RABHI Makhlouf - Centre de biophysique moléculaire

Transcription

UNIVERSITÉ D’ORLÉANS
ÉCOLE DOCTORALE SCIENCES ET TECHNOLOGIES
Centre de Biophysique Moléculaire
THÈSE présentée par :
Makhlouf RABHI
soutenue le : 24/02/2011
pour obtenir le grade de : Docteur de l’université d’Orléans
Discipline : Biologie moléculaire et cellulaire
Mécanismes et régulation d’une ARN hélicase
essentielle chez E. coli : le facteur de
terminaison de la transcription bactérienne Rho
THÈSE dirigée par :
Dr. Marc BOUDVILLAIN
Directeur de recherche, CNRS, Orléans
RAPPORTEURS :
Dr. Emmanuelle DELAGOUTTE
Chargée de recherche, CNRS, Paris
Dr. Xu-GUANG XI
Directeur de recherche, CNRS, Paris
_________________________________________________________________
JURY :
Dr. Emmanuelle DELAGOUTTE
Dr. Xu-GUANG XI
Pr. Alain LEGRAND
Dr. Olivier ESPELI
Dr. A. Rachid RAHMOUNI
Dr. Marc BOUDVILLAIN
Chargée de recherche, CNRS, Paris
Directeur de recherche, CNRS, Paris
Professeur à l’université d’Orléans
Chargé de recherche, CNRS, Gif sur Yvette
Remerciements
REMERCIEMENTS
Les travaux qui ont fait l’objet de ce mémoire ont été réalisés au Centre de Biophysique
Moléculaire d’Orléans sous la direction du Dr Marc Boudvillain, directeur de recherche au CNRS.
Merci Marc de m’avoir communiqué ton enthousiasme envers l’ARN et l’enzymologie ainsi que
pour ton implication dans le suivi et l’aboutissement de ce travail. Je te remercie chaleureusement
pour tous les précieux conseils, toute l’aide scientifique que tu m’as apportée et tout le temps que tu
m’as consacré pendant ces trois ans de thèse.
Je tiens à remercier le Dr Rachid Rahmouni, directeur de recherche au CNRS, pour
m’avoir accueilli au sein de son équipe et pour la confiance qu’il m’a accordée.
J’adresse mes sincères remerciements aux Dr Emmanuelle Delagoutte, Dr Xi Xu-Guang, Dr Olivier
Espeli, Dr Rachid Rahmouni et le Pr Alain Legrand d’avoir accepté de juger ce travail.
J’ai été très chanceux d’avoir comme voisines de paillasse Annie Schwartz et Frédérique Jacquinot
pour lesquelles je tiens à exprimer toute ma reconnaissance, pour leurs conseils précieux, leurs
encouragements et leur soutien.
J’adresse également tous mes remerciements au Dr Christine Mosrin-Huaman et à Nadège
Hervouet pour leur disponibilité et leur sympathie.
Je remercie également nos collaborateurs : Dr Véronique Arluison, Dr Olivier Espeli et Dr
Emmanuel Margeat pour les discussions scientifiques qui ont contribué à l’avancement de mes
recherches.
Un grand merci au Pr Daniel Locker et au Dr Martine Decoville qui m’ont offert l’opportunité
d’intégrer le CBM et qui m’ont fait découvrir le monde de la recherche scientifique durant mes
stages de Master.
Je remercie chaleureusement Annie Schwartz, Frédérique Jacquinot, Kadija Essalihi et Fredirico
Perche pour leur gentillesse, avoir relu mon manuscrit et pour les remarques judicieuses qui ont
contribué à l’élaboration de sa version finale.
Merci à tous les professeurs qui ont contribué de près ou de loin à ma formation.
Je remercie très chaleureusement les précieux membres de ma famille pour leur soutien et
encouragements.
A tout les membres de ma famille et mes amis loin des yeux mais près du cœur.
Abréviations
ABREVIATIONS
Å : angström
ADN : acide désoxyribonucléique
ADP : adenosine diphosphate
ADP●BeFx : ADP-beryllium fluoride
AMPPNP : adenosine 5’-(β,γ-imido) triphosphate
ARN (RNA) : acide ribonucléique
ARNm (mRNA): ARN messager
ATP : adénosine triphosphate
ATPγS : adenosine 5’-O-(3-thio)triphosphate
Bcm : Bicyclomycine
ChIP-chip : Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip
CTD : C-terminal domain
CTE : complexe ternaire d’élongation
DEAD : D :Asp, E : Glu-A : Ala et Asp :D
kDa : kilo Dalton
NAIM : nucleotide analog interference mapping
nts : nucléotides
NTD : N-terminal domain
PAP : polymérase polyA
Pb : paire de bases
PBS : primary binding site
Pi : inorganic orthophosphate
RBS : ribosome binding site
RMN : résonance magnétique nucléaire
rNTP : ribonucléoside triphosphate
Rut : Rho utilization
SF : superfamille
sRNAs: small RNAs
SBS : secondary binding site
Tsp : termination stop points
Note : le terme «anomèrique» est utilisé dans cette thèse pour indiquer une organisation en
anneau oligomérique.
Abréviations
ABREVIATIONS DES ACIDES AMINES
Acide aminé
Abréviation à 3 lettres
Abréviation à1 lettre
Alanine
Ala
A
Arginine
Arg
R
Asparagine
Asn
N
Acide aspartique
Asp
D
Cystéine
Cys
C
Acide glutamique
Glu
E
Glutamine
Gln
Q
Glycine
Gly
G
Histidine
His
H
Isoleucine
Ile
I
Leucine
Leu
L
Lysine
Lys
K
Méthionine
Met
M
Phénylalanine
Phe
F
Proline
Pro
P
Sérine
Ser
S
Thréonine
Thr
T
Tryptophane
Trp
W
Tyrosine
Tyr
Y
Valine
Val
V
Table des matières
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION ................................................................................................................................................. 1
CHAPITRE I. RHO : UN MOTEUR «ANOMERIQUE» A ACTIVITE ARN HELICASE ......................... 5
1. LES GRANDES FAMILLES D’HELICASES ............................................................................................... 6
1.1. LES HELICASES DE TYPES «MONOMERIQUES» ............................................................................................... 8
1.2. LES HELICASES OLIGOMERIQUES ................................................................................................................ 10
2. LES ACTIVITES ENZYMATIQUES DU FACTEUR RHO...................................................................... 16
2.1. L’ACTIVITE ATPASE .................................................................................................................................. 16
2.2. L’ACTIVITE HELICASE ................................................................................................................................ 18
3. ORGANISATION STRUCTURALE DU FACTEUR RHO ....................................................................... 22
3.1. SEQUENCE PRIMAIRE DE L’ENZYME RHO.................................................................................................... 22
3.2. LE SITE PRIMAIRE D’INTERACTION A L’ARN (PBS) ................................................................................... 24
3.3. LE SITE SECONDAIRE D’INTERACTION A L’ARN (SBS) .............................................................................. 27
4. FORMATION D’UN COMPLEXE PRODUCTIF RHO-SUBSTRAT...................................................... 34
CHAPITRE II. TERMINAISON DE LA TRANSCRIPTION RHO-DEPENDANTE CHEZ E. COLI ..... 37
1. LE CYCLE TRANSCRIPTIONNEL CHEZ E. COLI ................................................................................ 37
1.1. L’INITIATION .............................................................................................................................................. 38
1.2. L’ELONGATION........................................................................................................................................... 38
1.2.1. Les signaux de pause ......................................................................................................................... 40
1.2.2. Les signaux d’arrêt ............................................................................................................................ 41
1.2.3. Les signaux de terminaison ............................................................................................................... 41
2. LA TERMINAISON INTRINSEQUE .......................................................................................................... 42
3. LA TERMINAISON FACTEUR-DEPENDANTE ...................................................................................... 43
4. LA TERMINAISON RHO-DEPENDANTE ................................................................................................ 43
4.1. LES TERMINATEURS RHO-DEPENDANTS ..................................................................................................... 43
4.2. LES MODELES DE TERMINAISON RHO-DEPENDANTE CHEZ E. COLI.............................................................. 47
4.3. LA REGULATION CONTEXTUELLE DE LA TERMINAISON RHO-DEPENDANTE ................................................ 50
4.3.1. LE FACTEUR NUSA .................................................................................................................................. 50
4.3.2. LE FACTEUR NUSG .................................................................................................................................. 52
5. L’EXPRESSION GENIQUE ET LA TERMINAISON DE LA TRANSCRIPTION ............................... 54
5.1. EXEMPLES DE MECANISMES D’ATTENUATION IMPLIQUANT LE FACTEUR RHO ............................................ 54
5.1.1. La polarité du gène Rho .................................................................................................................... 54
5.1.2. L’opéron bactérien tna ...................................................................................................................... 54
5.1.3. Les BIMEs ......................................................................................................................................... 55
5.2. EXEMPLES DE MECANISMES D’ANTI-TERMINAISON AU NIVEAU DES TERMINATEURS RHO-DEPENDANTS.... 55
5.2.1. L’anti-terminaison dirigée par la protéine N .................................................................................... 55
5.2.2. L’anti-terminaison au niveau des opérons ribosomaux..................................................................... 56
5.2.3. L’anti-terminaison induite par la protéine Psu du bactériophage P4 ............................................... 58
5.2.4. L’anti-terminaison induite par le facteur bactérien YaeO................................................................. 58
CHAPITRE III. LA PROTEINE HFQ ............................................................................................................. 62
1. EXPRESSION ET LOCALISATION CELLULAIRE DE LA PROTEINE HFQ ................................... 63
2. ORGANISATION STRUCTURALE DE LA PROTEINE HFQ................................................................ 64
2.1. LE SITE PROXIMAL DE FIXATION A L’ARN ................................................................................................. 65
2.2. LE SITE DISTAL DE FIXATION A L’ARN ....................................................................................................... 65
3. ROLES DE HFQ AU NIVEAU POST-TRANSCRIPTIONNEL ............................................................... 66
Table des matières
3.1. Régulation de la traduction de la protéine RpoS .................................................................................. 69
3.2. Régulation du transport du glucose ...................................................................................................... 72
4. ROLES DANS LA VIRULENCE .................................................................................................................. 73
4.1. HFQ CHEZ LES AUTRES ESPECES BACTERIENNES ......................................................................................... 73
4. 2. HFQ ET LA VIRULENCE BACTERIENNE ........................................................................................................ 74
5. LES PARTENAIRES PROTEIQUES DE LA PROTEINE HFQ .............................................................. 75
5.1. LA PROTEINE RHO. ..................................................................................................................................... 75
5.2. LES COMPOSANTES DES MACHINERIES TRANSCRIPTIONNELLE ET TRADUCTIONNELLE ............................... 77
5.3. LES COMPOSANTES DU DEGRADOSOME ...................................................................................................... 78
5.3.1. L’endoribonucléase RNaseE ............................................................................................................. 78
5.3.2. La polyA polymérase I (PAP I) et la polynucléotide phosphorylase (PNPase)............................. 78
CHAPITRE IV : APPORT PERSONNEL ....................................................................................................... 80
1. INTRODUCTION ........................................................................................................................................... 80
1.1. ETUDE DE LA TRANSLOCATION DU MOTEUR MOLECULAIRE RHO ............................................................... 80
1.2. ETUDE DE LA REGULATION DE L’ACTIVITE DU FACTEUR RHO .................................................................... 83
2. ARTICLES ...................................................................................................................................................... 83
3. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...................................................................................................... 141
RÉFÉRENCES .................................................................................................................................................. 146
Introduction
Introduction
Mon travail de thèse s’inscrit dans l’étude de la régulation de la transcription
chez Escherichia coli. Il a été réalisé au sein de l’équipe « Interactions ribonucleoproteiques
et applications therapeutiques » (responsable : Dr. A. Rachid Rahmouni) sous la direction du
Dr. Marc Boudvillain, au Centre de Biophysique Moléculaire (CBM).
La transcription constitue le premier niveau important de régulation de l’expression des
gènes. Chez les procaryotes, l’expression génique est fortement régulée à ce niveau. Durant
de nombreuses années, les études du contrôle de l’expression génique ont été focalisées sur la
régulation de l’initiation de la transcription [pour revue : (Borukhov and Nudler 2008)].
Pourtant, la régulation génique peut également se produire à d’autres niveaux en aval de
l’initiation. En effet, l’élongation de la transcription est une étape dynamique au cours de
laquelle de nombreux facteurs s’associent au complexe ternaire d’élongation (CTE) et
modulent l’efficacité de la synthèse du transcrit par l’ARN polymérase (ARNP) ou
déclenchent la fin de cette synthèse [pour revue : (Roberts et al. 2008)]. Durant ma thèse, je
me suis intéressé à l’étude de l’un de ces facteurs protéiques capables de déstabiliser le CTE
et de terminer la transcription : le facteur Rho.
C’est en recherchant, dans un extrait bactérien, des facteurs capables de modifier la
synthèse in vitro d’ARN à partir d’ADN du phage λ que Jeff Roberts découvrit le facteur de
terminaison Rho (Roberts 1969). La protéine Rho est responsable d’une bonne partie des
événements de terminaison de la transcription chez E. coli et intervient au niveau de sites bien
spécifiques du génome : ce sont les terminateurs Rho-dépendants [pour revue : (Ciampi
2006)]. Le facteur Rho appartient à une famille d’enzymes, les hélicases, rencontrées dans
tous les aspects du métabolisme cellulaire impliquant les acides nucléiques [pour revue :
(Singleton et al. 2007)]. Les hélicases sont des enzymes qui utilisent l’énergie issue de
l’hydrolyse de NTPs (ATP, le plus souvent) pour dérouler l’ADN ou des duplexes ARN, ou
encore pour dissocier ou remodeler des complexes nucléoprotéiques. Les propriétés de ces
enzymes sont brièvement présentées dans le chapitre I de ce mémoire.
Le facteur Rho est organisé en anneau hexamérique constitué de six sous-unités
identiques de 47 KDa chacune et formant six poches de fixation à l’ATP [pour revue :
(Boudvillain et al. 2010a)]. Rho contient également deux sites de fixation à l’ARN qui ont des
fonctions différentes mais coordonnées. Le site primaire d’interaction à l’ARN (Primary
Binding Site, PBS) est utilisé par Rho pour reconnaître et fixer un segment du transcrit
naissant, peu structuré et riche en résidus cytosines appelé site Rut (Rho utilization). Les sites
1
Introduction
Rut sont retrouvés au sein des terminateurs Rho-dépendants. Une fois fixé au PBS, le transcrit
pénètre au centre de l’anneau hexamérique pour interagir avec le site secondaire d’interaction
à l’ARN (Secondary Binding Site, SBS). Le SBS est strictement ARN-spécifique et
l’interaction SBS-ARN est absolument nécessaire pour que Rho devienne une enzyme
catalytiquement active (par exemple, capable d’hydrolyser de l’ATP). Récemment, deux
structures du facteur Rho en interaction avec l’ARN ont été publiées par le groupe du Pr
James Berger (Skordalakes and Berger 2006; Thomsen and Berger 2009). Ces deux structures
contiennent des réseaux d’interaction SBS-ARN distincts qui suggèrent deux modèles
contradictoires pour la façon dont Rho couple en son sein la translocation de l’ARN à
l’hydrolyse de l’ATP. Ces modèles, dits «RNA handoff» ou «RNA escort» sont présentés à la
fin du chapitre I (figures 21 et 23, pages 31 et 33, respectivement). Pour tenter de discriminer
ces modèles et de mieux comprendre comment Rho reconnaît et se déplace sur l’ARN, nous
avons entrepris une étude fondée sur l’utilisation de deux approches complémentaires :
1) L’approche NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) dans laquelle des
modifications chimiques ciblées sont introduites de façon combinatoire au sein des substrats
ARN pour identifier les composants moléculaires essentiels à une activité biochimique
d’intérêt (par exemple l’activité hélicase du facteur Rho) [pour revue : (Strobel 1999;
Fedorova et al. 2005; Huntzinger et al. 2005)]. Cette approche est brièvement décrite au début
du chapitre IV (figure 58, page 81).
2) La mutagenèse dirigée, une approche plus classique, qui nous a permis de tester
l’importance des chaînes latérales en interaction avec l’ARN dans les structures du facteur
Rho.
Les résultats de cette étude, présentés sous forme de deux articles (I et II) dans le
chapitre IV (voir apport personnel, pages 84 et 98, respectivement), indiquent que ni le
modèle «RNA handoff» ni le modèle «RNA escort» ne sont satisfaisants pour décrire le
mécanisme de translocation de Rho sur l’ARN. Des modèles alternatifs, compatibles avec
l’information expérimentale existante, sont proposés et discutés (figure 61, page 143).
Des études récentes indiquent que Rho est un régulateur global de la transcription chez
E. coli, affectant de 20 à 50% des unités transcriptionnelles (Cardinale et al. 2008; Peters et al.
2009). Un autre régulateur transcriptionnel important est le couplage existant entre la
traduction et la transcription chez les bactéries. Ce couplage protège le CTE de l’action de
Rho, qui ne peut se fixer au transcrit naissant que lorsque celui-ci est suffisamment
«découvert» au niveau d’un site Rut (figure 01).
2
Introduction
(A)
(B)
(C)
(D)
Figure 01. Représentation schématique du mécanisme de terminaison Rho-dépendante.
L’hexamère Rho fixe le site Rut (A), à partir duquel Rho se déplace le long de l’ARN grâce à
l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP (B) pour rattraper la machinerie transcriptionnelle
(C) et provoquer sa dissociation (D). D’après :(Boudvillain et al. 2010a).
Il semblerait qu’un élément clé de ce couplage protecteur soit le «pontage» physique
entre ribosome et ARNP assuré par le co-facteur transcriptionnel NusG lors de la
synthèse/traduction des cadres ouverts de lecture (Open Reading Frames, ORFs) (Mooney et
al. 2009b; Proshkin et al. 2010). Le facteur NusG est organisé en deux domaines distincts
(Burmann et al. 2010). Le domaine N-terminal (NTD) interagit avec l’ARNP et le domaine Cterminal (CTD) interagit avec la protéine ribosomale S10 (encore appelée NusE) (Burmann et
al. 2010). L’interaction entre le CTD de NusG et la protéine S10 est également impliquée
dans des complexes d’anti-terminaison multi-protéiques qui protègent l’ARNP de l’action de
Rho lors de la transcription du génome du phage λ ou de la transcription des opérons
ribosomaux (lorsque le ribosome est absent et ne peut jouer son rôle protecteur). En lieu et
place de S10, le CTD de NusG peut également interagir avec Rho. Le lien physique assuré
cette fois-ci par NusG entre Rho et l’ARNP augmente l’efficacité de la terminaison Rhodépendante in vitro et in vivo (Sullivan and Gottesman 1992; Li et al. 1993; Burns et al.
1999). Le co-facteur NusG est donc un élément central de régulation contextuelle de la
transcription chez E. coli (Mooney et al. 2009b).
Nous avons émis l’hypothèse que cette régulation contextuelle pourrait être renforcée
si un ou plusieurs facteurs endogènes étaient en compétition avec NusG-CTD pour interagir
3
Introduction
avec Rho. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé des logiciels de comparaison
structurale afin de chercher des candidats potentiels dans le réseau d’interactions « protéineprotéine» (interactome) établi par des approches d’analyse globale pour E. coli (Butland et al.
2005; Hu et al. 2009). Un des candidats identifiés est la protéine Hfq (Host factor Q), un
régulateur global du métabolisme ARN chez E. coli [pour revue : (Vasil'eva Iu and Garber
2002; Brennan and Link 2007)]. Un panorama des propriétés et rôles biologiques de la
protéine Hfq est présenté dans le chapitre III. Nous avons vérifié qu’il existe bien une
possibilité d’interaction physique entre Hfq et Rho (Kd ~50 nM) et avons montré que Hfq est
un inhibiteur efficace du facteur Rho, capable d’induire des phénomènes d’anti-terminaison
transcriptionnelle aussi bien in vitro qu’in vivo. Ces résultats et leurs implications possibles
sont détaillés dans le chapitre IV (page 143).
Je conclurai ce manuscrit en replaçant, dans la discussion, l’ensemble des résultats
obtenus durant cette thèse.
4
Généralités. Rho : un moteur «anomèrique» à activité ARN hélicase
Chapitre I. Rho : un moteur «anomèrique» à activité ARN
hélicase
En 1976, les hélicases étaient décrites comme agents mécano-chimiques contrôlant la
structure de l’ADN (Abdel-Monem and Hoffmann-Berling 1976). Aujourd’hui, on sait que les
hélicases sont des moteurs moléculaires qui utilisent l’hydrolyse des NTPs pour dérouler
l’ADN ou des duplexes ARN, mais aussi pour déplacer des obstacles nucléoprotéiques (figure
02) [pour revue : (Mackintosh and Raney 2006; Jankowsky and Bowers 2006; Singleton et al.
2007)]. Par conséquent, elles jouent un rôle dans tous les métabolismes cellulaires qui
impliquent les acides nucléiques comme, par exemple, la réplication et la réparation de
l’ADN, la transcription, la traduction, la biosynthèse du ribosome, la maturation des ARN et
leur épissage ou encore les processus de l’export nucléaire [pour revue : (Delagoutte and von
Hippel 2002, 2003; Konieczny 2003; Bleichert and Baserga 2007; Pyle 2008; Jankowsky and
Fairman-williams 2010; Rabhi et al. 2010b)].
Les hélicases ont été identifiées chez la quasi-totalité des organismes procaryotes et
eucaryotes ainsi que chez les bactériophages et les virus [pour revue : (Matson and KaiserRogers 1990)]. Chez l’homme, la dérégulation de leur expression ou de leur activité a été
associée à de nombreuses pathologies dont des cancers [pour revue : (Abdelhaleem 2004; Guo
et al. 2005; Hanada and Hickson 2007)]. Le nombre d’hélicases est en général proportionnel à
la complexité de l’organisme hôte. Par exemple, on compte une quarantaine de protéines à
boîte DEAD (DEAD indiquant une séquence consensus en acide aminé rencontrée chez ces
enzymes) chez l’homme, environ 25 chez Saccharomyces cerevisiae et seulement 5 chez E.
coli; chez cette bactérie il n’y a au total qu’une vingtaine d’hélicases (Egelman 1998) incluant
le facteur Rho, l’objet d’étude de ce mémoire (tableau 01).
Hélicase
Duplexes acides
nucléiques
NTP NDP + Pi
+
NTP NDP + Pi
+
Obstacles
Nucléo-protéiques
Figure 02. Hélicases comme moteurs moléculaires NTP-dépendants.
5
Gene name
Helicase coding genes from EchoBASE (http://www.york.ac.uk/res/thomas/index.cfm)
Synonyms
Function
dbpA
deaD
rhlC
rhlD, mssB, csdA
DinG
dnaB
rarB
groP, grpA, grpD
helD
hepA
hrpA
hrpB
lhr
mfd
priA
srjB
rapA, yabA
recB
rorA, ior
recD
hopE
recG
spoV, radC
yadO
rhlF
TRCF
srgA
recQ
rep
rhlB
rhlE
rho
ruvA
ruvB
srmB
uvrD
mbrA, dasC?
mmrA?
nitA, psuA, rnsC, tsu,
sbaA, sun, nusD
rbaB, rhlA
dda, mutU, pdeB,
rad, recL, uvrE, srjC,
dar-2, uvr502
DEAD-box protein family; ATP-dependent RNA helicase specific for 23S rRNA
DEAD-box protein family; translation factor W2; homologous to eIF4A; facilitates translation of
mRNAs with 5 secondary structures; multicopy suppressor of rpsB(ts) mutations; cold shockinducible; acid-inducible
LexA regulated (SOS) repair enzyme; DNA-dependent ATPase activity; putative DNA helicase
Replicative DNA helicase; DNA-dependent ATPase involved in DNA synthesis; binds DNA
contrahelicase termination protein Tus at Ter sites; possibly involved in DNA recombination
Helicase IV
RNA polymerase binding protein; mutants are UV-S; ATPase and putative helicase
RNA helicase-like; similarity to eukaryotic DEAH family
RNA helicase-like; similarity to eukaryotic DEAH family and araC
Probable ATP-dependent helicase
DNA repair; disciation of inactive RNAP molecules stalled at template DNA lesions
Primosome factor Y; also called protein n; ATP-dependent DNA helicase activity required for
RecA-dependent stable DNA replication mode; also involved in double-strand break repair
Recombination and repair; RecBCD Exonuclease V subunit; chi-activated RecBCD recombinase
subunit; RecBCD helicase subunit; contains nuclease active site and ATP-binding site; RecB alone
has helicase activity; binds RecC
Recombination and repair; RecBCD Exonuclease V subunit; recD mutants are constitutively
activated for recombination; RecBCD helicase subunit; contains ATP-binding site; binds RecC;
inhibits RecA loading
Branch migration of Holliday junctions; junction-specific DNA helicase (see ruvABC); allelic to
radC102
Conjugational recombination and repair; presynaptic stage of recombination; lexA regulon; RecQ
helicase
Rep helicase; a single-stranded DNA-dependent ATPase
DEAD-box protein family; unwinds dsRNA; component of RNA degradosome; also binds PNPase
directly
DEAD-box protein family; ATP-dependent RNA helicase-like protein
Transcription termination factor Rho; bicyclomycin target; essential gene
Holliday junction recognition; lexA regulon
Branch migration of Holliday structures; lexA regulon
DEAD-box protein family; ATP-dependent RNA helicase; suppresses 50S ribosome assembly defect
of rplX(ts)
DNA-dependent ATPaseI-DNA helicase II; increased rates of spontaneous mutagenesis
Tableau 01. Les hélicases identifiées chez E. coli. D’après : (http://www.york.ac.uk/res/thomas/index.cfm).
1. Les grandes familles d’hélicases
L’étude des séquences primaires des gènes codant pour les hélicases a permis de
révéler des motifs courts d’acides aminés conservés, appelés « motifs hélicases » (Gorbalenya
et al. 1989; Hodgman 1988; Gorbalenya and Koonin 1993). Sur la base de cette découverte,
Gorbalenya et Koonin ont proposé une classification générale des hélicases en cinq
superfamilles majeures (SF-1, SF-2, SF-3, SF-4, SF-5) en fonction de leur similarité de
séquence et de l’organisation de ces régions conservées (Gorbalenya and Koonin 1993; Hall
and Matson 1999). Les données structurales récentes et biochimiques ont permis l’affinement
et l’extension des superfamilles (SF-6 et SF-7), pour y inclure les aspects qui ont trait à leurs
mécanismes biochimiques [pour revue : (Singleton et al. 2007; Berger 2008)]. Les différentes
superfamilles d’hélicases, leurs caractéristiques moléculaires, leurs fonctions cellulaires, et
quelques membres de ces superfamilles, sont résumés dans le tableau 02.
6
Superfamily/class
Protein Fold
Oligomeric state
Polarity
Function
Example Members
RecA
(tandem pair )
Monomer
(dimmer/mutimer)
3'-5' (SFI-IA)
5'-3' (SFI-IB)
DNA unwinding, repair and
degradation
Bacterial PcrA,Rep, UvrD,
RecBCD, Dda; eukaryotic
Rrm3, Pif1, Dna2
RecA
(tandem pair )
Monomer
(dimmer/mutimer)
3'-5' (SFI-IIA)
5'-3' (SFI-IIB)
Somme dsDNA
translocases
DExD/H-box proteins
(eukaryotic elf4A, Prp2, Ski2,
Vasa, Dpbs, NS3 of hepatitis
C ); Snf2/SWI proteins
(eukaryotic Snf2, ISWI,
Rad54, archaeal Hel308);
bacterial RecQ, RecG, UvrB
AAA+
Hexamer (dodecamer?)
3'-5'
RNA melting, RNA-binding
protein displacement; DNAor
RNA
Unwinding; chromatin
remodeling; DNA/RNA
translocation; melting and
migration of Holliday junctions
or branched structures
DNA rewinding/replication
RecA
Hexamer
(other states ?)
5'-3'
(dsDNA?)
DNA unwinding/replication;
ssRNA packaging
Superfamily V (SF-V)
RecA
Hexamer
5'-3'
Superfamily VI (SFVI)
AAA+
(PS-II clade)
Hexamer
5'-3'
(dsDNA?)
RNA translocation, RNA/DNA
heteroduplex unwinding;
transcription termination
DNA unwinding/replication
Superfamily VII ?
(SF-VII)
AAA+
(new clade ?)
Hexamer
(other states ?)
5'-3'
Superfamily I
(SF-I)
Superfamily II
(SF-II)
Superfamily III
(SF-III)
Superfamily IV (SFIV)
Chromatin remodeling
Papilloma virus E1, simian
virus 40large T-antigen,
adeno- associated virus
Rep40
Bacterial DnaB; phage T7
gp4, T4 gp41, SPP1 G40P;
pRSF1010 RepA; phage φ12
P4; mitochondrial protein
twinkle
Bacterial Rho
Eukaryotic/archaeal MCMs
Eukaryotic Tip48/49,
reptin/pontin
Tableau 02. Les superfamilles d’ hélicases. D’après : (Berger 2008).
En fonction du type d’acide nucléique ciblé, les hélicases sont généralement
considérées comme ADN ou ARN hélicases (tableau 02) [pour revue : (Bleichert and Baserga
2007; Berger 2008)], bien que certaines hélicases ne discriminent pas ces deux cibles
(Jankowsky and Fairman-williams 2010). Cependant, quelle que soit leur superfamille
d’appartenance, les hélicases ont généralement les propriétés biochimiques suivantes : elles
sont capables d’interagir avec des acides nucléiques simples brins ou doubles brins et de fixer
et d’hydrolyser des nucléosides triphosphates. La fixation des acides nucléiques stimule
généralement l’activité NTPase, suggérant que ces deux propriétés dépendent l’une de l’autre.
Enfin, elles convertissent l’énergie chimique fournie par l’hydrolyse de NTPs en énergie
mécanique pour se déplacer le long d’une matrice d’acide nucléique et/ou pour catalyser la
dissociation d’obstacles nucléiques ou protéiques [pour revue : (Lohman and Bjornson 1996;
Patel and Picha 2000; Jankowsky and Bowers 2006)]. Une caractéristique importante, appelée
polarité, est la direction de déplacement de ces enzymes le long de leur substrat (de 3’ vers
5’ comme par exemple pour PcrA ou de 5’ vers 3’, comme pour Rho ; tableau 02).
Cependant, certaines hélicases à boite DEAD semblent dépourvues de toute polarité (et de
toute capacité de translocation) et n’être capables que de dissocier localement de courtes
hélices d’ARN (Jankowsky and Fairman-williams 2010).
Les caractéristiques des différentes superfamilles d’hélicases (tableau 02) ont fait
l’objet de nombreuses revues récentes [pour revue : (Hickman and Dyda 2005; Donmez and
7
Patel 2006; Bleichert and Baserga 2007; Jankowsky and Fairman 2007; Singleton et al. 2007;
Pyle 2008; Fairman-Williams et al. 2010; Rabhi et al. 2010b)]. On peut également adopter
une classification plus simple des hélicases en fonction de leur état d’oligomérisation. On
distingue alors les hélicases de type «monomérique» (SF-1 et SF-2) de celles à structure
«oligomérique» (SF-3SF-7) (tableau 02).
Il est devenu difficile de faire une revue exhaustive des nombreux articles
scientifiques qui traitent de la thématique «hélicase» (plus de 10000 articles dans PUBMED à
ce jour). C’est pourquoi, je me contenterai d’une brève description générale des hélicases de
types «monomériques» et «oligomériques», et m’intéresserai davantage aux ARN hélicases
oligomériques similaires au facteur Rho.
1.1. Les hélicases de types «monomériques»
Les hélicases des SF-1 et SF-2 adoptent toutes une organisation fonctionnelle de base
en «monomère». Le monomère est constitué de deux modules de type RecA (domaines
hélicases) liés par un linker peptidique (figure 03). Ce linker peut avoir une composition,
taille, et/ou structure très variables d’une enzyme à une autre [pour revue : (Jankowsky and
Fairman 2007)]. Nous disposons de davantage d’informations sur la fonction catalytique et
l’organisation des motifs conservés des hélicases des SF-1 et SF-2 qui sont les plus
abondantes et donc les plus étudiées (figure 03).
Figure 03. Structure des hélicases des SF1 et SF-2. (A) organisation des domaines
RecA-like et distribution des séquences
conservées dans ces domaines. Les motifs
spécifiques à la SF-1, 1B et 1C sont en
vert et rose, respectivement. La coloration
des motifs conservés correspond à leurs
fonctions primaires, rouge: fixation et
hydrolyse de l’ATP; bleu: fixation à
l’ARN; jaune: communication entre les
domaines d’hydrolyse de l’ATP et de
fixation de l’ARN. (B) topologie des deux
ARN hélicases représentatives Upf1 et
Vasa des SF-1 et SF-2, respectivement.
Les flèches et les cylindres gris
correspondent aux feuillets β et hélices α,
respectivement.
Les
chiffres
correspondent aux numéros des feuillets β
connecteurs. Le feuillet β 3a et l’hélice en
bleu ainsi que le feuillet β 6* ne sont pas
présents chez tous les membres de la SF2. (C) organisation structurale des ARN
hélicases Upf1 et Vasa. Le code couleur
est le même que pour (A) et (B). L’ARN
dans la structure de l’hélicase Vasa est en
couleur beige. D’après : (Jankowsky and
Fairman-williams 2010).
8
Le NTP s’associe à l’interface entre les deux modules de type RecA (figure 04.A).
L’orientation respective de ces deux domaines est modulée par la nature du nucléotide fixé
(NTP ou NDP) et/ou par l’absence de celui-ci. C’est la fixation ou l’hydrolyse de cet NTP qui
produit l’énergie chimique nécessaire pour assurer le couplage mécano-chimique [pour revue:
(Singleton et al. 2007)]. Il a été montré chez un certain nombre de ces hélicases que la simple
fixation de l’ATP au site catalytique est suffisante pour induire un changement
conformationnel qui se traduit par un travail mécanique. C’est le cas de l’hélicase Ded1p
appartenant à la SF-2. En effet, chez cette enzyme, la simple fixation d’un analogue non
hydrolysable de l’ATP (ADP●BeFx, mimant la fixation de l’ATP au site ATPase) provoque
un changement conformationnel suffisant pour dissocier une courte hélice ARN-ARN in vitro
(Chen et al. 2008).
(A)
(B)
Figure 04. Représentation schématique du fonctionnement des hélicases, (A) de types monomériques
et (B) de types hexamériques.
Les hélicases «monomériques» fonctionnent suivant plusieurs mécanismes différents
et sont nécessaires pour des fonctions biologiques variées [pour revue : (Mackintosh and
Raney 2006)]. Une description exhaustive de l’ensemble des hélicases monomériques serait
inappropriée dans le cas de notre étude et je me contenterai d’évoquer brièvement ci-dessous
quelques caractéristiques significatives de ces enzymes. L’état oligomérique «fonctionnel»
des hélicases «monomériques» est souvent débattu. Par exemple, en s’appuyant sur des études
biochimiques, Harmon et Kowalczykowski ont initialement proposé que l’ADN hélicase
RecQ d’E. coli est fonctionnelle sous une forme multimérique (Harmon and Kowalczykowski
2001). Cependant, d’autres études biochimiques et enzymatiques indiquent plutôt que la
protéine RecQ fonctionne sous forme monomérique (Xu et al. 2003; Zhang et al. 2006). Cette
proposition est confortée par la structure cristallographique de la protéine RecQ qui la révèle
sous forme monomérique (Bernstein et al. 2003). Toutefois, des études biochimiques et
biophysiques ont révélé que l’activité optimale des hélicases monomériques nécessite parfois
9
la coopération de plusieurs monomères [pour revue : (Mackintosh and Raney 2006)]. C’est
par exemple le cas des ADN hélicases UvrD d’E. coli et PcrA de Bacillus stearothermophilus
de la SF-1 qui sont fonctionnelles in vitro sous une forme dimérique (Yang et al. 2008; Sun et
al. 2008).
La majorité des hélicases appartenant à la SF-2, qui est elle-même subdivisée en sousfamilles, sont des ARN hélicases. Quelques ARN hélicases appartiennent également à la SF-1
dont l’archétype est Upf1 (figure 03.C) (Linder et al. 1989; Jankowsky and Fairman 2007). La
première ARN hélicase à avoir été identifiée est le facteur d’initiation eIF4A de la levure
(Grifo et al. 1982). Depuis, la liste des ARN hélicases n’a cessé de s’allonger. Ces enzymes
sont impliquées dans tous les métabolismes des ARN : la transcription, l’épissage de l’ARN
prémessager, la biogénèse des ribosomes, le transport nucléocytoplasmique de l’ARN, la
traduction, la dégradation de l’ARN, la propagation du génome viral (Linder and Stutz 2001;
de la Cruz et al. 1999; Carpousis et al. 1999; Eisen and Lucchesi 1998; Iost and Dreyfus
2006) ou encore le «packaging» des ARN chez les phages [pour revue : (Kainov et al. 2006)].
1.2. Les hélicases oligomériques
L’organisation en anneau oligomérique de certaines hélicases a été établie par diverses
approches structurales et biochimiques, telles que des méthodes de microscopie électronique,
de filtration sur gel, de sédimentation ou encore de pontage chimique [pour revue : (Patel and
Picha 2000)]. Cette organisation est commune aux ADN hélicases, aux «dsDNA translocases»
(double-brin ADN translocases) NTP-dépendantes et à de rares ARN hélicases [pour revue :
(Jankowsky and Fairman-williams 2010)]. Cette oligomérisation est fréquemment en anneau
homo-hexamérique (figure 04.B). Des ADN hélicases hexamériques font partie intégrante de
la machinerie réplicative et sont nécessaires au cours des deux phases d’initiation et
d’élongation de la réplication [pour revue : (Delagoutte and von Hippel 2002; Remus and
Diffley 2009)]. Les hélicases hexamériques sont également impliquées dans d’autres
processus métaboliques comme par exemple la recombinaison ou la terminaison de la
transcription.
Une différence essentielle avec les enzymes de type «monomérique» est que chaque
chaîne peptidique au sein de l’anneau oligomérique ne contient qu’un seul domaine de type
RecA [figure 04.B; les domaines de type RecA sont parfois remplacés par les domaines
AAA+ apparentés ; (Berger 2008)]. Néanmoins, l’organisation en anneau permet la formation
de plusieurs interfaces entre modules RecA et donc de plusieurs poches ATPase (figure 04.B).
10
Cette organisation implique a priori un mécanisme de fonctionnement plus compliqué pour
ces enzymes. Par exemple, au sein d’un hexamère, six poches ATPase peuvent fixer et
hydrolyser l’ATP, ce qui peut nécessiter un mécanisme complexe de coordination et de
transmission du mouvement mécanique entre les différentes sous-unités (Enemark and
Joshua-Tor 2008). De plus, le substrat étant généralement positionné au centre de l’anneau, la
formation du complexe enzyme-substrat nécessite soit l’ouverture transitoire de l’anneau soit
son assemblage directement sur le substrat (voir paragraphe 4, page 34).
Il est important de noter que le mécanisme précis de transduction mécano-chimique
serait directement lié au mode d’hydrolyse des NTPs au sein de l’hexamère. En effet,
l’hélicase adopte des conformations différentes suivant qu’elle est associée ou non, au réactif
(NTP) ou aux produits de l’hydrolyse (NDP + Pi). Cela est illustré, par exemple, par l’étude
cristallographique du domaine hélicase de l’Antigène T SV40 de la SF-3 [pour revue :
(Enemark and Joshua-Tor 2008)]. La co-cristallisation de cette enzyme en présence de l’ATP
ou ADP ou encore en absence de nucléotide a révélé des différences conformationnelles
significatives principalement au niveau du centre de l’anneau hexamérique et des interfaces
monomère-monomère (figure 05), qui résultent d’une orientation respective des monomères
distinctes au sein de l’hexamère (Li et al. 2003; Gai et al. 2004).
Figure 05. Représentation des
changements
conformationnels
couplés à la fixation et l’hydrolyse de
l’ATP. Chaque monomère est
représenté de couleur différente.
Structure de l’hexamère en présence
d’ATP (A), d’ADP (B), en l’absence
de nucléotide (C). Les six molécules
d’ATP et d’ADP sont représentées en
rose. Les valeurs indiquées en Å
correspondent au diamètre du centre
de l’anneau hexamérique. D’après :
(Gai et al. 2004).
~ 17 Å
~ 14 Å
~ 22 Å
Il a été proposé que c’est l’alternance de ces trois états conformationnels distincts qui
induit le mouvement mécanique permettant à l’Antigène T SV40 de se déplacer sur l’ADN et
d’en moduler la fonction (Roman 2010). La transduction mécano-chimique au sein de cette
enzyme interviendrait donc suivant un mécanisme concerté d’hydrolyse des NTPs (figure
06.A). Néanmoins, d’autres mécanismes d’hydrolyse sont possibles au sein d’anneaux
11
oligomériques [pour revue : (Patel and Picha 2000; Delagoutte and von Hippel 2002; Pyle
2008; Rabhi et al. 2010b)]. Par exemple, l’hydrolyse des NTPs peut intervenir d’une façon
hasardeuse au sein des sites catalytiques qui fonctionnent indépendamment les uns des autres
autour de l’anneau (mécanisme probabiliste; figure 06.B). Une possibilité alternative est que
tous ou une partie des sites catalytiques hydrolysent des NTPs l’un après l’autre d’une
manière rotative (mécanisme séquentiel; figure 06.C). Il est important de noter que ce
mécanisme séquentiel d’hydrolyse des NTPs est souvent associé aux hélicases hexamériques
et que, d’une façon générale, le modèle séquentiel, associé au positionnement des sites
ATPase à l’interface entre les sous-unités de l’hexamère, semble assurer une meilleure
continuité de l’action mécano-chimique.
(A)
Figure 06. Les principaux modèles
d’hydrolyse des NTPs pour les
hélicases hexamériques.
(B)
(C)
Contrairement au grand nombre d’ARN hélicases de types «monomériques», seules
quelques ARN hélicases sont connues pour adopter une organisation oligomérique : P4, Rho
et l’Antigène T SV40 [pour revue : (Jankowsky and Fairman-williams 2010)]. La
signification biologique de l’activité ARN hélicase observée in vitro pour l’Antigène T SV40
est obscure, cette enzyme étant impliquée principalement dans la réplication de l’ADN viral
(Uhlmann-Schiffler et al. 2002). En revanche, les activités ARN hélicases des enzymes P4 et
Rho peuvent être directement reliées à leur fonctions biologiques [pour revue : (Rabhi et al.
2010b)].
L’ARN hélicase hexamérique P4 (SF-4) est responsable du «packaging» des ARN
génomiques simples brins dans les procapsides des bactériophages de la famille des
Cystoviridae [pour revue : (Kainov et al. 2006; Roman 2010)]. P4 est donc un moteur
moléculaire qui transloque l’ARN et utilise son activité hélicase pour dissocier les structures
secondaires des ARN génomiques lors de leur «packaging» (figure 09.A, page 15).
12
Figure 07. Structure de l’ARN hélicase P4 du phage Ф12. (A) organisation des domaines RecA-like et
distribution des séquences conservées dans ces domaines. La coloration des motifs conservés
correspond à leurs fonctions primaires, rouge : fixation et hydrolyse de l’ATP; bleu : fixation à l’ARN;
jaune : communication entre les domaines d’hydrolyse de l’ATP et fixation de ARN. Le motif RF
correspond au doigt arginine (arginine finger). (B) topologie de l’ARN hélicase P4 du phage Ф12. Les
flèches et les cylindres correspondent aux feuillets β et hélices α, respectivement. Ils constituent le
domaine hélicase de P4 en gris foncé et le domaine N-terminal de P4 en gris clair. Les chiffres
correspondent aux numéros des feuillets β. (C) structure de l’hexamère P4 du phage Ф12. Les chiffres
romains indiquent le numéro des sous-unités de couleur alternativement gris et orange. (D) structure
de deux sous-unités adjacentes constituant l’hexamère P4. Les motifs conservés sont colorés comme
dans (A). D’après : (Jankowsky and Fairman-williams 2010).
Des études biochimiques (Kainov et al. 2003; Lisal et al. 2004) et structurales (Juuti et
al. 1998; Mancini et al. 2004; Kainov et al. 2008) des protéines P4 de différents phages ont
révélé que cette enzyme présente des similitudes structurales et mécanistiques avec une
variété de moteurs RecA/F1-ATPase-like qui sont impliqués dans diverses fonctions
biologiques. Les motifs conservés chez la SF-4 (H1-4) sont situés dans des positions
équivalentes à celles des motifs typiques des SF-1 et SF-2 (figure 03, page 8 et figure 07). Les
motifs H1, H1a-H2 et H3 sont équivalents aux motifs I (walker A), II (walker B) et III,
respectivement, chez les SF-1 et SF-2. Ces motifs H1-3 sont impliqués dans la fixation et
l’hydrolyse de l’ATP. Cependant, les motifs L1, L2 et H4 impliqués dans la reconnaissance et
la fixation du substrat (ARN) n’ont pas d’équivalent chez les SF-1 et SF-2 (figure 07).
Toutefois, des motifs équivalents aux L1, L2 sont identifiés chez le facteur Rho (les boucles R
et Q sur la figure 08), une ARN hélicase hexamérique bactérienne de la SF-5 : [pour revue :
(Jankowsky and Fairman-williams 2010; Rabhi et al. 2010b).].
13
Le facteur Rho joue un rôle capital dans la régulation de l’expression génique
bactérienne en modulant la transcription (figure 09.B). En effet, Rho est responsable d’une
large proportion (20-50%) des événements de terminaison de la transcription chez E. coli
[pour revue : (Ciampi 2006; Banerjee et al. 2006)].
Figure 08. Structure de l’ARN hélicase Rho d’E. coli. (A) organisation des domaines RecA-like et
distribution des séquences conservées dans ces domaines. La coloration des motifs conservés
correspond à leurs fonctions primaires, rouge : fixation et hydrolyse de l’ATP et bleu : fixation à
l’ARN. Le motif RF correspond au doigt arginine (arginine finger). Le domaine N-terminal de
fixation à l’ARN est en bleu-vert. (B) topologie de l’ARN hélicase Rho d’E. coli. Les flèches et les
cylindres correspondent aux feuillets β et hélices α, respectivement. Ils constituent le domaine
hélicase de Rho en gris foncé et le domaine N-terminal de Rho en bleus clair. Les chiffres
correspondent aux numéros des feuillets β. (C) structure de l’hexamère Rho. Les chiffres romains
indiquent le numéro des sous-unités de couleur alternativement gris et orange. (D) structure de deux
sous-unités adjacentes constituant l’hexamère Rho. Les motifs conservés sont colorés comme dans
(A) et (B). Les nucléotides de l’ARN liés à Rho sont représentés en violet. D’après : (Jankowsky and
Fairman-williams 2010).
La terminaison Rho-dépendante de la transcription et les autres rôles biologiques de
l’enzyme Rho, essentielle pour de nombreuses espèces bactériennes, sont décrits dans le
chapitre II. In vitro, Rho provoque la dissociation de duplexes ARN-ADN et ARN-ARN et
également de complexes ribonucléo-protéiques (Walmacq et al. 2004, 2006; Schwartz et al.
2007b; Schwartz et al. 2007a; Boudvillain et al. 2010b).
Le facteur Rho est constitué de deux domaines, le domaine hélicase et le domaine de
fixation à l’ARN (figure 08.D). Les doigts arginines identifiés chez Rho sont équivalents aux
14
motifs conservés IV chez les SF-1 et SF-2 (figure 03, page 8 et figure 08). Comme nous
l’avons vu pour P4, les motifs A et B impliqués dans la fixation et l’hydrolyse de l’ATP du
facteur Rho (figure 08) sont équivalents aux motifs Walker A et B rencontrés chez les
hélicases des SF-1 et SF-2 (figure 03, page 8).
Les deux moteurs moléculaires P4 et Rho sont (d)NTP-dépendants et provoquent la
dissociation des hybrides ARN-ARN et ARN-ADN in vitro en se déplaçant sur l’ARN dans
l’orientation 5’3’ du transcrit [pour revue : (Rabhi et al. 2010b)]. Toutefois, une de ces
enzymes fonctionne en «marche arrière» par rapport à l’autre (figure 09). Pour P4, l’ARN est
transloqué de la face N-terminale vers la face C-terminale qui est ancrée dans la procapside
(figure 09.A). En revanche, pour Rho, la translocation de l’ARN s’effectue de la face Cterminale vers N-terminale de l’enzyme (figure 09.B). Cette différence d’orientation nécessite
la mise en œuvre de mécanismes de translocation distincts pour ces enzymes (figure 09).
( )
( )
Figure 09. Représentations schématiques des protéines hexamériques P4 et Rho dans leur
contextes biologiques. (A) «packaging» de l’ARN viral par l’ARN hélicase P4. (B) terminaison
de la transcription chez E. coli par l’ARN hélicase Rho.
La plupart des données bibliographiques disponibles sur le facteur Rho ont été
obtenues pour l’enzyme d’E. coli. Cependant, des homologues de Rho sont identifiés chez la
plupart des bactéries incluant des espèces ou souches pathogènes (Opperman and Richardson
1994; Washburn et al. 2001). On considère généralement que Rho est important ou essentiel
pour les bactéries à gram négatif (dont E. coli) et accessoire chez les bactéries à Gram positif.
Cette généralisation doit néanmoins être considérée avec précaution puisque Rho serait
indispensable chez la bactérie à Gram positif Micrococcus luteus (Nowatzke et al. 1997) et
pourrait être accessoire chez des bactéries à Gram négatif comme, N. meningitidis, P.
aeruginosa, P. vulgaris et E. cloacae (Nishida et al. 1972). Les données bibliographiques et
15
travaux présentés dans ce manuscrit de thèse se focalisent sur le facteur Rho d’E. coli, dont
les caractéristiques moléculaires sont détaillées dans les paragraphes suivants.
2. Les activités enzymatiques du facteur Rho
2.1. L’activité ATPase
L’activité ATPase du facteur Rho est strictement ARN-dépendante (LoweryGoldhammer and Richardson 1974; Lowery and Richardson 1977). L’hydrolyse de l’ATP au
sein du facteur Rho a été mise en évidence lors de terminaison de la transcription Rhodépendante in vitro ou encore en présence d’un polymère ARN, le poly[rC] (LoweryGoldhammer and Richardson 1974; Lowery and Richardson 1977).
Le facteur Rho est capable d’hydrolyser les quatre NTPs, bien que l’ATP soit le
substrat préférentiel de Rho (Lowery and Richardson 1977). Il est intéressant de noter que
l’activité ATPase de Rho in vitro est affectée par la nature et la concentration en ions
divalents (Brennan et al. 1990; Zou and Richardson 1991). Il a été montré que la fixation du
facteur Rho à l’ARN ne nécessite pas la présence de l’ATP (Galluppi and Richardson 1980;
McSwiggen et al. 1988) bien que celle-ci semble stabiliser les complexes Rho-ARN (Finger
and Richardson 1982; Gan and Richardson 1999). Le mécanisme d’hydrolyse de l’ATP a été
étudié par plusieurs groupes mais le mécanisme exact reste controversé. Néanmoins,
différents modèles ont été proposés (Geiselmann et al. 1993a; Stitt and Xu 1998; Kim and
Patel 1999; Chen and Stitt 2009).
Il a été montré qu’en absence d’ARN, Rho est capable de fixer trois molécules d’ATP
(Stitt 1988). Il semblerait que l’hexamère Rho possède trois sites forts de fixation à l’ATP.
Deux opinions divergent concernant l’existence de trois autres sites de liaison faible (Kim and
Patel 1999; Stitt 2001). Des mesures cinétiques à l’état pré-stationnaire suggèrent que les trois
sites forts de liaison à l’ATP correspondent à des sites non-catalytiques, et les sites faibles à
des sites catalytiques (figure 10) (Kim et al. 1999).
Trois molécules d’ATPs seraient fixées au niveau des sites non catalytiques et
hydrolysées simultanément à une vitesse de 1.8 sec-1 à 18 °C, puis les produits d’hydrolyse de
l’ATP seraient dissociés des sites non catalytiques à une vitesse de 0.02 sec-1 (figure 10.A)
(Kim and Patel 1999). A l’inverse de ce mécanisme coopératif, un mécanisme séquentiel de
fixation et d’hydrolyse rapide de l’ATP (> 250 sec-1) a été proposé pour les sous-unités
catalytiques (figure 10) (Kim and Patel 1999). L’activité ATPase au niveau des sites noncatalytiques (0.02 sec-1) serait trop faible pour être responsable de la translocation de Rho ou
16
de la dissociation des doubles hélices (Kim et al. 1999). D’autres auteurs ont proposé que trois
sites catalytiques identiques par hexamère (Kd ~ 0.2-5µM suivant les conditions salines)
hydrolysent les trois molécules d’ATP de façon séquentielle et dans un ordre déterminé
(figure 10.B). Il existerait une coopérativité catalytique entre les trois sites et l’étape
cinétiquement limitante serait un changement conformationnel de l’hexamère (Stitt and Xu
1998; Stitt 2001; Browne et al. 2005). Ces auteurs ont également suggéré l’absence de sites
faibles non catalytiques (Stitt and Xu 1998; Stitt 2001).
Figure 10. Comparaison
du
mécanisme
d’hydrolyse de l’ATP au
niveau (A) des sites
catalytiques (représentés
par des cercles gris) et
(B) non catalytiques
(cercles blancs) de Rho
proposés par Kim et
Patel. Le symbole A
représente un site fort de
fixation à l’ATP, D un
site associé aux produits
d’hydrolyse ADP+Pi, et
a un site faible de
fixation
à
l’ATP.
D’après : (Kim and
Patel 1999).
Les mécanismes d’hydrolyse de l’ATP décrits précédemment sont compatibles avec
une partie des données structurales (structure : trimère de dimère) (Skordalakes and Berger
2006) et le modèle de translocation qui en découle sera détaillé.
Récemment, un autre mécanisme d’hydrolyse de l’ATP a été proposé pour Rho qui
suggère que plus de trois sites ATPase sont susceptibles de fixer et d’induire une hydrolyse
rapide de l’ATP et que les six poches ATPase hydrolysent l’ATP en présence de l’ARN d’une
façon séquentielle (Adelman et al. 2006). Ce modèle est compatible avec des données
structurales plus récentes du facteur Rho (structure : asymétrique) et le modèle de
translocation suggéré par cette étude structurale (Thomsen and Berger 2009) sera également
détaillé plus loin dans ce manuscrit.
Dans tous les cas, les études enzymatiques et structurales écartent un mécanisme
«probabiliste» d’hydrolyse de l’ATP pour le facteur Rho. Il a été montré, par exemple, que la
reconstitution des hexamères Rho à partir d’un mélange de protomères sauvages et mutés
(inactifs pour l’activité ATPase) inhibe l’activité ATPase de Rho (Adelman et al. 2006). De la
même façon, le pontage irréversible de l’analogue 8-azidoadenosine 5’-triphosphate (8-azido-
17
ATP) par irradiation aux UV à une partie des poches ATPases inhibe l’activité ATPase de
Rho en présence d’un excès d’ATP (O and Stitt 1994).
Récemment il a été montré que le facteur Rho de Mycobacterium tuberculosis
(mtbRho) possède une activité ATPase découplée de l’activité de terminaison de la
transcription (Kalarickal et al. 2010). En revanche, chez E. coli, l’hydrolyse de l’ATP est
nécessaire pour les activités hélicase, translocase et de terminaison de la transcription Rhodépendante ou encore pour que Rho puisse déplacer des obstacles ribonucléo-protéiques
(Brennan et al. 1987; Dombroski et al. 1988; Richardson 2006; Schwartz et al. 2007a).
2.2. L’activité hélicase
L’activité hélicase de Rho a été identifiée pour la première fois in vitro par le groupe
de Platt en 1987 en utilisant un hydride ARN-ADN (Brennan et al. 1987). Cette activité
hélicase de Rho se traduit par le relargage du transcrit radiomarqué (trpt’) de l’hybride ARNADN en extrémité 3’. Cette activité ARN/ADN hélicase nécessite l’hydrolyse de NTPs et
dépend de la reconnaissance et de l’interaction de la protéine Rho avec un site Rut (Brennan
et al. 1987; Brennan et al. 1990; Walstrom et al. 1997; Walmacq et al. 2004),
préférentiellement utilisée par Rho (voir paragraphe 4.1, page 43). Bien que riches en
cytosines, aucune séquence ou structure consensus n’a pu être clairement établie pour les sites
Rut [pour revue : (Ciampi 2006)]. C’est dans ce contexte qu’a été découverte au laboratoire
une séquence d’entrée synthétique riche en pyrimidines, nommée aRut, capable d’induire une
terminaison Rho-dépendante totale aussi bien in vitro qu’in vivo (Guerin et al. 1998). Cette
séquence artificielle a été utilisée pour développer un système d’étude minimal afin de
caractériser de façon approfondie l’activité ARN-ADN hélicase de Rho in vitro (Walmacq et
al. 2004, 2006). Il a été montré que Rho est capable de former des complexes productifs
(induction de l’activité ATPase, dissociation des doubles hélices ARN-ADN) avec des
substrats contenant un site d’entrée synthétique aRut (Walmacq et al. 2004). De plus, en
utilisant ces substrats il a été vérifié que Rho transloque unidirectionnellement dans la
direction 5’3’ (Walmacq et al. 2004).
L’activité hélicase du facteur Rho in vitro, est caractérisée par deux phases : une
première phase rapide exponentielle «pre-steady state» correspond au premier cycle de
translocation de Rho suivie d’une seconde phase lente linéaire «steady state» reflétant une
combinaison complexe de réactions secondaires, liées au recyclage de Rho sur d’autres
molécules de substrat (figure 11) (Walstrom et al. 1997; Walmacq et al. 2004). Un moyen
18
expérimental pour caractériser uniquement le premier cycle de translocation sur l’ARN et la
dissociation de l’hybride par Rho est d’introduire en excès le poly[rC] lors de l’initiation de la
réaction hélicase. Ces conditions expérimentales sont dites «conditions de cycle unique» car
le poly[rC] piège les molécules de Rho libres pour que celles-ci ne puissent pas se réassocier à
des molécules de substrat ARN-ADN (figure 11) (Walstrom et al. 1997; Walmacq et al.
2004).
Figure 11. Représentation schématique des différentes étapes intervenant lors d’expériences
hélicases réalisées dans des conditions de cycles multiples et de cycle unique. Lors de son
déplacement depuis la séquence d’entrée (rectangle noir) vers l’extrémité 3’ de l’ARN,
l’hexamère Rho (représenté de façon schématique par 6 cercles groupés) dissocie la double
hélice ARN/ADN qu’il rencontre. Des conditions de cycles multiples se traduisent par un
recyclage permanent de l’hexamère Rho sur d’autres molécules de substrat. En revanche, un
excès de poly[rC] ajouté lors de l’initiation de la réaction hélicase permet de piéger les
molécules de Rho libres, et de limiter la réaction à un seul cycle de translocation/dissociation
de la double hélice d’acide nucléique.
Il a été montré au laboratoire que Rho est incapable de dissocier une hélice ARN-ADN
en aval d’une discontinuité physique «cassure» au sein du brin ARN (Walmacq et al. 2006).
En revanche, la même «cassure» au sein du brin ADN n’interfère pas avec l’activité hélicase
de Rho (Walmacq et al. 2006). Ce résultat suggère que l’interaction productive entre Rho et
l’ARN joue un rôle critique dans la translocation et la dissociation des hélices ARN-ADN par
Rho. Cette même étude a révélé que le facteur Rho dissocie des obstacles de nature variable
suivant un mécanisme d’exclusion stérique, mécanisme répandu chez les ADN hélicases
hexamériques réplicatives [pour revue : (Patel and Picha 2000)]. Ce modèle exclusion stérique
est soutenu par les données structurales du facteur Rho qui suggèrent que le diamètre de
l’anneau homo-hexamérique ne permet le passage que d’un seul brin d’acide nucléique
(Skordalakes and Berger 2003; Skordalakes et al. 2005; Skordalakes and Berger 2006;
Thomsen and Berger 2009). Ces travaux réalisés au laboratoire ont révélé que la réaction
hélicase est cinétiquement-limitée par une étape initiale lente (formation d’un complexe Rho-
19
substrat productif, paragraphe 4, page 34), distincte du processus de translocation (Walmacq
et al. 2004, 2006; Schwartz et al. 2007a). La continuité de ces travaux était l’élucidation du
mécanisme de translocation de Rho sur la chaîne ARN. Cette problématique constitue l’objet
des études présentées dans les articles I et II de ce mémoire de thèse. En 2007, la translocation
du facteur Rho a été étudiée au laboratoire en utilisant un substrat synthétique multi-pièces
(figure 12) contenant une jonction ARN-ARN (mimant une structure secondaire de type tigeboucle) (Schwartz et al. 2007b).
(A)
(B)
(C)
(D)
Figure 12. (A) substrat tripartite R5R3O1 est principalement constitué de deux transcrits distincts R5
et R3 appariés par une jonction ARN-ARN intercalée entre la séquence d’entrée synthétique aRut et
une double hélice ARN-ADN (R3-O1) rapportrice. (B) réactions hélicase avec le substrat tripartite
dans les conditions multi-cycles (gel et graphe « -poly(rC)»), et dans les conditions cycle unique
(graphe «+poly(rC)»). La piste ∆ correspond à un échantillon dénaturé à 95°C. L’astérisque
indique la position du marqueur radioactif (P32). (C) modèle de formation du complexe substratRho. (D) les voies RP1 et RP2. D’après : (Schwartz et al. 2007b).
L’utilisation du substrat synthétique tripartite (figures 12A et 12.B) a permis d’isoler
deux voies réactionnelles («reaction pathway» : RP), pour l’activité hélicase de Rho. Dans la
voie classique (Walmacq et al. 2004, 2006), Rho fixe la séquence aRut et transloque vers
l’extrémité 3’ en provoquant ainsi la dissociation de l’hélice ARN-ARN (produits de la voie
minoritaire RP2 : R5 et R3-O1, figures 12.B et 12.D). Il est intéressant de noter que la voie
RP2 est réprimée par un oligonucléotide complémentaire de la séquence aRut ou encore par la
délétion de cette séquence (Schwartz et al. 2007b). En revanche, dans la deuxième voie
majoritaire (RP1), Rho est capable d’ignorer la jonction ARN-ARN, et de provoquer la
dissociation de la double hélice ARN-ADN rapportrice (produits de la voie RP1: R5-R3 et O1,
20
figures 12.B et 12.D) en aval de cette jonction (Schwartz et al. 2007b). Cette étude confirme
le résultat obtenu par Steinmetz et ses collaborateurs qui ont montré qu’une structure en tige
boucle sur le transcrit trpt’ en aval d’une hélice ARN-ADN n’interfère pas avec l’activité
hélicase de Rho (Steinmetz et al. 1990). La voie RP1 est partiellement opérationnelle lorsque
la séquence aRut est délétée du substrat à condition que le brin R5 ne soit pas un brin ADN
(Schwartz et al. 2007b). Cette étude démontre que Rho peut former différents assemblages
productifs avec son substrat. Néanmoins, la forme privilégiée semble correspondre à
l’accommodation des substrats en tige boucle sur le dessus de l’hexamère (figure 12.C) au
sein du site PBS (voir paragraphe 3.2, page 24). Cette accommodation préférentielle serait
due au gain entropique assuré par la structure secondaire ainsi qu’à des interactions auxiliaires
«non-canoniques» entre le PBS et les groupement 2’ hydroxyl (2’-OH) se trouvant en amont
de la tige boucle (figure 12.C) (Schwartz et al. 2007b). Ces propriétés peuvent être utilisées
avantageusement pour préparer des substrats tripartites dépourvus de séquence aRut qui
n’utiliseraient que la voie réactionnelle RP1 (Schwartz et al. 2007b). La configuration
particulière des complexes Rho-substrats formés par ces constructions tripartites est utile pour
l’étude du mécanisme de la translocation de Rho sur l’ARN (voir apport personnel, article I,
page 84).
A ce jour, aucun analogue de Rho n’a été découvert chez les cellules nucléées, ni en
terme de séquence, ni en terme de fonction (Richardson 2002). L’expression conditionnelle de
Rho chez S. cerevisiae est toxique et provoque des défauts de croissance dose-dépendants
(Arnoldo et al. 2008; Mosrin-Huaman et al. 2009). Cet effet de Rho peut être modulé par des
mutations au niveau de l’ARNPII qui est responsable de la synthèse des ARNm de la levure
(Mosrin-Huaman et al. 2009). In vitro, Rho est capable d’induire la terminaison de la
transcription des ARN synthétisés par l’ARNPII de la levure mais pas par les ARNPI et III
responsables de la synthèse des ARNr et ARNt, respectivement (Lang et al. 1998). In vivo,
l’expression de Rho chez la levure induit la production d’ARNm aberrants due probablement
à la dissociation précoce des CTE par le facteur Rho (Mosrin-Huaman et al. 2009). Ces effets
pourraient être expliqués par la capacité de Rho à interagir avec des régions nues des
transcrits et à déplacer des obstacles hétérologues forts (figure 13), en cours de translocation
(Schwartz et al. 2007a). Néanmoins, le ciblage spécifique de l’ARNPII suggère que d’autres
paramètres, fonctionnels et/ou mécanistiques, entrent en jeu. In fine, le rôle exact assuré par
l’activité hélicase de Rho d’un point de vue biologique, n’est pas clairement défini.
Néanmoins, l’activité hélicase du facteur Rho pourrait expliquer l’implication de Rho dans la
résolution des «R-loops» (hétéro-duplexes formés à l’arrière de l’ARNP par appariement de la
21
matrice ADN avec une région complémentaire du transcrit naissant) qui sont délétères in vivo
(Harinarayanan and Gowrishankar 2003; Drolet 2006). La formation de ces «R-loops» est
favorisée lorsque la traduction est découplée de la transcription chez la bactérie, c’est-à-dire
lorsque Rho a le plus de chance de s’associer au transcrit (figure 01, page 3) [pour revue :
(Gowrishankar and Harinarayanan 2004)]. Rho pourrait donc dissocier rapidement et
efficacement les «R-loops» lors de son déplacement dans le sens 5’3’ sur l’ARN (Walmacq
et al. 2004, 2006). Rho d’ailleurs est capable de dissocier d’autres obstacles (figure 13), de
façon ATP-dépendante, comme une streptavidine liée à un substrat ARN biotinylé (Schwartz
et al. 2007a). La force mécanique nécessaire à la dissociation de la streptavidine est estimée à
200 pN (Moy et al. 1994; Wong et al. 1998), c’est-à-dire 6,5 fois supérieure à la force requise
pour arracher l’ARN du complexe d’élongation de la transcription (Dalal et al. 2006). On ne
peut donc exclure que l’activité hélicase de Rho soit avant tout une manifestation de sa
capacité à transloquer le long d’un brin ARN et à déplacer les obstacles se trouvant sur son
chemin. Pour ces raisons, l’activité centrale de terminaison de la transcription du facteur Rho
fait l’objet d’un traitement séparé au chapitre II.
Figure 13. Rho est un moteur
moléculaire
capable
de
perturber
in
vitro
un
assemblage nucléo-protéique
hétérologue.
D’après :
(Schwartz et al. 2007a).
3. Organisation structurale du facteur Rho
3.1. Séquence primaire de l’enzyme Rho
Le gène codant pour le facteur Rho a été séquencé pour la première fois en 1983 par
Pinkham et Platt (Pinkham and Platt 1983). La connaissance de la séquence du gène rho a
permis d’obtenir des informations sur l’organisation structurale et les propriétés physicochimiques du facteur Rho. Chez E. coli, la protéine Rho est composée de 419 acides aminés
qui définissent plusieurs domaines à l’organisation et aux propriétés remarquables (figure 14).
22
Figure 14. Organisation structurale du polypeptide Rho. Les différents domaines sont
représentés ainsi que les sites de coupure à la trypsine. Les régions conservées entre les
différentes bactéries sont représentées par des rectangles, les segments les plus foncés
correspondant aux zones les mieux conservées. D’après : (Richardson 1996).
L’organisation de Rho en deux domaines structuraux distincts a été révélée par des
expériences de coupure à la trypsine (Dombroski and Platt 1988; Dolan et al. 1990). Les deux
domaines manifestent deux fonctions distinctes : le premier est responsable de fixation des
acides nucléiques et le second de l’hydrolyse de l’ATP (Bear et al. 1985; Dombroski et al.
1988).
Le premier domaine (figure 14), correspondant aux 130 premiers résidus N-terminaux
(Richardson and Richardson 1992; Geiselmann et al. 1992a), contient des motifs similaires à
ceux rencontrés chez certaines ribonucléoprotéines eucaryotes (RNP1 et RNP2) (Query et al.
1989). Le deuxième domaine, comprenant les 268 résidus C-terminaux, contient les motifs
Walker A (P-loop) et B caractéristiques des ATPases et qui sont impliqués dans la fixation et
l’hydrolyse de l’ATP (Bear et al. 1985; Dombroski and Platt 1988). Les motifs «R-loop» et
«Q-loop», connus pour leurs rôles dans la transduction mécano-chimique sont aussi retrouvés
dans ce domaine C-terminal (figure 08, page 14). L’importance de ces différents motifs
conservés a été confirmée par de nombreuses études de mutagenèse dirigée (Xu et al. 2002;
Dombroski and Platt 1990; Dombroski et al. 1988; Chalissery et al. 2007; Wei and
Richardson 2001b; Miwa et al. 1995; Pereira and Platt 1995b, 1995a).
Différentes approches expérimentales ont très tôt suggéré que Rho adopte une
structure oligomérique dans des conditions physiologiques (Roberts 1969; Finger and
Richardson 1982). Par ailleurs, des expériences de pontage chimique ont montré que Rho se
fixe à l’ARN sous une forme agrégée, probablement sous la forme hexamérique (Finger and
Richardson 1982). Par la suite, il a été montré que la protéine Rho est fonctionnelle sous la
forme d’un anneau homo-hexamérique de 282 kDa (Geiselmann et al. 1992a). Des
expériences
de
microscopie
électronique
ont
révélé
la
structure
quaternaire
et
l’oligomérisation de cet homo-hexamère en présence de courts oligonucléotides (rC)23. Deux
23
conformations différentes de l’hexamère Rho ont été identifiées : des formes majoritaires
fermées et des formes minoritaires ouvertes de l’hexamère (figure 15) (Gogol et al. 1991; Yu
et al. 2000).
Figure 15. Clichés de microscopie
électronique représentant l’hexamère sous
une forme ouverte. D’après : (Gogol et al.
1991; Yu et al. 2000).
Les études structurales récentes ont confirmé que l’hexamère Rho pouvait adopter des
conformations ouvertes et fermées (Skordalakes and Berger 2003; Skordalakes and Berger
2006; Thomsen and Berger 2009). Ces études supportent également l’idée que l’hexamère
contient deux sites de fixation à l’ARN qui ont des fonctions différentes mais coordonnées : le
site primaire (Primary Binding Site, PBS) dans le domaine N-terminal et le site secondaire
(Secondary Binding Site, SBS) dans le domaine C-terminal dont les caractéristiques et les
fonctions sont détaillées ci-dessous.
3.2. Le site primaire d’interaction à l’ARN (PBS)
L’affinité de Rho pour des ARN de séquences différentes (terminateurs naturels et
oligomères synthétiques) a été abondamment caractérisée (Steinmetz and Platt 1994; Gan and
Richardson 1999; Wang and von Hippel 1993b). Il ressort de ces études que Rho a une
préférence pour les ARN simples brins riches en cytosines. Rho se fixe, par exemple, très
fortement au poly[rC]. L’hexamère complet ainsi que le fragment composé du domaine Nterminal d’un monomère, sont néanmoins capables de fixer d’autres types de polynucléotides
dépourvus de cytosines (Wang and von Hippel 1993b). Le PBS reconnaît et fixe aussi bien
l’ARN que l’ADN simple brin pourvu qu’il soit riche en cytosines (Richardson 1982;
Briercheck et al. 1996). Cette fixation au niveau du PBS ne nécessite donc pas la
reconnaissance de groupement 2’-OH spécifique à l’ARN (Richardson and Richardson 1992;
Geiselmann et al. 1992c). Néanmoins, la saturation du PBS par un poly[dC]) n’est pas
suffisante pour stimuler l’activité ATPase de Rho (Galluppi and Richardson 1980; Wang and
von Hippel 1993a). Cette observation suggère que le domaine N-terminal ne constitue pas
24
l’unique site de fixation à l’ARN et que la spécificité du facteur Rho pour l’ARN n’est pas
due au PBS [pour revue : (Richardson 2002)].
Un peptide correspondant au domaine N-terminal de Rho contenant les 129 premiers
résidus a été isolé et cristallisé, seul (Allison et al. 1998; Modrak and Richardson 1994) ou en
complexe avec des oligonucléotides (Bogden et al. 1999). Le co-crystal formé avec un
oligoribonucléotide (rC)9 a révélé que deux résidus, Arg-66 et Asp-78 (figure 16.A), forment
trois liaisons hydrogène spécifiques mimant un appariement de type Watson-Crick avec la
base d’une cytosine (figures 16.B, 16C et 16D). De plus la base située en 5’ de ce résidu
cytosine se fixe au niveau d’une poche dont la taille ne permet d’accueillir qu’une pyrimidine
(Richardson and Richardson 1992; Bogden et al. 1999). Cette structure explique donc
l’affinité du facteur Rho pour les séquences Rut par une reconnaissance moléculaire
spécifique de dinucléotides de type 5’-YC (Y étant une pyrimidine).
(A)
Figure 16. Interactions spécifiques
formées par le domaine N-terminal de Rho
et un dimère 5’-CC au sein de sa cible
ARN. (A) les résidus et les atomes qui
interagissent directement avec l’ARN (en
bleu) sont représentés et identifiés en noir.
(B) environnement autour de la cytosine en
position 3’. Les liaisons hydrogène sont
représentées par des pointillés. (C) dans le
complexe, la base d’une cytosine forme
trois liaisons hydrogène spécifiques, de
type Watson-Crick, avec deux chaînes
latérales du domaine N-terminal de Rho,
Arg-66 et Asp-78. La base située en 5’ de
ce résidu C est maintenue dans une poche
dont la taille n’est pas suffisamment large
pour
accueillir
une
purine.
(D)
appariement G.C de type Watson-Crick.
D’après : (Bogden et al. 1999).
(B)
(C)
(D)
25
En 2003, est apparue la première structure cristalline montrant un hexamère Rho
complet (Skordalakes and Berger 2003). Dans cette structure l’anneau hexamérique adopte
une forme ouverte (figure 17.A). Cette structure confirme la fixation préférentielle de
dinucléotides de type 5’-YC par chaque domaine N-terminal. De plus, les six poches de
reconnaissance (1 par monomère) composent un site PBS multipartite organisé en forme de
couronne à la surface de l’hexamère (figure 17.B). Cette structure suggère que l’orientation
des domaines N-terminaux des monomères de Rho et que la forme «twistée» de l’hexamère
favorisent l’orientation de l’ARN vers le centre de Rho et son entrée dans le canal central de
l’anneau hexamérique (figure 17.B). Cependant, cette structure ne précise pas le
positionnement de l’ARN dans le canal central. De plus, la fixation des six analogues non
hydrolysables d’ATP (AMPPNP ou ATPγS) à l’hexamère Rho ne révèle pas les éléments
responsables de l’hydrolyse de l’ATP dans des positions propices à la catalyse (Skordalakes
and Berger 2003). Ces éléments suggèrent que cette forme ouverte de l’hexamère Rho n’est
pas catalytiquement compétente (Skordalakes and Berger 2003).
(A)
(B)
Figure 17. (A) reconstruction 3D de la surface de l’hexamère représentant les sites
primaires (bleu) et secondaires de fixation à l’ARN (violet). (B) l’orientation des domaines
N-terminaux (vert) permet de positionner l’ARN vers le site secondaire au centre de
l’anneau. D’après : (Skordalakes et Berger, 2003).
Une structure du facteur Rho de Thermotoga maritima, (tmRho) a également été
obtenue en absence de ligands acides nucléiques (Canals et al. 2010). Cette structure présente
des caractéristiques très proches de la forme ouverte de l’hexamère Rho décrite
précédemment pour E. coli (Skordalakes and Berger 2003). Néanmoins, quelques différences
conformationnelles observées dans la forme apo-mtRho suggèrent que les domaines Nterminaux pourraient être flexibles. Un réarrangement de ces domaines induit par la fixation
26
d’un fragment d’ARN de type Rut pourrait assurer le positionnement de la chaîne ARN dans
une conformation favorable à son entrée au centre de l’hexamère (Canals et al. 2010).
Des structures cristallographiques montrant Rho sous forme ouverte ont également été
obtenues en présence de Bicyclomycine (Bcm) ou de dérivés semi-synthétiques (Skordalakes
et al. 2005). La Bcm et ses dérivés sont des antibiotiques qui bloquent la translocation de Rho
in vitro (Magyar et al. 1996). Ces structures cristallines ont dévoilé l’origine de cette
inhibition. En effet, ces inhibiteurs interagissent avec Rho au niveau d’une poche adjacente au
site de fixation de l’ATP, empêchant ainsi la fixation de la molécule d’H2O catalytique, c’està-dire, nécessaire pour l’hydrolyse de l’ATP (Skordalakes et al. 2005).
3.3. Le site secondaire d’interaction à l’ARN (SBS)
Bien que longtemps spéculatif [pour revue : (Geiselmann et al. 1993b)], l’existence
d’un deuxième site de fixation à l’ARN au sein de Rho était supportée par plusieurs évidences
expérimentales [pour revue : (Richardson 2002)]. La première évidence est le fait que
l’activité ATPase du facteur Rho est ARN-dépendante, alors que le PBS fixe aussi bien
l’ARN que l’ADN. L’affinité du SBS a été mesurée de façon indirecte par un essai ATPase
«poly[dC]-coupled» qui consiste à saturer le PBS par une chaîne poly[dC] et à mesurer la
concentration de ribonucléotides (≤10nt) qui permet d’activer l’hydrolyse de l’ATP par Rho
(figure 18.A) (Richardson 1982; Wang and von Hippel 1993a; Schwartz et al. 2009).
(A)
(B)
Figure 18. Activité ATPase du facteur Rho en saturant le PBS avec un poly[dC] et en
présence de co-facteurs ARN courts. (A) le principe de l’expérience «poly[dC]- coupled».
(B) l’activité ATPse en fonction de la concentration des co-facteurs ARN courts de
séquences différentes (PVHbest, SeqA et CtrlSB). D’après : (Schwartz et al. 2009).
27
Le poly[dC] seul étant incapable d’activer Rho, l’activité ATPase n’est observée qu’en
présence de co-facteur ARN (Richardson 1982; Wang and von Hippel 1993a; Schwartz et al.
2009). De plus l’activité ATPase est sensible à la séquence de l’ARN, les séquences riche en
résidus rC semblent, comme pour le PBS, être préférés (figure 18.B) (Richardson 1982; Wang
and von Hippel 1993a; Schwartz et al. 2009).
Des expériences de pontage chimique du facteur Rho en présence d’un ARN contenant
ou pas une séquence aléatoire en 3’ de la séquence Rut ont permis de mettre en évidence les
interactions entre des résidus d’une boucle R (figure 08, page 14 et figure 19) et l’ARN
(Burgess and Richardson 2001a). Une autre étude a permis de révéler que la boucle Q (figure
19) se trouvait protégée de l’attaque de radicaux peroxydes (OH°) en présence d’ARN, mais
pas d’ADN (Wei and Richardson 2001a). L’implication de la boucle Q dans le SBS a été
confirmée par l’effet délétère de mutations introduites dans cette région (Wei and Richardson
2001b). Dans la structure cristallographique de l’hexamère Rho ouvert (figure 19), les boucles
P, Q et R se trouvent dans le canal central de l’hexamère (figure 19).
(A)
(B)
Figure 19. Structure ouverte du facteur Rho. (A) structure et topologie du monomère et de
l’hexamère Rho (B) position du site secondaire de fixation de l’ARN au centre de l’anneau
hexamérique. Les boucles P (bleus), Q (violet), et R (vert) sont indiquées. D’après : (Skordalakes
and Berger 2003).
28
Une seconde structure cristallographique de l’hexamère Rho a été révélée par le
groupe du Pr Berger en 2006 (figure 20). Contrairement à la structure décrite précédemment,
l’hexamère Rho présente cette fois une forme fermée, en « trimère de dimères » (figures 20A
et 20.B) (Skordalakes and Berger 2006). Dans cette structure, la fixation de dinucléotides 5’YC au sein de PBS est toujours visible sur le dessus de l’hexamère (figure 20.A). Par contre
des fragments ARN pentanucléotidiques (UCUCU) en interaction avec Rho sont également
visibles sur la face opposée de l’hexamère (figure 20.B). Ces pentanucléotidiques occupent
chacun une crevasse à l’interface entre protomères et où les chaînes latérales contactent
directement l’ARN (figure 20.E). Ce réseau d’interaction SBS-ARN putatif implique
plusieurs chaînes latérales fortement conservées appartenant à l’hélice α12 (Lys336), et aux
boucles P (Lys181) et R (Asp322) (figure 20.E). Seule une chaîne latérale (Asp322) est
identifiée en interaction avec un groupement 2’-OH (figure 20.E). Cependant, la mutation de
ce résidu (D322A/N) n’abolit pas les activités enzymatiques du facteur Rho (voir apport
personnel, article I et II, pages 84 et 98, respectivement) ce qui suggère que l’interaction
Asp322-ARN n’est pas à l’origine de la spécificité stricte du SBS pour l’ARN. En revanche,
le réseau SBS-ARN observé semble conforter les données enzymatiques indiquant que le SBS
est séquence-dépendant (figure 20.E) et accommode préférentiellement les séquences riches
en C (voir ci-dessus). Il est intéressant de noter que le réseau SBS-ARN est juxtaposé à la
poche ATPase, ce qui suggère une communication directe entre celle-ci et le SBS (figure
20.D). La trajectoire putative de l’ARN entre les deux sites PBS et SBS n’est pas résolue
structuralement (figure 20.C). Même si la densité électronique au centre de l’hexamère est
compatible avec la présence de l’ARN dans cette région à proximité des boucles Q (figure
20.C) (Skordalakes and Berger 2006).
29
ATPase site
(D)
(A)
(B)
(E)
(C)
Figure 20. Structure de l’hexamère Rho (PDB#2HT1). Les monomères sont représentés en
gris et jaune alternativement et la localisation des co-facteurs d’ATP est indiquée par des
sphères rouges. En noir est représenté l’ARN, tandis que les domaines de fixation à l’ARN,
les motifs ATPase, de même que les Q et R-loops sont représentés respectivement en orange,
vert, rouge et bleu. (A) l’hexamère vu de dessus. (B) l’hexamère vu de dessous. (C) dimère
avec la trajectoire putative de l’ARN entre le PBS et SBS représentée par une ligne
pointillée. (D) la poche ATPase. (E) le réseau d’interactions putatif SBS-ARN.
30
Figure 21. Le modèle de translocation «RNA handoff». Les monomères de l’hexamère sont
représentés par les sphères de couleur verte et orange alternativement. Dans le modèle, l’interconversion ATP-dépendante des monomères au sein de chaque dimère induit un mouvement des
boucles Q (lignes rouges) qui transloquent l’ARN et le transfèrent d’un monomère à l’autre. Les
flèches en pointillées indiquent le sens du transfert de l’ARN.
Un autre aspect important révélé par cette structure est le fait que les boucles Q
adoptent des conformations différentes alternatives sur les monomères (figures 20.A et 20.B).
Cette observation suggère que ces boucles pourraient agir comme des leviers permettant la
translocation séquentielle de Rho le long de la chaîne d’ARN. En s’appuyant sur l’ensemble
de ces observations les auteurs ont proposé un modèle de translocation de l’ARN indiquant ce
phénomène de transfert (modèle «RNA handoff», figure 21).
Une structure cristalline récente offre une alternative crédible à ce modèle «RNA
handoff». Dans cette nouvelle structure, l’hexamère Rho est en interaction avec un
oligonucléotide (rU)12 et six molécules d’analogue non-hydrolysable de l’ATP (ADP• BeF3)
(figures 22.A et 22.B) (Thomsen and Berger 2009). L’hexamère Rho forme un anneau fermé
mais complètement asymétrique. Au centre de l’anneau, six nucléotides (rU)6 sont en
interaction avec les chaînes latérales des six sous-unités. Ce réseau d’interaction est organisé
en forme d’escalier hélicoïdal d’une manière similaire à ce qui avait été observé pour l’ADN
hélicase hexamérique E1 de la SF-3 (Enemark and Joshua-Tor 2006). De plus, la
configuration asymétrique de l’hexamère Rho induit quatre conformations distinctes des
poches ATPase correspondant aux interfaces E, T, T * et D (figure 22) qui pourraient mimer
quatre étapes intermédiaires du cycle de l’hydrolyse de l’ATP. Contrairement aux structures
précédentes, aucune interaction de l’ARN avec les sites PBS n’a été observée dans cette
structure mais ceci pourrait être dû à la séquence de l’oligonucléotide ((rU)12) utilisé dans
cette étude. En effet, il a été montré que l’affinité de site PBS pour le poly[rU] est dix fois
plus faible que le poly[rC] (Wang and von Hippel 1993b).
31
(A)
(B)
Figure 22. La structure asymétrique du facteur Rho (PDB#3ICE). (A) l’hexamère Rho vu de
dessous. Les six monomères sont de couleurs différentes. L’ARN est en orange au centre de
l’hexamère, ADP●BeF3 en magenta et Mg2+ jaune-vert. (B) l’hexamère vu de côté (rotation 90°) par
rapport à (A). L’hexamère est représenté avec une surface transparente et les monomères A et B ont
été retirés pour visualiser la position de l’ARN au centre de l’hexamère. D’après : (Thomsen and
Berger 2009).
Il est intéressant de noter que le réseau d’interactions SBS-ARN putatif observé dans
la structure en anneau asymétrique est totalement différent de celui présent dans la structure
en «trimère de dimères». En effet, trois chaînes latérales très conservées de la boucle Q
(Val284, Thr286 et Gly287) sont identifiées en interaction avec l’ARN. Dans cette structure
Rho contacte plusieurs groupements 2’-OH consécutifs de l’ARN via cinq résidus Val284
appartenant à différentes sous-unités à l’intérieur de l’anneau hexamérique (figure 23.A). Ces
interactions Val284-ARN pourraient être à l’origine de la spécificité stricte de Rho pour
l’ARN. Le résidu Lys326 très conservé de la boucle R est également impliqué dans le réseau
SBS-ARN (figure 23.A). Trois contacts entre un résidu Lys326 et une liaison phosphodiester
sont observés dans la structure. En s’appuyant sur ces caractéristiques et par analogie avec le
mécanisme proposé pour l’ADN hélicase E1 (figure 23.B) (Enemark and Joshua-Tor 2006),
un modèle de translocation de type «escort» a été proposé (figure 23.A).
32
(A)
(B)
Figure 23. Le modèle de translocation «RNA escort». (A) schématisation des contacts ARN-Rho en
fonction des états chimiques des poches ATPase. Les monomères sont représentés par les grands
rectangles arrondis de couleurs différentes. Seules les boucles Q et R sont représentées sur chaque
monomère, le monomère F est indiqué deux fois pour mettre en évidence son positionnement par
rapport aux sous-unités A et E. Les poches ATPase à l’interface entre deux monomères sont
représentées par les petits rectangles arrondis les expansions crantées représentent les doigts
arginines. E, T, T* et D correspondent à différents états du cycle ATPase : échange de nucléotides,
fixation de l’ATP, hydrolyse de l’ATP et produits d’hydrolyse, respectivement. R : ribose, P :
phosphate qui sont numérotés en fonction de leur position sur la chaîne ARN. Les résidus du SBS et
leurs groupes chimiques contactant l’ARN sont indiqués, les liaisons chimiques sont indiquées par
les lignes pointillées. L’étoile jaune indique la position dans laquelle le mécanisme d’interactions
SBS-ARN sont observées (l’interface des monomères B/C). D’après : (Thomsen and Berger 2009).
(B) schématisation des contacts ADN-E1 en fonction des états chimiques des poches ATPase.
Chaque sous-unité de l’hexamère E1 est schématisée par un «wagon» de couleur différente.
Chaque wagon transporte un nucléotide d’ADN (sphère jaune) de la droite vers la gauche.
L’hydrolyse de l’ATP et la libération de l’ADP se produisent le long du chemin comme indiqué
entre les sous-unités. Le «wagon» rouge le plus à gauche éjecte son nucléotide d’ADN transporté et
regagne le «wagon» mauve du côté droit lors de la liaison d’une nouvelle molécule d’ATP afin de
prendre en charge un nouveau nucléotide. D’après : (Enemark and Joshua-Tor 2006).
Le modèle «RNA escort» soutient que chaque sous-unité va prendre en charge un
nucléotide et l’escorter au sein du canal central de l’hexamère. Pour ce faire, la configuration
de chaque sous-unité va évoluer progressivement en fonction de l’état «chimique» des poches
ATPase qui y sont accolées. Ce mécanisme prédit que les événements d’hydrolyse d’ATP se
font d’une manière séquentielle et concertée au sein de l’anneau hexamérique et que chaque
sous-unité adopte une configuration différente de celle des autres à un instant donné. Ainsi
33
chaque nucléotide de la chaîne ARN est pris en charge et «escorté» successivement de la
même façon (figure 23.A) (Thomsen and Berger 2009).
Bien que séduisant ce modèle «RNA escort» ne semble pas compatible avec
l’ensemble des informations expérimentales disponibles (voir apport personnel). Des modèles
alternatifs compatibles avec cette structure sont décrits dans le chapitre IV (figure 61, page
143), mais nécessitent une validation expérimentale.
4. Formation d’un complexe productif Rho-Substrat
Les informations biochimiques et structurales évoquées ci-dessus indiquent que la
configuration du complexe Rho-ARN catalytiquement compétente est compliquée et nécessite
le passage de l’ARN au centre de l’hexamère. Cette formation d’un état enzyme substrat
productif est une étape clé, cinétiquement lente dans le cas de Rho (Walmacq et al. 2006;
Schwartz et al. 2007a) et qui pourrait intervenir suivant différents mécanismes (figure 24).
Les mécanismes de formation de complexes enzyme-substrat chez les hélicases
oligomériques (généralement hexamériques, tableau 02, page 7) ont été étudiés
principalement chez les ADN hélicases réplicatives [pour revue : (Patel and Picha 2000;
Delagoutte and von Hippel 2002, 2003)]. Ces ADN hélicases réplicatives ont pour rôle la
séparation des brins du duplex d’ADN au niveau de l’origine d’initiation de la réplication.
Dans la plupart des cas, la fixation et la reconnaissance de ce site d’initiation par les hélicases
réplicatives nécessite l’intervention de protéines auxiliaires spécifiques, les facteurs de
chargement [pour revue : (Davey and O'Donnell 2003)]. Ces protéines interviennent suivant
deux mécanismes, le «ring breaker» ou le « ring maker » [pour revue : (Davey and O'Donnell
2003)]. Les facteurs de chargement des hélicases appartenant à la classe des «ring breaker»
agissent sur un anneau hexamérique stable et préassemblé et induisent une ouverture partielle
de l’anneau, permettant ainsi le passage de l’ADN simple brin au centre de l’hexamère (figure
24.A). Ce mécanisme est utilisé, par exemple, par l’ADN hélicase DnaB d’E. coli appartenant
à la SF-4 [pour revue : (Konieczny 2003)]. Dans le mécanisme «ring maker», l’intervention
des protéines de chargement induit l’assemblage d’un anneau hexamérique autour de l’ADN à
partir de formes sub-oligomériques (monomères, dimères, etc...) (figure 24.B). Ce mécanisme
est rencontré, par exemple, chez les ADN hélicases : gp41 du bactériophage T4 (Bleuit et al.
2001) et l’antigène T du virus SV40 (Dean et al. 1992).
34
(A)
(B)
(C)
(D)
Inactive
Helicase loading
Active
Figure 24. Représentation schématique des mécanismes «ring breaker» (A), «ring maker» (B),
«threading model» (C), et «ring opening» (D). D’après : (Patel and Picha 2000; Davey and
O'Donnell 2003)
Cependant, à ce jour aucun facteur de chargement n’a été identifié pour le facteur Rho.
De plus, dans les conditions physiologiques Rho est majoritairement sous la forme
hexamérique et même si l’interaction avec l’ARN stabilise l’hexamère, elle n’est pas
responsable de sa formation (Geiselmann et al. 1992b). Un autre mécanisme, dit «threading
model» (figure 24.C), a été proposé dans la littérature qui suppose que l’entrée du substrat se
fasse via l’une de ses extrémités s’introduisant dans l’anneau hexamèrique déjà formé [pour
revue : (Patel and Picha 2000)]. Toutefois, il a été montré que Rho pouvait dissocier in vitro
un hydride ARN-ADN sans disposer d’une extrémité libre de l’ARN (transcrit circularisé)
(Burgess and Richardson 2001b). De plus, in vivo Rho doit être capable de former des
complexes Rho-ARN productifs, alors que l’ARN est fixé en extrémité 5’ par des ribosomes
en cours de traduction, et que l’extrémité 3’ est bloquée par l’ARNP en cours d’élongation de
la transcription (figure 25) [pour revue : (Richardson 2003)]. Les mécanismes décrits
précédemment ne semblent pas être impliqués dans la formation des complexes productifs
Rho-substrat. Cependant, un mécanisme suggérant une ouverture de l’anneau suffisante pour
permettre le passage d’un simple brin dans le centre de l’hexamère a été proposé «ring
opening» (Patel and Picha 2000).
35
Figure 25. Représentation schématique du
chargement de Rho sur un segment du
transcrit naissant à la fin d’un opéron. Un
ribosome arrêté au niveau d'un codon «stop»
bloque l’extrémité 5’ de l’ARN. La protéine
Rho peut alors se fixer sur l’ARN nu,
désormais dépourvu de protéines et induire la
terminaison de la transcription. Le transcrit,
émergeant du canal de sortie de l’ARN
polymérase, interagit avec six domaines Nterminaux de Rho formant le site primaire.
D’après : (Richardson 2003).
Dans le cas de Rho, l’utilisation du mécanisme «ring opening» (figure 24.D) est
soutenue par les données structurales (Gogol et al. 1991; Yu et al. 2000; Skordalakes and
Berger 2003) et enzymatiques (Kim and Patel 2001) décrites précédemment. Ces données
suggèrent une ouverture suffisante et transitoire de l’anneau hexamérique permettant ainsi le
passage de l’ARN dans le centre de l’hexamère et l’interaction de l’ARN avec le SBS (figure
26). Ce processus lent et complexe est une cible potentielle pour la régulation de Rho (voir
apport personnel, article III, page 118) et, par analogie avec les mécanismes de chargement
des hélicases réplicatives, pourrait mobiliser le domaine N-terminal de Rho comme «protéine
helper» positionné en cis et facilitant l’ouverture de l’anneau hexamérique et l’entrée du
substrat ARN (Canals et al. 2010).
Figure 26. Modèle de formation de complexes Rho-ARN productifs. Chaque PBS
reconnait (ovale blanc) et fixe un dimère 5’-YC de la séquence Rut (en bleue) du transcrit
simple brin libre (sans complexes riboprotéiques). Ouverture transitoire de l’anneau
hexamérique et pénétration du transcrit au centre de l’hexamère, l’ARN ainsi sera fixé
par le SBS.
36
Généralités. Terminaison de la transcription Rho-dépendante chez E. coli
Chapitre II. Terminaison de la transcription Rho-dépendante
chez E. coli
1. Le cycle transcriptionnel chez E. coli
La transcription constitue la première étape de l’expression de l’information génétique
contenue dans l’ADN. Ce phénomène est possible grâce aux ARN polymérases (ARNP) qui
synthétisent l’ARN à partir d’une matrice d’ADN. Les ARNP sont des complexes multiprotéiques très conservés au cours de l’évolution (Zhang et al. 1999; Ebright 2000; Cramer et
al. 2001; Darst 2001). Chez la bactérie, tous les ARN cellulaires sont synthétisés par une seule
forme d’ARNP. L’ARNP bactérienne est composée, dans sa forme minimale «core» de cinq
sous-unités (α2, β, β', ω) pour une masse totale de 450 kDa (Burgess and Travers 1970).
Cette forme de l’ARNP est capable de catalyser la synthèse des ARN, mais incapable de
reconnaître les séquences promotrices sur l’ADN. D’autres sous-unités (σ) ou co-facteurs
s’associent à la forme minimale pour former une «holoenzyme» qui reconnaît les séquences
promotrices et permet ainsi la transcription des gènes [pour revue : (Borukhov and Nudler
2008)]. Le cycle transcriptionnel comporte quatre étapes principales : la reconnaissance des
régions promotrices, l’initiation, l’élongation et la terminaison (figure 27) [pour revue :
(Greive and von Hippel 2005; Grainger and Busby 2008; Roberts et al. 2008)].
Figure 27. Représentation
schématique des différentes
étapes
du
cycle
transcriptionnel chez E.coli.
Adaptée d’une figure de R.
Landick
(University
of
Wisconsin)
37
Chacune de ces étapes est une cible potentielle pour les différents acteurs de la
régulation transcriptionnelle. Je décrirai brièvement ces différentes étapes ci-dessous, avant de
présenter plus en détails ce qui constitue l’objet d’étude de ce mémoire, la terminaison Rhodépendante.
1.1. L’initiation
L’initiation est la première phase du cycle transcriptionnel au cours de laquelle
l’ARNP reconnaît et fixe les régions promotrices sur le génome [pour revue : (deHaseth et al.
1998)]. Cette reconnaissance des régions promotrices nécessite l’intervention de facteurs
protéiques, facteurs primaires ou facteurs alternatifs, chacun dirigeant l’ARNP vers une classe
spécifique de promoteurs (Gross et al. 1992). Les facteurs primaires permettent à l’ARNP de
reconnaître les promoteurs régulant l’expression des gènes impliqués dans les fonctions
basales de la bactérie. Les facteurs alternatifs interviennent, quant à eux, lors d’un stress
particulier de la bactérie. Ces facteurs sont notamment responsables de l’expression des gènes
codant les protéines de choc thermique mais également de gènes codant des protéines
flagellaires ou encore d’assimilation de l’azote (Gross et al. 1992). L’holoenzyme reconnaît et
se fixe aux motifs qui composent le promoteur formant ainsi le complexe fermé (figure 27)
(deHaseth et al. 1998). Puis, l’holoenzyme subit un changement conformationnel qui
provoque un déroulement d’un segment d’ADN d’environ 17 paires de bases (pb) et forme
ainsi la bulle de transcription. Ce nouveau complexe holoenzyme est dénommé le complexe
ouvert (figure 27). L’ARNP peut accéder ainsi au simple brin d’ADN qui lui servira de
matrice (deHaseth and Helmann 1995; Saecker et al. 2002). La synthèse d’ARN débute alors
avec l’addition des premiers nucléotides. Au début, l’ARNP adopte une forme peu stable et la
transcription peut être stoppée après la polymérisation de seulement quelques nucléotides
(figure 27). On parle de phénomène d’initiation abortive (Vo et al. 2003). Lorsque la taille de
la chaîne d’ARN atteint 8-10 nucléotides, un réarrangement conformationnel du complexe
ternaire (ARNP-ADN-ARN) vers une forme hautement stable assure l’entrée en phase
d’élongation (figure 27) (Krummel and Chamberlin 1992; Vogel and Jensen 1994; Mooney et
al. 1998).
1.2. L’élongation
L’élongation de la transcription est une succession d’étapes identiques permettant
l’extension de la chaîne de l’ARN naissant d’un nucléotide et le déplacement du CTE d’une
paire de base sur la matrice ADN (figure 28). Chaque addition de nucléotide implique trois
38
étapes élémentaires (Vassylyev et al. 2007; Roberts et al. 2008) : 1) la fixation d’un
nucléoside triphosphate complémentaire (NTP) dans le site actif de l’ARNP ; 2) la réaction
chimique proprement dite, catalysée par deux ions métalliques Mg2+ qui permettent la
formation de la liaison phosphodiester à l’extrémité 3’ de la chaîne d’ARN et le relargage du
pyrophosphate; 3) la translocation du CTE (figure 28). Cette translocation se traduit par
l’ouverture d’une paire de base en aval de la bulle de transcription et d’une paire de base à
l’extrémité amont de l’hybride ARN-ADN et par la réassociation d’une paire de base en
amont de la bulle de transcription (Greive and von Hippel 2005). Le CTE est stabilisé par un
réseau complexe d’interactions protéine-ADN-ARN et est capable d’allonger la chaîne ARN
avec une vitesse de 30 à 100 nucléotides/sec (Vogel and Jensen 1994; Mooney et al. 1998).
Ce phénomène permet la synthèse de transcrits extrêmement longs (jusqu’à 20 000
nucléotides) correspondant à la transcription d’opérons entiers (Levin et al. 1987).
Figure
28.
Représentation
schématique du mécanisme
d’addition des nucléotides. La
synthèse de l’ARN se fait à partir
de l’extrémité 3’-OH de l’ARN
par
l’addition
d’un
ribonucléotide monophosphate
selon le schéma réactionnel
décrit ici. Deux ions Mg2+
associés au site actif catalysent
l’attaque
nucléophile
du
groupement 3’-OH de l’ARN sur
le phosphate α du NTP entrant.
Adaptée d’une figure de
R. Landick (University of
Wisconsin)
De nombreux signaux sont néanmoins capables de réguler la processivité du CTE via
plusieurs phénomènes nécessitant l’intervention de facteurs intrinsèques et/ou protéiques
[pour revue : (Mooney et al. 1998; Roberts et al. 2008)].
Chaque cycle d’addition d’un nucléotide à la chaîne ARN est potentiellement en
compétition avec des voies réactionnelles alternatives dues à l’intervention de trois types de
signaux (figure 29) (Greive and von Hippel 2005) : 1) les signaux de pause qui provoquent la
pause plus ou moins longue du CTE avant que l’ARNP ne reprenne la transcription; 2) les
signaux d’arrêt qui provoquent l’arrêt de l’ARNP et pour lesquels la reprise de la transcription
nécessite l’intervention de facteurs protéiques (GreA, GreB, par exemple); 3) les signaux de
terminaison qui provoquent la dissociation irréversible du CTE.
39
Figure 29. Représentation schématique des
différentes
voies
réactionnelles
en
compétition avec l’élongation de la
transcription.
1.2.1. Les signaux de pause
Lorsqu’il rencontre un signal de pause, le CTE passe de sa forme hautement
processive vers une forme alternative dont la capacité d’élongation du transcrit est fortement
réduite (figure 30). Cette perte de processivité est due à une série de réarrangements dans le
site actif de l’ARNP provoqué par les signaux de pause (Toulokhonov and Landick 2003).
Deux types de sites de pause ont été identifiés (figure 30) : les sites de classe I, codant pour
des motifs ARN structurés ou les sites de classe II, induisant la formation d’un hybride
ARN/ADN instable (Artsimovitch and Landick 2000).
Figure 30. Représentation schématique des mécanismes de régulation de l’élongation de la
transcription impliquant un intermédiaire conformationnel commun, qui suite à des réarrangements,
évolue vers une conformation de pause, d’arrêt ou de terminaison. D’aprè : (Artsimovitch and
Landick 2000).
La pause du CTE joue un rôle important dans la régulation de la transcription,
notamment en facilitant la synchronisation de la transcription et de la traduction chez la
bactérie (Landick et al. 1985; Gong and Yanofsky 2002). Il est intéressant de noter, que la
pause de la transcription peut être modulée par certains facteurs protéiques (par exemple,
NusA et NusG sur la figure 30) et qu’elle compte sans doute des états intermédiaires très
40
proches de ceux formés lors de l’arrêt et de la terminaison de la transcription (Artsimovitch
and Landick 2000).
1.2.2. Les signaux d’arrêt
Le phénomène d’arrêt de la transcription se produit généralement chez la bactérie lors
d’une carence en nucléosides triphosphates (NTPs), lors d’une erreur d’incorporation, ou
encore lorsque l’ARN polymérase est bloquée par un obstacle protéique. Dans ces différentes
situations, l’ARNP effectue un glissement vers l’arrière conduisant à l’extraction irréversible
du site catalytique de l’extrémité 3’ du transcrit (Landick 1997; von Hippel 1998; Nudler
1999). Cependant, l’ARNP pourrait reprendre la transcription en provoquant l’hydrolyse du
fragment d’ARN extrudé (Orlova et al. 1995). L’intervention des facteurs d’élongation GreA
et GreB favorisent largement cette hydrolyse in vitro (Borukhov et al. 1993) et in vivo
(Toulmé et al. 2000).
1.2.3. Les signaux de terminaison
La terminaison de la transcription conduit à la dissociation irréversible du CTE. Elle
peut intervenir chez E. coli selon deux mécanismes bien distincts nécessitant ou non
l’intervention de facteurs protéiques (terminaison intrinsèque ou terminaison facteurdépendante). Ces mécanismes sont décrits dans les paragraphes suivants.
La terminaison de la transcription chez les bactéries, mais aussi chez les phages, est
régulée par un grand nombre de signaux. En fonction de leur effet, ces signaux sont classés en
deux catégories antagonistes : les signaux provoquant l’atténuation de la transcription [pour
revue : (Yanofsky 2000; Naville and Gautheret 2010)] et, inversement, les signaux induisant
des phénomènes d’anti-terminaison de la transcription [pour revue : (Weisberg and Gottesman
1999; Condon et al. 1995)]. En modifiant ainsi l’efficacité de la terminaison les bactéries
régulent leur expression génique.
L’atténuation est un phénomène d’arrêt prématuré de la transcription qui permet de
contrôler l’expression d’un ou plusieurs gènes. Les mécanismes d’atténuation sont très divers
mais impliquent souvent un remodelage conformationnel dans la région 5’-leader du transcrit
qui expose (ou active) un terminateur transcriptionnel. La régulation au niveau
transcriptionnel des opérons bactériens impliqués dans la biosynthèse et l’utilisation des
acides aminés est en général assurée par les mécanismes d’atténuation.
L’anti-terminaison a été découverte au cours de l’infection d’E. coli par le phage λ
(Roberts 1969). Ce phénomène contrôle la capacité de l’ARNP à transcrire les gènes situés
41
au-delà des terminateurs (intrinsèque ou Rho-dépendant). Ce mécanisme de contrôle est
observé à la fois dans le système de régulation des phages et des opérons bactériens.
Quelques exemples représentatifs de ces phénomènes d’atténuation et d’antiterminaison sont abordés brièvement dans le paragraphe 5, page 54.
2. La terminaison intrinsèque
Ce mécanisme de terminaison ne nécessite l’intervention d’aucun co-facteur protéique.
In vitro, ce mode de terminaison nécessite seulement des NTPs, de l’ARNP et une matrice
ADN contenant la séquence codant pour un terminateur intrinsèque, en aval d’un promoteur
[pour revue : (Nudler and Gottesman 2002)]. En effet, la terminaison intrinsèque intervient
lorsque l’ARNP rencontre sur l’ADN un signal spécifique composé d’une séquence répétée
inversée riche en GC suivie d’une répétition de T. Ce signal engendre sur l’ARN la formation
d’une structure en tige boucle extrêmement stable suivie d’une répétition de U (figures 31.A,
31.B et 31.C) formant un hydride ADN-ARN instable dans la bulle de transcription (Martin
and Tinoco 1980; Richardson and Greenblatt 1996). Ces deux caractéristiques sont avancées
dans les modèles de la terminaison intrinsèque pour expliquer la déstabilisation et la
dissociation du complexe d’élongation. Ce mécanisme de terminaison a été très étudié et deux
modèles principaux ont été proposés dans la littérature pour en expliquer le fonctionnement :
le modèle allostérique (Gusarov and Nudler 1999; Toulokhonov et al. 2001; Epshtein et al.
2007) et le modèle d’extraction (Santangelo and Roberts 2004). Le modèle allostérique
(«hairping inclusion model») suggère que le CTE est déstabilisé par un changement
conformationnel induit par la structure tige-boucle du terminateur (Figure 31.D).
(A)
(B)
(D)
(C)
Figure 31. Terminaison intrinsèque. Séquences de deux terminateurs intrinsèques
naturels λtR2 (A) et rrnBT2 (B) (les flèches indiquent les sites de terminaison). (C)
représentation schématique du mécanisme de terminaison intrinsèque. (D) modèles
allostérique et d’extraction de la terminaison intrinsèque. D’après : (Epshtein et al.
2007).
42
Au contraire, dans le modèle d’extraction («forward translocation model»), la structure
tige-boucle du terminateur force l’avancement de l’ARNP, sans qu’il ait d’allongement
concomitant du transcrit. La réduction spontanée de la taille de l’hybride ARN-ADN
déstabiliserait le CTE et induirait sa dissociation (Figure 31.D).
3. La terminaison facteur-dépendante
Chez E. coli, deux facteurs protéiques sont connus pour leur implication dans la
terminaison de la transcription : le facteur TRCF et la protéine Rho. La dissociation du CTE
par ces deux facteurs protéiques implique des mécanismes distincts.
Le TRCF (Transcription Repair Coupling Factor) (Selby and Sancar 1993) est codé
par le gène mfd (Borukhov et al. 2005; Roberts and Park 2004). TRCF est apparenté à la
superfamille II des hélicases, et plus particulièrement à la protéine RecG, impliquée dans les
processus de recombinaison et de réparation de l’ADN chez E. coli (Mahdi et al. 2003). En
effet, le facteur TRCF est une ADN translocase ATP-dépendante qui provoque la dissociation
du CTE arrêté au contact des lésions sur l’ADN afin de faciliter l’accès des enzymes de
réparation de l’ADN (Smith et al. 2007; Murphy et al. 2009). Le facteur TRCF agit donc
comme un facteur de terminaison spécifique des complexes de transcription arrêtés (Selby
and Sancar 1995a, 1995b). Le mécanisme de terminaison TRCF-dépendant implique à la fois
l’activité hélicase du facteur TRCF et l’interaction de ce dernier directement avec l’ADN et
l’ARNP (Selby and Sancar 1993; Park et al. 2002).
Le deuxième acteur de la terminaison facteur-dépendante est la protéine homohexamérique Rho (Roberts 1969) dont les caractéristiques moléculaires sont décrites dans le
chapitre I. Chez E. coli, la terminaison de la transcription est l’un des principaux moyens de la
régulation de l’expression génique (Richardson 1991, 2002). Des homologues du gène rho ont
été identifiés dans des lignées de bactéries divergentes mais ne seraient pas essentiels chez
toutes les espèces (Opperman and Richardson 1994; Washburn et al. 2001). Chez E. coli, Rho
est essentiel et serait impliqué dans 20 à 50 % des évènements de terminaison de la
transcription (Ciampi 2006; Mooney et al. 2009a).
4. La terminaison Rho-dépendante
4.1. Les terminateurs Rho-dépendants
Pour son action, Rho nécessite des séquences sur le génome codant pour des sites
spécifiques, dits terminateurs Rho-dépendants. Ces terminateurs ne présentent pas de
séquences consensus clairement définies (Schneider et al. 1993). Toutefois, il a été proposé
43
que ces terminateurs seraient composés de deux éléments distincts répartis dans une séquence
ADN de 150 à 200 pb environ (Lau et al. 1983; Faus and Richardson 1990; Zalatan et al.
1993). La séquence rut qui code pour le site d’entrée de Rho sur l’ARN et le site de relargage
du transcrit appelé tsp (transcription stop point) en aval de cette séquence d’entrée. Le rôle
exact de ces séquences tsp n’est pas clairement identifié. Par exemple, il a été montré que Rho
peut induire la terminaison Rho-dépendante en utilisant une séquence distincte de la séquence
tsp naturellement présente en aval du site rut du terminateur tR1 du phage λ (voir plus loin).
Cette étude suggère que les sites tsp n’ont qu’une importance relative dans le phénomène de
terminaison Rho-dépendante (Richardson and Richardson 1996) bien qu’ils coïncident
souvent avec les sites de pause de l’ARNP (Morgan et al. 1983; Guerin et al. 1998; Landick
2006).
Jusqu’à récemment, seuls quelques terminateurs Rho-dépendants avaient été identifiés
clairement dans les génomes de différentes espèces (tableau 03) [pour revue (Ciampi 2006)].
Bien que les séquences d’entrées Rut de ces différents terminateurs soient pauvres en
structures secondaires et présentent un haut ratio C/G (Alifano et al. 1991), ces terminateurs
ne présentent pas des similarités de séquences évidentes (Ciampi 2006).
Récemment, les analyses globales des transcriptomes de quatre souches divergentes
d’E. coli cultivées en présence ou absence de Bicyclomycine ont révélé des changements dans
l’expression de nombreux gènes en réponse à cet antibiotique ciblant spécifiquement Rho
(Cardinale et al. 2008). Cette observation suggère que le facteur Rho est un régulateur global
de l’expression génique.
Tableau 03. Classification et localisation des principaux terminateurs Rho-dépendants
identifiés dans les génomes de différentes espèces. D’après: (Ciampi 2006).
44
Le travail effectué par Cardinale et ses collaborateurs a révélé l’effet d’atténuation
Rho-dépendante d’un certain ensemble de gènes, notamment dans des régions intergéniques
(non codantes). Cette étude a montré également l’implication du facteur Rho dans l’inhibition
de l’expression de gènes toxiques acquis par transfert horizontal (Cardinale et al. 2008).
Cependant, ce travail n’a pas permis d’identifier les positions exactes des sites de terminaison
Rho-dépendante. Plus récemment, Peters et ses collaborateurs se sont intéressés à la
distribution de l’ARNP et de co-facteurs transcriptionnels dans l’ensemble du génome d’E.
coli en utilisant la technique de ChIP-chip (Peters et al. 2009). Cette étude a révélé une
distribution de l’ARNP sur l’ensemble du génome qui varie en réponse à l’inhibition du
facteur Rho par la Bcm, comme par exemple, au niveau du gène rho (figure 32.A);
l’expression de Rho est autorégulée par la terminaison Rho-dépendante en amont du gène rho
(Brown et al. 1982; Matsumoto et al. 1986). En présence de la Bcm, la distribution de
l’ARNP est plus importante en aval du terminateur Rho-dépendant contenu dans la région
leader rhoL de l’opéron rho. Ce résultat est la conséquence de la protection de l’ARNP de
l’effet de Rho par la Bcm (figure 32.A). Un résultat comparable a été observé pour 199
régions du génome d’E. coli (figure 32.B), suggérant l’existence d’au moins 199 terminateurs
Rho-dépendants dans ce génome (Peters et al. 2009).
(A)
(B)
Figure 32. Distribution des terminateurs Rho-dépendants sur le génome d’E. coli. (A)
exemple d’expérience de Chip montrant la distribution de l’ARNP sur le locus Rho en réponse
à la Bcm. (B) classifications des terminateurs Rho-dépendants sur le génome d’E. coli.
D’après : (Peters et al. 2009).
La moitié des terminateurs Rho-dépendants (102/199) identifiés par cette étude sont
intergéniques, c’est-à-dire localisés aux extrémités 3’ des gènes (figure 32.B). Ces
terminateurs réguleraient la transcription d’ARNm (codants pour des protéines ; n=83),
d’ARNt (n=12), et de petits ARN non-codants (small RNAs, sRNAs; n=7) (figure 32.B). Ces
45
terminateurs Rho-dépendants pourraient également permettre à Rho de moduler le niveau
relatif d’expression des différents gènes d’un même opéron. Les autres terminateurs Rhodépendants (97/199) sont intragéniques, c’est-à-dire situés dans les régions codantes (figure
32.B). Certain de ces terminateurs intragéniques (25/97) contrôleraient la transcription d’ARN
anti-sens (Peters et al. 2009).
L’existence de terminateurs intragéniques latents dans les conditions normales
d’expression est connue depuis longtemps et permet une réponse rapide lors d’un changement
génétique ou environnemental (Ruteshouser and Richardson 1989). Lorsque le ribosome est
bloqué ou ralenti (par une mutation non sens ou une carence en acide aminé, par exemple),
l’ARN est alors dépourvu de protéines et peut être reconnu par Rho, qui induit alors la
terminaison. Ainsi dans un opéron, une mutation non-sens dans un gène provoque la
diminution de l’expression des gènes situés plus en aval. Ce mécanisme est dénommé : la
polarité transcriptionnelle (Stanssens et al. 1986; Richardson 1991). Ces études récentes des
terminateurs Rho-dépendants (Cardinale et al. 2008; Peters et al. 2009) suggèrent que, en plus
du rôle du facteur Rho dans la terminaison de la transcription classique (à la fin des gènes et
opérons) et l’induction de la polarité transcriptionnelle, Rho est impliqué dans la terminaison
de la transcription de certains ARNt, ARN anti-sens et sRNAs. Il est intéressant de noter que
les fonctions biologiques de ces sRNAs non-codants modulés par Rho sont inconnues.
A ce jour, seuls quelques exemples de terminateurs Rho-dépendants ont été étudiés en
détail in vivo comme in vitro. Les mieux étudiés : le terminateur trpt’ d’E. coli (Zalatan et al.
1993) et le terminateur tR1 du phage λ (λtR1) (Chen and Richardson 1987; Graham and
Richardson 1998; Richardson and Richardson 1996). Je me contenterai de présenter le
terminateur λtR1 que nous avons utilisé comme prototype dans la plupart de nos études
présentées dans le chapitre apport personnel.
Le phage λ appartient à la famille des phages dits tempérés qui ont pour particularité
deux cycles de vie lors de leur infection cellulaire. Au cours du premier cycle, dit cycle
lytique, le phage détourne et utilise la machinerie cellulaire pour proliférer puis provoque la
lyse de la cellule hôte. Dans le second cycle, dit lysogénique, le phage s’intègre dans le
génome de la cellule hôte et est répliqué comme une partie intégrante du chromosome,
jusqu’à l’apparition d’un signal qui va activer le cycle lytique. Au cours de l’infection d’E.
coli par le phage λ, seul le gène cI codant pour un répresseur de la transcription de l’ADN
phagique est exprimé afin d’assurer le maintien du phage en phase lysogénique. Le cycle
lytique du phage λ commence lorsque cette inhibition de la transcription est levée. L’ARNP
d’E. coli transcrit alors les gènes cro et N à partir des promoteurs pR et pL, respectivement.
46
La terminaison de la transcription de ces deux gènes est Rho-dépendante et intervient au
niveau des terminateurs tR1 et tL1, respectivement (figure 33.A) (Richardson and Greenblatt
1996). La protéine Cro a pour rôle de rentrer en compétition avec le répresseur CI afin de
permettre la transcription des promoteurs pR et pL. La protéine Cro favorise ainsi sa propre
expression et celle de la protéine phagique N (λN) (figure 33.A).
(A)
Figure 33. (A) carte génétique
partielle du bactériophage λ,
indiquant
les
effets
transcriptionnels des protéines
N et Q. (B) séquence ARN du
terminateur λtR1 les cytosines
sont surlignées. D’après :
(Richardson and Greenblatt
1996).
(B)
La séquence Rut du terminateur λtR1 est composée de séquences rutA et rutB qui sont
séparées par une structure en tige boucle, boxB (figure 33.B). Ce terminateur supporte deux
phénomènes antagonistes : la terminaison Rho-dépendante et l’anti-terminaison induite par la
protéine N du phage λ (Vieu and Rahmouni 2004). En effet au niveau de λtR1, les sites rut et
les sites nut (N-utilization) sont superposés. Les séquences rutA et rutB séparées par la
séquence boxB, sont nécessaires pour induire la terminaison Rho-dépendante. Toutefois, la
délétion de la séquence boxB n’affecte pas la terminaison Rho-dépendante (Hart and Roberts
1994; Graham and Richardson 1998). Cependant, cette séquence boxB forme un motif dans
l’ARN qui est reconnu par la protéine λN et donc indispensable au mécanisme d’antiterminaison N-dépendant (vior paragraphe 5.2.1, page 55).
4.2. Les modèles de terminaison Rho-dépendante chez E. coli
Bien qu’actuellement nous disposions de nombreuses données expérimentales sur le
fonctionnement du facteur Rho [pour revue : (Boudvillain et al. 2010a; Rabhi et al. 2010a)], le
mécanisme exact de terminaison Rho-dépendante reste encore mal compris. Plusieurs
modèles plus ou moins contradictoires ont été proposés pour ce phénomène de terminaison
(figure 34). Dans tous ces modèles la terminaison Rho-dépendante est décomposée en trois
étapes élémentaires : 1) la reconnaissance et le chargement du facteur Rho au niveau d’une
séquence d’entrée (Rut). Bien que ce phénomène complexe (figure 26, page 36) soit
potentiellement cinétiquement limitant (Walmacq et al. 2004, 2006), il n’est généralement pas
pris en compte de façon détaillée dans les modèles de la terminaison Rho-dépendante; 2) la
translocation ATP-dépendante de Rho : dans le modèle de compétition cinétique (figure
47
34.A), cette étape clé gouverne l’efficacité de la terminaison Rho-dépendante qui va émaner
directement de la capacité du moteur moléculaire Rho à rattraper une autre machine en
mouvement, le CTE (Jin et al. 1992). L’existence du couplage cinétique entre Rho et l’ARNP
a été révélée, in vitro en utilisant un mutant de Rho ayant une translocation réduite et qui
présente un profil de terminaison sauvage lorsque la vitesse d’élongation de l’ARNP était
également réduite (en contrôlant la concentration des rNTPs), et in vivo en utilisant un mutant
lent (rpoB8) de l’ARNP (Fisher and Yanofsky 1983; Jin et al. 1992). Dans ce modèle de
compétition cinétique, l’efficacité de la terminaison dépendrait directement des facteurs
régulant la processivité de l’ARNP (Roberts et al. 2008). Les facteurs favorisant la pause de
l’ARNP permettraient à Rho de rattraper le CTE (arrêté au niveau d’un site de pause) et
d’induire sa dissociation. En accord avec cette proposition, plusieurs études cinétiques de
l’élongation de la transcription ont révélé que les sites de relargage de l’ARN coïncident avec
les signaux de pause de l’ARNP (Morgan et al. 1983; Guerin et al. 1998; Landick 2006) ; 3)
la dissociation du CTE et le relargage du transcrit naissant : c’est pour cette étape que les
modèles sont les plus divergents. En effet, la dissociation du CTE pourrait avoir lieu suivant,
soit un phénomène de «spooling» (figure 34.B) durant lequel Rho va tirer et extraire le
transcrit du CTE immobilisé, soit un mécanisme d’hyper-translocation («forward
translocation model», figure 34.C) conduisant au raccourcissement de l’hybride ADN-ARN et
à la destruction de la bulle de transcription, soit une déstabilisation allostérique (figure 34.D)
engendrée par les contacts entre Rho et le CTE (Epshtein et al. 2010).
Figure 34. Modèles de terminaison Rhodépendante chez E. coli. (A) compétition
cinétique entre Rho et le CTE. (B) modèle
«spooling» : Rho en enroulant l’ARN
provoque son extraction du CTE. (C) modèle
«forward tranlocation» : Rho induit l’hypertranslocation du CTE et la destruction de
l’hydride ADN-ARN. (D) Rho provoque un
changement allostérique du CTE. Adaptée
d’une figure préparée par le Dr Emmanuel
Margeat (CNRS UMR5048, Centre de
Biochimie Structurale, Montpellier).
48
Quelque soit le modèle exact, celui-ci devra probablement inclure la suggestion
récente que Rho est en interaction permanente avec l’ARNP durant le cycle transcriptionnel.
Cette interaction a été montrée in vitro, par expérience de pull-down en absence de tout cofacteurs, protéiques ou acides nucléiques (Epshtein et al. 2010). De plus, une similitude de
distribution de l’ARNP et de Rho sur le génome bactérien a été observée par l’expérience de
ChIP-chip, cette observation suggère une interaction physique entre ces deux partenaires
(Mooney et al. 2009a). Epshtein et ses collaborateurs ont proposé un nouveau modèle de la
terminaison Rho-dépendante qui suggère que Rho s’associerait avec l’ARNP tout au début de
la phase de l’élongation (Epshtein et al. 2010). Puis une fois que l’ARN naissant devient assez
long, il serait fixé par Rho au niveau de la séquence Rut afin de former un complexe RhoARN productif. L’hydrolyse de l’ATP permettrait à Rho de transloquer l’ARN de 5’ vers 3’
tout en étant fixé à l’ARNP. Une fois que tout le transcrit fournit par l’ARNP serait
transloqué, Rho provoquerait un changement allostérique au niveau du centre catalytique de
l’ARNP qui induirait la dissociation du CTE et le relargage du transcrit naissant (figure 35)
(Epshtein et al. 2010).
(A)
(B)
(C)
Figure 35. Modèle allostérique de terminaison
Rho-dépendante
incluant
l’association
permanente de Rho à l’ARNP. (A) Rho se fixe à
l’ARNP au début et tout le long de la phase
d’élongation. (B) une fois le transcrit naissant
devient assez long, Rho se charge sur celui-ci
et le transloque en hydrolysant de l’ATP. (C)
une fois tout l’ARN fournit par l’ARNP est
transloqué, Rho provoque un changement
allostérique au niveau du centre catalytique de
l’ARNP, représenté par l’étoile verte, induisant
ainsi la dissociation du CTE. D’après
(Epshtein et al. 2010).
Chacune de ces étapes pourrait être la cible de nombreux co-facteurs connus, comme
par exemple NusA et NusG, mais aussi probablement de co-facteurs qui ne sont pas encore
connus (Squires et al. 1993) (voir apport personnel, article III, page 118).
49
4.3. La régulation contextuelle de la terminaison Rho-dépendante
Au cours de la transcription le CTE peut adopter plusieurs conformations médiées par
les interactions entre l’ARNP, l’ADN et l’ARN. Ces différentes conformations peuvent
également être modulées par des facteurs extrinsèques, qui favorisent ou défavorisent
l’élongation ou la terminaison de la transcription [pour revue : (Mooney et al. 1998)]. Pour ce
qui concerne l’ARNP, les mieux étudiés de ces facteurs extrinsèques sont NusA et NusG qui
affectent la processivité de l’ARNP et interviennent dans les phénomènes de pause, de
terminaison et d’anti-terminaison de la transcription (Artsimovitch and Landick 2000). Ces
facteurs ont d’abord été découverts pour leur contribution au phénomène d’anti-terminaison
de la transcription chez le bactériophage λ (Sullivan and Gottesman 1992). Les facteurs NusA
et NusG régulent d’une façon paradoxale la terminaison Rho-dépendante. NusG favorise cette
terminaison, tandis que NusA semble être antagoniste à ce phénomène. Il est intéressant de
noter que les facteurs NusA et NusG sont essentiels chez E. coli (Nudler and Gottesman
2002). Ces facteurs sont notamment indispensables à E. coli dans l’atténuation des gènes
toxiques acquis par transfert horizontal (Cardinale et al. 2008).
Bien que la plupart des études disponibles sur les facteurs Nus avait été menée chez E.
coli, les facteurs Nus sont généralement conservés chez les bactéries et les archaea (Nudler
and Gottesman 2002). Contrairement au facteur NusA, des homologues de NusG ont été
identifiés chez les eucaryotes (Hartzog et al. 1998). De plus, un paralogue de NusG, le facteur
RfaH, a été identifié chez E. coli (Belogurov et al. 2009). Dans les paragraphes suivants, je
développerai les caractéristiques moléculaires des facteurs NusA et NusG et leurs rôles
biologiques, plus particulièrement dans la régulation de la terminaison Rho-dépendante.
4.3.1. Le facteur NusA
Le facteur NusA est essentiel pour la bactérie, probablement à cause de son
implication dans plusieurs phénomènes de régulation de la transcription. De plus, une étude
récente a montré que NusA est également impliqué dans la réparation de l’ADN en
interagissant directement avec DinB, une ADN polymérase translésionelle (Cohen et al.
2009). Ces divers rôles de NusA pourraient être dus aux différents domaines qui le constituent
(figure 36). En effet, les six domaines de NusA interagissent avec des composantes différentes
du CTE (figue 36).
50
Figure 36. Domaines du facteur NusA d’E. coli et leurs fonctions. Les chiffres correspondent
aux positions des acides aminés sur la séquence primaire. D’après : (Prasch et al. 2009).
.
Le NTD (N-terminal domaine) de NusA présente des similitudes structurales avec la
région 2 du facteur σ (Borukhov et al. 2005). Chez E. coli, le facteur σ comme le NTD de
NusA interagit directement avec l’ARNP, ce qui suggère que NusA et le facteur σ pourraient
être en compétition pour la même région sur ARNP (Mah et al. 1999; Borukhov et al. 2005).
Toutefois, des expériences de ChIP-chip suggèrent que le CTE peut contenir à la fois NusA et
le facteur σ (Mooney et al. 2009a).
Chez E. coli, les domaines AR1 et AR2 du CTD (C-terminal domaine) de NusA (qui
ne sont pas conservées chez la plupart des espèces) interagissent avec la sous-unité α de
l’ARNP (Mah et al. 1999). En revanche, des études de l’interaction ARNP:NusA réalisées
chez Bacillus subtilis ont révélé que NusA interagit avec le domaine «β-flap» de l’ARNP
(Yang et al. 2009). Ce domaine «β-flap» interagit avec la région 4 du facteur σ lors de
l’initiation de la transcription (Yang et al. 2009). Cette interaction est faible et serait la
première à être rompue lors de la transition initiation/élongation de la transcription (Nickels et
al. 2005). La région 2 du facteur σ qui, elle, interagit avec la sous-unité β de l’ARNP serait le
dernier site de contact avec l’ARNP lors de cette transition (Murakami and Darst 2003). Yang
et ses collaborateurs suggèrent que l’interaction entre NusA et le domaine «β-flap» serait
formée au cours de la transition initiation/élongation, le facteur σ restant associé à l’ARNP via
sa région 2. Ainsi, un complexe transcriptionnel de transition pourrait contenir à fois les deux
facteurs, NusA et σ (Yang et al. 2009).
Le facteur NusA contribue à la synchronisation de la transcription et de la traduction
en induisant la pause de l’ARN polymérase lors de la transcription (Squires and Zaporojets
2000). En absence de facteurs auxiliaires, NusA ralentit la vitesse d’élongation du transcrit
favorisant soit les pauses de type I de l’ARNP (figure 30, page 40) soit la terminaison
intrinsèque (Artsimovitch and Landick 2000). L’utilisation de mutants NusA tronqués a
révélé que le domaine NTD de NusA est nécessaire et suffisant pour induire le phénomène de
pause et de terminaison de la transcription chez E. coli (Ha et al. 2010).
51
4.3.2. Le facteur NusG
Chez E. coli, le facteur NusG régule la terminaison Rho-dépendante de façon
paradoxale. En effet, NusG permet à l’ARNP de résister à certains signaux de pause (figure
30, page 40) (Artsimovitch and Landick 2000) et favorise la transcription en augmentant la
vitesse d’élongation de la transcription d’environ 20 à 30 % aussi bien in vivo qu’in vitro
(Burova et al. 1995; Burns et al. 1998). Cependant, NusG semble également être essentielle
pour certains terminateurs Rho-dépendants in vivo et in vitro (Li et al. 1993). L’interaction
physique entre Rho et NusG a été mis en évidence in vitro (Li et al. 1993; Kalarickal et al.
2010) et est mediée par le domaine CTD de NusG (Mooney et al. 2009b). En effet, NusG est
constitué de deux domaines : CTD et NTD indépendants et liés par un mini-domaine (linker)
flexible (figure 37) (Mooney et al. 2009b; Burmann et al. 2010). Des délétions au niveau de
ce linker perturbent à la fois l’élongation et la terminaison de la transcription Rho-dépendante
(Richardson and Richardson 2005).
Figure 37. Structure (A) et séquence
peptidique (B) du facteur NusG.
D’après : (Burmann et al. 2010).
Les rôles respectifs des domaines CTD et NTD de NusG dans la régulation de
l’élongation de la transcription ont été testés in vivo et in vitro (Mooney et al. 2009b). Cette
étude suggère que le domaine NTD seul est suffisant pour supprimer la pause et stimuler
l’élongation de la transcription in vitro. Cependant, les phénomènes de terminaison Rhodépendante et d’anti-terminaison nécessitent la présence du facteur NusG entier (Mooney et
al. 2009b). Les auteurs de cette étude proposent que les domaines de NusG sont impliqués
dans des interactions distinctes avec les composantes du CTE, le domaine NTD se lie à
l’ARNP, et le domaine CTD interagit avec Rho et pourrait également interagir avec d’autres
52
partenaires cellulaires ayant des fonctions distinctes (figure 38). Des mutants ponctuels du
CTD affectent la terminaison de la transcription induite par la protéine Nun du phage HK022
mais pas la terminaison Rho-dépendante. Cette observation suggère que la face du CTD
impliquée dans l’interaction avec la protéine Nun est différente de celle engagée dans
l’interaction avec Rho (Mooney et al. 2009b). NusG serait donc un élément central de la
régulation contextuelle de la transcription chez E. coli via des interactions mutuellement
exclusives entre son CTD et les autres facteurs protéiques (Mooney et al. 2009b)
Figure 38. NusG interagit avec le CTE : Le
NTD-NusG (rose) est en interaction avec la
sous-unité β de l’ARNP (vert) au niveau de
la bulle de transcription. Les interactions
alternatives du CTD-NusG (jaune), par
exemple, avec le facteur Rho (violet).
D’après (Mooney et al. 2009b).
Le lien physique assuré par NusG entre Rho et l’ARNP (Mooney et al. 2009b;
Belogurov et al. 2009) pourrait être à l’origine de la stimulation de l’efficacité de la
terminaison Rho-dépendante in vitro et in vivo (Sullivan and Gottesman 1992; Li et al. 1993;
Burns et al. 1999). Des études génétiques soutiennent également une interaction fonctionnelle
entre les facteurs NusG et la protéine S10 (appelée également NusE), une sous-unité du
ribosome (Sullivan and Gottesman 1992). Des études de RMN ont confirmé cette relation
fonctionnelle en montrant une interaction physique entre le domaine CTD de NusG et le
facteur NusE (Burmann et al. 2010). De plus, la face de NusE impliquée dans l’interaction
avec NusG est accessible lorsque NusE interagit avec la sous-unité 30S (Burmann et al.
2010). Cette interaction révèle ainsi l’importance du facteur NusG dans le couplage
transcription-traduction chez la bactérie, en assurant un lien physique entre les deux
machineries transcriptionnelle (ARNP) et traductionnelle (ribosome). Ce lien expliquerait
pourquoi la translocation du ribosome sur l’ARNm lors de la traduction contrôle directement
la vitesse d’élongation de l’ARNP et empêche sa translocation en cours de transcription
(Proshkin et al. 2010). L’interaction entre le CTD de NusG et la protéine S10 est également
impliquée dans des complexes d’anti-terminaison multi-protéiques qui, en absence du
ribosome, protègent l’ARNP de l’action de Rho lors de la transcription du génome du phage λ
ou des opérons ribosomaux (voir ci-dessous).
53
5. L’expression génique et la terminaison de la transcription
Dans les paragraphes suivants, je présente quelques exemples de régulation génique
intervenant au niveau de la terminaison de la transcription.
5.1. Exemples de mécanismes d’atténuation impliquant le facteur Rho
5.1.1. La polarité du gène Rho
Au cours de la croissance cellulaire, le niveau d’expression du facteur Rho est
relativement constant (~103 hexamères/cellule) (Blumenthal et al. 1976; Geiselmann et al.
1992b). Cependant, ce niveau d’expression est perturbé chez les mutants Rho. L’expression
du gène rho diminue ou augmente significativement chez les mutants de Rho hyperactifs et
déficients, respectivement (Imai and Shigesada 1978; Tsurushita et al. 1984). L’expression du
gène rho est régulée par un phénomène d’atténuation (Brown et al. 1982; Matsumoto et al.
1986; Peters et al. 2009) intervenant au niveau de terminateurs Rho-dépendants situés en aval
de la région rhoL de l’opéron (figure 32.A, page 45 et figure 39).
Figure 39. Régulation de l’expression de l’opéron rhoL-rho chez E. coli. D’après :
(http://biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE?type=GENE&object=EG12428).
5.1.2. L’opéron bactérien tna
L’opéron tna contient les gènes tnaA et tnaB qui codent respectivement pour la
tryptophanase (qui dégrade le tryptophane en métabolites utilisés de diverses façons par la
bactérie) et le transporteur du tryptophane (figure 40.A). Ces deux gènes sont localisés en aval
d’une région leader nommée tnaC, elle-même située juste en amont d’un terminateur Rhodépendant et codant pour un peptide leader de 24 acides aminés (figure 40.A). L’expression
de l’opéron tna est modulée par deux phénomènes antagonistes sensibles à la concentration du
tryptophane endogène : atténuation et anti-terminaison de la transcription (Yanofsky 2000).
Le modèle proposé pour la régulation de cet opéron (figure 40.B) est basé sur la protection/
déprotection d’un site Rut en fonction de la concentration en tryptophane. Lorsque cette
concentration est élevée, le ribosome accompagné du peptide tnaC restent bloqués au niveau
du codon stop (figure 40.B, en rouge) empêchant l’accès du site Rut à Rho et permettent ainsi
l’expression des gènes tnaA et tnaB. En revanche, lorsque la concentration en tryptophane est
54
faible, le peptide tnaC serait clivé, entrainant ainsi la dissociation du ribosome et l’accès de
Rho au site Rut suivant un mécanisme qui n’est pas encore complètement clarifié.
(A)
(B)
Figure 40. Atténuation de l’opéron tryptophane. (A) représentation schématique de l’opéron
tna. (B) en absence de Trp les ribosomes se dissocient de l’ARNm, Rho reconnait son site
d’entré et induit la dissociation du CTE. D’après (Gong and Yanofsky 2002).
5.1.3. Les BIMEs
En 2001, Espéli et ses collaborateurs ont identifié un nouveau mécanisme de
régulation de l’expression de gènes adjacents au sein d’un opéron via le phénomène
d’atténuation médié par les BIMEs (Bacterial Interspersed Mosaic Elements) (Espeli et al.
2001). Les BIMEs sont de courtes séquences extragéniques répétées et dispersées dans plus
de 250 opérons et peuvent affecter l’expression de gènes adjacents au sein d’un même opéron
[pour revue : (Bachellier et al. 1999)]. En effet, l’insertion d’un élément BIME entre deux
gènes d’un opéron réduit la transcription des gènes situés en aval du BIME. Cet effet est dû au
phénomène d’atténuation dépendant de la présence du facteur Rho (Espeli et al. 2001). Rho
induit la terminaison de la transcription en rattrapant l’ARNP en pause au niveau du BIME
qui constituerait un obstacle pour son l’élongation (Espeli et al. 2001).
5.2. Exemples de mécanismes d’anti-terminaison au niveau des
terminateurs Rho-dépendants
5.2.1. L’anti-terminaison dirigée par la protéine N
Chez le bactériophage λ, l’expression des opérons précoces nécessite l’intervention de
la protéine N qui forme un complexe multiprotéique contenant l’ARNP et les facteurs Nus, et
qui provoque le phénomène d’anti-terminaison [pour revue : (Friedman and Court 1995)]. In
vitro les facteurs Nus (A, B, E et G) en présence de la protéine N suffisent pour induire l’anti-
55
terminaison chez le phage λ (Li et al. 1992). La protéine λN reconnait le site nut sur l’ARN
naissant lors de la transcription de l’ADN phagique chez E. coli. Les sites nut sont formés par
deux éléments distincts, boxA et boxB, séparés par une séquence aléatoire (Friedman and
Court 1995). La séquence boxA est hautement conservée, chez les phages de type λ et est
retrouvée également au niveau de l’élément anti-terminateur des gènes des ARN ribosomaux
d’E. coli (Prasch et al. 2009) ainsi qu’au sein de certains terminateurs Rho-dépendants
(Ciampi 2006). L’anti-terminaison se produit lorsque la région N-terminale riche en arginine
de la protéine λN se lie à la structure en tige boucle boxB au sein du transcrit naissant (figure
41). Ce complexe ribonucléoprotéique favorise l’assemblage d’un complexe multi-protéique
contenant les facteurs bactériens NusA, NusB, NusG et NusE (figure 41). Différentes études
génétiques et biochimiques ont mis en évidence les interactions entre ces différents
composants du complexe d’anti-terminaison. Les facteurs NusA, NusB et NusE sont recrutés
sur des régions spécifiques de la séquence nut (figure 41). Le couple NusB-NusE (Luo et al.
2008) reconnaît et fixe la séquence boxA (Greive et al. 2005). Cependant, NusA interagit à la
fois avec la séquence «spacer» séparant boxA de boxB et la protéine λN via son domaine
AR1 (Prasch et al. 2009). Bien que le facteur NusG fasse partie du complexe d’antiterminaison (Sullivan and Gottesman 1992), il est également nécessaire à l’action de Rho au
niveau de certains terminateurs (Roberts et al. 2008). L’action de NusG en faveur de Rho dans
le complexe d’anti-terminaison serait donc bloquée probablement à cause de la séquestration
de son CTD dans une interaction avec le facteur NusE (Burmann et al. 2010).
L’ensemble des interactions formées au sein du complexe d’anti-terminaison
stabilisent celui-ci de façon coopérative, lui assurant ainsi une grande processivité pour la
transcription des régions situées en aval du site nut (figure 41).
Figure
41.
Modèle
d’antiterminaison impliquant la protéine
λN chez le phage λ. Les divers
facteurs importants composant le
complexe
protéique
d’antiterminaison sont indiqués sur la
figure. D’après : (Prasch et al.
2009).
5.2.2. L’anti-terminaison au niveau des opérons ribosomaux
Chez E. coli, sept opérons ribosomaux sont identifiés. L’anti-terminaison au niveau de
ces opérons empêche le phénomène de polarité induit par Rho (Brewster and Morgan 1981)
56
suivant un mécanisme très proche de celui décrit dans le paragraphe précédent. Les éléments
induisant ce phénomène (AT) sont identifiés en aval du promoteur P2 mais aussi entre les
gènes codant les ARNr 16S et 23S (figure 42.A). L’anti-terminaison est responsable par
exemple, de la stœchiométrie de synthèse des ARNr 16S, 23S, et 5S (figure 42.B). La
séquence boxA de l’élément AT, dans la région 5’ de l’ARNr est conservée chez tous les
opérons ribosomaux d’E. coli (Nodwell and Greenblatt 1993). Cependant, la séquence boxB
formant la structure en tige-boucle au niveau du transcrit est beaucoup moins conservée en
comparaison à la séquence boxB du phage λ (Prasch et al. 2009).
Bien que les facteurs NusA, NusB, NusE et NusG soient indispensables pour induire
l’anti-terminaison chez l’opéron rrn (Vogel and Jensen 1997) in vitro, ils ne sont pas
suffisants pour induire le phénomène d’anti-terminaison (Squires et al. 1993). Celui-ci n’est
observé qu’en présence d’un extrait cellulaire brut (Squires et al. 1993). Ce résultat
suggèrerait que d’autres facteurs cellulaires soient nécessaires pour ce phénomène d’antiterminaison. Torres et ses collaborateurs ont identifié quatre protéines ribosomales (S4, L3,
L4 et L13) parmi ces facteurs participant au complexe d’anti-terminaison (Torres et al. 2001).
Il a été montré que le facteur NusB reconnaît et fixe la boxA, cette fixation est
nécessaire pour l’interaction entre NusB et NusE (S10) (Nodwell and Greenblatt 1993). Cette
interaction initie la formation coopérative d’un complexe multi-protéique hautement stable et
processif (figure 42.B). L’ARNP ainsi modifiée peut ignorer les terminateurs Rho-dépendants
mais pas les terminateurs intrinsèques (Albrechtsen et al. 1990). Récemment il a été montré
que l’anti-terminaison au niveau des terminateurs Rho-dépendants pourrait produire des ARN
anti-sens en cis qui provoqueraient l’atténuation de leur gènes cibles (Krylov et al. 2010).
Cette observation suggère donc que le phénomène d’anti-terminaison ne serait pas toujours en
faveur de l’expression génique.
(A)
(B)
Figure 42. L’anti-terminaison au niveau de l’opéron rrn. (A) séquence de l’élément AT et
(B) le complexe ribonucléoprotéique induisant l’anti-terminaison.
57
5.2.3. L’anti-terminaison induite par la protéine Psu du bactériophage P4
Psu (Polarity suppression) est une protéine de la capside du bactériophage P4. Il a été
montré que cette protéine inhibe la terminaison de la transcription Rho-dépendante aussi bien
in vitro qu’in vivo (Pani et al. 2006). La co-surexpression chez E. coli de la protéine Psu et de
Rho diminue la viabilité des cellules, en raison de l’activité anti-Rho de la protéine Psu, Psu
est également capable d’inhiber Rho in vitro (Pani et al. 2006). En présence de la protéine Psu
l’affinité de Rho pour l’ATP est très réduite (Pani et al. 2006). Ce phénomène provoque le
ralentissement de la translocation de Rho sur l’ARN naissant en raison de sa faible activité
ATPase. L’activité anti-terminatrice de Psu est supprimée par une délétion des 10 ou des 20
acides aminés du domaine C-terminal de Psu mais aussi par la mutation ponctuelle Y80C au
niveau du PBS du facteur Rho (Chalissery et al. 2007). Ces observations suggèrent que l’antiterminaison médiée par Psu est due à son interaction physique avec Rho, et que cette
interaction implique les premiers acides aminés du domaine C-terminal de Psu et le site
primaire de fixation de l’ARN du facteur Rho (Pani et al. 2009).
5.2.4. L’anti-terminaison induite par le facteur bactérien YaeO
La surexpression du facteur YaeO (9 KDa) in vivo aboli la terminaison Rhodépendante de la transcription (Pichoff et al. 1998). Il est intéressant de noter que YaeO et copurifié avec Rho. Dans les conditions physiologiques le complexe Rho:YaeO serait donc très
stable, et n’est dissocié in vitro qu’à haute force ionique ([KCl] ≥0,4M) (Pichoff et al. 1998).
In vivo, YaeO peut induire l’anti-terminaison en utilisant des terminateurs Rho-dépendants
différents mais sans avoir d’affinité notable pour les acides nucléiques (Gutierrez et al. 2007).
Ces observations suggèrent que le mécanisme utilisé par YaeO est différent des mécanismes
décrits pour l’opéron rrn et le phage λ, qui nécessitent des séquences spécifiques (boxA et
boxB) permettant le recrutement sur le transcrit des facteurs protéiques induisant l’antiterminaison. Des études biochimiques ont montré que l’interaction de YaeO avec Rho réduit
significativement l’affinité de Rho pour son substrat (Gutierrez et al. 2007). L’étude
structurale par RMN de YaeO a montré que les 106 résidus constituant YaeO sont organisés
en une seule hélice α et 7 feuillets β (Gutierrez et al. 2007). L’alignement de séquence a
montré que des résidus au sein de l’hélice α sont fortement conservés dans plusieurs espèces
bactériennes (Gram positive et négative). Il est important de noter que ces chaînes latérales
conservées (Cys-12, Asp-16, Glu-19, Cys-22, et Glu-52) sont exposées à la surface du facteur
YaeO. Ces observations suggèrent que ces résidus pourraient être importants pour les
fonctions biologiques de YaeO.
58
Afin d’élucider la nature de l’interaction Rho:YaeO et le mécanisme d’inhibition de la
terminaison Rho-dépendante par YaeO, l’interaction entre le PBS (forme tronquée constituée
des résidus : 1-130) et YaeO a été étudiée par RMN (Gutierrez et al. 2007). Cette étude
structurale a révélé les résidus de YaeO impliqués dans l’interaction avec le PBS de Rho. La
mutation de ces résidus supprime aussi bien l’inhibition de fixation de Rho sur son substrat
que la terminaison Rho-dépendante in vivo (Gutierrez et al. 2007). Ces résultats structuraux et
biochimiques ont permis à Gutiérrez et ses collaborateurs de proposer un modèle du
mécanisme d’anti-terminaison du facteur YaeO. Ce modèle postule que la complémentarité de
charge est un facteur important pour la formation du complexe Rho:YaeO et que l’interaction
de YaeO au PBS du facteur Rho diminuerait l’affinité de Rho pour son substrat. YaeO
inhiberait donc la terminaison Rho-dépendante en interférant avec l’ancrage de Rho au
transcrit naissant via un encombrement stérique, des poches PBS de fixation à l’ARN induit
par YaeO (figure 43).
(A)
(B)
Figure 43. Modèle du complexe Rho-130:YaeO. (A) YaeO perturbe l’interaction entre l’ARN et
Rho. YaeO est de couleur verte et Rho130 est en rose. La trajectoire de l’ARN est représentée par la
ligne pointillée jaune. (B) interaction de YaeO avec l’hexamère ouvert de Rho. Les cercles en
pointillés jaunes indiquent les régions d’interférence stérique causés par la fixation de YaeO à Rho.
D’après : (Gutierrez et al. 2007).
La fonction biologique exacte du facteur bactérien YaeO reste inconnue. Douze
protéines présentant une similarité de structure avec le facteur YaeO ont été identifiées (Zscore >2,0, programme DALI). Le Z-score (mesure de la qualité de la prédiction) le plus élevé
(Z=4,4) a été obtenu pour la protéine Hfq qui est une protéine chaperonne très abondante chez
E. coli (figure 44).
59
Figure 44. Similitude structurale significative
entre YaeO et la protéine Hfq (Z-score=4,4;
Rmsd =2,7 Å). Les structures sont de couleurs
différentes de l’extrémité N-terminale (bleu) à
l’extrémité C-terminale (rouge). D’après :
(Gutierrez et al. 2007)
Y-a-t-il d’autres partenaires protéiques potentiels du facteur Rho ?
L’analyse de la carte d’interactions protéine-protéine à l’échelle protéomique
disponible chez E. coli (Butland et al. 2005; Hu et al. 2009) révèle que Rho pourrait interagir
avec plusieurs partenaires protéiques (figure 45). Il est important de noter que cette analyse
identifie la protéine Hfq (qui présente une similitude topologique significative avec YaeO)
comme partenaire du facteur Rho (mais YaeO ne l’est pas). De plus, les deux protéines Rho et
Hfq partagent plusieurs partenaires protéiques communs (Butland et al. 2005; Hu et al. 2009).
Figure 45. Partenaires protéiques du facteur Rho identifiés dans l’interactome d’E. coli.
Les gènes présentés sur la figure 45 codent pour des protéines impliquées dans des
fonctions biologiques différentes chez E. coli (voir apport personnel, article III, tableau 1,
page 129). L’étude et la validation de ces interactions pourraient attribuer de nouveaux rôles
biologiques pour le facteur Rho ou permettraient de mieux comprendre la régulation
contextuelle de son action chez E. coli. Le partenaire du facteur Rho le plus impliqué dans
60
cette régulation contextuelle est le facteur NusG (Mooney et al. 2009b). Cette régulation de la
transcription via le facteur NusG pourrait être renforcée si un ou plusieurs partenaires de Rho
étaient en compétition avec le domaine CTD de NusG pour interagir avec Rho. C’est
pourquoi dans le travail présenté dans cette thèse (voir apport personnel, article III, page 118),
nous avons entrepris une comparaison structurale entre le CTD de NusG et tous les
partenaires potentiels du facteur Rho identifiés dans l’interactome d’E. coli (figure 45). Cette
étude comparative a permis d’identifier trois partenaires potentiels du facteur Rho dont la
protéine Hfq présentant une similitude topologique significative avec le CTD de NusG (voir
apport personnel, article III, tableau 2, page 131). Au cours de notre étude (article III), nous
nous sommes intéressés exclusivement à l’étude de l’interaction du facteur Rho avec la
protéine Hfq. Avant de présenter les résultats obtenus au cours de cette étude, je décris
brièvement quelques caractéristiques moléculaires de la protéine Hfq et ses implications
cellulaires dans le chapitre suivant.
61
Généralités. La protéine Hfq
Chapitre III. La protéine Hfq
Ces dernières années, divers mécanismes de régulation post-transcriptionnelle
impliquant des petits ARN non codants (sRNAs) ont été mis en évidence chez les bactéries
[pour revue : (Livny and Waldor 2007; Waters and Storz 2009; Arnvig and Young 2010)].
Deux classes principales de sRNAs ont été identifiées [pour revue : (Waters and Storz 2009)].
D’une part, il existe des sRNAs qui sont exprimés à partir d’éléments génétiques mobiles
(plasmides, bactériophages et transposons). Dans ces systèmes, les sRNAs contrôlent des
fonctions essentielles pour l’élément extra-chromosomique et sont synthétisés en cis par
rapport à leur gène cible (transcrits à partir du brin antisens). La complémentarité entre ces
sRNAs et leurs ARNm cibles est totale. La deuxième classe correspond à des sRNAs qui sont
exprimés à partir du génome bactérien et transcrits en trans par rapport à leur gène cible. La
complémentarité entre ces sRNAs et leur ARNm cible n’est souvent que partielle et leur
appariement peut dépendre fortement de l’assistance de la protéine endogène Hfq [pour revue:
(Gottesman 2005; Aiba 2007)]. Hfq a été identifiée initialement pour sa participation dans la
réplication du bactériophage Qß (DuBow et al. 1977). Dans ce cas, Hfq modifie les structures
secondaires et tertiaires de l’extrémité 3’ de l’ARN Qß (Miranda et al. 1997) qui sera
reconnue par la réplicase phagique. La protéine Hfq est très abondante (~µM) chez E. coli
(Kajitani et al. 1994). En solution, Hfq est principalement présente sous la forme d’un
hexamère (Franze de Fernandez et al. 1972) qui se fixe à l’ARN au niveau de régions simples
brins riches en AU (Senear and Steitz 1976). Hfq est un facteur global de régulation posttranscriptionnelle chez E. coli et d’autres bactéries, notamment Salmonella, où elle participe à
des événements de «gene silencing» en facilitant l’appariement de sRNAs avec leurs ARNm
cibles [pour revue : (Brennan and Link 2007; Vogel 2009)]. La formation Hfq-dépendante de
ces duplexes sRNAs/mRNA intervient généralement à proximité d’un site RBS (Ribosome
Binding Site) et a pour effet de moduler la traduction (généralement, mais pas exclusivement,
de façon négative) et/ou la dégradation de l’ARNm cible. Hfq est également impliquée dans
d’autres aspects du métabolisme ARN qui ne semblent pas concerner les sRNAs mais dont les
mécanismes sont encore mal compris [pour revue : (Brennan and Link 2007; Vogel 2009)].
Par exemple, Hfq est impliquée dans la régulation de plusieurs ARNm d’E. coli en agissant au
niveau transcriptionnel suivant un mécanisme encore inconnu (Le Derout et al. 2010).
62
1. Expression et localisation cellulaire de la protéine Hfq
Chez E. coli, le gène hfq a été séquencé en 1991 par Kajitani et Ishihama (Kajitani and
Ishihama 1991). Ce gène fait partie d’un opéron complexe (amiB-mutL-miaA-hfq-hflX-hflKhflC) qui comprend les gènes amiB et miaA, également impliqués dans le métabolisme des
ARN (Tsui et al. 1996). Cet opéron est sous le contrôle d’au moins trois promoteurs sensibles
au choc thermique (σ32-dépendants) et de quatre promoteurs dépendants du facteur σ70 (Tsui
et al. 1996). L’inactivation du gène hfq entraîne des effets pléïotropes chez E. coli (Tsui et al.
1994), ce qui suggère que la protéine Hfq est impliquée dans diverses fonctions cellulaires.
Cette hypothèse est supportée par les nombreuses variations du transcriptome observées chez
les mutants hfq nuls d’E. coli [ 275 gènes sont touchés soit 6,3% du génome; (Guisbert et al.
2007)] ou d’autres espèces comme par exemple Salmonella typhimurium [18% du génome
affecté; (Sittka et al. 2008)] Pseudomonas aeruginosa [15% du génome affecté ; (Sonnleitner
et al. 2006)] ou Vibrio cholerae [5.6% du génome touché; (Ding et al. 2004)]. En général, les
gènes dont l’abondance des ARNm diminue en absence d’Hfq sont majoritaires, environ 65%
des gènes touchés chez E. coli (Guisbert et al. 2007). De plus, chez le mutant hfq nul d’E.
coli, l’expression de plus de 30 protéines est perturbée (Muffler et al. 1997). Cette
perturbation est due en partie à l’implication de Hfq dans la régulation du gène rpoS qui code
pour le facteur sigma S (σS) (voir paragraphe 3.1, page 69). Il est également intéressant de
noter que Hfq régule négativement sa propre expression au niveau post-transcriptionnel. En
effet, Hfq se fixe à deux sites sur l’ARNm hfq, empêchant ainsi la formation du complexe
d’initiation de la traduction sur cet ARN messager (Vecerek et al. 2005).
Chez E. coli, la protéine Hfq est très abondante avec en moyenne 30000 à 60000
molécules (≈10000 hexamères) par cellule (Kajitani et al. 1994). Le taux d’expression de Hfq
peut néanmoins varier en fonction de la croissance cellulaire (Azam et al. 1999). Par exemple,
il a été montré que la concentration de la protéine Hfq est plus élevée lorsque les cellules sont
en croissance lente (Vytvytska et al. 1998) ou au début de la phase stationnaire (Tsui et al.
1997).
Des études de fractionnement d’extraits cellulaires par gradients de glycérol suivis
d’immunodétection (Kajitani et al. 1994) et des études d’immunofluorescence in situ (Azam
et al. 2000) ont montré que la protéine Hfq d’E. coli est fortement localisée au niveau du
cytoplasme (80-90%) et seulement localisée au niveau du nucléole de façon minoritaire (1020%) bien qu’elle ait été identifiée parmi les principales protéines associées à l’ADN du
nucléole (Azam and Ishihama 1999). Récemment, des études de microscopie électronique ont
63
également localisé la protéine Hfq au niveau périphérique des cellules (Diestra et al. 2009).
Les auteurs de cette étude expliquent cette localisation pseudo-membranaire par l’implication
de la protéine Hfq dans la régulation de l’expression de plusieurs protéines membranaires
(Diestra et al. 2009) via l’interaction Hfq-dépendante des ARNm correspondants avec des
sRNAs [pour revue : (Valentin-Hansen et al. 2007)].
2. Organisation structurale de la protéine Hfq
La protéine Hfq est apparentée à la famille des protéines à motif Sm, que l’on retrouve
chez les eucaryotes ou les archæbactéries [pour revue : (Wilusz and Wilusz 2005)]. Ces
protéines adoptent généralement une structure fonctionnelle en anneau oligomérique
hétéromère alors que Hfq forme un anneau homo-hexamérique (Wilusz and Wilusz 2005).
Des études d’affinité pour l’ARN avec des mutants ponctuels de Hfq suggéraient la présence
de deux sites distincts de fixation à l’ARN, chacun localisé sur une face opposée de l’homohexamère (Mikulecky et al. 2004). Des études cristallographiques ont confirmé ces
observations (figure 46). Sur une face, le site proximal assure la fixation préférentielle de la
protéine Hfq à des séquences d’ARN riches en AU. L’autre site, situé sur la face distale de
l’hexamère, présente une forte affinité pour les séquences ARN riches en A (poly[rA])
(Schumacher et al. 2002; Mikulecky et al. 2004; Sun and Wartell 2006; Link et al. 2009).
Face proximale
Face distale
Figure 46. Modèle structural de l’hexamère Hfq avec les oligomères r(AUUUUUG) (en vert) et
r(A)9 (en rouge) liés aux faces proximale et distale, respectivement. Le modèle a été construit en
utilisant le logiciel TopMatch (Sippl and Wiederstein 2008) par alignement structural de deux
structures cristallines distinctes de Hfq liée à l’ARN (PDB # 3GIB et 1KQ2).
Récemment, il a été montré que la face distale de Hfq est également capable de fixer
des fragments du génome d’E. coli avec une affinité modérée (Kd >100nM) (Updegrove et al.
64
2010). Ceci pourrait contribuer à expliquer pourquoi Hfq est l’une des protéines les plus
abondantes qui soient associées à l’ADN du nucléoïde (Azam and Ishihama 1999).
2.1. Le site proximal de fixation à l’ARN
La structure cristallographique de la protéine Hfq de S. aureus (PDB# 1KQ1)
complexée à un oligoribonucléotide (AU5G) procure un modèle de l’organisation du site
proximal (Schumacher et al. 2002). Dans cette structure, l’oligoribonucléotide contacte
plusieurs chaînes latérales au niveau de la cavité centrale de l’anneau hexamérique (figure
47). Les contacts forment notamment des poches de fixation pour des dimères AU aux
interfaces entre monomères adjacents de l’hexamère Hfq. Cette organisation, incluant divers
contacts spécifiques pour les résidus adénine et uracile (figure 47) contribue à expliquer la
préférence de la protéine Hfq pour les séquences ARN riches en AU (Schumacher et al. 2002;
Brennan and Link 2007).
Figure 47. Poche d’interaction formant le site proximal-ARN dans la structure cristallographique
de Hfq S. aureus (PDB# 1KQ1). Les résidus de chaque monomère formant les poches de fixation
sont colorés en bleu clair et jaune, respectivement. Les panneaux (a) et (b) montrent que les bases
«uracile» et «adénine» sont accommodées par les mêmes chaînes latérales au sein du site proximal.
D’après : (Brennan and Link 2007).
2.2. Le site distal de fixation à l’ARN
Une structure cristallographique montrant un trimère Hfq d’E. coli (PDB# 3GIB) en
complexe avec un oligoribonucléotide A15 a révélé récemment l’organisation du site distal de
fixation à l’ARN (figure 48) (Link et al. 2009). Ce site distal est subdivisé en trois
composantes distinctes : le site A qui reconnait et fixe spécifiquement une adénine, le site R
qui est spécifique pour une purine, et enfin le site E qui est non-spécifique. Ces différentes
composantes forment un site de fixation à l’ARN sur chaque monomère appelé «site
65
tripartite». Six sites tripartites sont présents sur la face distale de l’hexamère Hfq qui peut
donc, en principe, se lier à 18 nucléotides d’ARN (Link et al. 2009). La superposition de la
structure de l’hexamère apo-Hfq (PDB# 1hk9) (Sauter et al. 2003) avec la structure du trimère
Hfq en complexe avec l’oligoribonucléotide A15 (figure 48) n’a pas révélé de différences
structurales importantes au sein de la protéine Hfq (Link et al. 2009). Cette observation
suggère que le site distal de fixation à l’ARN est préformé au sein de l’anneau Hfq (Link et al.
2009).
Figure 48. A gauche, représentation en ruban de la superposition de l’hexamère apo-Hfq (vert)
avec deux trimères liant un oligoribonucléotide (A9) (gris et noir). A (site adénine), R (site purique),
et E (site non spécifique). A droite, la vue latérale du site distal occupé par l’ARN (PDB# 3GIB). La
fixation de l’oligonucléotide AU5G (ARN) au site proximal est modélisée (CPK), d’après la
structure de S. aureus (PDB# 1KQ1). D’après : (Link et al. 2009).
En s’appuyant sur ces observations structurales, des études biochimiques de
l’interaction de la protéine Hfq avec des oligomères [ARN]n (A : adénine, R : purine et N :
nucléotide; n≥3) ont montré que Hfq présente une affinité très importante pour ce type de
séquence (Link et al. 2009). Il est intéressant de noter que les séquences de type [ARN]n sont
abondantes dans le génome d’E. coli (69 et 394 séquences [ARN]n identifiées au sein des
ARNm pour n=5 et n=4, respectivement) (Link et al. 2009).
3. Rôles de Hfq au niveau post-transcriptionnel
Chez les procaryotes, les sRNAs sont des acteurs importants dans les cascades de
régulation de divers processus physiologiques [pour revue : (Wassarman 2002)]. La
transcription d’un ou plusieurs de ces petits ARN non codants est souvent induite lorsque les
cellules sont soumises à un stress précis ou lors de conditions de croissance particulières [pour
revue : (Repoila et al. 2003; Gottesman 2004)]. Les sRNAs caractérisés sont généralement de
petite taille (40-400nt) et hautement structurés [pour revue : (Gottesman 2004)]. Ces sRNAs
étant synthétisés rapidement, leur utilisation dans une cascade régulatrice lors de nombreuses
66
réponses aux stress permet à la cellule un gain de temps et d’énergie [pour revue : (Lease and
Belfort 2000a; Waters and Storz 2009)]. Ces sRNAs fonctionnent généralement par
appariement plus ou moins parfait avec des séquences contenues dans leurs ARN messagers
cibles [pour revue : (Gottesman 2004)]. Cet appariement induit une régulation qui peut être
négative (occlusion du RBS, dégradation de l’ARN) ou positive (activation de la traduction)
(figure 49).
(A)
(B)
(C)
Figure 49. Principaux modes d’action des sRNAs. Régulation négative de la traduction pour
(A) occlusion du RBS ou (B) dégradation du messager. (C) Activation de la traduction. Le RBS
est séquestré dans une structure en tige boucle. La fixation du sRNA au messager libère le RBS.
D’après : (Waters and Storz 2009).
L’implication de la protéine Hfq dans un mécanisme de régulation posttranscriptionnelle impliquant un sRNA a été montrée pour la première fois dans une étude du
sRNA OxyS, un régulateur de la réponse au stress oxydatif (Altuvia et al. 1998). Depuis,
plusieurs systèmes impliquant un appariement sRNAs/mRNA nécessitant l’intervention de la
protéine Hfq ont été mis en évidence (Zhang et al. 2003; Zhang et al. 2002; Moller et al.
2002). A ce jour, chez E. coli, une vingtaine de sRNAs ont été identifiés en interaction avec la
protéine Hfq (Masse et al. 2003a; Majdalani et al. 2005). La plupart de ces sRNAs identifiés
chez E. coli sont conservés dans d’autres espèces pathogènes, notamment chez Salmonella
typhimurium [pour revue : (Romby et al. 2006)], Toutefois, l’importance de la relation
fonctionnelle entre Hfq et les sRNAs semble dépendre de l’espèce [pour revue : (Jousselin et
al. 2009)] et il existe des bactéries comme Mycobacterium tuberculosis qui sont dépourvues
67
d’homologue Hfq (Sun et al. 2002). Cette relation, semble, par exemple, plus importante chez
Salmonella typhimurium (40/65 sRNAs dont la fonction est Hfq-dépendante sont validés
expérimentalement) que chez E. coli (Sittka et al. 2008). Chez E. coli, il est intéressant de
noter que l’expression des sRNAs est, comme celle de Hfq, plus importante en phase
stationnaire (Argaman et al. 2001; Zhang et al. 2003).
Plusieurs modes d’action de la protéine Hfq ont été proposés [pour revue : (Storz et al.
2004)]. Le premier modèle suggère que Hfq agit comme une chaperonne (Moll et al. 2003b).
Des changements de conformation au sein d’un ARN seraient induits par sa fixation à Hfq
rendant ainsi accessibles les régions interagissant avec l’ARN complémentaire (figure 50.A)
(Moll et al. 2003b). Un autre modèle soutient que les concentrations effectives locales des
deux ARN (sRNAs et ARNm cible) sont augmentées par leur fixation à un hexamère Hfq
(figure 50.B). Ceci favoriserait leur appariement (Mikulecky et al. 2004). Une autre
possibilité implique l’intervention de deux hexamères d’Hfq (figure 50.B): l’un fixerait
l’ARN régulateur et l’autre fixerait l’ARNm cible (Arluison et al. 2002). C’est donc la
formation d’un dimère d’hexamère qui permettrait le rapprochement des deux ARN et
favoriserait leur interaction. Ce modèle est soutenu par des expériences d’ultracentrifugation
analytique qui ont révélé l’existence de dimères d’hexamères Hfq (Arluison et al. 2002). Ces
dimères constituent également l’unité asymétrique des cristaux ayant servi à résoudre la
structure de la protéine Hfq de S. aureus (PDB# 1KQ1) (Schumacher et al. 2002).
(A)
Figure 50. Mécanismes par lesquels
Hfq pourrait faciliter la formation
des duplexes sRNAs-mRNA. (A) Hfq
agit comme une chaperonne. (B) Hfq
fixe les deux partenaires (sRNA et
mRNA) provoquant l’augmentation
de leurs concentrations effectives
locales. Les sRNAs et leur cible
mRNA sont en rouge et bleu,
respectivement. Hfq est schématisée
par l’anneau bleu clair. D’après :
(Storz et al. 2004).
(B)
68
A ce jour, il n’est pas clair quel modèle prévaut ni si le mécanisme d’action de Hfq
varie suivant le couple sRNA/mRNA ou suivant les circonstances environnementales.
Dans les paragraphes suivants je présente deux exemples de régulation posttranscriptionnelle relativement bien compris et qui impliquent les sRNAs et la protéine Hfq
(Masse et al. 2003b). Je commence par un des cas les mieux étudiés : la régulation positive du
gène rpoS [pour revue : (Vasil'eva Iu and Garber 2002; Gottesman 2004; Vecerek et al.
2010)]. Ensuite, je présenterai un exemple de régulation négative par «extinction» (silencing)
du gène codant le transporteur du glucose (IICBGlc) chez E. coli [pour revue : (Vanderpool
2007; Aiba 2007)].
3.1. Régulation de la traduction de la protéine RpoS
Chez E. coli, l’implication de la protéine Hfq dans la régulation du gène rpoS est
souvent avancée pour expliquer l’effet pléïotropique de Hfq. Le gène rpoS est régulé
positivement à l’entrée en phase stationnaire ou à la suite de certains stress (Muffler et al.
1996; Muffler et al. 1997; Brown and Elliott 1996). Le produit de ce gène, σS est un facteur de
virulence notable chez bon nombre d’espèces pathogènes [pour revue : (Kazmierczak et al.
2005; Dong and Schellhorn 2010)]. La régulation de rpoS intervient principalement au niveau
post-transcriptionnel. En effet, la traduction du messager rpoS est normalement réprimée par
la formation d’une structure secondaire au sein du messager qui séquestre le site RBS et
empêche la fixation du ribosome (Brown and Elliott 1996). Il a été montré que Hfq est
impliquée dans la libération de ce site RBS (Brown and Elliott 1996). En absence de Hfq
(dans un contexte génétique hfq-) des mutations perturbant la formation de la structure
secondaire sur le messager rpoS sont suffisantes pour activer l’expression du gène rpoS
(Brown and Elliott 1996). D’autres études ont révélé que l’activation de la traduction du
messager rpoS via la protéine Hfq implique l’intervention des sRNAs, DsrA, RprA (Majdalani
et al. 1998; Majdalani et al. 2002), et plus récemment, ArcZ (Mandin and Gottesman 2010).
Je me contenterai ici de présenter le mécanisme de régulation de l’expression du gène
rpoS d’E. coli qui a été le plus étudié et qui implique DsrA et la protéine Hfq [pour revue :
(Lease and Belfort 2000a; Brescia et al. 2003)]. L’expression de DsrA elle-même est sous le
contrôle d’un promoteur actif seulement à basses températures (<30°C). Par exemple, il a été
montré que le niveau d’expression de DsrA est 30 fois plus élevé à 25°C qu’à 42°C (Sledjeski
et al. 1996; Repoila and Gottesman 2001). Ce promoteur est également régulé négativement
par le facteur de transcription LeuO (Klauck et al. 1997). LeuO est connu pour son action
69
antagoniste à celle de la protéine H-NS (Histone like Nucleoid Structural protein) [pour revue
: (Stoebel et al. 2008)].
DsrA module conjointement l’expression de deux facteurs généraux de régulation
génique (figure 51) : le facteur sigma de réponse généralisée au stress (σS) et la protéine H-NS
(Sledjeski and Gottesman 1995; Sledjeski et al. 1996; Repoila et al. 2003).
Figure 51. Régulation de la traduction des ARN messagers h-ns et RpoS par le complexe HfqDsrA. D’après : (Lease and Belfort 2000a; Brescia et al. 2003).
L’ARN DsrA régule activement la traduction de l’ARNm rpoS via son interaction
avec Hfq (figure 52) (Majdalani et al. 1998; Lease and Woodson 2004). A basse température,
Hfq fixe DsrA et favorise son appariement avec une séquence partiellement complémentaire
située dans la partie 5’ non traduite de l’ARNm rpoS (figure 52) (Majdalani et al. 1998;
Vecerek et al. 2010; Soper et al. 2010). Une fois DsrA apparié à rpoS, Hfq se dissocie du
duplexe sRNA/mRNA, qui est alors reconnu par la RnaseIII. Celle-ci clive le duplexe au
niveau de deux positions, A29 et G-112 (figure 52). Ce phénomène permet l’activation de la
traduction de rpoS via l’exposition de la séquence RBS et sa reconnaissance par la sous unité
30S du ribosome (figure 52).
70
Figure 52. Modèle de l’activation de la traduction de l’ARNm rpoS par l’ARN DsrA et la protéine
Hfq. A gauche, en absence de DrsA et de Hfq le RBS est séquestré dans un duplexe de l’ARNm rpoS
formant une tige boucle. Le duplexe est reconnu par les RnaseIII et RnaseE qui provoquent sa
dégradation. A droite la protéine Hfq favorise l’appariement de l’ARN DrsA et de l’ARNm rpoS,
libérant ainsi le RBS. Le duplex ARN DrsA-rpoS est clivé en position A29 et G-112 par la RnaseIII.
La sous unité 30S reconnait le RBS et permet la traduction de l’ARNm rpoS. Les ARN DrsA et rpoS
sont en bleu et rouge, respectivement. L’hexamère Hfq est en vert et les sites de clivage RNaseIII
sont indiqués par des ciseaux. D’après : (Vecerek et al. 2010).
En parallèle, le complexe Hfq-DsrA réprime légèrement l’expression de la protéine HNS (figure 51) (Lease and Belfort 2000b). H-NS est une protéine de 15,6 kDa qui est très
abondante (105 molécules/cellule) chez les entérobactéries (Esposito et al. 2002). Cette
protéine a été isolée initialement comme un facteur de transcription bactérien (Hommais et al.
2001) et est capable de réguler sa propre expression (Spurio et al. 1997). De nombreux gènes
sous le contrôle de la protéine H-NS sont impliqués dans des phénomènes de virulence
(Prosseda et al. 1998; Nye et al. 2000) ou d’adaptation aux différents stress [pour revue :
(Atlung and Ingmer 1997)]. En effet, H-NS régule négativement un certain nombre de gènes
qui sont inductibles par ces différents stress [pour revue : (Atlung and Ingmer 1997)]. L’un de
ces gènes est le gène rpoS. Il a été montré que l’efficacité de la traduction de l’ARNm rpoS
dans une souche mutante h-ns- est environ 15-fois plus élevée que dans la souche sauvage,
alors que les quantités d’ARNm rpoS sont équivalentes dans les deux souches (Yamashino et
71
al. 1995). Cet effet ne peut être expliqué que par une diminution H-NS-dépendante de la
traduction de l’ARNm rpoS ou par un effet direct de H-NS sur la stabilité de σS (Brescia et al.
2004). Il a été montré que Hfq favorise l’appariement de DsrA à une séquence partiellement
complémentaire sur l’ARNm h-ns, provoquant la répression de l’expression de ce messager
(Lease and Belfort 2000b; Sledjeski et al. 2001). Cet appariement masque probablement le
site RBS, inhibant ainsi la traduction de l’ARNm h-ns (Lease and Belfort 2000b). Cette
inhibition par DsrA favorise ainsi indirectement la synthèse de σS et contribue également à la
survie des cellules dans des conditions de stress (basses températures et/ou choc osmotique).
3.2. Régulation du transport du glucose
Les sucres, dont le glucose, constituent pour les bactéries une des sources de carbone
et d’énergie. Un des systèmes de transport des sucres à travers la membrane cytoplasmique est
le PTS (Phosphotransferase System) qui couple la phosphorylation du sucre avec son
transport [pour revue : (Plumbridge 2002)]. Les transporteurs de la famille PTS sont
responsables de l’absorption de plusieurs sucres, comme le glucose ou la Nacétylglucosamine (Plumbridge 2002). Chez E. coli, l’accumulation du glucose-phosphate
(G6P) ou de son analogue non métabolisable, le α-méthyl-glucoside 6-phosphate (αMG6P),
provoque un stress glucose-phosphate (figure 53). Ce stress a pour conséquence
l’augmentation du niveau intracellulaire du phosphoenolpyruvate (PEP), un produit formé par
l’énolase lors d’une étape ultérieure de la glycolyse. Le PEP est le «phosphodonor» qui anime
le transport du sucre à travers le PTS. Lors du stress glucose-phosphate, le PEP est reconnu
par un facteur de transcription spécifique : SgrR (Sugar transport-related sRNA regulator)
(figure 53). Ce complexe induit la transcription du sRNA SgrS (Sugar transport-related
sRNA) qui a pour cible l’ARNm ptsG codant pour le transporteur transmembranaire du
glucose (IICBGlc; PtsG sur la figure 53) (Vanderpool and Gottesman 2004; Kawamoto et al.
2005). Le sRNA SgrS s’associe avec la protéine Hfq qui favorise son appariement avec
l’ARNm ptsG (Morita et al. 2005). Ce complexe, reconnu par la RNaseE et les différents
composés du dégradosome, provoquerait la dégradation de l’ARNm ptsG cible (Kimata et al.
2001; Morita et al. 2005). Cette réponse au stress glucose-phosphate permet donc de réduire
la synthèse des protéines de transport du glucose (IICBGlc), ce qui diminue l’accumulation de
molécules de glucose phosphate endogènes en abolissant le passage du glucose du milieu
extracellulaire vers le cytoplasme (figure 53).
72
Figure 53. Modèle de réponse au stress dû au glucose-phosphate chez E.coli impliquant la protéine
Hfq. Le PTS du glucose (représenté à gauche), induit une cascade de phosphorylations qui aboutit à
la translocation du glucose à travers la membrane cytoplasmique et à sa phosphorylation
concomitante. Quand les molécules de glucose-phosphate(G6P) s’accumulent dans le cytoplasme, un
signal en aval de la glycolyse (PEP) est détecté par le facteur de transcription SgrR. Le facteur SgrR
active la transcription du gène codant pour sgrS. Ce sRNA s’associe avec la protéine Hfq qui
favorise son appariement avec l’ARNm codant pour le transporteur PtsG. Ce complexe est reconnu
par la RNase E (en noir) et ses différents partenaires : enolase (en orange), polynucleotide
phosphorylase (en rose) et ARN hélicase RhIB (en bleu). D’après : (Vanderpool 2007).
On peut noter que l’extinction du gène codant le transporteur du glucose a été
observée dans des souches exprimant une forme tronquée et inactive de la RNaseE ou dans
des souches RNaseEts (Morita et al. 2006). Ces observations suggèrent que l’intervention de la
RNaseE n’est pas nécessaire à l’extinction du gène codant le transporteur IICBGlc.
Récemment, il a été proposé que l’appariement Hfq-dépendant de SgrS et du messager ptsG
provoque l’occlusion du RBS (Kawamoto et al. 2006) et l’extinction de ptsG par un
mécanisme classique d’interférence avec la traduction (figure 49, page 67).
4. Rôles dans la virulence
4.1. Hfq chez les autres espèces bactériennes
Des homologues de Hfq ont été identifiés dans environ la moitié des génomes
bactériens séquencés (Sun et al. 2002) ainsi que chez les cyanobactéries comme
Prochlorococcus marinus ou Synechococcus WH8102 (Axmann et al. 2005). Hfq est
notamment retrouvée chez de nombreux organismes pathogènes, comme Yersinia
enterocolitica, Pseudomonas aeruginosas (Sonnleitner et al. 2006), Vibrio cholerae (Ding et
al. 2004), Brucella abortus, Listeria monocytogenes (Nielsen et al. 2010) ou Staphylococcus
aureus (Bohn et al. 2007). Plusieurs études suggèrent que non seulement le facteur Hfq mais
73
aussi ses différentes fonctions et/ou modes d’actions sont conservés dans différentes espèces
[pour revue : (Vogel 2009; Arnvig and Young 2010)].
4. 2. Hfq et la virulence bactérienne
Il est maintenant clair que la protéine Hfq est un facteur de virulence chez diverses
bactéries pathogènes [pour revue : (Chao and Vogel 2010; Arnvig and Young 2010)]. Les
mécanismes impliqués sont de diverses natures et varient suivant l’espèce [pour revue :
(Frohlich and Vogel 2009; Chao and Vogel 2010)]. Par exemple, Hfq semble réguler
positivement l’expression d’une majorité des gènes contenus dans 4 des 5 îlots de
pathogénicité de Salmonella typhimurium (Sittka et al. 2008). La délétion de Hfq provoque
une perte considérable de virulence de cette bactérie (Sittka et al. 2007) dont les phénotypes
du mutant ∆hfq sont résumés dans la figure 54.
Figure 54. Les phénotypes du mutant ∆hfq chez
S. typhimurium. D’après : (Sittka et al. 2007).
La régulation par Hfq des gènes contenus dans les îlots de pathogénicité a également
été retrouvée chez d’autres espèces où elle peut néanmoins s’exercer de façon différente :
régulation négative du système de sécrétion de type III chez E. coli, par exemple
(Shakhnovich et al. 2009; Hansen and Kaper 2009; Meibom et al. 2009). De plus, il a été
montré récemment chez E. coli que Hfq affecte indirectement l’efficacité et l’accumulation de
drogues via le système d’efflux impliquant le transporteur AcrAB (Yamada et al. 2010). Les
niveaux d’accumulation de drogues dans des souches respectivement hfq-nulle et acrAB-nulle
sont notamment identiques. L’action de Hfq sur ce système d’efflux est exercée au niveau
post-transcriptionnel (Yamada et al. 2010). Hfq pourrait également contribuer indirectement à
la virulence bactérienne en favorisant le phénomène de résistance aux antibiotiques. En effet,
la comparaison des profils d’expressions protéiques au sein des souches hfq- et hfq+ a indiqué
que la protéine OppA est présente en forte concentration uniquement chez le mutant hfq-,
suggérant que Hfq régule négativement la synthèse de cette protéine (Ziolkowska et al. 2006).
74
La protéine OppA est une composante du système de transport périplasmique des
antibiotiques de la famille des aminoglycosides. Hfq réprimerait l’expression d’OppA au
niveau post-transcriptionnel (Pulvermacher et al. 2008).
5. Les partenaires protéiques de la protéine Hfq
En 2005, Butland et ses collaborateurs ont construit une carte d’interactions «protéineprotéine» à l’échelle protéomique chez E. coli en utilisant la technique TAP-tag (qui permet la
purification de complexes protéiques in vivo sous la forme native) suivie d’une analyse par
spectrométrie de masse à haute résolution (Butland et al. 2005). Cette étude suggère (et dans
certains cas confirme) que Hfq interagit avec de nombreuses protéines incluant, notamment,
des composantes des machineries de transcription, de traduction et de dégradation de l’ARN
(figure 55) (Butland et al. 2005; Mohanty et al. 2004). Bien que la signification biologique de
ces interactions ne soit pas toujours connue, ce réseau d’interactions impliquant Hfq confirme
le rôle central de ce facteur dans le métabolisme ARN chez E. coli.
Figure 55. Classification des
partenaires protéiques du facteur
Hfq
selon
leurs
fonctions
biologiques. D’après : (Wilusz and
Wilusz 2005).
Dans les paragraphes suivants, je présente quelques partenaires protéiques notables de
la protéine Hfq ainsi que le rôle (connu ou supposé) de leur relation avec Hfq.
5.1. La protéine Rho.
La carte d’interaction protéine-protéine disponible chez E. coli révèle que la protéine
Hfq interagit avec le facteur de la terminaison Rho-dépendante (Butland et al. 2005).
75
Figure 56. Réseau d’interactions
protéiques impliquant la protéine
Hfq et le facteur Rho.
Comme le montre la figure 56, les protéines Rho et Hfq non seulement interagissent
ensemble mais elles sont également impliquées dans un réseau complexe d’interactions avec
divers partenaires protéiques communs (Butland et al. 2005). A ce jour, une seule étude
confirme l’existence d’une interaction physique directe entre Hfq et Rho (Kd ~ 50 nM; apport
personnel, article III, page 118). Tandis que, très peu de données de la littérature suggèrent
une relation fonctionnelle entre les deux protéines. Le cas le plus notable concerne la
régulation de l’opéron bgl qui est en partie assurée par la protéine H-NS (Dole et al. 2004).
Schnetz et ses collaborateurs ont proposé un modèle de répression de l’opéron bgl par H-NS
(figure 57). Dans ce modèle, H-NS agit à la fois au niveau du promoteur afin d’inhiber
l’initiation de la transcription (effet amont) et en interagissant avec l’ADN au niveau de la
séquence codant le premier gène de l’opéron située à 600-700 pb du promoteur (effet aval).
Dans ce dernier cas, le blocage physique du complexe d’élongation par la protéine H-NS
favoriserait l’action de Rho et la dissociation du CTE (figure 57) (Dole et al. 2004).
Effet amont
Effet aval
Figure 57. Modèle de répression de l’opéron bgl par la protéine H-NS.
D’après : (Dole et al. 2004).
76
Bien que chez le mutant hfq- une forte répression de l’opéron bgl soit observée, celle-ci
n’est augmentée qu’au travers l’effet en aval du promoteur vraisemblablement par induction
de la polarité Rho-dépendante (Dole et al. 2004). Il faut noter toutefois que le modèle présenté
dans la figure 57 repose essentiellement sur des évidences génétiques et qu’il est en partie
contredit par des expériences biochimiques récentes réalisées dans le même laboratoire
(Nagarajavel et al. 2007). Il est donc possible que dans ce cas précis l’interaction
fonctionnelle entre Rho et Hfq ne résulte pas d’une interaction physique directe entre ces deux
facteurs. Néanmoins, nous avons montré au laboratoire que l’interaction directe entre Hfq et
Rho peut provoquer une inhibition de la terminaison de la transcription Rho-dépendante aussi
bien in vitro qu’in vivo (voir apport personnel, article III, page 118). Hfq inhibe également les
activités enzymatiques in vitro du moteur moléculaire Rho (ATPase et hélicase). Ces résultats
révèlent un nouveau mécanisme d’anti-terminaison de transcription Rho-dépendante
impliquant la protéine Hfq (article III).
5.2. Les composantes des machineries transcriptionnelle et
traductionnelle
Les données actuelles suggèrent que la protéine Hfq pourrait réguler l’expression de
certains gènes au niveau transcriptionnel en modulant l’élongation de la transcription. Par
exemple, il a été proposé que la protéine Hfq pourrait intervenir directement au début de
l’élongation de la transcription en interagissant avec l’ARN naissant pour empêcher la pause
de l’ARNP et éviter ainsi la terminaison précoce de la transcription du gène rpsO (codant
pour la protéine ribosomale S15) via un mécanisme non élucidé (Le Derout et al. 2010). Le
phénomène d’anti-terminaison médié par Hfq que nous avons observé pour des terminateurs
Rho-dépendants (voir apport personnel, article III, page 118) pourrait peut-être expliquer ces
observations (mais c’est à vérifier expérimentalement). Plusieurs études biochimiques
suggèrent également un partenariat physique entre la protéine Hfq et des composantes des
machineries transcriptionnelle (les sous-unités de l’ARNP) et traductionnelle (protéines
ribosomales) chez E. coli (figures 55 et 56) (Sukhodolets and Garges 2003; Butland et al.
2005). En 2003, Sukhodolets et Garges ont co-purifié Hfq avec l’ARNP en présence de la
protéine ribosomale S1, une composante de la petite sous-unité 30S du ribosome (Sukhodolets
and Garges 2003). Ces auteurs ont également montré que la protéine Hfq stimule la
transcription et la traduction in vitro (Sukhodolets and Garges 2003). Malgré, la forte
localisation de la protéine Hfq au niveau du cytoplasme (Azam et al. 2000; Diestra et al.
77
2009; Kajitani et al. 1994) et l’identification de plusieurs protéines ribosomales en interaction
avec la protéine Hfq dans l’interactome d’E. coli, seule l’interaction avec la protéine S1 a été
étudiée (Sukhodolets and Garges 2003). Cette interaction serait ARN-dépendante (Vecerek et
al. 2010). D’autres études apparaissent donc nécessaires pour mieux comprendre la relation
exacte existant entre Hfq et les machineries de transcription et traduction.
5.3. Les composantes du dégradosome
5.3.1. L’endoribonucléase RNaseE
La RNaseE est une protéine essentielle d’E. coli (Kemmer and Neubauer 2006). Cette
endoribonuléase est responsable de la dégradation de nombreux ARNm (Mudd and Higgins
1993). Hfq est associée à la RNaseE dans l’interactome d’E. coli (figure 55, page 75)
(Butland et al. 2005). Une interaction physique Hfq-RNaseE a été aussi suggérée par des
expériences de co-immunoprécipitations (Morita et al. 2005). Malgré la fixation de l’ARN par
les deux protéines, l’interaction Hfq-RNaseE est ARN-indépendante. De plus, Hfq masque les
sites utilisés par la RNaseE sur l’ARN, les deux protéines reconnaissant les mêmes régions
riches en uridines (Moll et al. 2003a). En accord avec ce mécanisme, de nombreux ARN
semblent être protégés in vivo de l’action de la RNaseE par la protéine Hfq (Folichon et al.
2003; Masse et al. 2003a).
5.3.2. La polyA polymérase I (PAP I) et la polynucléotide
phosphorylase (PNPase).
Chez les procaryotes, la taille de la queue poly(A) de l’ARNm dépend de la
compétition entre la PAP I et les exonucléases, qui digèrent les extrémités 3’ des ARNm
[pour revue : (Vasil'eva Iu and Garber 2002)]. Chez E. coli, il a été proposé que Hfq joue un
rôle protecteur des extrémités 3’ polyadénylées des ARNm, inhibant ainsi leur dégradation
par les ribonucléases (Hajnsdorf and Regnier 2000). Il a été montré qu’en absence de Hfq la
capacité de la PAP I à synthétiser la queue poly(A) en extrémité 3’ est réduite alors que le
niveau d’expression de la PAPI est inchangé (Mohanty et al. 2004). Ce phénomène a été
étudié principalement pour des ARN contenant des terminateurs Rho-indépendants qui sont
caractérisés par une structure en tige boucle suivie d’une répétition de résidus uraciles à
l’extrémité 3’ (figure 31, page 42). Ce motif spécifique protégerait les ARN de l’action des
exonucléases (3’5’) (Mohanty et al. 2004). Hfq interagirait avec la PAP I afin de faciliter la
reconnaissance et la polyadénylation des extrémités 3’ des ARNm (issus de terminaison Rhoindépendante). La présence d’une queue poly(A) faciliterait l’action des exonucléases sur la
78
tige
boucle.
Le
mécanisme
précis
est
débattu
mais
pourrait
dépendre
de
grignotages/polyadénylénations itératifs et/ou de «l’élan» pris par l’exonucléase sur la queue
polyA. L’exonucléase impliquée dans ce phénomène chez E. coli serait la polynucléotide
phosphorylase (PNPase) une 3’5’ exoribonucléase (O'Hara et al. 1995; Mohanty and
Kushner 1999). En accord avec ce mécanisme, la co-purification de Hfq, PNPase et PAPI à
partir d’extraits bactériens suggère un lien physique direct entre ces trois facteurs (Mohanty et
al. 2004). La PNPase a également été co-purifiée avec la RNaseE (Carpousis et al. 1994), un
autre partenaire d’Hfq (voir paragraphe précédent). Néanmoins, l’interaction Hfq-RNaseE ne
nécessite pas la PNPase et est observée dans un contexte PNPase mutant (Morita et al. 2005).
L’interaction entre Hfq et PNPase ne serait pas donc essentielle et pourrait même avoir un
rôle antagoniste sur la dégradation des ARNm en protégeant les queues polyA de la
dégradation par la PNPase (Folichon et al. 2003). Ces différentes études suggèrent donc que
la protéine Hfq participe aux différents processus de la dégradation des ARNm, à la fois par le
contrôle de la polyadénylation des ARNm et par son interaction avec ces ARN et les
différentes composantes du dégradosome. Néanmoins, la présence de Hfq dans la forme
canonique du «RNA degradosome» reste controversée et il est probable que les différents
composants de celui-ci (RNaseE, par exemple) s’associent avec Hfq au sein de complexe(s)
distinct(s) (Carpousis 2007).
L’implication de la protéine Hfq dans un réseau d’interactions impliquant des
composantes des machineries principales du métabolisme ARN (transcription, traduction et
dégradation) pourrait contribuer à expliquer son rôle pléïotropique chez E. coli. Néanmoins, le
rôle précis de ces interactions ainsi que les mécanismes mis en jeu restent pour beaucoup
inconnus ou mal compris. La découverte que l’interaction entre Hfq et Rho pourrait moduler
l’expression génique au niveau transcriptionnel (voir apport personnel, article III, page 118)
contribue modestement au déchiffrage de ces aspects importants.
79
Apport personnel. Introduction
Chapitre IV : Apport personnel
1. Introduction
Mon apport personnel est présenté sous la forme de trois articles scientifiques dont
deux sont déjà publiés dans des revues spécialisées. Afin de limiter les redondances et les
longueurs, j’ai choisi de ne rediscuter que très brièvement les résultats décrits dans ces
articles.
Les études présentées dans ces articles se focalisent sur l’étude de l’ARN hélicase
homo-hexamérique Rho. Cette enzyme bactérienne est connue pour son rôle capital dans la
régulation de l’expression génique via la terminaison de la transcription (Richardson 1991,
2002). Rho induit 20 à 50% des événements de terminaison chez E. coli (Ciampi 2006; Peters
et al. 2009). Actuellement, on sait que Rho est non seulement responsable de la terminaison
de la transcription d’ARNm mais également d’ARN non-codant (Peters et al. 2009). Rho est
essentiel pour E. coli (et pour d’autres espèces bactériennes), probablement à cause de son
implication dans l’atténuation de l’expression de gènes toxiques acquis par transfert
horizontal (Cardinale et al. 2008). Rho a néanmoins d’autres rôles potentiels importants
comme par exemple, son implication dans le contrôle des «R-loops» formées au cours de
transcription (Harinarayanan and Gowrishankar 2003; Drolet 2006) ou encore dans la
virulence bactérienne (Lee et al. 1992).
Les mécanismes moléculaires à l’origine des différents rôles biologiques de Rho
restent encore mal compris. C’est le cas, notamment, des événements conformationnels
régissant la formation d’un complexe Rho-ARN productif ou encore des mécanismes assurant
la translocation de l’enzyme le long de l’ARN, sa spécificité stricte pour l’ARN, ou son
interaction avec l’ARNP lors de la dissociation du CTE. Pour tenter de répondre à certaines
de ces interrogations nous avons entrepris une étude approfondie du mécanisme de
translocation du facteur Rho (articles I et II). Nous avons également exploité la carte
d’interactions «protéine-protéine» disponible pour E. coli (Butland et al. 2005; Hu et al. 2009)
dans le but d’identifier d’éventuels régulateurs de la fonction de Rho (article III).
1.1. Etude de la translocation du moteur moléculaire Rho
Rho contient deux sites de fixation à l’ARN qui ont des fonctions différentes mais
coordonnées (voir paragraphes 3. et 3.3, pages 24 et 27, respectivement). Le site primaire
d’interaction à l’ARN (PBS) est utilisé par Rho pour reconnaître et fixer les séquences Rut
contenues au sein des transcrits. Puis, le transcrit pénètre au centre de l’anneau hexamérique
80
pour interagir avec le site secondaire d’interaction à l’ARN (SBS). Ce site est strictement
ARN-spécifique et cette interaction SBS-ARN est primordiale pour que Rho devienne une
enzyme catalytiquement active. Actuellement, les deux structures disponibles pour Rho en
interaction avec l’ARN contiennent des réseaux d’interactions SBS-ARN distincts qui
suggèrent deux modèles contradictoires («RNA handoff» et «RNA escort») pour la façon dont
Rho couple en son sein la translocation de l’ARN à l’hydrolyse de l’ATP (Skordalakes and
Berger 2006; Thomsen and Berger 2009). Afin d’évaluer ces deux modèles et de
décortiquer le mécanisme de translocation du moteur moléculaire Rho, deux approches
complémentaires ont été utilisées : l’approche NAIM (Nucleotide Analog Interference
Mapping) [pour revue : (Strobel 1999; Fedorova et al. 2005; Huntzinger et al. 2005)] et la
mutagenèse dirigée. Les résultats de ces études sont présentés dans les articles I et II.
L’objectif de l’étude présentée dans l’article I était de cataloguer les groupements
ARN importants pour les interactions Rho-ARN et la translocation du moteur Rho en utilisant
l’approche NAIM (Boudvillain and Pyle 1998; Schwartz et al. 2003a).
Figure 58. Principe de l’expérience
NAIM. Les molécules d’ARN modifiées
aléatoirement par un résidu N∝S sont
préparées par transcription in vitro avec
l’ARNP
T7
et
des
analogues
nucléotidiques NTPαS. Les molécules
répondant au crible (activité hélicase)
sont traitées à l’iode pour couper les
chaînes ARN au niveau du mouchard
phosphorotioate. Les positions des
groupements importants sont révélées par
l’absence (les cadres rouges sur le gel) ou
la diminution de l’intensité des bandes
correspondantes après électrophorèse sur
gel de polyacrylamide/urée.
81
Pour notre étude, nous avons adapté cette approche à partir des principes schématisés
dans la figure 58 : 1) un répertoire de molécules d’ARN modifiées aléatoirement par un
résidus NαS est préparé en utilisant un mutant de l’ARNP T7 (Y639F) qui permet
l’incorporation des NTPαS au sein des transcrits (Huang et al. 1997; Schwartz et al. 2003b);
2) ces transcrits sont utilisés pour construire des substrats ARN-ADN tripartites optimisés
pour Rho (figure 12, page 20); 3) ces substrats sont soumis à l’activité hélicase du facteur
Rho. Cette dernière étape permet de fractionner les substrats en deux populations : «active»
pour laquelle Rho déroule l’hybride ARN-ADN et «non-active» pour laquelle Rho ne dissocie
pas cet hybride (figure 58); 4) les deux populations sont traitées à l’iode qui provoque une
coupure au niveau des liaisons phosphorothioates (Gish and Eckstein 1988) associées aux
résidus NαS. Ces coupures révèlent les fonctionnalités ARN importantes pour l’activité
hélicase du moteur Rho (figure 58).
L’objectif principal de l’étude présentée dans l’article II, était la caractérisation
fonctionnelle du site secondaire de fixation à l’ARN (SBS) et du mécanisme de translocation
du moteur moléculaire Rho sur son substrat. La stratégie retenue dans cette étude consiste à
analyser la réponse «fonctionnelle» de mutants ponctuels du site SBS. Le choix de ces
mutants a été basé sur les données structurales existantes pour le facteur Rho au début de
l’étude (Skordalakes and Berger 2003; Skordalakes and Berger 2006). Nous avons
systématiquement muté les six résidus du SBS révélés en interaction avec l’ARN dans la
structure «trimère de dimère» (figure 20, page 30) et certains résidus qui sont potentiellement
sur la trajectoire putative de l’ARN (hors le PBS) dans cette structure (figure 59). Les
phénotypes des différents mutants ont été caractérisés in vitro à l’aide de tests enzymatiques
complémentaires (ATPase, hélicase et terminaison Rho-dépendante).
Figure 59. Réseau d’interaction SBS-ARN à l’interface entre deux monomères de l’hexamère Rho.
La position des résidus ciblés par la mutagénèse sur le monomère est indiquée grossièrement. La
ligne discontinue représente le chemin putatif de l’ARN entre le PSB et SBS.
82
En résumé, les objectifs des études présentées dans les articles I et II étaient de mieux
comprendre l’origine de la spécificité stricte de Rho pour l’ARN et le mécanisme de
translocation de Rho sur son substrat.
1.2. Etude de la régulation de l’activité du facteur Rho
L’étude présentée dans l’article III, avait pour objectif principal de préciser les
mécanismes de régulation du facteur Rho chez E. coli. Des études récentes ont révélé que le
facteur NusG est un élément fonctionnel clé lors de la synthèse/traduction des ORF (Mooney
et al. 2009b). NusG interagit physiquement à la fois avec le ribosome (la protéine S10) via
son CTD et avec l’ARNP via son NTD (Mooney et al. 2009b; Proshkin et al. 2010).
L’interaction NusG:S10 stabilise également les complexes d’anti-terminaison multiprotéiques qui protègent l’ARNP de l’action de Rho lors de la transcription des opérons
ribosomaux ou du génome du phage λ (voir paragraphes 5.2.1 et 5.2.2, pages 55 et 56,
respectivement). Le domaine CTD de NusG interagit également avec Rho afin d’assurer un
lien physique entre Rho et l’ARNP, ce qui favoriserait l’efficacité de la terminaison Rhodépendante in vitro et in vivo (Sullivan and Gottesman 1992; Li et al. 1993; Burns et al.
1999). Le facteur NusG est donc un élément central de régulation contextuelle de la
transcription chez E. coli (Mooney et al. 2009b). Cette régulation pourrait être renforcée si un
ou plusieurs facteurs endogènes étaient en compétition avec le CTD de NusG pour interagir
avec Rho. Pour tester cette hypothèse, nous avons analysé la carte d’interactions «protéineprotéine», réalisée par des approches d’analyse globale pour E. coli (Butland et al. 2005; Hu
et al. 2009). Cette carte d’interactions suggère que le facteur Rho interagirait avec plusieurs
partenaires protéiques impliqués dans des fonctions cellulaires distinctes (figure 45, page 60).
L’identification, parmi ces partenaires, de protéines présentant une similitude topologique
avec le CTD de NusG est une première étape dans la recherche de compétiteurs potentiels de
l’interaction NusG-CTD:Rho. Un candidat notable issu de cette recherche par similitude
topologique est la protéine Hfq, un ribo-régulateur global dont les propriétés sont décrites
dans le chapitre III.
Dans l’article III, nous avons caractérisé en détail l’interaction entre Rho et Hfq et
montrons que celle-ci induit l’inhibition du facteur Rho et pourrait donc en réguler les
fonctions.
2. Articles
83
Article I. A stepwise 2’-hydroxyl activation mechanism for the
bacterial transcription termination factor Rho helicase
84
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90
91
“A stepwise 2’-hydroxyl activation mechanism for the bacterial
transcription termination factor Rho helicase”
(Documents additionnels)
92
93
94
95
Where λA, λC, λG, and λU are the discrimination factors
for the hybrids containing, respectively, an A, C, G or U
residue at the p position and i, j, m, and n are the numbers
of hybrids containing an A, C, G or U residue at this
position (i + j + m + n = 6). Note that we varied
nucleotide identities systematically for all the positions of
the RNA-DNA hybrid except for helix termini where we
used only doublets of G/C pairs to limit spontaneous
opening fluctuations. We optimized hybrid sequences to
level the representation of nearest-neighbor combinations
while insuring sufficient sequence variations for optimal
detection and quantitation of NAIM signals.
SUPPLEMENTARY METHODS
Quantification and analysis of interference signals. We
performed analysis of the interference signals as
described previously7,8 with minor modifications. Briefly,
we deduced NAIM effects from the intensities of
individual bands after normalization for differences in
loading of the gel lanes. We expressed the NAIM
interference (κ) at a given position as the ratio of
normalized band intensities that were obtained for this
position9:
κ = INαS(unreacted)/ INαS(unwound) for the
parental NαS modifications;
Analysis of NAIM data using Quantitative Structure
Activity/Property Relationships (QSAR/QSPR) and
autocorrelation
algorithms.
We
performed
autocorrelation analysis of the dNαS interference signals
within the DNA-RNA region with a LabVIEW- (National
Instruments, Austin, TX) based software routine.
Autocorrelations curves display a second maximum at
position ~7 (Fig. 4c) which is indicative of a periodicity
of ~7bp for the interference signals.
In an attempt to identify a correlation between the
interference values at specific positions and local and/or
global physico-chemical parameters, we performed
numerical analysis with tools originally developed for
Quantitative Structure Activity Relationships (QSAR)
studies (namely the TSAR software, from Accelerys, San
Diego, CA). While in QSAR, a correlation between a
biological activity and various physicochemical
parameters ('descriptors') of a chemical compound (or a
combination of them) is investigated, here we looked
after a correlation between the interference value at a
specific position, and physicochemical descriptors
associated with this specific position within its context
(QSPR approach). We selected the following descriptors:
global descriptors:
o
ke (rate constant of the exponential phase of
the helicase reaction for the hybrid)
o
Ae (amplitude of the exponential phase of the
helicase reaction)
o
klin (rate constant of the linear, steady-state
phase of the helicase reaction)
κ = [IdNαS(unreacted)/ IdNαS(unwound)] for the
whole 2'-deoxyNαS modifications;
κ
=
[IdNαS(unreacted)/
IdNαS(unwound)]/[INαS(unreacted)/ INαS(unwound)] for
only the 2'-deoxy modifications(Ortoleva-Donnelly et al.
1998) (purine and inosine effects were normalized
similarly).
A κ value > 1 indicates a nucleotide
modification that is detrimental to Rho-directed
unwinding of the RNA-DNA substrate whereas κ < 1
reveals a modification that favors strand separation (only
interference effects that were consistently observed in 2-3
independent experiments were considered significant). To
facilitate data analysis, we converted interference effects
into normalized λ discrimination factors7,8 as follows:
First, we excluded the κ values that were
outside a range comprised between 0.5 and 2 and
calculated the standard deviation, SD, on the reduced data
set. Then we defined a discrimination factor for every
κ value of the original data set as:
λ = (κ−1)/SD when κ > 1
λ = (1-1/κ)/SD when κ < 1
In this way, NAIM signals are normalized for varying
experimental qualities and compositions of the data
sets7,8. The λ discrimination factors also provide identical
intensity scales for favorable (λ < 0) and detrimental (λ >
0) effects7. We used conservative confidence intervals of
>98.8% and >99.9% to define moderate (2.5 < │λ│ <
3.5) and strong (│λ│ > 3.5) interference effects,
respectively.
o
local descriptors:
∆G[0] to ∆G[19], that is twenty different
parameters corresponding to the Gibbs free
energy of the RNA-DNA base pair (as given in:
10
), from position 0 to the downstream position
+19.
o
Tm(i) : the melting temperature of the RNADNA region between the interference position
and the end of the hybrid.
o
Stop(i): the number of base pairs between the
interference position and the end of the hybrid
(this parameter is somewhat redundant with
Tm(i)).
We excluded from the QSAR/QSPR search the
downstream interference signals for which some or all of
the local descriptors were equal to zero. We looked for
correlations between the local interference values and
each of the descriptors, or a combination of them. The
best linear combination of descriptors gave an overall
correlation coefficient of 0.54. The best individual
correlation was with the helicase amplitude, A, although
it was rather low (R = 0.28). Moreover, all
One should note that the number of distinct species
within the initial pool of substrates (e.g., substrates with a
NαS or dNαS modification at a given position) increases
with the number of substrate positions to be probed.
Because the conditions for helicase reaction and substrate
selection (including the ~20% extent of reaction) are kept
constant irrespective of the substrate length, the
abundances of a given species in the fractionated
populations (unreacted and unwound substrates) and,
thus, the signal/noise ratios for NAIM signals are
inherently lower for longer substrates (e.g., with more
positions to be probed).
To generate sequence-weighted NAIM signals for the
RNA-DNA region, we used the following formula:
λweighted (p) = 1/4i x ∑0→i [λA] +1/4j x ∑0→j [λC] +1/4m x
∑0→m [λG] +1/4n x ∑0→n [λU]
96
9.
Ortoleva-Donnelly, L., Szewczak, A.A., Gutell, R.R.
& Strobel, S. The chemical basis of adenosine
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Predict the Stability of RNA/DNA Hybrid Duplexes.
Biochemistry 34, 11211-11216 (1995).
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Inorganic phosphate content and free energy change
of ATP hydrolysis in regional short-term hibernating
myocardium. Cardiovasc Res 39, 318-26 (1998).
thermodynamic descriptors gave individual correlation
coefficients that were below 0.15 with the exception of
∆G[1] (R = 0.25), ∆G[2] (R = 0.25), ∆G[3] (R = 0.22),
and ∆G[10] (R = 0.20). Finally, neither the Principal
Component Analysis or Cluster Analysis built-in routines
gave a composite correlation that could have explained
quantitatively the variations on the amplitudes of the
interference signals.
ATP hydrolysis during RNA-DNA unwinding by Rho. In
control helicase experiments performed with the HybA
substrate, we added trace amounts of 32P-γATP to the
reaction mixture so that the extent of ATP hydrolysis
could be monitored concomitantly by thin-layer
chromatography, as described11. We found that no more
than ~3% of total ATP was hydrolyzed after 120 min of
incubation. Taking into account the purity of the rNTP
batches (>98%), we can therefore reasonably assume that
the concentrations of ADP and Pi stay in the 10 to 50 µM
range during the course of the helicase reaction. Under
these conditions, the energy available from ATP
hydrolysis is comprised between 15.1 and 17.1 kcal/mol
(using a standard free energy change for ATP hydrolysis
of -7.3 kcal/mol)12. This is significantly more than the
energy that is needed to unwind the ~7 bp of RNA-DNA
hybrid (~7 x 1.5 = 10.5 kcal/mol; Supplementary Fig. 4)
that, on average, separate consecutive 2'-OH-dependent
activation events.
REFERENCES FOR SUPPLEMENTARY
INFORMATION
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into RNA-Dependent Ring Closure and ATPase
Activation by the Rho Termination Factor. Cell 127,
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3. Skordalakes, E. & Berger, J.M. Structure of the rho
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recognition and helicase loading. Cell 114, 135-146
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(Wiley-VCH, Weinheim, 2005).
97
Article II. Mutagenesis-based evidence for an asymmetric configuration of the ringShaped transcription termination factor Rho
98
99
100
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117
Article III. The Sm-like RNA chaperone Hfq is potent inhibitor of the
transcription termination factor Rho
The Sm-like RNA chaperone Hfq is a potent inhibitor of the transcription termination
factor Rho
Makhlouf Rabhi,1,2 Olivier Espéli,3 Annie Schwartz,1 Bastien Cayrol,4,5 A. Rachid Rahmouni,1 Véronique Arluison,4,5,6
and Marc Boudvillain1,7
1
: Centre de Biophysique Moléculaire, CNRS UPR4301, rue Charles Sadron, 45071 Orléans cedex 2, France.
: Ecole doctorale Sciences et Technologies, Université d’Orléans, France.
: Centre de Génétique Moléculaire, CNRS UPR2167, Avenue de la Terrasse, 91198Gif sur Yvette, France.
4
: Laboratoire Jean Perrin; FRE 3231 CNRS-Université Paris 6, France.
5
: Laboratoire Léon Brillouin; UMR 12 CNRS, CEA Saclay, 91191 Gif sur Yvette, France.
6
: Université Paris Diderot-Paris 7, 75013 Paris, France.
7
: Corresponding author: +33 238 25 55 85 (phone); +33 238 63 15 17 (fax); [email protected]
2
3
(ARTICLE SOUMIS POUR PUBLICATION)
order to catch up with and dissociate RNAP with an
efficiency that is thought to depend on the relative Rho
and RNAP velocities (conditional “entry” and kinetic
competition model).7 Recent studies attempted to refine
this model, notably by proposing that Rho is biased
towards ‘foreign’ horizontally-acquired genes in E. coli4
or that Rho associates with RNAP throughout the
transcription cycle.8 A tight Rho-RNAP association is
supported indirectly by chromatin immunoprecipitation
experiments (ChIP-chip assay) showing analogous RNAP
and Rho distributions along transcription units.9 Such an
association raises the question of what regulates Rho
outside ORFs (notably during transcription of long leader
regions) when there is no ribosome trailing behind RNAP
to increase its processivity10 and prevent the mRNA from
associating with Rho.1,2 One possibility is that, as
observed during transcription of ribosomal rrn operons or
bacteriophage λ chromosome,1,11 accessory factors bind,
in a conditional manner, to RNA and/or the transcription
machinery to form an antitermination complex resistant
to Rho.
Antitermination complexes that resist to Rhodependent signals within rrn and λ operons contain the
same NusA, NusB, NusE (ribosomal protein S10), and
NusG factors as well as specific factors such as
bacteriophage N protein for λN antitermination1,11 or
ribosomal proteins (S2, S4, L1, L3, L4, and L13) and
other unidentified
cellular factor(s)
for
rrn
antitermination.11,12 Both rrn and λN antitermination
complexes are stabilized by elaborate networks of
interactions among their components that include binding
of a NusB-NusE heterodimer to a boxA sequence found
in the rrn and λ transcripts11 and binding of NusG to
RNAP through its N-terminal domain (NTD) and to
NusE through its C-terminal domain (CTD).1,13,14 The
bridge formed by NusG between RNAP and NusE (S10)
could also connect physically the ribosome and RNAP
during transcription of ORFs, thereby occluding the
nascent RNA to Rho.13 Thus, the interaction between
NusE and NusG-CTD13 seems critical to protect the
transcription machinery from Rho under various contexts.
Importantly, NusG can also bind Rho through its
CTD13,14 and stimulates Rho-dependent termination.15-17
Regulatory plasticity is thus provided by NusG which
uses its NTD to bind RNAP and its CTD to bind Rho or
NusE in a mutually exclusive fashion.13,14
Although NusG is abundant in E. coli ( 1-2 x 104
molecules/cell),15 ChIP-chip distributions suggest that it
associates slowly with transcribing RNAPs.9 The NusG
binding site on RNAP-bound Rho8 may thus be occupied
by other factor(s), which could contribute to delay NusG
ABSTRACT
Essential transcription termination factor Rho and
RNA chaperone Hfq are micromolar, pleiotropic
effectors of RNA metabolism in Escherichia coli.
Here, we show that Hfq displays structural homology
with host proteins NusG and YaeO and, like them,
associates with Rho (Kd ~ 50 nM) to regulate its
function. The Hfq:Rho complex can be further
stabilized by RNA bridging both factors in a
configuration that impedes Rho function and that
mediates transcription antitermination at Rhodependent terminators in vitro and in vivo.
Antitermination at a prototypical terminator (λ
λtR1)
requires Hfq binding to an A/U-rich transcript region
directly upstream from the terminator and is
modulated by cis- or trans-acting factors (including
NusG and nucleic acid competitors) that affect Hfq
association with Rho or RNA. These data unveil a new
transcription antitermination mechanism with
potentially important implications in bacterial RNA
metabolism, gene silencing, and/or pathogenicity.
INTRODUCTION
RNA biosynthesis is a fundamental process that is often
regulated during the various phases of transcription as a
function of other RNA metabolism transactions. In
Escherichia coli, for instance, the synchronized
translation of mRNAs’ open reading frames (ORFs) by
ribosomes during their synthesis by RNA polymerase
(RNAP) protects the transcription machinery from
destabilization by Rho,1-3 an essential2,4 and abundant
(~103 hexamers/cell)5 ring-shaped, homo-hexameric
protein motor. Rho has generic ATP-dependent [5’→3’]
RNA translocation, duplex unwinding, and protein
displacement activities that it most likely uses to disrupt
transcription elongation complexes at untranslated loci of
the
bacterial
genome,
termed
Rho-dependent
terminators.1-3 An estimated fifth of E. coli’s transcription
units (encoding genes and non-coding RNAs) are
subjected to Rho-dependent termination.6 Rho also
attenuates gene expression by promoting intracistronic
transcription termination whenever mutations or
environmental conditions perturb the coupling of
translation with transcription.1,2
The classical model for Rho-dependent termination
posits that Rho first binds to ~70 nucleotide (nt)-long
naked regions of nascent transcripts (i.e., deprived of
bound proteins or ribosomes), preferentially at
unstructured C-rich/G-poor Rut (Rho utilization) sites.1,2
Then, Rho translocates towards the transcript’s 3’-end in
118
association9 and to repress Rho during transcription of 5’leader regions. To test this hypothesis, we sought Rho
partners exhibiting structural homology with NusG-CTD
within the E. coli “interactome” that has been established
by global tag affinity purification and mass spectrometry
identification approaches.18,19 We found several proteins
that may bind Rho in a manner similar to NusG-CTD.
One intriguing candidate is Hfq, a Sm-like protein with
RNA-chaperone activity which forms stable, homohexameric rings having opposite polyA- and polyUbinding faces (Fig. 1a).20 In E. coli, Hfq is about as
abundant (~104 hexamers/cell)20 as NusG and is
associated with components of the ribosome, RNAdegradosome, and RNAP.18-21 Hfq also exhibits structural
homology with YaeO (Fig. 1b, left),22 the only cellular
protein that, to our knowledge, is known to bind and
inhibit Rho directly.23
Hfq is a post-transcriptional regulator and virulence
factor in E. coli and other bacteria where it mediates gene
silencing events by facilitating pairing of small, noncoding RNAs (sRNAs) with their mRNA targets.20,24,25
Hfq-mediated formation of sRNA-mRNA duplexes
usually occurs near translation start sites and affects
mRNA translation and/or decay.20,24,25 Hfq is also
involved in other aspects of RNA metabolism in ways
that are not completely understood, yet do not seem to
implicate sRNAs.20,24 For instance, Hfq modulates the
levels of several mRNAs in E. coli using an unresolved
transcriptional mechanism.26
Here, we show that Hfq associates stably with Rho
and inhibits its ATP hydrolysis, duplex unwinding, and
transcription termination activities. Consistent with these
observations, transcription termination at the prototypical
Rho-dependent λtR1 terminator is stronger in a hfq null
mutant than in wild-type (WT) E. coli. In vitro, Hfqmediated antitermination requires the interaction of Hfq
with both Rho and RNA transcript and can be repressed
by the addition of NusG, an A-rich oligomer, or an
oligonucleotide that pairs with a specific region of the
transcript upstream from the λtR1 Rut site. Our data
unveil a new transcriptional antitermination mechanism
that depends on the trapping of the Rho-RNA complex
into an inactive configuration by the bound Hfq. They
also reveal a complex interplay between key players of
bacterial RNA metabolism and suggest that Rhodependent transcription termination could contribute to
sRNA-dependent gene silencing and/or control of
virulence.
Figure 1: Proteins interacting with transcription termination
factor Rho. (a) Model of the Hfq hexamer with r(AUUUUUG)
(in cyan) and r(A)9 (in magenta) oligomers bound to its
proximal and distal faces, respectively. The model has been
built by structural alignment of two distinct crystal structures of
RNA-bound Hfq (PDB #3GIB and #1KQ2)39,58 using
TopMatch.28 Tyr25 residues stacking on adenine bases are
shown in yellow. (b) TopMatch topological similarity among the
Hfq (white and magenta), YaeO (grey and orange) and NusGCTD (black and blue) peptides. Representative SDS-PAGE gels
show Ni-NTA pulldown experiments with “bait” his6Hfq (c) or
his6NusG (d) and “prey” Rho proteins. Note that Hfq hexamers
are only partially denatured by SDS-PAGE.
antitermination11 and can, on its own, decrease Rhodependent transcription termination.12 This effect may
thus result from L3 association with Rho, although this
conjecture has never been tested. Hfq is also implicated
in transcriptional regulation, although underlying
mechanisms remain unsolved.26 Because Hfq is abundant
in E. coli and has multiple, important roles in bacterial
RNA metabolism,20,24,25 we hereafter focus on its
partnership with Rho.
Hfq forms a stable binary complex with Rho
Global analyses of E. coli’s interaction network revealed
that Rho and Hfq associate in the same protein
complexe(s) in vivo.18,19 To determine if they can
associate directly in absence of other factors, we
performed “pull-down” trials on Ni-NTA agarose beads
with purified Rho and hexahistidine-tagged Hfq (his6Hfq).
We used a “low adsorption” binding and washing
procedure (see methods) whereby his6Hfq stably
associates with the beads (Fig. 1c, lane 3) whereas Rho
alone does not (lane 5). When the beads, Rho, and his6Hfq
are incubated together, however, a significant fraction of
Rho is recovered with the beads (Fig. 1c, lane 4). Polyhystidine did not promote Ni-NTA pull-down of Rho
(data not shown), excluding that Rho binds the his6-tag
on Hfq. Thus, Rho and Hfq can form a genuine binary
complex. Under the same experimental conditions, Rho
also forms binary complexes with his6-tagged NusG (Fig.
RESULTS
Topological similarity among Hfq, L3, GssA, YaeO,
and NusG proteins
We used the distinct DaliLite27 and TopMatch28
comparison algorithms to seek structural homologs of
NusG-CTD (PDB# 2JVV) within proteins associated to
Rho in the E. coli interactome.18,19 Published structures
allowed comparisons for ~75% (36/48) of these putative
Rho partners (Supplementary Table 1). Both searches
indicated that only Hfq, ribosomal protein L3, and
Glutathionylspermidine
synthetase/amidase
(GssA)
display significant structural homology with NusG-CTD
(Z-score > 2; Supplementary Table 1). These proteins
also display topological similarity among themselves or
with Rho’s inhibitor YaeO (Fig. 1b; Supplementary Table
2).22 The function of GssA is obscure29 and, to our
knowledge, has never been linked to transcriptional
regulation. In contrast, L3 contributes to rrn
119
1d, lane 4) and YaeO (Supplementary Fig. 1a),
confirming previous observations.23,30
Hfq inhibits Rho-dependent transcription termination
in vitro and in vivo
To determine if Hfq binding affects Rho activity, we
performed in vitro transcription experiments with E. coli
RNAP and DNA template pT7A1-λcro which contains a
region of the λ chromosome encompassing the cro ORF
and Rho-dependent tR1 terminator (Fig. 2a, schematic).31
With this template, Rho triggers efficient transcription
termination at canonical release sites I, II and III (Fig. 2a,
lane 2).31,32 The presence of bicyclomycin (Bcm), an
antibiotic that specifically inhibits Rho,2 induces
complete read-through of the tR1 terminator by RNAP
(Fig. 2a, lane 1). Similarly, Hfq represses Rho-dependent
termination at λtR1 in a dose-dependent fashion (Fig. 2a,
lanes 3-6 and graph). This effect is observed whichever
the order of addition of reactants, including when Hfq is
added with the mix of NTPs after open transcription
initiation complexes have formed (data not shown).
Similar observations were made with the distinct
trpt’ terminator (compare lanes 2, 4, and 5 in
Supplementary Fig. 2), suggesting that Hfq-mediated
read-through of Rho-dependent terminators has general
relevance. However, Hfq does not trigger efficient
antitermination with phylogenetically-distinct Rho from
Mycobacterium tuberculosis (Supplementary Fig. 3), a
bacterium without Hfq homolog.33 Moreover, Hfq has no
effect on transcript release induced by the Rhoindependent rrnB T1 terminator nor affects pausing of
RNAP along the pT7A1-λcro template (data not shown).
Thus, Hfq most likely promotes antitermination at Rhodependent terminators by a mechanism involving a
genuine Hfq-Rho interaction but without changing RNAP
sensitivity to other signals regulating transcription
elongation.
YaeO induces a comparable inhibition of Rhodependent termination (Supplementary Fig. 1b, lanes 48). However and in contrast to Hfq, the antitermination
activity of purified YaeO declined rapidly upon time
(data not shown) which probably explains why it was not
detected previously.23 Because we could not find
conditions limiting YaeO inactivation, we did not study
its antitermination properties further.
To determine if Hfq also triggers antitermination in
vivo, we constructed an artificial operon to measure
cellular transcriptional readthrough of the tR1 terminator.
The operon contains the temperature-inducible cl857ts
promoter upstream from lacZ and cat genes and from
sequences encoding tRNAarg5 and a Rho-independent
terminator (croUPnt operon; Fig. 2b) and is carried by a
low-copy replicon.34 The tR1 terminator and upstream
cro coding sequences are inserted between the lacZ and
cat genes in croUPnt (Fig. 2b). This insert lacks
canonical Shine-Dalgarno sequence and initiation codon
so that both tR1 termination and potential Hfq-mediated
antitermination can be studied independently from cro
translation. Cellular croUPnt expression is induced
transiently by a temperature shift while synthesis and
accumulation of the mature tRNAarg5 are used to measure
read-through of the upstream tR1 terminator (see
methods; ref. 34 and references within).We first measured
tRNAarg5 accumulation from croUPnt in E. coli strain
Figure 2: Hfq-mediated transcriptional antitermination. (a) Effect of Hfq
on in vitro Rho-dependent transcription termination at the tR1
terminator. The composition of the DNA template (pT7A1-λcro) used in
the single-cycle transcription experiments is schematically depicted on
top of the panel. Gel bands corresponding to transcripts terminated at the
canonical sites I, II, and III and to RNAP read-through of the terminator
(Run-off transcripts) in presence of 70 nM Rho are identified by
arrowheads on the left side of the gel. The graph shows the global
termination efficiency (sites I, II, and III) as a function of Hfq
concentration. (b) A schematic of the reporter operon used in in vivo
experiments. Hfq also reduces Rho-dependent tR1 termination in vivo, as
evidenced by northern blots showing tRNAarg5 and 5S RNA accumulation
in hfq+ (c) or hfq- (d) cells carrying plasmid pOM10cI (Control operon
without cro-tR1 insert between lacZ and cat genes) or pOM10cI-croUPnt
(croUPnt operon). Total RNA was extracted from two different cultures in
each case. Blots were successively hybridized with tRNA arg5 and 5S RNA
probes. Blots separated by dotted lines are from the same membranes and
were phosphor-imaged simultaneously. Histograms show normalized
tRNAarg5 amounts (mean ± error from 4-6 independent samples) in cells
carrying the pOM10cI-croUPnt (croUPnt) plasmid. In each case,
normalization assumes that 100% of tRNAarg5 is formed in the strain
carrying the control pOM10cI plasmid. (e) Ectopic Hfq expression from a
promoter-inducible plasmid (pBAD-Hfq)36 restores transcriptional
antitermination in hfq- cells. Hfq expression was induced by addition of
0.01% arabinose (+Ara) to the culture media. Conditions for northern
blots and tRNAarg5 normalization are as in panels c,d. Note that Hfq
expression from pBAD-Hfq is not totally shut-off in the repressed state.36
120
Figure 3: NusG counteracts Hfq-mediated transcriptional antitermination at the tR1 terminator. A representative gel shows in vitro
transcription termination experiments performed with the pT7A1-λcro template (Fig. 2a) in presence of 210 nM Hfq (+ lanes) and the
various amounts of NusG indicated above gel lanes. The graph shows the global termination efficiency (sites I, II, and III) as a function of
NusG concentration.
MC4100 (hfq+). As shown in figure 2c, there is ~40%
less tRNAarg5 in cells carrying the croUPnt operon than in
cells carrying the parent operon without cro-tR1 insert
(Control). Addition of Bcm to culture media at the time
of induction eliminates this difference (~100% tRNAarg5
with croUPnt and 25 mg/L Bcm; Fig. 2c). These results
are consistent with tRNAarg5 accumulation from croUPnt
being controlled by Rho-dependent tR1 termination.
Interestingly,
tRNAarg5
accumulation
decreases
significantly upon cro deletion from the reporter operon
(RutA-B construct; Supplementary Fig. 4), suggesting
that the untranslated cro region mitigates Rho action.
We performed similar experiments in a hfq null
strain (hfq-).35 The relative accumulation of tRNAarg5
from croUPnt is reduced in hfq- (Fig. 2d) when compared
to that in hfq+ (Fig. 2c). Although addition of Bcm to the
media still increases tRNAarg5 accumulation from
croUPnt, the effect is smaller than in hfq+ (compare
histograms in Fig. 2c,d). Thus, Rho-dependent tR1
termination with croUPnt seems more robust in absence
of Hfq. This was confirmed by the increase of tR1 readthrough observed upon ectopic expression of Hfq (from
pBAD-Hfq plasmid)36 in hfq- (Fig. 2e). Altogether, these
results demonstrate that Hfq can also inhibit Rhodependent termination in vivo. Moreover, tRNAarg5
synthesized from the RutA-B operon accumulates in
similarly low amounts in hfq+ or hfq- or if Hfq is
expressed from pBAD-Hfq (Supplementary Fig. 4). This
suggests that Hfq needs the untranslated cro region to
trigger efficient tR1 antitermination with croUPnt.
NusG does not totally displace Hfq from Rho, that the
Hfq-Rho and NusG-Rho complexes are in dynamic
equilibrium, or that Hfq and NusG bind Rho
simultaneously during transcription.
Hfq inhibits Rho’s ATPase and helicase activities
To define which step of Rho motor function is targeted
by Hfq, we probed the effect of Hfq on Rho-directed
RNA-DNA unwinding.2 Standard multiple-cycle helicase
experiments38 were performed with a synthetic RNADNA construct bearing the tR1 terminator upstream from
a 21-bp duplex target (tR1RNA/D21; Fig. 4a, schematic).
Hfq inhibits Rho-directed unwinding of tR1RNA/D21 in a
dose-dependent fashion (Fig. 4a). This shows that Hfq
can affect Rho in absence of RNAP and suggests that
Hfq-mediated antitermination is not due to a direct
interference with the Rho-RNAP contacts triggering
termination.8 Similar helicase experiments were
performed with a shorter, unrelated substrate that
contains a synthetic Rut site38 upstream from a 23-bp
RNA-DNA duplex. Although Hfq also reduces Rhodirected unwinding of this substrate, the effect is weaker
than with tR1RNA/D21 (Supplementary Fig. 5). This
observation further supports that Hfq requires specific
RNA region(s) to inhibit Rho optimally.
Next, we measured Rho’s poly[rC]-dependent
ATPase activity2 in presence of Hfq. We observed that
Hfq does not affect Rho’s ATPase under these conditions
(Fig. 4b, dotted line). If tR1RNA replaces poly[rC] as the
activating cofactor, however, Hfq inhibits Rho’s ATPase
in a dose-dependent fashion (Fig. 4b, black circles and
lines) mimicking that observed for tR1RNA/D21
unwinding (Fig. 4a, graph). Thus, Hfq can inhibit all the
enzymatic activities of Rho (transcription termination,
duplex unwinding, and ATP hydrolysis) but this
inhibition depends on the nucleic acid cofactor. This
dependence may stem from stabilization of the Hfq-Rho
complex by the cofactor. Indeed, a higher fraction of Rho
is retained with his6Hfq on Ni-NTA beads in presence of
tR1RNA (Fig. 1c, compare lanes 4 and 6), while both
Rho and Hfq form stable complexes with tR1RNA (Fig.
5a, lanes 2 and 3). By contrast, poly[rC] oligomers are
very poor ligands for Hfq,20,39 although they bind and
activate Rho.2 Thus, Hfq probably needs to bind RNA to
inhibit Rho efficiently.
NusG does not affect Hfq-mediated inhibition of
Rho’s ATPase and helicase activities (data not shown)
which contrast with its antagonistic effect on Hfqmediated antitermination (Fig. 3a; Supplementary Fig. 2).
This difference may be due to the local, effective NusG
concentration which, in absence of stabilizing RNAP
contacts with NusG-NTD,1,14 may not be sufficient to
NusG represses Hfq-mediated antitermination
We tested the combined effect of Hfq and NusG on Rho
in transcription termination experiments with the pT7A1λcro template in vitro. In absence of Hfq, NusG weakly
activates promoter proximal termination sites that are not
normally used by Rho (Fig. 3, compare lanes 1 and
2).15,16,31 In presence of Hfq, however, NusG has a larger
effect and restores tR1 termination in a dose-dependent
fashion (Fig. 3, lanes 4-10). Similar observations were
made with the trpt’ terminator (Supplementary Fig. 2,
lanes 6-8). Maximal recovery effects are reached with 70
nM NusG (Fig. 3; Supplementary Fig. 2), i.e. at a ratio of
one NusG monomer per Rho hexamer in the transcription
mixtures. This effective stoichiometry is the same as that
of the Rho-NusG complex formed at equilibrium (Kd ~
15 nM)37 and is not dependent on the order of addition of
the transcription components (data not shown). Thus,
repression of Hfq-mediated antitermination by NusG is
likely due to its canonical interaction with Rho. This
repression is not total (Fig. 3, compare lanes 7-10 with
lanes 1-2; see also Supplementary Fig. 2), suggesting that
121
Figure 4: Effect of Hfq on Rho’s RNA-DNA unwinding (a) and ATPase (b) activities. A schematic of the tR1RNA/D21 duplex used in helicase
experiments is presented in panel a together with representative helicase gels and a graph showing the effect of Hfq on tR1RNA/D21
unwinding. The tR1RNA sequence is provided in Supplementary Fig. 5.
ternary complex (see above). Using data in figure 5b and
fluorescence quenching titrations with Cy3-labelled Hfq
(Supplementary Fig. 6), we estimate the Kd for the
Rho:Hfq interaction at ~50 nM without RNA.
Formation of a ternary Hfq:Rho:dC34 complex (Fig.
5b) contrasts with the effect of YaeO which
competitively displaces dC34 from Rho (Supplementary
Fig. 1c).22 Thus, despite their topological similarity and
affinities for Rho (Fig. 1; Supplementary Fig. 1b),22,23
YaeO and Hfq use distinct mechanisms to inhibit Rho.
antagonize Hfq. The Hfq vs. NusG competition may thus
be tuned by Hfq and NusG contacts with, respectively,
the transcript and RNAP. In any case, our data support
that NusG can only regulate Rho in the context of
bacterial transcription.2
Hfq does not prevent Rho binding to RNA
Formation of a catalytically-competent Rho-RNA
complex is an elaborate process implicating two distinct
binding sites on Rho.2 On the hexamer’s N-terminal
facet, the primary binding site (PBS), which
preferentially binds single-stranded, YC-rich RNA or
DNA (Y being a pyrimidine),2 anchors Rho to transcripts
at Rut sites. Once bound to Rho’s PBS, RNA must enter
inside the hexamer ring to associate with secondary
binding site components and activate Rho.2
Using a gel retardation assay, we found that Hfq and
Rho bind tR1RNA comparably well (Fig. 5a, complexes
C1 and C2, respectively). Incubation of tR1RNA with
both Rho and Hfq yields a band super-shift consistent
with formation of a ternary tR1RNA:Rho:Hfq complex
(Fig. 5a, complex C3). To ensure that Hfq does not
perturb Rho anchoring to its substrate, we used a dC34
oligonucleotide which should not bind Hfq.20,39 This was
verified by the absence of gel shift of the band
corresponding to 32P-labeled dC34 incubated in presence
of up to 3 µM Hfq (Fig. 5b, lanes 1-5). Although dC34
cannot activate Rho, it binds its PBS efficiently,22,40 as
evidenced by the shift of the 32P-labeled dC34 band in
presence of 50 nM Rho (Fig. 5b, lane 6). A super-shift of
this band in presence of Rho and Hfq (Fig. 5b, complex
C3 in lanes 7-10) confirms that both proteins associate
directly (see Fig 1c and above). However, a higher
concentration of Hfq is required to form a ternary
complex with dC34 than with tR1RNA (Fig 5a,b),
confirming that Hfq contacting RNA further stabilize the
Figure 5: Interactions within the ternary Hfq:Rho:RNA
complex assessed by equilibrium band-shift assays.
Representative gels show that: (a) both Rho (20 nM) and Hfq
(50 nM) interact with tR1RNA to form a ternary complex; (b)
Hfq (concentrations indicated above gel lanes) interacts with
the Rho-dC34 complex. Rho concentration was 20 nM (+ lanes).
122
Figure 6: Identification of the Hfq
binding region in tR1RNA. (a)
Secondary structure of the relevant
tR1RNA region based on RNase
probing (Supplementary Fig. 7) and
Several
mfold
computation.59
ambiguous RNase cleavages and
structural constraints that could not
be accounted for by the model
suggest that regions 20-50 and 100140
can
adopt
alternative
conformations. Sites protected by Hfq
from digestion with the RNases are
identified by symbols (key is inset)
and blue letters. Pairing of the
Anti93-112
oligonucleotide
is
depicted by an arrow. Nucleotides in
region 165-175 that are protected by
Hfq from digestion with RNase T2
(blue lines) could not be identified
precisely. (b) The antitermination
activity of Hfq is suppressed by the
presence of oligonucleotide Anti93112.
poly[rA] or poly[rU]. These polymers do not affect tR1
termination in absence of Hfq (Fig. 7a; lanes 2-4 and 810). However, poly[rA] is a strong suppressor of Hfqmediated antitermination (Fig. 7a, compare lanes 6-7
with lane 5) whereas poly[rU] is not (lanes 11-13).
Poly[rA] also protects Rho-directed tR1RNA/D21
unwinding from inhibition by Hfq whereas poly[rU] does
not (Fig. 7b). An rA20 oligomer likewise suppresses Hfq
inhibitory effects (data not shown). These data suggest
that components on the distal, polyA-binding face of Hfq
(Fig. 1a) mediate Rho inhibition. To precise the origin of
this mediation, we performed gel shift experiments with
32
P-labelled dC34, Rho, Hfq, and rA20. As shown in figure
7c, rA20 prevented formation of the dC34:Rho:Hfq
complex (C3 species) in a dose-dependent fashion (lanes
5-8), although it did not affect the binary dC34:Rho
complex (lane 9). Because Hfq does not associate with
dC34 (see above; Fig. 7c, lane 2), these results strongly
suggest that Hfq binds Rho through its distal face.
We performed similar experiments with a Hfq
mutant, Y25A, which binds polyA oligomers ~100 times
less efficiently than WT Hfq.43 Y25A and WT Hfq form
equally stable complexes with tR1RNA (Supplementary
Fig. 8a, lanes 1 and 4), confirming that nucleotides other
than adenines contribute to the tR1RNA-Hfq interaction
(see above and Fig. 6a). However, Y25A does not
associate with the dC34:Rho complex at testable protein
concentrations (Supplementary figure 8b, lanes 6-10).
Thus, distal face’s Y25A mutation dramatically weakens
Hfq interaction with Rho. The decrease in affinity of
Y25A for poly[rA] is ascribed to the loss of stacking of
Tyr25 residues onto adenines (Fig. 1a, Tyr25 residues in
yellow).39 Similar stacking contact(s) between Tyr25
residue(s) on Hfq and aromatic side-chain(s) on Rho may
stabilize the interaction between both proteins. Consistent
with a defective interaction with Rho, Y25A has weaker
antitermination activity than WT Hfq and is easily
outcompeted by NusG (Supplementary Fig. 8c). Yet, the
antitermination activity of Y25A is suppressed by rA20 or
poly[rA] (Supplementary Fig. 8d and data not shown),
suggesting that, although weakened, inhibitory contacts
Hfq binds to an upstream A/U-rich region of tR1RNA
Rho binds two subsites (RutA and RutB) within tR1RNA
(Fig 4a; ref. 41 and references therein). To identify Hfq
binding site(s), we performed digestions of 32P-end
labelled tR1RNA with RNases A, T2, and V1. Hfq
protects specific regions of tR1RNA from cleavage with
the RNases (Supplementary Fig. 7). Hfq “footprints”,
which are summarized on the secondary structure of
tR1RNA (Fig. 6a), identify an A/U-rich cro region
upstream from RutA as the major Hfq binding site (blue
nucleotides). Protections of RutB nucleotides from RNase
T2 cleavage (Fig 6a, blue lines) also suggest that Hfq has
some affinity for this region, which may contribute to
inhibit Rho.
To verify that the major Hfq binding site is
important for Hfq-mediated antitermination, we
performed transcription termination experiments in
presence of U-rich oligonucleotide Anti93-112 which
should pair with tR1RNA and disrupt helices I and III
(fig. 6a, black arrow). As shown in figure 6b, Anti93-112
stimulates (lanes 6-10) or reduces (lanes 3-4) Rhodependent termination depending, respectively, on
whether Hfq is present or not in the transcription mixture.
Moreover, Hfq no longer affects termination when
Anti93-112 is present at a high concentration (Fig. 6b,
graph). These effects could not be recapitulated with
poly[rU] or an oligonucleotide that is not complementary
to tR1RNA (see below and data not shown). These data
show that: 1) perturbing tR1RNA folding (upon pairing
of Anti93-112) affects Rho function, possibly by
modulating access to Rut sites;42 2) nucleotide
availability and/or structural integrity of the major A/Urich Hfq binding site are important for the antitermination
activity of Hfq. Regions preceding and encompassing the
RutA-B sites of the trpt’ transcript are also strongly A/Urich (Supplementary Fig. 2) and may similarly befit Hfq,
although we did not test this prediction explicitly.
Antitermination involves components on Hfq distal
face
To determine if the RNA binding faces of Hfq (Fig. 1a)
mediate its antitermination activity, we performed
transcription termination experiments in presence of
123
Figure 7: Interaction with the distal, polyAbinding face of Hfq is critical for Rho inhibition.
(a) Effect of polynucleotides (concentrations in
nucleotides are indicated above gel lanes) on
Hfq-mediated transcription antitermination at
λtR1 in presence of 70 nM Rho. In vitro
transcriptions were performed with the pT7A1λcro template (Fig. 2a) and Hfq (+ lanes)
present at a concentration of 210 nM. Global
termination efficiencies (Term) are indicated
below gel lanes. (b) Effect of the polynucleotides
(900 nM, in nucleotides) on Rho-directed
unwinding of the tR1RNA/D21 duplex. The
concentrations of Rho and Hfq (in selected
samples) were 20 nM and 210 nM, respectively.
(c) Oligomer rA20 prevents the association of
Hfq with the binary Rho-dC34 complex. Assay
conditions are as in Fig. 5b. (d) Oligomer rA20
does not displaces Hfq from tR1RNA whereas
poly[rA] does.
between Rho and Y25A still form in the antitermination
complex. Poly[rA] but not rA20 precludes tR1RNA
binding to Y25A and WT Hfq in equilibrium binding
assays (Fig. 7d and data not shown). This strong
competitor may thus suppress the antitermination activity
of Y25A and WT Hfq by preventing both Rho and RNA
binding
to
Hfq.
Furthermore,
Hfq-mediated
antitermination at the trpt’ terminator is suppressed by
rA20 and poly[rA] but is also moderately affected by
poly[rU] (Suplementary Fig. 9). Thus, Hfq-dependent
antitermination can vary with both cis- and trans-acting
components and upon their matching combination.
Rho and to trigger antitermination at Rho-dependent
terminators (Supplementary Fig. 1).23 Although YaeO
and Hfq display topological similarity (Fig. 1b;
Supplementary Table 2),22 they use distinct mechanisms
to inhibit Rho: YaeO displaces C-rich oligomers from
Rho’s PBS22 whereas Hfq does not (Fig. 5b). Two
additional host proteins, GssA and L3, are candidate Rho
inhibitors similar to YaeO or Hfq. Indeed, GssA and L3
associate with Rho in the E. coli interactome18,19 and
display topological similarity with NusG-CTD, Hfq,
and/or YaeO (Supplementary Table 2). Moreover, L3 is a
component of rrn antitermination complexes and alone
can decrease Rho-dependent termination in vitro.12
Both GssA and YaeO are dispensable in E. coli,46
suggesting that their, respectively, hypothetical or
proven23 antitermination activities are accessory.
Although YaeO is expressed in E. coli,47 its association
with Rho was undetected in global analyses of the
cellular interactome.18,19 This may be due to its fast
inactivation in vitro (see results) or may indicate that the
YaeO-Rho complex forms only under specific conditions
in vivo. By contrast, Hfq, a very abundant, stable protein
in E. coli,20 was consistently associated to Rho in the
cellular interactome.18,19 This suggests that a functional
Rho-Hfq interaction is frequent in E. coli, although
targeted
transcription
units
remain
unknown.
Remarkably, mRNA levels are reduced for a majority of
genes affected in hfq- (including rho and other known
Rho-dependent genes)48 which, besides increased
RNaseE cleavages,49 may underscore unrestrained Rho
activity. Our data with the croUP operon (Fig. 2b) show
that Hfq can increase read-through of Rho-dependent
terminators in vivo (Fig. 2c-e). This is highly significant
given that conditions for terminator read-through may not
have been optimal with our in vivo reporter system. For
instance, we did not probe the effect of Hfq on croUP
transcription independently from that of NusG, yet NusG
reduces Hfq-mediated antitermination in vitro (Fig. 3;
Supplementary Fig. 2). Thus, it is possible that
antitermination is maximized in vivo when NusG cannot
counter Hfq. This could be the case during synthesis of
mRNA leader regions (Fig. 8a) when NusG has not yet
associated with RNAP9 or during synthesis of ORFs
when NusG-CTD binds S10 rather than Rho (Fig. 8b).13
DISCUSSION
In E. coli, the elongation of transcripts by RNAP is often
terminated by Rho,4,6 an essential ring-shaped protein
motor.2 Rho-dependent termination relies on multiple
interactions among Rho, RNA, RNAP, and cofactor
NusG which are regulatory targets for transcription
factors, some remaining unidentified.1,11 In search for
new host inhibitors of Rho, we found that Hfq, a protein
displaying topological similarity with NusG-CTD (Fig.
1b; Supplementary Table 1), can associate with Rho (Fig.
1c; Supplementary Fig. 6) and inhibit all of its enzymatic
activities (Fig. 2 and 4). Yet, Hfq does not simply perturb
Rho allosterically since it cannot inactivate Rho if the
RNA cofactor is a poor Hfq ligand (poly[rC]; Fig. 4b).
Conversely, Hfq inhibits Rho if the cofactor contains
Hfq-preferred A/U-rich regions,20 as in tr1RNA or trpt’
transcript (Fig. 2 and 4; Supplementary Fig. 2 and 5).
Inhibition requires Rho interaction with Hfq’s distal face
(Fig. 7c) and Hfq binding RNA near Rut sites (Fig. 6).
Primary Rho and Hfq interactions with RNA co-stabilize
the ternary Rho:Hfq:RNA complex (Fig. 1c and 5).
Altogether, these features suggest that bound Hfq
precludes productive Rho-RNA configuration(s).2
Topological constraints in the Rho:Hfq:RNA complex
may, for instance, impede conformational rearrangements
driving RNA inside the central Rho channel.44,45
Protein factors known to bind Rho to repress its
function are rare. On one hand, the coat protein Psu from
bacteriophage P4 binds Rho and alters its capacity to
utilize ATP.40 On the other hand, YaeO is, to our
knowledge, the only other host protein known to bind
124
Figure 8: Possible contexts for Hfq-mediated antitermination. (a) Hfq may be required to repress Rho-dependent termination optimally
during transcription of long (> 70 nt) leader regions. (b) Hfq may contribute to Rho inactivation in the tandem transcription/translation
complex. Scavenging of NusG-CTD by S10 (NusE) and occlusion of RNA by the ribosome are also likely important factors.13 (c) Uncoupling
of translation from transcription may activate Rho-dependent termination by allowing NusG-CTD to bind Rho and by helping it to form a
productive complex with RNA upon disruption of the Hfq-Rho interaction. These events may also signal for degradation of the mRNA.
MATERIALS AND METHODS
Materials. We purchased chemicals, oligonucleotides,
and Sigma-saturated E. coli RNAP from SigmaAldrich,Eurogentec, and Epicentre Biotechnologies
respectively. We obtained poly[rA], poly[rC], and
poly[rU] from GE-Healthcare and Midland CRC (USA).
We obtained MC4100∆Hfq strain (hfq-)35 and pBAD-Hfq
plasmid36 from M. Soukhodolets (University of Lamar,
TX) and N. Majdalani and S. Gottesman (NCI, NIH,
MD), respectively.
We prepared the DNA templates for transcriptions
with T7 or E. coli RNAP by PCR amplification of
custom-made DNA fragments described previously31 or
purchased from GenScript (USA). We prepared plasmid
pOMcI-croUPnt by subcloning the PCR-amplified region
of λDNA (Invitrogen) encoding the cro ORF (minus first
codon) and tR1 terminator into the filled-in BamHI site of
previously described plasmid pOM10cI.34 We followed
published procedures55 to prepare the RNA-DNA
constructs used in helicase experiments.
We prepared micromolar solutions of Rho as
described previously.55 We over-expressed his-tagged
variants of NusG , YaeO, and M. tuberculosis’ Rho in
BL21(DE3) cells harboring, respectively, the pIA247
(kindly provided by I. Artsimovitch, Ohio State
University), pET15b-YaeO (kindly provided by K.
Gehring, McGill University), or pET28b-mtbRho (kindly
provided by R. Sen, CDFD-Hyderabad, India) plasmid
and purified them as described previously.22,30,56 We
stored Rho and NusG at -20°C in storage buffer (100 mM
KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.9, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM
DTT and 50% glycerol). The inhibitory activity of YaeO
declined rapidly upon storage whichever the buffer and
temperature conditions that were tried. Experiments
described herein were thus performed with YaeO
preparations that were not older than 2-3 days. We
prepared his-tagged Hfq as described previously,57
excepted that the polyA affinity purification step was
replaced by strong anion-exchange chromatography on a
Mono Q HR5/5 column (GE Healthcare). We stored Hfq
at 4°C in 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA, 10%
glycerol, and 50 mM NH4Cl. We express Rho and Hfq
concentrations in hexamers throughout the manuscript.
Hfq association with RNAP and ribosomal proteins18-21
suggests that Hfq may travel with the tandem
translation/transcription complex and contribute to readthrough of ORFs by binding and inactivating Rho within
it (Fig. 8b). The antitermination activity of the tandem
complex may therefore be multi-factorial (Fig. 8b), as
certainly is the case for the composite rrn and λN
antitermination complexes (recurrence of boxA-like
sequences in Rho-dependent terminators3 and binding of
Hfq-RNAP mediator S1 protein21 to boxA RNA50 further
suggests a commonality of mechanisms).1,11 Interestingly,
disruption of the tandem complex at the end of ORFs (or
upon conditional perturbation)1,2 may both activate
transcription termination and recruitment of RNA
degradosome components that frequently associate with
Hfq,18-20 thereby linking the three major steps of RNA
metabolism in the same regulatory mechanism (Fig. 8c).
Despite evidences for a molecular partnership between
Rho and Hfq18 and for Hfq-dependent regulation at the
transcriptional level,26 the Rho-Hfq connection has been
overlooked. The expressions of proU and bgl operons are
under the antagonistic influence of Rho and Hfq but
effects are complex and may be indirect.51,52
Nevertheless, important biological functions may be
controlled by Hfq-mediated Rho inhibition. A potential
target of such control is the expression of virulence
genes, notably in enterobacteria where Rho and Hfq seem
equally important.2,53 Horizontal DNA transfer fosters
bacterial virulence,53 yet Rho preferentially represses
expression of foreign DNA.4 Hfq relieving Rhodependent silencing of horizontally-acquired genes may
thus contribute to explain the tight dependence of
virulence factors on Hfq.53 Circumstantial evidence
comes from rho defects conferring hyperinvasive
phenotypes to Salmonella typhimurium.54 Conversely,
Rho-dependent termination may strengthen Hfq-mediated
gene silencing20,24,25 when conditions altering the RhoHfq relationship arise. Our findings that nucleic acids
provided in trans can suppress contextually Hfq
inhibition of Rho (Fig. 6b and 7; Supplementary Fig. 9)
suggest that such conditions could develop with some
sRNA/mRNA pairs involved in Hfq-mediated silencing.
Our discovery of a direct functional relationship between
Rho and Hfq therefore opens new avenues of
investigation for a better understanding of the roles of
these two key factors in bacterial metabolism and
pathogenicity.
Pull-down experiments with his-tagged proteins. We
washed aliquots (100 µl) of Ni-NTA agarose beads
(Qiagen) thrice with 200 µl of Interaction Buffer (20 mM
Tris-HCl, pH7.9, 100 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1% TritonX100 and 20 mM PMSF) and then mixed beads with 150
125
pmol of His-tagged protein (his6NusG, his6Hfq or his6YaeO)
in 500 µl of Interaction Buffer before incubation for 2h at
4°C. We washed beads thrice again with 500 µl of
Interaction Buffer supplemented with 0.1% BSA and 20
mM imidazole (“low adsorption” buffer) before addition
of 50 pmol of Rho (we also added an equimolar amount
of tR1RNA in selected samples). We incubated beads
overnight at 4°C in 500 µl of “low adsorption” buffer.
After centrifugation, we discarded the supernatant and
washed beads thrice with 800 µl of “low adsorption”
buffer. We re-suspended beads in SDS loading buffer
(2% SDS, 12% glycerol, 0.1mM Tris-HCl pH 6.8, 0.4%
2-mercapto-ethanol and 100mM imidazole), heated them
for 5 min at 90°C, and loaded them on 12.5 % SDSPAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) gels. We
ran gels at 25mA for approximately 80 min.
acetate) before incubation for 3 min at 30°C. Then, we
added ATP, MgCl2 (1 mM, final concentrations), and
DNA trap (400 nM, final concentration; the DNA trap
oligonucleotide is complementary to the released DNA
strand) before further incubation at 30°C. We withdrew
reaction aliquots at various times, mixed them with 4
volumes of quench buffer (100 mM EDTA, 2.5% SDS,
15 % Ficoll-400) before loading them on 7.5% PAGE
gels that contained 0.5% SDS. We analyzed gels with a
Typhoon-Trio imager.
ATPase assays. We measured the steady-state ATPase
activity of Rho at 25°C with the EnzCheck Phosphate
Assay kit (Molecular Probes) as described previously.31
Reactions mixtures contained 20 nM Rho, 20 nM of
tR1RNA or poly[rC] fragments, and Hfq at the
concentrations indicated in Fig. 4b.
Single-cycle transcription termination experiments. We
incubated mixtures of DNA template (0.1 pmol), E. coli
RNAP (0.45 pmol), Rho (1.4 pmol), SUPERase-In
(0.5U/µL; Ambion), with or without NusG in 18-µL of
transcription buffer (40 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM
KCl, 5 mM MgCl2, 1,5 mM DTT) for 10 min at 37°C
(control reactions also contained 3 nmoles of Bcm,
obtained from Pr. K. Schnetz, University of Cologne,
Germany). We started single-round transcriptions by
adding 2 µL of initiation mix (2 mM ATP, GTP, and CTP
and 0.2 mM UTP, 25 µCi/µL of 32P-αUTP, and 250
µg/mL rifampicin in transcription buffer) before
incubation for 20 min at 37°C. In competition
experiments, we added poly[rA] or poly[rU] with the
initiation mix to limit their interference with transcription
initiation. We stopped transcription reactions by adding 4
µL of EDTA (0.5M), 6 µL of tRNA (0.25mg/mL), and
80 µL of sodium acetate (0.42M) before precipitation at 20°C with 330 µL of ethanol. We dissolved reaction
pellets in denaturing loading buffer (95% formamide, 5
mM EDTA), and analyzed them by denaturing 5% PAGE
and Typhoon-Trio (GE-Healthcare) imaging. We
calculated transcription termination efficiencies for
experiments performed with the pT7A1-λcro template as
described previously.31
Electrophoretic mobility shift assays. We mixed the 32Pend labelled tR1RNA or dC34 oligonucleotide (0.1 nM,
final concentration) with various concentrations of Rho
and/or Hfq in binding buffer (150 mM potassium acetate,
20 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM DTT;
0.1 mg/mL tRNA, 0,5 U/µL SUPERase-In, and 0.1%
BSA). We incubated the mixtures for 30 min at 20°C
before adding 2.5 µL Ficoll-400 and loading them on a
4% (for tR1RNA) or stacked 4/12% (for dC34
oligonucleotide) PAGE gel that contained 0.05% TritonX100. We ran gels at 10 V/cm for 5 h at 20°C to resolve
the protein-RNA complex species.
ACKNOWLEDGEMENTS
We gratefully acknowledge I. Artsimovitch, J.M. Berger,
K. Gehring, S. Gottesman, N. Majdalani, K. Schnetz, R.
Sen, and M. Soukhodolets for the gift of materials as well
as N. Hervouet-Coste and C. Mosrin-Huaman for many
helpful technical advices. This work was supported by a
grant from the Conseil Régional du Centre.
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polymerase elongation factors. Annu Rev Microbiol 62,
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and rho. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 89, 1453-1457
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In vivo experiments with synthetic tR1-containing
operons. We incubated E. coli cells carrying the
pOM10cI (control)34 or pOMcI-croUPnt plasmid at 30°C
in LB supplemented with spectinomycin until A600 ~ 0.3.
Then, we incubated cultures at 42°C for 40 min to induce
operon expression from the CI857ts promoter. We
extracted total RNA from independent cultures using a
hot phenol procedure, as described previously.34 We
resolved RNA samples on formaldehyde/1.5% agarose
gels and electro-blotted them on positive TM membranes
(MPbiochemicals) with a TransBlot SD transfer cell,
following manufacturer instructions (Bio-rad). We
performed successive hybridizations with 32P-end labeled
tRNA and 5S RNA probes, as described previously34 and
quantified hybridization signals by Typhoon-Trio
imaging. We performed signal normalization as described
previously.34
Helicase assays. We performed unwinding experiments
as described previously.41 Briefly, We mixed RNA-DNA
substrates (5 nM, final concentration) with Rho (20 nM,
final concentration) in helicase buffer (20 mM HEPES,
pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 0.5 mM DTT, 150 mM sodium
126
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“The Sm-like RNA chaperone Hfq is a potent inhibitor of the transcription
termination factor Rho”
(Documents additionnels)
Supplementary Table 1: Proteins associated to Rho in the interactome network of E. coli.a
topological similarity e
PDB
b
Group
Gene
hfq
cspC
cspE
dnaJ
file #d
Peptide
Zscore
Dali
N° of
residues
1HK9
fulllength
2.7
45
2.9
38
2.5
none
-
-
-
-
-
-
3I2Z
(S
typhimirium)
fulllength
1.8
37
1.9
35
1.8
0
-
-
24
3.8
0
-
-
20
2.0
fulllength
2.9
45
2.3
35
1.3
fulllength
0
-
-
-
-
fulllength
0
-
-
-
-
fulllength
0
-
-
-
-
fulllength
0
-
-
-
-
fulllength
0
-
-
-
-
fulllength
0
-
-
20
2.1
0
-
-
17
2.3
0
-
-
23
2.8
0.9
43
3.1
35
2.3
c
Function
HF-I; host factor for RNA phage Q beta
replication; DNA- and RNA-binding protein;
RNA chaperone; multiple regulatory roles: sRNA
co-factor
Cold shock protein homolog; multicopy
suppresses mukB mutants; constitutively
expressed at 37C; affects rpoS and uspA
expression
Cold shock protein homolog; high copy promotes
or protects chromosome condensation;
constitutively expressed at 37C; affects rpoS and
uspA expression
Chaperone with DnaK; DNA chain elongation;
stress-related DNA biosynthesis; responsive to
heat shock; binds Zn(II)
1BQ0
1EXK
2X9S, chain
E
(T.
thermophilu
s)
2X9S, chain
F
(T.
thermophilu
s)
2J01, chain
L,M
(T.
thermophilu
s)
2X9R, chain
B
(T.
thermophilu
s)
1HQM,
chain A,B
(T.
thermophilu
s)
rplC
50S ribosomal subunit protein L3
rplD
50S ribosomal subunit protein L4; erythromycin
sensitivity
rplL
50S ribosomal subunit protein L7/L12
rpsB
30S ribosomal subunit protein S2; binds Zn(II)
rpoA
RNA polymerase; alpha subunit; binds Zn(II)
rpoB
RNA polymerase, beta subunit; binds Zn(II)
secA
preprotein translocase subunit; ATPase that
targets protein precursors to the SecYE core
translocon
2FSG
selB
Novel elongation factor promoting selenocysteine
incorporation (specific for selenocysteyl tRNA)
2PJP
1
lpxD
tufA
tufB
UDP-3-O-(R-3-hydroxymyristoyl)-glucosamine
N-acyltransferase
Duplicate gene for EF-Tu subunit; elongation
factor; unstable; essential gene; with tufB
3EH0
2FX3
129
NTD
(1-104)
(131209)
CTD
(487607)
fulllength
fulllength
Rmsd
(Å)
TopMatch
N° of
Rmsd
residues
(Å)
Supplementary Table 1 (continued)
topological similarity d
PDB
a
Group
Gene
cspD
dxs
prsA
cbpA
clpA
clpP
greA
yhbY
gyrA
malT
mreB
ftsA
2
nusG
Function
Cold shock protein homolog; not cold shock
inducible; stationary phase and starvation
inducible; lethal when overproduced; inhibitor of
DNA replication
DXP synthase; DXP is precursor to isoprenoids;
thiamin; pyridoxol
Phosphoribosylpyrophosphate synthetase
Recognizes a curved DNA sequence; sequence
similarity to DnaJ
ATPase subunit of ClpAP ATP-dependent
protease; protease Ti
Proteolytic subunit of ClpXP and ClpAP ATPdependent proteases; protease Ti
Transcript cleavage factor
Function unknown; putative RNA binding
protein; similar to IF3 C-terminal RNA binding
fold; UPF0044 family
DNA gyrase; subunit A; nalidixic acid resistance;
cold shock regulon; essential gene
Lambda sensitivity; positive regulator for mal
regulon
Mecillinam resistance; cell shape; affects division
versus elongation 31343 resistance
Cell division and septation protein; specific role
unknown; recruited to FtsZ ring
Stabilizes phage lambda protein N-NusA-RNAP
antitermination complex
Dali
N° of
residues
-
Rmsd
(Å)
-
TopMatch
N° of
Rms
residues
d (Å)
-
file #c
Peptide
none
-
Zscore
-
2O1S
full-length
0
-
-
19
2.8
2JZV
(S. aureus)
2KQX
full-length
0
-
-
28
2.9
NTD (2-72)
0
-
-
10
1.4
1R6B
full-length
0
-
-
22
3.5
1TYF
full-length
0
-
-
23
2.5
1GRJ
full-length
0
-
-
26
2.4
1LN4
full-length
0
-
-
26
4.1
0
-
-
30
2.2
0
-
-
15
2.8
full-length
0
-
-
23
2.6
full-length
0
-
-
25
2.8
1SUU
1HZ4
1JCE
(T. maritima)
1E4G
(T. maritima)
CTD (506809)
ID (438803)
2jvv
CTD (123181)
full-length
0
-
-
11
3.1
full-length
0
-
-
24
2.7
0
-
-
24
3.1
0
-
-
12
2.6
plsB
Glycerolphosphate acyltransferase activity
1IUQ
(C. moscata)
fabI
Enoyl-ACP reductase; NADH dependent;
essential gene
1LX6
UMP kinase; hexameric; essential gene
rpoD
RNA polymerase; sigma 70 subunit; initiates
most exponential phase transcription
1SIG
Branch migration of Holliday structures; lexA
regulon
1HQC
(T.
thermophilus
)
full-length
0
-
-
25
2.8
1OX8
full-length
0
-
-
43
3.2
full-length
0
-
-
23
2.5
YdcP
-
-
-
-
-
full-length
0
-
-
22
3.3
2OAQ
(A. fulgidus)
full-length
0
-
-
32
3.6
2EUA
full-length
0
-
-
29
2.9
sspB
rnpA
ydcP
b249
6
gspE
menF
lolB
gltA
spoT
edd
flu
csrA
lspA
Specificity-enhancing factor for ClpXP protease;
binds ssrA-tagged proteins; ribosome-associated
stress response protein (Sm-like fold)
RNase P; protein component; involved in tRNA
and 4.5S RNA-processing
Function unknown
Required for regulatory inactivation of DnaA;
multicopy suppressor of dnaN(ts); essential gene
general secretory pathway component; P-loop
containing nucleoside triphosphate hydrolase
domain; cryptic
Menaquinone pathway-specific isochorismate
synthase
outer membrane lipoprotein required for sorting
and membrane localization of lipoproteins
Citrate synthase
Guanosine 5-diphosphate; 3-diphosphate
pyrophosphatase; ppGpp synthetase II activity
Phosphogluconate dehydratase; growth on
gluconate
Antigen 43; phase-variable bipartite outer
membrane autotransporter protein
Global regulator of carbon source metabolism;
CsrA exerts reciprocal effects on glycolysis
versus gluconeogenesis and glycogen
biosynthesis; glgC mRNA-binding activity
blocks GlgC translation; csrB RNA inhibits csrA
Prolipoprotein signal peptidase; signal peptidase
II; SPII
2BNF
UTP-bound
PyrH
Sigma70
(114-448)
Target structure
pyrH
ruvB
3
b
1NZ0
(T. maritima)
none
3BOS (S.
amazonensis)
1IWM
full-length
0
-
-
31
3.9
1OWB
full-length
0
-
-
23
2.5
none
-
-
-
-
-
-
none
-
-
-
-
-
-
none
-
-
-
-
-
-
1Y00
full-length
0
-
-
27
2.7
none
-
-
-
-
-
-
130
Supplementary Table 1 (continued)
acnA
Aconitase A; stationary phase induced; ironnone
sulfur cluster; apo-enzyme binds mRNA for
negative translational autoregulation; negatively
regulated by ryhB RNA as part of indirect
positive regulation by Fur
3
yiim
Function unknown
1O65
full-length
0.1
40
3.3
29
2.0
fixb
Required for anaerobic carnitine reduction;
none
similar to Rhizobium fix gene
gsp
Glutathionylspermidine synthetase/amidase;
2IOA, chain
full-length
2.4
50
3.0
46
3.2
bifunctional protein
B
a
Specimens that display significant topological similarity with the C-terminal domain of NusG (blue boxes) are highlighted in yellow.
b
Groups are as follows: proteins interacting with both Rho and Hfq (1) or only with Rho (2) in Butland et al., Nature, 2005, 433, 531-7. (3) Previously
uncharacterized proteins interacting with Rho as described in Hu et al., PLoS Biol., 2009, 7, e96.
c
Functions according to the Echobase database (http://www.york.ac.uk/res/thomas/index.cfm).
d
Structures of proteins from E. coli unless indicated otherwise (in parentheses).
e
Pairwise comparisons were performed on the Dali (http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite/start) and Topmatch (http://topmatch.services.came.sbg.ac.at/)
servers.
Supplementary table 2: topological similarity among selected Rho partnersa
NusG-CTD
Hfq
YaeO
L3
(2JVV)
(1HK9)
(1SG5)
(2X9S, chE)
NusG-CTD
X
(2JVV)
Z = 2.7
Hfq
45 residues
X
(1HK9)
Rmsd = 2.9Å
Z = 0.5
Z = 4.4
YaeO
39 residues
59 residues
X
(1SG5)
Rmsd = 3.59Å
Rmsd = 2.6Å
Z = 2.9
Z = 3.4
Z = 0.9
L3
45 residues
49 residues
42 residues
X
(2X9S-E)
Rmsd = 2.3Å
Rmsd = 2.4Å
Rmsd = 2.8Å
Z = 2.4
Z = 1.8
Z = 0.8
Z = 2.6
GssA
50 residues
50 residues
50 residues
50 residues
(2IOA, chB)
Rmsd = 3.0Å
Rmsd = 3.5Å
Rmsd = 3.3Å
Rmsd = 2.5Å
a
calculated on the Dali server (http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_lite).
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
Apport personnel. Conclusions et perspectives
3. Conclusions et perspectives
Les structures de Rho en interaction avec l’ARN («trimère de dimères» et
«asymétrique», figures 20 et 22, pages 30 et 32, respectivement) suggèrent deux réseaux
d’interactions SBS-ARN et également deux modèles distincts («RNA handoff» et «RNA
escort», figures 21 et 23, pages 31 et 33, respectivement), de translocation de cette enzyme sur
son substrat (Skordalakes and Berger 2006; Thomsen and Berger 2009).
Nos résultats de mutagénèse (article II) indiquent que la structure «trimère de
dimères» (Skordalakes and Berger 2006) n’est probablement pas une représentation
fonctionnelle du moteur Rho. Cette conclusion exclut, de fait, le mécanisme «RNA handoff»
et les modèles dérivés comme le modèle «large lever» (figure 61) pour expliquer la
translocation de Rho sur l’ARN. De la même façon, nos résultats indiquent que le réseau
d’interactions observé dans la structure «trimère de dimères» ne peut pas expliquer la
spécificité stricte de Rho pour l’ARN. Nos données de mutagénèse sont en revanche
compatibles avec un anneau hexamérique tel qu’il est représenté dans la structure
«asymétrique» (Thomsen and Berger 2009). Cependant, nos résultats NAIM (article I) sont en
désaccord avec le modèle «RNA escort» proposé à partir de cette structure (figure 61). En
effet ce modèle suggère que chaque nucléotide est pris en charge, «escorté» exactement de la
même façon alors que nos données biochimiques révèlent que les groupements 2’-OH ne sont
contactés de façon productive que périodiquement (tous les sept nucléotides en moyenne ;
figure 60). Ce mécanisme de translocation assuré par des contacts fluctuants avec la piste
ARN est observé quelques soit l’architecture du substrat ARN-ADN (figure 60).
Puisque les données expérimentales contredisent à la fois le modèle «RNA escort» et
le modèle «RNA handoff», il est nécessaire d’envisager d’autres possibilités. Plusieurs
modèles compatibles avec une structure «asymétrique» de l’hexamère Rho et une activation
2’-OH dépendante périodique ont été proposé par nous et d’autres auteurs (Boudvillain et al.
2010a).
1) le modèle «open-ring» : dans ce modèle il est postulé que la translocation de
l’ARN est assurée par la fluctuation entre deux formes structurales : «ouverte/étendue» et
«fermée/plate». Des contacts productifs entre Rho et les groupements 2’-OH de l’ARN se
formeraient dans l’une ou l’autre de ces formes structurales (figure 61). Ces structures
extrêmes pourraient correspondre aux formes ouverte (figure 17, page 26) et asymétrique
(figure 22, page 32) observées pour l’hexamère Rho par cristallographie aux rayons X
(Skordalakes and Berger 2003; Skordalakes and Berger 2006; Thomsen and Berger 2009).
141
L’existence d’états intermédiaires ouverts, intrinsèquement moins stables, est compatible avec
la processivité modérée observée pour Rho lors du déroulement d’hélices ARN-ADN
(Walmacq et al. 2004). Il est à noter que le modèle «open-ring» a été proposé initialement
pour un autre moteur moléculaire «anomèrique», l’ATPase pentamérique du phage Φ29,
responsable du packaging de l’ADN simple brin dans la capside de ce bactériophage (Moffitt
et al. 2009).
Figure 60. Interactions et translocation
périodiques du moteur moléculaire Rho
lors de son activité ARN-ADN hélicase,
sont suggérées par les «vagues»
d’interférence NAIM. Les trois graphes
illustrent trois expériences NAIM réalisées
pour trois substrats différents.
2) le modèle «RNA scrunching» : ce modèle postule que la translocation de l’ARN
au sein de Rho, qui pourrait se faire par un mécanisme de type «escort » (figure 23, page 33)
conduit à l’accumulation d’une tension au sein de l’hexamère (figure 61). Cette tension
pourrait, par exemple, être due à la compression d’une région du transcrit au sein de
l’hexamère (Thomsen and Berger 2009). Cette tension serait «relarguée» périodiquement
(tous les sept nucléotides) par un mécanisme de gâchette 2’-OH dépendante qui reste à
préciser.
142
Figure 61. Modèles de translocation proposés pour le moteur moléculaire Rho. D’après :
(Boudvillain et al. 2010a).
Des modèles hybrides sont également possible comme le modèle «zipper-lock»
proposé récemment (Patel 2009). Selon celui-ci, les sous-unités de l’hexamère Rho
établiraient des contacts avec les groupements 2’-OH (comme dans le modèle «escort») mais
l’hydrolyse d’une molécule d’ATP provoquerait un changement conformationnel global qui
provoquerait une translocation de sept nucléotides par Rho (Patel 2009).
Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour déterminer le mécanisme exact de
translocation de Rho le long de l’ARN. Etant donné la difficulté d’étudier cette enzyme par
des approches d’enzymologie classiques, il est probable qu’il sera nécessaire d’utiliser des
approches d’observation plus directes telle que celles reposant sur les technique de FRET
et/ou de nano-manipulations à l’échelle de la molécule unique (smFRET, pinces optiques et
magnétiques) [pour revue : (Joo et al. 2008; Neuman and Nagy 2008)]. Il pourrait être
également intéressant de déterminer si les caractéristiques observées pour le facteur Rho sont
conservées pour P4, l’autre exemple connu de moteur moléculaire «anomèrique» ARNdépendant (figure 07, page 13). Des expériences préliminaires avec différents substrats
synthétiques sont en cours au laboratoire afin d’identifier le substrat optimal qui permettrait
d’adapter l’approche NAIM à l’étude de cette enzyme P4.
Dans l’étude présentée dans l’article III, nous avons révélé l’existence d’une similitude
topologique entre la protéine Hfq et les protéines NusG et YaeO et montré que, comme elles,
Hfq s’associe à Rho (Kd ~ 50 nM). L’interaction Hfq:Rho est renforcée lorsque le substrat
ARN fixe les deux facteurs dans une configuration qui empêche la formation d’un complexe
Rho-ARN productif, inhibe les activités ATPase et hélicase de Rho, et induit un phénomène
143
d’anti-terminaison de la transcription au niveau de terminateurs Rho-dépendants in vitro et in
vivo. Nos données expérimentales (article III) suggèrent un nouveau mécanisme d’antiterminaison chez E. coli impliquant la protéine Hfq (voir article III, figure 8, page 125).
Le mode d’action de la protéine Hfq semble être différent de celui utilisé par le facteur
YaeO, le seul inhibiteur bactérien de Rho connu (Pichoff et al. 1998; Gutierrez et al. 2007).
Toutefois, la comparaison des structures YaeO et Hfq montre que certains résidus nécessaires
pour l’interaction de YaeO ou de NusG (Gutierrez et al. 2007; Chalissery et al. in press) à Rho
ont leurs équivalents sur Hfq. La mutation de ces résidus permettrait donc de vérifier leur
importance dans l’interaction Rho:Hfq. L’utilisation de formes tronquées de la protéine Rho
(par exemple : la partie N-terminale ou C-terminale) pourrait également faciliter
l’identification du domaine du facteur Rho engagé dans l’interaction Rho:Hfq. La nature de
cette interaction pourrait aussi, peut-être, être précisée par RMN comme dans l’étude de
l’interaction Rho:YaeO (Gutierrez et al. 2007). Le rôle des résidus de Rho et de Hfq engagés
dans l’interaction Rho:Hfq pourraient alors être vérifié par mutagenèse dirigée. La
combinaison de ces informations expérimentales contribuerait à la caractérisation des contacts
moléculaires entre Rho et Hfq et à la conception d’un modèle moléculaire du complexe
Rho:Hfq.
Les cibles biologiques potentiellement régulées par l’interaction Rho:Hfq ne sont pas
connues. Les résultats présentés dans l’article III constituent donc une première étape
nécessaire mais insuffisante dans l’étude de la relation fonctionnelle entre les deux facteurs
Rho et Hfq.
Il a été montré par analyse globale du transcriptome d’E. coli que le niveau d’ARNm
est diminué en absence de Hfq pour une majorité des gènes sous le contrôle de Hfq (Guisbert
et al. 2007). Afin de déterminer si cette diminution est due, du moins en partie, à une activité
accrue de Rho, il serait nécessaire de répéter ce type d’analyse globale en présence de la Bcm
afin de moduler l’activité de Rho. Toutefois, cette analyse peut s’avérer compliquée par
l’activité accrue de la RNaseE dans les souches hfq- (Carpousis 2007; Gottesman 2004). Il est
donc probable qu’il sera également nécessaire de comparer les profils transcriptomiques pour
les souches hfq+ et hfq- dans des contextes RNaseE+ et RNaseEts et en présence ou absence de
la Bcm dans les milieux de cultures.
Pour étudier l’interaction fonctionnelle entre Rho et Hfq au niveau génomique, il serait
également intéressant de reconstruire une carte de la distribution génomique des terminateurs
Rho-dépendants sensible à l’action de Hfq. Il s’agirait de comparer par l’expérience du Chip-
144
chip les distributions de Rho et de l’ARNP sur l’ensemble du génome (comme, dans l’étude
de Peters et al., figure 32, page 45) dans des contextes hfq+ et hfq-. La distribution des
facteurs protéiques sur les ARN terminés par Rho et qui sont sensibles à l’action de Hfq,
pourrait être également étudiée par expérience de PAR-CLIP (PhotoactivatableRibonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (Hafner et al. 2010), en
testant une batterie d’anticorps, anti-Rho, anti-Hfq, anti-NusA, anti-NusE et anti-NusG, par
exemple. Les transcrits photopontés à ces différents facteurs (Rho, Hfq, NusA, NusE et
NusG) seraient alors identifiés par «deep-sequencing» (CLIP-seq). La combinaison des
expériences CLIP-seq et ChIP-chip permettrait ainsi d’identifier in vivo les terminateurs Rhodépendants sur le génome qui sont affectés par Hfq et les facteurs protéiques endogènes
potentiellement impliqués dans ce phénomène d’anti-terminaison.
Récemment, la relation fonctionnelle entre Hfq et l’un de ses partenaires potentiels
(identifié dans l’interactome), l’ARN hélicase CsdA a été étudiée (Resch et al. 2010). Cette
étude suggère que CsdA faciliterait l’action de Hfq dans l’appariement de DsrA à l’ARNm
rpoS, en provoquant la dissociation de la structure en tige boucle séquestrant le RBS (figure
52, page 71) (Resch et al. 2010). Dans l’étude présentée dans l’article III, nous n’avons pas
caractérisé l’effet de l’interaction Rho:Hfq sur le fonctionnement de Hfq. A court terme, il
serait intéressant de développer des tests in vitro et in vivo qui permettraient d’étudier l’effet
potentiel de Rho sur Hfq lors de la formation du complexe Rho:Hfq.
Nos résultats révèlent un nouveau mécanisme d’anti-terminaison de la transcription
avec diverses implications possibles dans le métabolisme bactérien et/ou la virulence de
germes pathogènes chez lesquels Rho et Hfq sont conservés. Par exemple, il a été montré que
chez le mutant ∆hfq de S. typhimurium la virulence de cette bactérie est très réduite (figure 54,
page 74) (Sittka et al. 2007) alors que cette virulence est plus importante chez les mutants
rhots de S. typhimurium (Lee et al. 1992). Des manipulations génétiques seraient nécessaires
pour explorer le rôle de l’interaction Rho:Hfq dans la virulence bactérienne, dans des
contextes géniques et des conditions environnementales distincts.
L’ensemble des informations obtenues au cours de ces trois ans de thèse contribue
modestement à l’élucidation du mécanisme de fonctionnement et de régulation du facteur Rho
découvert depuis presque un demi-siècle. La découverte d’une relation fonctionnelle entre
Rho et la protéine Hfq pourrait ouvrir un champ d’investigation vaste et intéressant afin de
mieux comprendre les mécanismes de régulation de l’expression des gènes, notamment ceux
impliqués dans la virulence bactérienne.
145
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Makhlouf RABHI
Mécanismes et régulation d’une ARN hélicase essentielle chez E.
coli : le facteur de la terminaison de la transcription bactérienne
Rho
Chez E. coli, Rho est un facteur essentiel qui contrôle l’expression de multiples unités
transcriptionnelles via le phénomène de terminaison de la transcription. Rho est un moteur
moléculaire ATP-dépendant ayant une activité ARN hélicase caractéristique de sa capacité à dissocier
des obstacles (comme l’ARN polymérase) lors de sa translocation le long de sa piste ARN. Il existe
différentes structures de Rho en interaction avec l’ARN qui suggèrent des mécanismes de
translocation contradictoires. Afin de mieux comprendre ces mécanismes, nous avons utilisé deux
approches complémentaires pour identifier les fonctionnalités moléculaires importantes au sein de
l’ARN et de Rho : l’approche NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) développée au
laboratoire et la mutagenèse dirigée. Nos résultats excluent une organisation de l’anneau
hexamérique en «trimère de dimère» (ainsi que les mécanismes de translocation qui en découlent)
mais sont compatibles avec différents aspects rencontrés dans une structure en anneau asymétrique
plus récente. Toutefois, nos résultats ne supportent pas le mécanisme d’escorte nucléotide par
nucléotide qui découle de cette structure asymétrique. Ainsi, nous montrons que Rho contacte la
chaîne ARN de façon hétérogène et ne nécessite un groupement 2’-OH que tous les sept nucléotides
en moyenne. Par ailleurs, nous avons exploré l’interactome d’E. coli dans le but d’identifier d’éventuels
régulateurs de la fonction de Rho. Nous montrons que la protéine hexamèrique Hfq présente une
similitude topologique avec les protéines endogènes NusG et YaeO et que, comme elles, Hfq
s’associe à Rho pour en réguler la fonction. L’interaction Hfq:Rho inhibe les activités enzymatiques de
Rho. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme d’anti-terminaison de la transcription avec
diverses implications possibles dans le métabolisme bactérien et/ou la virulence de germes
pathogènes.
Mots clés : facteur bactérien Rho, ARN hélicase, terminaison de la transcription, Hfq, NAIM.
Mechanisms and regulation of an essential RNA helicase in E. coli:
the bacterial transcription termination factor Rho
In E. coli, Rho is an essential factor that controls the expression of multiple transcriptional units
via the phenomenon of transcription termination. Rho is an ATP-dependent molecular motor displaying
RNA helicase activity, a feature typical of Rho’s ability to dissociate obstacles (such as RNA
polymerase) during translocation along its RNA track. Different structures of the Rho-RNA complex
have been published and suggest contradictory mechanisms of translocation. In order to understand
these mechanisms, we have used two complementary approaches to identify functionality molecular
comports in RNA and Rho : the NAIM (Nucleotide Analog Interference Mapping) approach developed
in the laboratory and site-directed mutagenesis. Our results exclude that Rho forms a functional
"trimer of dimer" ring (which rules out related translocation mechanisms) but are compatible with
various aspects encountered in a recent asymmetric ring structure. However, our results do not
support the "nucleotide by nucleotide" escort mechanism inferred from this asymmetric structure.
Indeed, we show that Rho forms heterogonous contacts with the RNA chain and only requires a 2'-OH
every seven nucleotides on average. Furthermore, we explored the interactome of E. coli in order to
identify potential regulators of Rho function. We show that the hexameric protein Hfq displays
topological similarity with the endogenous proteins NusG and YaeO and, that, like them, Hfq
associates with Rho to regulate Rho function. The Hfq:Rho interaction inhibits the enzymatic activities
of Rho. These results reveal a novel mechanism of transcription anti-termination with potentially
important
implications
in
bacterial
metabolism
and/or
virulence
of
pathogens.
Keywords: Rho bacterial factor, RNA helicase, transcription termination, Hfq, NAIM.
Centre de Biophysique Moléculaire « Interactions
ribonucleoproteiques et applications therapeutiques »
CNRS UPR4301
Rue Charles Sadron 45071 Orléans Cedex 2

RABHI Makhlouf - Centre de biophysique moléculaire

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