-matter on nitric-oxide formation by
Nitrosomonas europaea. Archives of microbiology 158(6):439-443.
Su F, Takaya N & Shoun H (2004) Nitrous oxide-forming codenitrification catalyzed by
cytochrome P450nor. Bioscience Biotechnology and Biochemistry 68(2):473-475.
Su JJ, Liu BY & Liu CY (2001) Comparison of aerobic denitrification under high oxygen
atmosphere by Thiosphaera pantotropha ATCC 35512 and Pseudomonas stutzeri SU2
newly isolated from the activated sludge of a piggery wastewater treatment system.
Journal of applied microbiology 90(3):457-462.
Suharti, Heering HA & de Vries S (2004) NO reductase from Bacillus azotoformans is a
bifunctional enzyme accepting electrons from menaquinol and a specific endogenous
membrane-bound cytochrome c 551. Biochemistry 43(42):13487-13495.
Sutherland IW (2001) Microbial polysaccharides from Gram-negative bacteria. International
Dairy Journal 11(9):663-674.
Sutton MA, Howard CM, Erisman JW, Billen G, Bleeker A, Grennfelt P, van Grinsven H & Grizzetti
B (2011) The european nitrogen assessment: sources, effects and policy perspectives.
Cambridge University Press,
Suzuki S, Kohzuma T, Yamaguchi K, Nakamura N, Shidara S, Kobayashi K & Tagawa S (1994) Pulse
radiolysis studies on nitrite reductase from Achromobacter cycloclastes IAM 1013:
evidence for intramolecular electron transfer from type 1 Cu to type 2 Cu. Journal of the
American Chemical Society 116(24):11145-11146.
Tanimoto T, Hatano K, Kim DH, Uchiyama H & Shoun H (1992) Co-denitrification by the
denitrifying system of the fungus Fusarium oxysporum. FEMS microbiology letters
93(2):177-180.
Tarazona S, Garcia-Alcalde F, Dopazo J, Ferrer A & Conesa A (2011) Differential expression in
RNA-seq: A matter of depth. Genome Research 21(12):2213-2223.
Tavares P, Pereira A, Moura J & Moura I (2006) Metalloenzymes of the denitrification pathway.
Journal of Inorganic Biochemistry 100(12):2087-2100.
Thauer RK & Shima S (2008) Methane as fuel for anaerobic microorganisms. Annals of the New
York Academy of Sciences 1125(1):158-170.
Thongdee M, Gallagher LA, Schell M, Dharakul T, Songsivilai S & Manoil C (2008) Targeted
mutagenesis of Burkholderia thailandensis and Burkholderia pseudomallei through
natural transformation of PCR fragments. Applied and Environmental Microbiology
74(10):2985-2989.
Tosques IE, Shi J & Shapleigh JP (1996) Cloning and characterization of nnrR, whose product is
required for the expression of proteins involved in nitric oxide metabolism in
Rhodobacter sphaeroides 2.4. 3. Journal of bacteriology 178(16):4958-4964.
Toyofuku M, Inaba T, Kiyokawa T, Obana N, Yawata Y & Nomura N (2016) Environmental factors
that shape biofilm formation. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 80(1):7-12.
Trotsenko YA & Murrell JC (2008) Metabolic aspects of aerobic obligate methanotrophy.
Advances in applied microbiology 63:183-230.
Tyson K, Cole JA & Busby S (1994) Nitrite and nitrate regulation at the promoters of two
Escherichia coli operons encoding nitrite reductase: identification of common target
heptamers for both NarP‐and NarL‐dependent regulation. Molecular microbiology
13(6):1045-1055.
147
Upadhyay AK, Hooper AB & Hendrich MP (2006) NO reductase activity of the tetraheme
cytochrome c 554 of Nitrosomonas europaea. Journal of the American Chemical Society
128(13):4330-4337.
Van Spanning RJM, Delgado MJ & Richardson DJ (2005) The nitrogen cycle: denitrification and its
relationship to N2 fixation. Nitrogen Fixation in Agriculture, Forestry, Ecology, and the
Environment, 4), Werner D & Newton WE (Édit.) Springer Netherlands. p 277-342.
Van Spanning RJM, Houben E, Reijnders WN, Spiro S, Westerhoff HV & Saunders N (1999) Nitric
oxide is a signal for NNR-mediated transcription activation in Paracoccus denitrificans.
Journal of bacteriology 181(13):4129-4132.
Vandesompele J, De Preter K, Pattyn F, Poppe B, Van Roy N, De Paepe A & Speleman F (2002)
Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of
multiple internal control genes. Genome Biology 3(7).
Villeneuve C, Martineau C, Mauffrey F & Villemur R (2012) Complete genome sequences of
Methylophaga sp strain JAM1 and Methylophaga sp strain JAM7. Journal of bacteriology
194(15):4126-4127.
Villeneuve C, Martineau C, Mauffrey F & Villemur R (2013) Methylophaga
nitratireducenticrescens sp. nov. and Methylophaga frappieri sp. nov., isolated from the
biofilm of the methanol-fed denitrification system treating the seawater at the Montreal
Biodome. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 63:22162222.
Vitousek PM, Aber JD, Howarth RW, Likens GE, Matson PA, Schindler DW, Schlesinger WH &
Tilman D (1997) Human alteration of the global nitrogen cycle: Sources and
consequences. Ecological Applications 7(3):737-750.
Vitousek PM & Howarth RW (1991) Nitrogen limitation on land and in the sea - How can it occur.
Biogeochemistry 13(2):87-115.
von Liebig J (1855) Principles of agricultural chemistry with special reference to the late
researches made in England. John Wiley, New York
Vorholt JA (2002) Cofactor-dependent pathways of formaldehyde oxidation in methylotrophic
bacteria. Archives of microbiology 178(4):239-249.
Vuilleumier S, Chistoserdova L, Lee M-C, Bringel F, Lajus A, Zhou Y, Gourion B, Barbe V, Chang J
& Cruveiller S (2009) Methylobacterium genome sequences: a reference blueprint to
investigate microbial metabolism of C1 compounds from natural and industrial sources.
PLoS One 4(5):e5584.
Vymazal J (2002) The use of sub-surface constructed wetlands for wastewater treatment in the
Czech Republic: 10 years experience. Ecological Engineering 18(5):633-646.
Wakida FT & Lerner DN (2005) Non-agricultural sources of groundwater nitrate: a review and
case study. Water Research 39(1):3-16.
Walker JCG (1991) Biogeochemistry - an analysis of global change - Schlesinger,Wh. Science
253(5020):686-687.
Wang W, Richardson AR, Martens-Habbena W, Stahl DA, Fang FC & Hansen EJ (2008)
Identification of a repressor of a truncated denitrification pathway in Moraxella
catarrhalis. Journal of bacteriology 190(23):7762-7772.
Ward N, Larsen Ø, Sakwa J, Bruseth L, Khouri H, Durkin AS, Dimitrov G, Jiang L, Scanlan D & Kang
KH (2004) Genomic insights into methanotrophy: the complete genome sequence of
Methylococcus capsulatus (Bath). PLoS biology 2:1616-1628.
Warnecke-Eberz U & Friedrich B (1993) Three nitrate reductase activities in Alcaligenes
eutrophus. Archives of microbiology 159(5):405-409.
148
Warnock JN, Bratch K & Al-Rubeai M (2005) Packed bed bioreactors. Bioreactors for Tissue
Engineering, Chaudhuri J & Al-Rubeai M (Édit.) Springer Netherlands, 10.1007/1-40203741-4_4. p 87-113.
Whittaker M, Bergmann D, Arciero D & Hooper AB (2000) Electron transfer during the oxidation
of ammonia by the chemolithotrophic bacterium Nitrosomonas europaea. Biochimica et
Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics 1459(2):346-355.
Williams JB (2002) Phytoremediation in wetland ecosystems: Progress, problems, and potential.
Critical Reviews in Plant Sciences 21(6):607-635.
Williams SB & Stewart V (1997) Nitrate-and nitrite-sensing protein NarX of Escherichia coli K-12:
mutational analysis of the amino-terminal tail and first transmembrane segment.
Journal of bacteriology 179(3):721-729.
Wing HJ, Williams SM & Busby S (1995) Spacing requirements for transcription activation by
Escherichia coli FNR protein. Journal of bacteriology 177(23):6704-6710.
Wolfe AH & Patz JA (2002) Reactive nitrogen and human health: Acute and long-term
implications. Ambio 31(2):120-125.
Wood PM (1986) Nitrification as a bacterial energy source.
Wrage N, Velthof GL, van Beusichem ML & Oenema O (2001) Role of nitrifier denitrification in
the production of nitrous oxide. Soil Biology & Biochemistry 33(12-13):1723-1732.
Wu SQ, Chai W, Lin JT & Stewart V (1999) General nitrogen regulation of nitrate assimilation
regulatory gene nasR expression in Klebsiella oxytoca M5al. Journal of bacteriology
181(23):7274-7284.
Wu SQ & Stewart V (1998) NasFED proteins mediate assimilatory nitrate and nitrite transport in
Klebsiella oxytoca (pneumoniae) M5al. Journal of bacteriology 180(5):1311-1322.
Yan HC, Huang WY, Yan CY, Gong XQ, Jiang SR, Zhao Y, Wang JW & Shi YG (2013) Structure and
Mechanism of a Nitrate Transporter. Cell Reports 3(3):716-723.
Yasueda H, Kawahara Y & Sugimoto S-i (1999) Bacillus subtilis yckG andyckF encode two key
enzymes of the ribulose monophosphate pathway used by methylotrophs, and yckH is
required for their expression. Journal of bacteriology 181(23):7154-7160.
Ye R, Haas D, Ka J, Krishnapillai V, Zimmermann A, Baird C & Tiedje J (1995) Anaerobic activation
of the entire denitrification pathway in Pseudomonas aeruginosa requires Anr, an
analog of Fnr. Journal of bacteriology 177(12):3606-3609.
Yoshinari T (1980) N2O Reduction by Vibrio succinogenes. Applied and Environmental
Microbiology 39(1):81-84.
Zehr JP (2011) Nitrogen fixation by marine cyanobacteria. Trends in microbiology 19(4):162-173.
Zhang X & DeMoss JA (1996) Structure modification induced in the narG promoter by binding of
integration host factor and NARL-P. Journal of bacteriology 178(13):3971-3973.
Zumft WG (1992) The denitrifying prokaryotes. The Prokaryotes, 1:554-582.
Zumft WG (1997) Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology and Molecular
Biology Reviews 61(4):533-616.
Zumft WG (2005) Nitric oxide reductases of prokaryotes with emphasis on the respiratory,
heme–copper oxidase type. Journal of Inorganic Biochemistry 99(1):194-215.
Zumft WG, Braun C & Heinrich C (1994) Nitric oxide reductase from Pseudomonas stutzeri.
European Journal of Biochemistry 219(1‐2):481-490.
149