MUC4 et miARN dans la chimiorésistance du cancer pancréatique à

MUC4 et miARN dans la chimiorésistance du cancer pancréatique à la gemcitabine et
aux drogues du protocole FOLFIRINOX
Directeur de thèse :
Dr Nicolas Jonckheere, Chargé de recherche Inserm
Inserm UMR-S1172-JPARC, Lille
Sujet de recherche choisi et contexte scientifique
L’adénocarcinome pancréatique est la 4ème cause de mort par cancer dans les pays
occidentaux. Le taux de survie à 5 ans est de 3% avec une médiane de survie de moins de 6
mois due à une détection tardive du cancer et à un manque de thérapie efficace. En 2030,
les projection épidémiologiques montrent que le cancer pancréatique deviendra la 2ème
cause de mort par cancer (Rahib et al. 2014) Plus de 80% des cancers pancréatiques sont
métastatiques ou sont étendus localement au-delà du pancréas au moment du diagnostic, ce
qui explique notamment la gravité du diagnostic (Vincent et al., 2011). L’adénocarcinome
pancréatique est responsable d’environ 8000 décès par an en France et son incidence est
en augmentation constante. La chirurgie est actuellement le seul traitement curatif de
l’adénocarcinome pancréatique mais elle n’est envisageable que pour 10 à 15% des patients
(avancement de la maladie, localisation de la tumeur, état général du patient. Dans 85-90%
des cas, une chimiothérapie palliative seule ou en association à la radiothérapie est
prescrite. Or le cancer du pancréas est un des cancers les plus résistants aux drogues.
Un enjeu capital, dans le but d’augmenter l’efficacité des traitements, est donc de mieux
comprendre les mécanismes responsables de cette chimiorésistance.
La mucine MUC4, partenaire membranaire de l'oncogène ErbB2 (Jonckheere et al. 2012),
dont l'expression augmente régulièrement au cours de la carcinogenèse pancréatique
(Figure 1) et qui est directement impliquée dans la résistance des cellules cancéreuses
pancréatiques humaines à la gemcitabine (Skrypek et al. 2013), traitement de référence en
chimiothérapie pour le cancer du pancréas. Ces mécanismes impliquent les transporteurs
hCNT1/3 et la voie de signalisation NF-kB. Ces données in vitro ont ensuite été confirmées
ex vivo sur une petite cohorte de patients atteints d’adénocarcinome pancréatique dans
laquelle nous montrons une corrélation inverse entre l’expression de MUC4 et celle d’hCNT1
(Skrypek et al. 2013). Ces résultats encourageants ont permis de proposer hCNT1/3
comme cible et comme marqueur de réponse à la gemcitabine. Nous envisageons donc
maintenant d’étendre nos études aux molécules incluses dans le protocole
FOLFIRINOX (5-fluoro-uracile, irinotécan, oxaliplatine, acide folinique) dont l’efficacité a
été récemment démontrée avec une amélioration de la survie malgré une toxicité accrue
dans des cancers pancréatiques métastatiques (Conroy et al. 2011).
C’est dans ce cadre que nous développons des travaux visant à mieux comprendre le rôle
de la mucine membranaire MUC4 dans la chimiorésistance des cancers épithéliaux. Notre
but est de déterminer l’implication de la mucine MUC4 dans la chimiorésistance des cellules
cancéreuses pancréatiques au FOLFIRINOX par des approches complémentaires in vitro
(modèles cellulaires d’adénocarcinome pancréatique), ex vivo (cohorte de patients) et in vivo
(modèle murin préclinique de cancer pancréatique).
Etant donné la sur-expression de MUC4 dans de nombreux cancers épithéliaux (pancréas,
côlon, sein) et notamment les cancers oeso-gastriques (axe 1 SIRIC), nous pensons pouvoir
élargir ces connaissances à d’autres cancers et proposer des mécanismes généraux du
cancer.
Différents mécanismes cellulaires liant les mucines à la chimiorésistance sont décrits dans la
littérature (barrière physique, altération des voies de signalisation et ARN non codants tels
que les miARN, résistance à l’apoptose, altération du métabolisme des drogues, phénotype
cellule souche, transition épithélio-mésenchymateuse) (Jonckheere et al. 2014) (Figure 2).
La régulation de l’expression des gènes par les microARN (miARN) est apparue récemment
comme une stratégie prometteuse de contrôle de l’expression des gènes dans le cancer qui
pourrait conduire à des applications thérapeutiques. Dans le cancer pancréatique, les
miARN sont exprimés de manière aberrante, et peuvent réguler des processus
oncogéniques ou agir comme suppresseurs de tumeur en fonction des ARNm ciblés. Nous
avons récemment identifié MUC4 comme gène cible du miR219-1-3p (Lahdaoui et al.
2014). De plus, nos données préliminaires montrent que l’expression des miARN est altérée
suite à l’inhibition de MUC4. Ceci confirme un réel intérêt d’étudier l’impact des miARN liés à
l’expression de MUC4 dans la biologie du cancer du pancréas.
Figure 1 : L’adénocarcinome pancréatique et l’oncomucine MUC4 (Schwarz et al., 2002;
Jonckheere and Van Seuningen, 2010; Vincent et al., 2011; Jonckheere et al., 2014)
Etat du sujet dans le laboratoire et l’équipe d’accueil
Nous avons précédemment caractérisé l’interaction à la membrane et les rôles biologiques
de la mucine MUC4 et de son partenaire membranaire ErbB2 dans des cellules humaines
d’adénocarcinome pancréatique (Jonckheere et al. 2012). Nous avons également montré
que MUC4 est directement impliquée dans la résistance des cellules cancéreuses
pancréatiques humaines à la gemcitabine via les transporteurs hCNT1/3 et la voie de
signalisation NF-kB (Skrypek et al. 2013). Nous avions pour cela établi des modèles
cellulaires invalidés de manière stable pour MUC4 par ARN interférence (pRetroSuper
MUC4 ShRNA) (Jonckheere et al. 2012). Nos résultats préliminaires (Fig 2) ont permis de
mettre en évidence une chimio-sensibilité accrue des clones MUC4-KD au 5-FU alors que
ces clones sont plus résistants à l’oxaliplatine dans les CAPAN-2.
Une étude préalable du miRnome (miRNA array 8x15K Agilent) a montré que les miARN
(hsa-miR-361-3p, -584-5p, -132-3p, -96-5p et -210) sont dérégulés suite à l’invalidation de
MUC4. Nous avons validé par qPCR la diminution d’expression des miARN-132-3p, miR-965p et miR-210
A
B
C
D
Figure 2 : MUC4 et chimiosensibilité aux drogues du protocole FOLFIRINOX dans les celllules
d’adénocarcinome pancréatique CAPAN-2. (A) la détermination de la dose IC50 des cellules
CAPAN-2 MUC4-KD montre une sensibilité accrue au 5-FU et diminuée à l’oxaliplatine. (B)
Chimiosensibilité des MUC4-KD aux combinaisons de drogues (C) La perte de MUC4 conduit à
une diminution de l’expression du transporter CTR1 visualisée par qRT-PCR et western blot. (D)
L’inhibition de MUC4 induit une diminution de l’expression relative des miARN-132-3p, -96-5p et
210 dans les cellules CAPAN-2.
Programme et l’échéancier de travail
Notre projet comprend quatre objectifs:
- Objectif 1: identifier les rôles de MUC4 et les mécanismes cellulaires associés à la
résistance aux drogues chimiothérapeutiques du protocole FOLFIRINOX.
- Objectif 2: Identifier de nouveaux miARN dérégulés par MUC4 et élucider leurs rôles
dans la chimiorésistance.
- Objectif 3: valider in vivo MUC4 ou de nouveaux miARN candidats en tant que cibles
thérapeutiques potentielles
- Objectif 4 : Recherche de marqueurs prédictifs de la réponse à la gemcitabine et au
FOLFIRINOX chez l’homme
Objectif 1 : MUC4 et mécanismes cellulaires associés : Nous étudierons les
modifications d’expression et la régulation des enzymes du métabolisme associées à des
phénomènes de résistance chez l’homme (hCNT1/3, MRP1/2/3/4/5, ABCG2, CTR1, DPYD,
ATP7B) par qRT-PCR, western blot et cytométrie en flux. L’implication de ces différents
éléments sera validée par des expériences d’ARN interférence transitoire et détermination
des IC50 (tests de viabilité cellulaire MTT). Nous identifierons également les voies de
signalisation impliquées dans les altérations d’expression des différentes protéines d’intérêt
(MAPK, p38, JNK, NF-kB, Akt…). Nous réaliserons sur des cellules Mock et MUC4-KD
l’analyse des marqueurs de type « cellules souches » EZH2, CD44, CD24, CXCR4 et CD133
(western blot et cytométrie en flux) et les tests de formation de sphères afin de démontrer un
éventuel enrichissement d’un sous type cellulaire conduisant à un échec thérapeutique.
Objectif 2 : miARN et chimiorésistance : Une étude préalable du miRnome a montré que
les miARN (hsa-miR-361-3p, -584-5p, -132-3p et -96-5p) sont dérégulés suite à l’invalidation
de MUC4. Des lignées cellulaires sur-exprimant stablement ces miARN seront établies
(vecteurs pLenti4/TO/GFP-miR) en collaboration avec le Dr J. Torrisani (Inserm UMR1037,
CRCT, Toulouse). Nous caractériserons ces clones pour leurs propriétés de
chimiorésistance (IC50) à la gemcitabine et aux drogues du protocole FOLFIRINOX par tests
de viabilité cellulaire MTT comme réalisés précédemment (Lahdaoui et al. 2014).
Objectif 3 : Evaluation thérapeutique des gènes/miARN candidats : Notre objectif est de
montrer in vivo l’effet chimioprotecteur de MUC4 et des miARN candidats (identifiés au cours
des Objectifs 1 et 2) lors de la cancérogenèse pancréatique. L’effet des traitement
chimiothérapeutiques (gemcitabine, 5-FU, oxaliplatin and Irinotecan/SN-38, (10-50 mg/kg, bihebdomadaire) sera déterminé (i) dans des modèles de xénogreffes des cellules de cancer
pancréatique (CAPAN-1, CAPAN-2, Mock et MUC4-KD) et (ii) dans le modèle préclinique de
cancer pancréatique (LstopLKrasG12D, Pdx1-Cre) (Hingorani et al., 2003, disponibles au
laboratoire, animalerie High Tech Univ Lille 2, responsable : D. Taillieu).
Des siARN ciblants les différents gènes candidats seront administrés (250 µg de siARN/kg
pendant 1 mois) dans les deux types de modèles animaux. Les miARN seront injectés de
manière intratumorale afin d’évaluer leur potentiel thérapeutique (progression
carcinogénétique, apparition et progression de métastase). L’analyse macroscopique et
histologique des tumeurs sera réalisée par le Pr E. Leteurtre (pathologiste, CHRU Lille, CBP,
membre de l’équipe).
Objectif 4 : Recherche de marqueurs prédictifs de la réponse à la chimiothérapie :
Nous validerons la valeur prédictive et/ou pronostique des marqueurs identifiés en réponse à
la chimiothérapie grâce à une cohorte de 200 patients atteints de cancer pancréatique en
collaboration avec les chirurgiens, oncologues et anatomopathologistes de l’équipe, tous
cliniciens au CHRU de Lille et membres de l’équipe (Pr C. Mariette, Dr S. Truant, Pr M.
Hebbar, Pr E. Leteurtre). Cette cohorte a été étiquetée et les échantillons sélectionnés sur
les critères suivants (répondeur/progression selon les critères RECIST) afin de répondre à la
question posée.
Des expériences d’immuno-histochimie et hybridation in situ seront réalisées dans les
échantillons de cancer pancréatique pour l’expression de MUC4 et nouveaux gènes
candidats et des miARN. Le statut d’expression de ces gènes d’intérêt sera corrélé avec la
réponse au traitement.
Cette étude sur tissus de patient sera élargie via notre participation à une étude ancillaire de
l’essai clinique PRODIGE24 (responsable Pr T. Conroy) pour lequel nous avons déposé un
projet. Notre objectif est d’identifier de nouveaux marqueurs prédictifs (miARN, MUC4 et
nouveaux gènes candidats) dans les deux bras expérimentaux (Gemzar vs Folfirinox).
Echéancier (mois)
Objectif 1 : MUC4 et mécanismes cellulaires associés
1.1 Altération des enzymes du métabolisme et validation par
siARN
1.2 Caractérisation des voies de signalisation
1.3 Marqueurs de cellules souches, test de formation de
sphères
Objectif 2: miARN et chimiorésistance
2.1 Etablissement des lignées stables (collab. J. Torrisani,
CRCT, Toulouse)
2.2 Caractérisation in vitro (IC50 et propriétés biologiques)
Objectif 3 : Evaluation thérapeutique des gènes/miARN
6
12 18 24 30 36
candidats
3.1 Xénogreffes SC, injections siARN genes candidats et
miARN
3.2 Modèle préclinique de cancer pancréatique, injection
siARN et miARN
Objectif 4 : Recherche de marqueurs prédictifs de la réponse à
la chimiothérapie
4.1 IHC sur cohorte de patients CHRU Lille
4.2 Hybridation in situ, patients CHRU Lille
4.3 IHC cohorte Prodige24
Retombées scientifiques et économiques attendues
Alors que 80% des cancers pancréatiques sont métastatiques ou sont étendus localement
au-delà du pancréas au moment du diagnostic et ne sont donc pas éligibles pour bénéficier
d’une résection chirurgicale (seul traitement curatif). Le cancer du pancréas est un des
cancers les plus résistants aux drogues chimiothérapeutiques qui sont alors proposées au
patient. La compréhension des mécanismes responsables de cette chimiorésistance est
ainsi cruciale pour augmenter l’efficacité des traitements.
L’objectif 1 de ce projet permettra l’identification de nouveaux mécanismes et de nouvelles
cibles thérapeutiques associées à la chimiorésistance.
L’objectif 2 permettra de générer de nouveaux outils pour étudier le potentiel des miARN
comme marqueurs et cibles thérapeutiques.
L’objectif 3 permettra de valider in vivo les marqueurs identifiés dans les Objectifs 1 et 2 et
de proposer de nouveaux outils thérapeutiques permettant une meilleurs prise en charge des
patients.
L’objectif 4 permettra de valider la valeur prédictive et/ou pronostique des gènes candidats
identifiés dans les objectifs 1 et 2 en réponse à la chimiothérapie. Si nos observations sont
confirmées dans une cohorte de patients, il sera envisageable d’utiliser ces gènes candidats
comme marqueurs prédictifs de réponse à la chimiothérapie et d’orienter le patient vers un
protocole basé sur la gemcitabine ou sur le FOLFIRINOX.
L'ensemble de ces travaux devrait donc permettre:
Sur un plan fondamental :
1- d’apporter de nouvelles connaissances sur les mécanismes cellulaires de
chimiorésistance des cancers épithéliaux in vitro et in vivo
2- l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles (intervention sur la
chimiosensibilité) dans le traitement du cancer du pancréas.
Sur un plan appliqué :
3- identifier de nouveaux marqueurs prédictifs d'efficacité du traitement (gemcitabine vs
Folfirinox).
Sur le plan économique :
4- proposer de nouveaux traitements du cancer plus efficaces et moins toxiques,
5- combattre la résistance des tumeurs aux traitements loco-régionaux,
6- mieux traiter et mieux prendre en charge le patient de manière personnalisée,
7- réduire les coûts de prise en charge de la maladie.
Collaborations prévues
1- Dr Jérome Torrisani (Inserm UMR1037, CRCT, Toulouse, France)
Dans le cadre de l’étude de la régulation des mucines MUC1 et MUC4 par les miARN, nous
avons mis en place une collaboration étroite avec le Dr Jérome Torrisani qui a abouti à deux
publications (Lahdaoui et al., Oncogene 2014 ; Tréhoux et al, BBRC 2015 et soumis à
publication). Les lignées cellulaires sur-exprimant stablement les nouveaux miARN d’intérêt
seront réalisées dans ce cadre. Cette équipe est spécialisée dans l’identification des
évènements moléculaires intervenant dans les phases précoces de la cancérogenèse
épithéliales et notamment dans l’implication des phénomènes épigénétiques et les miARN.
2- Pr Emmanuelle Leteurtre (Centre de Biologie et de Pathologie, CHRU de Lille).
Analyse anatomopathologique des échantillons d’adénocarcinome pancréatique (modèles
murins précliniques et cohorte de patients atteints de cancer pancréatique).
Références bibliographiques
1. Conroy, T., F. Desseigne, M. Ychou, O. Bouche, R. Guimbaud, Y. Becouarn, A. Adenis, J. L.
Raoul, S. Gourgou-Bourgade, C. de la Fouchardiere, J. Bennouna, J. B. Bachet, F. KhemissaAkouz, D. Pere-Verge, C. Delbaldo, E. Assenat, B. Chauffert, P. Michel, C. Montoto-Grillot
and M. Ducreux (2011). "FOLFIRINOX versus gemcitabine for metastatic pancreatic cancer."
N Engl J Med 364(19): 1817-25.
2. Hingorani, S. R., E. F. Petricoin, A. Maitra, V. Rajapakse, C. King, M. A. Jacobetz, S. Ross, T.
P. Conrads, T. D. Veenstra, B. A. Hitt, Y. Kawaguchi, D. Johann, L. A. Liotta, H. C. Crawford,
M. E. Putt, T. Jacks, C. V. Wright, R. H. Hruban, A. M. Lowy and D. A. Tuveson (2003).
"Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse."
Cancer Cell 4(6): 437-50.
3. Hollingsworth, M. A. and B. J. Swanson (2004). "Mucins in cancer: protection and control of
the cell surface." Nat Rev Cancer 4(1): 45-60.
4. Jonckheere N, Skrypek N, Van Seuningen I.Mucins and tumor resistance to chemotherapeutic
drugs. Biochim Biophys Acta. 2014 Aug;1846(1):142-51.
5. Jonckheere, N., N. Skrypek and I. van Seuningen (2010). "Mucins and pancreatic cancer."
Cancers 2(4): 1794-1812.
6. Jonckheere, N., N. Skrypek, J. Merlin, A. F. Dessein, P. Dumont, E. Leteurtre, A. Harris, J. L.
Desseyn, C. Susini, F. Frenois and I. Van Seuningen (2012a). "The Mucin MUC4 and Its
Membrane Partner ErbB2 Regulate Biological Properties of Human CAPAN-2 Pancreatic
Cancer Cells via Different Signalling Pathways." PLoS One 7(2): e32232.
7. Lahdaoui F, Delpu Y, Vincent A, Renaud F, Messager M, Duchêne B, Leteurtre E, Mariette C,
Torrisani J, Jonckheere N, Van Seuningen I. miR-219-1-3p is a negative regulator of the
mucin MUC4 expression and is a tumor suppressor in pancreatic cancer. Oncogene. 2014
Mar 10;0:1-9.
8. Rahib L, Smith BD, Aizenberg R, Rosenzweig AB, Fleshman JM, Matrisian LM. Projecting
cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas
cancers in the United States. Cancer Res. 2014 Jun 1;74(11):2913-21.
9. Skrypek, N., B. Duchene, M. Hebbar, E. Leteurtre, I. van Seuningen and N. Jonckheere
(2013). "The MUC4 mucin mediates gemcitabine resistance of human pancreatic cancer cells
via the Concentrative Nucleoside Transporter family." Oncogene 32(13): 1714-1723.
10. Vincent, A., J. Herman, R. Schulick, R. H. Hruban and M. Goggins (2011). "Pancreatic
cancer." Lancet 378(9791): 607-20.