Diagnostic Division 13 Mountain View Avenue Orangeburg, NY

Diagnostic Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, NY 10962
http://www.icndiagnostics.com
Coffret SimulTRAC-S pour Radio-Dosage
Vitamine B12 [57Co]/Folates [125I]
Catalog No. 06B254819 - 100 Tube
Catalog No. 06B254932 - 200 Tube
RIA HOT LINE USA ONLY: 1-800-431-1237
Customer support and technical information can be obtained at local ICN Pharmaceuticals,
Inc. offices.
Kindenberatung und technische
Niederlassungen erhältlich.
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Pour toute aide et
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Pharmaceuticals, Inc.
Para información y soporte técnico dirijase a las oficinas locales de ICN Pharmaceuticals,
Inc.
COFFRET SimulTRAC-S POUR RADIO-DOSAGE
VITAMINE B 12 [57Co]/FOLATES [125I]
Destiné au dosage quantitatif et simultané de la Vitamine B12 et des Folates dans du sérum
et du plasma.
Explication Sommaire Du Test
Les carences en vitamine B12 et en folates représentent deux des trois anémies
nutritionnelles sans équivoque dont l'homme peut être atteint, la troisième étant due à une
carence en fer1.
On observe une carence en folates (acide folique) chez environ un tiers des femmes
enceintes, chez la plupart des alcooliques et chez la majorité des individus qui ont un régime
dépourvu de légumes et de fruits crus ou de jus de fruits frais, chez de nombreuses
personnes ayant des lésions structurelles ou fonctionnelles du tiers supérieur de l'intestin
grêle, ainsi que dans un certain nombre d'autres cas2. La mesure des taux de folates
constitue un moyen direct et fiable permettant d'établir l'existence d'une carence en folates
et ce test doit être pratiqué chez tout patient souffrant d'une anémie mégaloblastique, ainsi
que chez tout patient atteint d'anémie, d'hypersegmentation des noyaux granulocytaires et
de carence en fer prouvée3,4.
Il est conseillé de doser la vitamine B12 sérique et les folates érythrocytaires en plus des
folates sériques pour confirmer le diagnostic de carences en folates, dont le traitement
consistera à administrer de l'acide folique.
Un taux de folates érythrocytaires faible peut
également indiquer que le patient souffre d'une carence primaire en vitamine B12, qui bloque
la capacité des cellules à fixer les folates, et dans ce cas, le traitement consiste à administrer
de la vitamine B 12 et non pas de l'acide folique 5.
La carence en vitamine B12 est en général associée à des anémies pernicieuses, des lésions
gastriques, des lésions de l'intestin et des régimes végétariens stricts.
Du point de vue
diététique, on ne trouve de la vitamine B12 en quantité significative, que dans des produits
d'origine animale; par conséquent, un régime purement végé-tarien entraînera, à long terme,
une carence en vitamine B 12.
La mesure du taux sérique de cobalamine "vraie", vitamine B12, à l'exclusion de ses
analogues, est le test le plus utile pour le diagnostic d'une carence en vitamine B12 et
l'exploration des patients présentant une anémie.
Les modifications morphologiques des érythrocytes associées aux carences en vitamine B12
s'observent également dans les carences en acide folique, et il est nécessaire de doser le
taux de cobalamine sérique pour pouvoir déterminer si la mégaloblastose est due à une
carence en B 12, en folates ou aux deux à la fois2,4,8-10.
1
Principe du Test
Dans une analyse par compétition, le réactif de liaison doit avoir une affinité égale pour
l'étalon et pour la substance présente dans l'échantillon. La vitamine B12 ou les folates non
marqués entrent en compétition avec leurs homologues marqués sur le nombre restreint de
sites de fixation disponibles sur l'agent de fixation, ce qui réduit la quantité de vitamine B12
ou de folates marqués liés au réactif.
Par conséquent, la taux de radio-activité liée est
inversement proportionnel à la concentration de l'échantillon du patient ou de l'étalon.
Dans le cas du test radioactif SimulTRAC-S de ICN Pharmaceuticals, Inc. les taux de
vitamine B12 et de folates sont déterminés simultanément dans un seul tube. Les marqueurs
de la Vitamine B12 et des folates, les réactifs de liaison et les étalons sont fournis sous forme
combinée. Les folates sous forme d'acide ptéroylglutamique (PGA) sont utilisés à la fois
comme étalon et comme marqueur dans un mélange pour incubation dont la pH est de 9,3.
A ce pH de liaison, l'acide 5-méthyl-tétrahydro-folique (MTFA) de l'échantillon du patient et
le PGA des étalons ont une affinité égale pour le réactif de liaison lacté 1 1 , les deux
marqueurs: 57Co pour la vitamine B12 et 125I pour les folates produisent chacun une énergie
à des taux que l'on peut facile-ment séparer en utilisant l'un des nom-breux compteurs à
double canal existant sur le marché.
Le coffret SimulTRAC-S de ICN Pharmaceuticals, Inc. utilise un facteur intrinsèque purifié.
La proteine R est retirée par chromatographie d'affinité. Une fois qu'elle est retirée, seul le
facteur intrinsèque purifié est disponible pour la liaison; étant donnée qu'il est spécifique pour
la cobalamine, on peut mesurer un vrai taux de cobalamine 6. Le facteur intrinsèque purifié
et le réactif de liaison des folates ont été fixés de façon covalente sur un support solide.
On peut également utiliser ce coffret pour une carence en folates et ainsi mesurer le taux de
folates érythrocytaires.
Reactifs
A utiliser pour un diagnostic in vitro
1.
2.
Solution de Dithiothreitol, N° réf.: 06B229261. Contient du Dithiothreitol et un
stabilisateur. Volume > 4 mL/ flacon. Un flacon est suffisant pour 100 tubes; un flacon
pour le coffret de 100 tubes et deux flacons pour le coffret de 200 tubes. Conservation:
au réfrigérateur, entre 2 et 8°C; bien refermer le flacon après usage.
Date de
péremption: se reporter à la date indiquée sur le flacon.
Marqueur Vitamine B12/Folates, N° réf.: 06B254827. Chaque flacon contient moins de
1,5 µCi (55,5 kBq) 57Co vitamine B12 et moins de 3 µCi (111 kBq) 125I folates avec un
tampon de borate dans la sérum-albumine* humaine, du dextran, du cyanide de
potassium, un colorant et des conservateurs. Chaque flacon contient plus de 100 mL,
suffisant pour 100 tubes; un flacon par coffret de 100 tubes; 2 flacons par coffret de
200 tubes.
Conservation: Au réfrigérateur entre 2 et 8°C, à l'abri de toute lumière intense. Date de
péremption: se reporter à la date indiquée sur le flacon.
2
3.
A. Solution active de marquage/Solution tampon: Préparation: Ajouter le contenu d'un
flacon de solution de Dithiothreitol dans un flacon de marqueur Vitamine B12/Folates.
Ce volume permet de traiter 100 tubes. Si la totalité du contenu du flacon de
marqueur ne doit pas être utilisée dans les deux semaines qui suivent l'addition de
DTT, diluer une part de solution de Dithiothreitol à chacune des 50 parts de
marqueur. Se référer à la procédure du test pour préparer une solution active de
marquage de formule facile à l'emploi. Conservation: au réfrigéra-teur entre 2 et
8°C, à l'abri de toute lumière intense. Stabilité: deux semaines.
Etalons A-F Vitamine B 1 2 /Folates. Prêt à l'emploi, formulé dans une matrice synthétique
avec du borate de sodium, du chlorure de sodium, et des agents de conservation. Un
flacon par étalon dans chaque coffret. Conservation: au réfrigérateur entre 2 et 8°C,
à l'abri de toute lumière intense. Date de péremption: se reporter aux dates indiquées
sur les flacons.
Concentration
Vitamine B 12
Etalon
Référence N°
Volume
pg/mL
pmol/L
A
06B240516
8 mL
0
0
B
06B242128
4 mL
100
74
C
06B242217
4 mL
200
148
D
06B242314
4 mL
400
296
E
06B242411
4 mL
1000
740
F
06B242519
4 mL
2000
1480
Etalon
A
B
C
D
E
F
4.
5.
Référence N°
06B240516
06B242128
06B242217
06B242314
06B242411
06B242519
Volume
8 mL
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
4 mL
Acide Folique
ng/mL
nmol/L
0
0
1,0
2,3
2,0
4,5
4,0
9,1
10,0
23
20,0
45
Liant (phase solide) Vitamine B12/Folates, N° réf.: 06B254835. Contient un liant de folate
purifié provenant du lait bovin et un facteur intrinsèque porcin purifié fixé
sur un support solide dans un tampon salin de phosphate avec un colorant et des
conservateurs. Chaque flacon contient plus de 20 mL et permet de tester 100 tubes;
Un flacon par coffret de 100 tubes, 2 flacons par coffret de 200 tubes. Bien agiter avant
usage. Conservation: au réfrigérateur entre 2 et 8°C. Date de péremption: se reporter
à la date indiquée sur le flacon.
Réactif neutre, N° réf.: 06B254843. Contient un support solide sans agent de liaison,
formulé à la même concentration en phase solide que le liant, dans un tampon salin
de phosphate avec un colorant et un agent de conservation. Chaque flacon contient
3 mL; un flacon par coffret. Conservation: au réfrigéra-teur entre 2 et 8°C. Date de
péremption: se reporter à la date indiquée sur le flacon.
3
*
ATTENTION :
A MANIPULER COMME AGENT POTENTIELLEMENT INFECTIEUX:
Les matières premières d'origine humaine utilisées pour la fabrication des composants
de cette trousse ont été analysées et révélées négatives en antigène HBs, anticorps
VIH 1/2 et anticorps VHC lors de tests réalisés avec des réactifs homologués.
Toutefois, aucune méthode d'analyse connue ne pouvant garantir l'absence totale
d'agents pathogènes dans des produits d'origine humaine, il faut les manipuler comme
des agents
potentiellement infectieux.
ATTENTION: Composant Radioactif Ce système radio-dosage de ICN Pharmaceuticals,
Inc. contient: Pour le coffret de 200 tubes: moins de 3 uCi (111 kBq) de 57Co et moins
de 6 uCI (222 kBq) de 125I. Pour le coffret 100 tubes: moins de 1,5 uCi (55,5 kBq) de
57
Co et moins de 3 uCi (111 kBq) de 125I.
Ce produit radioactif ne peut être reçu, acquis, détenu et utilisé que par des médecins de
laboratoire ou des hôpitaux pour des analyses cliniques ou de laboratoire in vitro qui ne
demandent pas l'administration interne ou externe du produit ou des radiations émises par
celui-ci à l'homme ou à l'animal. Sa réception, son acquisition, sa détention, son utilisation
et sa transmission sont soumis aux réglementations de la législation française.
ICN Pharmaceuticals, Inc.
Pour information, nous indiquons ci-après un résumé des réglementations américaines:
Ë Ne pas manger, boire, fumer, ni se maquiller dans le local où les produits radioactifs sont
utilisés.
Ë Ne pas se servir de pipettes à aspiration par la bouche pour des solutions
radioactives. Ë Eviter tout contact direct avec tout produit radioactif: utiliser des blouses de
laboratoire et des gants à usage unique. Ë Tout travail radiologique doit être effectué dans
un endroit spécial à l'écart de toute circulation. Ë Les produits radioactifs doivent être stockés
dans leur emballage d'origine en un lieu spécifique.
Ë Tenir un journal dans lequel on
indiquera l'entrée et la sortie de tout produit radioactif. Ë Le matéteriel de laboratoire et la
verrerie que sont soumis à contamination doivent être tenus à l'écart pour éviter toute
contamination croisée par les différents isotopes radioactifs. S'il se produit un débordement
de liquide radioactif, procéder immédiatement au nettoyage conformément aux dispositions
prévues à cet effet.
Ë Tout produit radioactif doit être mis au rebut conformément aux
réglementations légales. Ë
Les récipients non contaminés peuvent être jetés comme du
matériel non radioactif, à condition que les étiquettes et toutes autres marques d'identification
soient retirées.
Matériel et réactifs nécessaires mais non fournis dans le coffret.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Tube en verre sous vide de 5 ou 10 mL, contenant de l'EDTA, de 7 ou 10 mL.
Tubes en polypropylène (12x75mm), à usage unique.
Portoir pour tubes.
Pipettes semi-automatique (au choix de l'utilisateur) à pointes à usage unique pouvant
prélever 1 mL et 0,2 mL.
Agitateur Vortex.
Bain-Marie ou bain de glycérine avec un thermomètre capable de maintenir une
température de 100 ± 2°C.
4
7.
8.
Centrifugeuse pouvant atteindre un force centrifuge d'au moins 1000xg.
Compteur gamma capable de mesurer simultanément ou successivement l'Iode 125
et le Cobalt 57, et disposant de valeurs réglables permettant de séparer les deux
spectres de comptage.
Matériel et réactifs supplémentaires nécessaires pout le dosage des folates érythrocytaires.
1.
2.
3.
4.
Acide ascorbique, ICN Pharmaceuticals, Inc. N° réf.: 06B259110.
Centrifugeuse pour micro-héma-tocrite.
Tubes capillaires héparinés.
Support utilisé pour l'obturation et le transport des tubes microcapillaires.
Prélèvement de l'Echantillon
Les échantillons doivent être prélevés chez des individus à jeûn, étant donné qu'une
absorption alimentaire récente risque d'accroître de façon significative le taux d'acide folique.
La laboratoire doit être informé, le cas échéant, de la présence de radioactivité dans
l'échantillon.
Les échantillons ne doivent pas être prélevés dans de l'acide ascorbique, ni dans du fluorure
en concentration élevée, étant donné que ces deux agents semblent détruire la vitamine B12.
Ne pas utiliser d'échantillons hémolysés.
1.
Préparation de l'échantillon pour analyse
A.
B.
Sérum ou plasma
Prélever le sang dans un tube en verre sous vide de 5 ou 10 mL. Si on prélève
du sérum, laisser le sang former un caillot à température ambiante, dans le tube
fermé pendant 30 à 60 mns. Utiliser de l'EDTA si l'on veut faire une analyse sur
plasma. Centrifuger pendant 10 mns et prélever le sérum ou le plasma.
Hémolysat de sang total (pour dosage des folates érythrocytaires)
Prélever le sang dans un tube en verre sous vide de 5 mL contenant de l'EDTA
(bouchon lavande).
Mesure et noter la valeur de l'hématocrite.
2.
Ajouter 100 µl de sang en suspension à 2 mL de solution récente d'acide
ascorbique à 0,2%. La dilution est alors de 1 pour 21. Renverser plusieurs fois
pour bien mélanger; éviter la formation de mousse. Les échantillons peuvent
être mesurés immédiatement ou dans les 90 minutes qui suivent la préparation
des hémolysats.
Transport des échantillons: Le sérum ou le plasma soigneusement emballés doivent
être transportés congelés du départ à l'arrivée.
5
3.
Conservation des échantillons: avant analyse, conserver les échantillons entre 2 et 8°C.
Si l'on doit garder un échantillon plus de 4 heures, il faut le conserver à -20°C
minimum. A cette température, les échantillons sont stables pendant 6 à 8 semaines.
Ne pas stocker les échantillons dans les congélateurs à dégivrage auto-matique pour
éviter de les soumettre à des cycles de congélation-décongélation.
Procédure de Dosage
Si le compteur possède deux canaux ou plus, il convient de l'étalonner pour compter l'Iode
125 dans un canal et le Cobalt 57 dans un autre. Si le compteur n'a qu'un canal, il faut
l'étalonner de façon à ce que les différents réglages du compteur permettent de compter un
seul isotope à la fois. Dans ce cas, il faudra passer les tubes deux fois.
Tous les réactifs et les échantillons soivent être amenés à température ambiante avant
utilisation; pour minimiser tout risque de détérioration,
éviter de les laisser à cette température plus longtemps que nécessaire. Ne pas mélanger
des réactifs provenant de différents coffrets pour un même dosage.
ATTENTION: La vitamine B 12 et les
folates sont sensibles à la lumière, et ne doivent être soumis qu'à une lumière diffuse et ce
pendant un laps de temps aussi court que possible. Il est préférable de couvrir le portoir à
tubes pendant les étapes d'extraction et de fixation.
Dans le protocole, il est conseillé d'effectuer les mesures des étalons en double.
Les
échantillons des patients doivent étre dosés en double, et la préparation de la courbe étalon
ainsi que les dosages cliniques doivent se dérouler simultanément. Les sérums de contrôle
seront analysés en même temps que les échantillons des patients.
Préparation des Réactifs
Si la totalité du flacon de marqueur ne peut être utilisé dans les 15 jours, utiliser l'équation
suivante pour calculer le volume de DTT qui doit être ajouté au marqueur/tampon (1 mL
marqueur/tube).
mL marqueur utilisé x 4 = mL de DTT à ajouter
100
par exemple,
35 mL de marqueur utilisé x 4 = 1.4
100
Ainsi, il faut ajouter 1,4 mL de DTT à 35 mL de marqueur avant de commencer le dosage.
6
Procédure de Dosage
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Numéroter 16 tubes en poly-propylène pour la courbe étalon. A partir du numéro 17,
numéroter deux tubes supplémentaires pour chaque échantillon clinique.
Ajouter les étalons et les échantillons cliniques conformément aux indi-cations données
dans le tableau suivant.
Ajouter 1000 µl de solution active de marquage/solution tampon dans chaque tube, y
compris les tubes 1 et 2. Mettre les tubes 1 et 2 de côté jusqu'à l'étape 12.
Agiter doucement et couvrir tous les tubes (excepté les tubes 1 et 2) avec une feuille
en aluminium.
Chauffer tous les tubes (excepté les tubes 1 et 2) dans un bain glycériné ou au bainMarie à 100°C pendant 15 minutes; Protéger de la lumière..
Enlever les tubes du bain à 100°C. Rafraîchir à 18-25°C dans un bain d'eau courante.
Ne pas poursuivre le dosage tant que les tubes ne sant pas redescendus à celte
température. Enlever le papier aluminum.
Bien agiter le flacon de réactif neutre. Ajouter 200 µl de réactif neutre aux tubes 3 et
4. Agiter au Vortex.
Bien agiter le flacon de réactif de liaison en phase solide. Attention: Bien agiter.
Ajouter 200 µl de réactif de liaison aux tubes 5 à 16 et les tubes des échantillons.
Agiter au Vortex.
Incuber les tubes 3-16 et tous les tubes échantillons à température ambiante pendant
18-25°C 60 minutes à partir du dernier ajout de réactif de liaison. Recouvrir le portoir
de papier aluminium pour protéger de la lumière, ou le placer dans un endroit sombre.
Centrifuger à au moins 1000 x g pendant 10 minutes, de préférence au frais.
Décanter avec précaution, et jeter le surnageant. Retirer la dernière goutte en posant
les tubes sur un papier absorbant.
Compter la radioactivité dans les tubes 1 et 2, l'un après l'autre à l'aide d'un compteur
gamma. Le nombre total de coups par minute pour les tubes 1 et 2 doit se situer entre
10 000 et 20 000 pour le Cobalt 57, et entre 15 000 et 35 000 pour l'Iode 125 en
fonction de l'appareil et de l'âge du marqueur. On peut utiliser un temps de mesure
plus court, à condition que les nombres de coups pour les tubes 1 et 2 soit au moins
de 10 000 (Nombre total de coups).
Radio-dosage SimulTRAC-S
Tube
1, 2
3, 4
5, 6
7, 8
9,10
11,12
13,14
15,16
Echantillo
ns
cliniques
Etalons
(µl)
Sérum ou
plasma du
patient
(µl)
Solution
active
(µl)
--200A
200A
200B
200C
200D
200E
200F
-----------------
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
1000
---
200
1000
Incub.
Agiter
douceme
nt.
Incuber
tous les
tubes à
100°C
pendant
15 mns.
Refroidir
à (1825°C.)
7
Réactif
neutre
(µl)
Réactif
de
liaison
(µl)
--200
-------------
----200
200
200
200
200
200
---
200
Incub.
Centrif.
Vortex.
Incuber
tous les
tubes à
temperatu
re
ambiante
60 mns
(18-25°C)
--Centrifuge
r tous les
tubes (sf
les tubes
1 & 2) à
1000 x g
10 mns.
Après centrifugation, décanter le surnageant et compter la radioactiveté. Calculer.
Tracer la courbe étalon et déterminer les résultats des patients.
Calcul des Resultats
A.
Vitamine B 12 et folates, sériques ou plasmatiques.
La courbe étalon et les tant de vitamine B12 ceux des folates sont calculés à partir des
résultats obtenus par comptage du Cobalt 57; sont calculés à partir des valeurs
obtenues par comptage de l'Iode 125.
1.
Faire la moyenne des mesures des tubes 3 et 4, qui sont des tubes "blancs".
Soustraire la valeur "blanc" de toutes les autres mesures pour obtenir des mesures
corrigées pour les calculs. REMARQUE: l'unité de temps doit étre indentique pour tous
les tubes.
Faire la moyenne des mesures corrigées des tubes 1 et 2 pour obtenir le nombre de
coups total corrigé pour chaque dosage.
Diviser la moyenne des mesures corrigées des tubes 5 et 6 par le nombre de coups
total corrigé de façon à obtenir le coefficient de niveau de marquage Bo; ce coéfficient
ne doit pas dépasser 35%.
Diviser les mesures corrigées de chaque tube par la moyenne des tubes 5 et 6 pour
obtenir le pour-centage de niveau de marquage de chaque tube.
On peut tracer une courbe étalon comme suit: utiliser du papier logit-log, noter le
pourcentage de niveau de marquage par rapport aux valeurs en pg/mL des étalons de
vitamine B12 ou en ng/mL des étalons de folates sur l'échelle logarithmique.
On
trouvera dans le tableau 1, des valeurs types de nombre de coups et de pourcentages
obtenus par calcul. La courbe étalon tracée à partir de ces données est indiquée en
Figure 1. Dans la pratique, il est préférable de tracer chaque courbe étalon sur une
feuille différente pour éviter tout risque de confusion.
La concentration en vitamine B12 ou en folates dans le sérum ou le plasma est
déterminée par extra-polation à partir de la courbe étalon donnant le pourcentage de
niveau de marquage par rapport à la valeur pg/mL de vitamine B12 ou la valeur en
ng/mL de folates (Figure 1).
Exemple: L'exemple suivant est donné pour un échantillon de folates.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Pour la vitamine B 12, on suit la même procédure de calcul.
Neutre
= cpm tube 3 + cpm tube 4 = 755 + 728 = 742
2
2
Nb coups total corrigé
= (cpm tube 1 - neutre) + (cpm tube 2 - neutre)
2
= (31951 - 742) + (31779 - 742) = 31123
2
8
Bo=niveau de marquage
= Moyenne nb cpm corrigé tubes 5 et 6 X 100
Nb cpm total corrigé
= 16074 X 100 = 51.6%
31123
Calcul du % de marquage
pour le tube 7
=
(nb cpm tube 7 - neutre)
X 100
moyenne nb cpm corrigés tubes 5 et 6
= (12098 - 742) X 100 = 70.6%
16074
Exemple de calcul pour un échantillon clinique:
Nb cpm (trouvé)
= 10796
Neutre
= 742
% marquage
= 10796 - 742 X 100 = 62.5%
10674
La courbe étalon logit-log (Figure 1) indique que 62.5% correspond à une concentration de
folates de 1,49 ng/mL.
La moyenne de cette valeur et de celle effectuée en double donnera la concentration des
folates érythrocytaires en ng/mL de l'échantillon du patient.
B.
Folates érythrocytaires
1.
2.
3.
4.
Diviser les mesures corrigées de l'hémolysat par la moyenne des tubes 5 et 6 pour
obtenir le pourcentage de niveau de marquage de l'hemolysat.
Obtenir la concentration en folates érythrocytaires par extrapolation à partir de la
courbe étalon.
Multiplier la concentration en folates par 21. (Une dilution de sang total dans un
rapport 1 pour 21 a été faite lors de la préparation de l'échantillon). Ceci donne la
concentration des folates en ng/mL de sang total.
Diviser la concentration des folates dans le sang total par l'hématocrite exprimée
sous forme décimale.
Ceci donne la concentration en folates érythrocytaires en
ng/mL.
ng/mL érythrocytaire
= (ng/mL d'hémolysat) x 21
% hématocrite/100
9
Exemple de calcul pour folates érthrocytaires:
Nb cpm (trouvé)
= 6368
Neutre
= 742
% marquage
= 35.0%
La courbe étalon logit-log (Figure 1) indique que 35% correspond à une concentration en
folates de 4.8 ng/mL.
Hématocrite du patient
ng/mL érythorcytaires
= 42%
= 4.8 x 21 = 240 ng/mL
0,42
La moyenne de cette valeur et de celle du deuxième dosage effectué en double donnera
la concentration des folates érythrocytaires en ng/mL de l'échantillon du patient.
REMARQUE: En règale générale, il n'est pas nécessaire de corriger les folates
sériques/plasmatiques étant donné que cette valeur est très faible comparée à celle des
folates érythrocytaires. On observe parfois des taux de folates élevés dans le sérum ou dans
la plasma. Si la concentration de folates dans le sérum ou le plasma est supérieure à 10%
de la concentration en folates érythro-cytaires calculée, il convient de procéder à une
correction sérique comme suit:
ng/mL érythrocytaire
= (ng/mL x 21) - [folates sériques (1-% hématocrite/100)]
% hématocrite/100
Exemple de calcul:
1. Concentration en folates sériques ou plasmatiques
= 32 ng/mL
2.
Concentration en folates
= 3,0 ng/mL
3.
Hématocrite pour le patient en question
= 30%
4.
Concentration en folates érythrocytaires non corrigé:
3,0 ng/mL x 21
30
= 210 ng/mL
10
Etant donné que 32 ng/mL est supérieur à 10% de 210 ng/mL, la concentration en folates
érythrocytaires doit être corrigée comme suit:
ng/mL érythrocytaire corrigé = (3,0 ng/mL x 21) - [32 ng/mL (1-0,3)]
0,30
Folates érythrocytaires corrigés
= 135 ng/mL
Limites de la Procédure
1.
2.
3.
Les méthodes de radiodosage permettant de doser le taux de vitamine B12 dans un
échantillon clinique peuvent donner, pour certaines populations à risques, des valeurs
différentes de celles obtenues lorsqu'on utilise des méthodologies microbiologiques
spécifiques, étant donné que chacune a sa propre zone de référence.
Les valeurs attendues et celles des valeurs de contrôle déterminées par une méthode
de calcul peuvent ne pas être identiques à celles qui auront été calculées par une autre
méthode.
L'exactitude des résultats obtenus avec le coffret SimulTRAC S dépend de la capacité
du compteur gamma à faire la différence entre les désintégrations de l'Iode 125 et
celles du Cobalt 57.
Il faut établir des fenêtres de façon à ce que le Cobalt 57
produise le minimum d'interférence sur le canal prévu pour l'Iode 125 et vice versa. On
peut utiliser la méthode suivante pour éviter les chevauchements:
a.
b.
c.
4.
Régler le compteur gamma pour le comptage de l'Iode 125.
1.
Mesurer la source d'Iode 125
=A
2.
Mesurer la source de Cobalt 57 avec
le réglage Iode 125
=B
Régler le compteur gamma pour comptage du Cobalt 57.
1.
Mesurer la source de Cobalt 57
=C
2.
Mesurer la source d'Iode 125 avec le
réglage Cobalt 57
=D
Calculer le chevauchement.
1.
Du Cobalt 57 sur l'Iode 125
=B X 100
C
2.
De l'Iode 125 sur le Cobalt 57
=D X 100
A
Le chevauchement ne doit pas dépasser 3% pour l'un ou l'autre des canaux. Si on
détecte un chevauchement supérieur à 3%, le réglage de la fenêtre doit être réduit,
sinon il faut appliquer une méthode de correction mathématique.
Les sources de
Cobalt 57 peuvent être fournies sur demande.
Il faut être vigilant dans le choix des sérums de contrôle pour folates que l'on trouve
dans le commerce. En effet, certains d'entre eux ont été préparés à partir de 5-méthyltétrahydrofolate (MFTA), instable, qui entraîne des résultats particulière-ment bas.
D'autres sérums préparés à partir d'acide ptéroylglutamique mais analysés à un pH de
7,4 avec des étalons de MFTA se verront attribuer un taux de folates trop élevé par le
11
fabricant.
Ces sérums de contrôle donneront un taux de folates inférieur à celui
indiqué dans la notice d'emploi.
Valeurs Prévues
Il est conseillé à chaque laboratoire d'établir lui-même ses propres normes pour interpréter
ses résultats, mais les zones de normalité indiquées ci-après peuvent servir de guide. La
zone de normalité pour les folates sériques a été déterminée à partir des valeurs centrales
obtenues sur 95% d'une population de 122 volontaires considérés comme normaux sur le
plan hémato-logique.La zone prévue pour les folates érythro-cytaires a été déterminée par
dosage des hémolysats de sang total de 122 individus considérés comme normaux sur le
plan hématologique. 95% des valeurs normales se situaient entre 110 et 700 ng/mL.
Interprétation
Faible
Normal
Folates sériques,
ng/mL
<1,8
>1,8
Folates
érythrocytaires,
ng/mL
<110
>110
Pour les valeurs prévues pour la vitamine B12 sérique (cobalamine "vraie"), deux populations
ont été utilisées.
La première était constituée de 39 individus souffrant de carence en
vitamine B12, et dont le diagnostic avait été confirmé, que ce soit des anémies pernicieuses,
des lésions gastriques ou intestinales, ou des états pathologiques associés à une carence
en vitamine B12. On a utilisé le percentile 95 estimé sur cette population pour définir la limite
supérieure de la zone de carence.
La seconde population était constituée de 122 hommes et femmes volontaires sains âgés
de 19 à 60 ans, ne suivant pas de régime alimentaire particulier. Les volontaires ont été
jugés normaux sur le plan hématologique par rapport aux critères habituels des laboratoires.
La zone normale a été définie à partir de 95% des résultats centraux de cette population. La
zone d'indétermination a été définie comme étant la zone située entre la zone de carence et
la zone de normalité.
Interprétation
Faible
Indéterminé
Normal
Elevé
Vitamine B 12 pg/mL
<130
130 - 200
200 - 900
>900
Une étude comparative a mis en parallèle le dosage SimulTRAC
microbiologique par Euglena Gracilis. Ces résultats sont donnés en Figure 2.
S
et
le
dosage
Des taux de vitamine sérique très supérieurs à 1000 pg/mL indiquent soit une affection
hépatique, soit un syndrome myéloprolifératif tel que la polyglobulie, la
métaplasie myéloïde ou la leucémie
12
myéloïe chronique.
Des taux supérieurs à 4000 pg/mL sont rares dans les affections
hépatiques, mais sont courants dans les syndromes myéloproliératifs8,9,12,13.
Chaque fois que les donníes due laboratoire sont en contradiction avec le diagnostic clinique,
le jugement clinique doit primer et des explorations complémentaires doivent être entreprises.
Caractéristiques et Performances Spécifiques
Exactitude:
1.
2.
La comparaison des résultats obtenus pour la vitamine B12 avec ce coffret et ceux
obtenus avec le coffret de dosage RIA SimulTRAC pour la cobalamine "vraie" (N° réf.:
06B242039) a donné les résultats d'analyse de régression suivants (x = SimulTRAC,
y = SimulTRAC-S):
Nombre d'échantillons
= 116
Coéfficient de corrélation
= 0,98
Pente
= 1,07
Intercept-y
= -15
La comparaison des résultats de la vitamine B12 obtenus avec ce coffret et ceux
obtenus avec le dosage microbiologique avec Euglena Gracilis14 a donné les résultats
d'analyse de régression suivants (x = dosage microbiologique, y = SimulTRAC-S):
Nombre d'échantillons
= 132
Coéffieient de corrélation
= 0,97
Pente
= 1,23
Intercept-y
= -22
39 échantillons sur les 132 observés ont été pris à partir de malades souffrant d'anémie
pernicieuse ou d'autres maladies associés à un manque de vitamine B 12.
3.
La comparaison des résultats du folate sérique obtenu avec ce coffret et ceux obtenus
avec le coffret SimulTRAC a donné les résultats suivants: (x = SimulTRAC, y =
SimulTRAC-S):
Nombre d'échantillons
= 111
Coéffieient de corrélation
= 0.95
Pente
= 0,79
Intercept-y
= 0,44
13
Précision
1. Variation intra-dosage
La précision intra-dosage a été déterminée à partir de 5 sérums de contrôle et un
faible sérum de B 12.
A. Vitamine B 12
Contrôle 1
Contrôle 2
Contrôle 3
Contrôle 4
Sérum
20
168
14
8,3
19
388
21,7
5,6
20
529
29
5,5
20
1016
44
4,3
18
99,6
7,1
7,1
Contrôle 1
20
0,46
0,064
13,9
Contrôle 2
19
0,98
0,095
9,7
Contrôle 3
20
4,93
0,225
9,7
Contrôle 4
20
11,4
0,58
5,1
Sérum
18
3,55
0,17
4,8
N
moyenne,
pg/mL
Ecart-type
C.V. %
B. Folate
N
moyenne,
ng/mL
Ecart-type
C.V. %
2.
Variation inter-dosages
La précision inter-dosages a été déterminée à partir de 5 sérums de contrôle et un
faible sérum de B 12.
A. Vitamin B 12
N
moyenne,
pg/mL
Ecart-type
C.V. %
Contrôle 1
20
158
18
11,4
Contrôle 2
34
390
29
7,4
Contrôle3
20
529
34
6,4
14
Contrôle 4
34
592
33
5,6
Contrôle 5
34
950
48
5,1
Sérum
13
108
16
14,8
B. Folate
N
moyenne,
ng/mL
Ecart-type
C.V. %
Contrôle 1
20
0.52
0.09
17.3
Contrôle 2
34
1,02
0,12
11,8
Contrôle 3
20
4,94
0,27
5,5
Contrôle 4
34
3,81
0,23
6,0
Contrôle 5
34
10,77
0,75
7,0
Sérum
13
3,84
0,34
8,9
Récupération
Un échantillon de sérum a été additionné de cyanocobalamine et un autre de MFTA.
a calculé le pourcentage de récupération selon la formule suivante:
On
Trouvé - Endogène x 100
Ajouté
Vitamine B 12
Ajout
0
200
400
1000
Trouvé
339
547
714
1312
Attendu
--539
739
1339
MFTA
%
Récupération
--104
94
97
Ajout
0
1.2
4.8
12.0
Trouvé
0,5
1,79
5,95
12,48
Attendu
--1,7
5,3
12,5
%
Récupération
--108
114
100
Spécificité:
L'acide 5-Méthyltetrahydrofolique
pour le liant dans ce test11.
et
l'acide
ptéroylglutamique
ont
une
affinité
équivalente
Le facteur intrinsèque porcin utilisé dans ce coffret est purifié par affinité
chromatographique et contient moins de 5% de protéine R.
Le degré de pureté a été
établi en fonction des critères proposés par le Comité National Américan pour les Etalons
Cliniques des Laboratoires15.
Le coffret de radiodosage SimulTRAC-S de ICN Pharmaceuticals, Inc. contient un facteur
intrinsèque qui mesure 10.000 pg/mL de cobinamide (un analogue de la vitamine B12) à
moins de 75 pg/mL lorsqu'on le mesure avec une courbe d'étalonnage construite à partir
des étalons de cobalamine. De plus, la vitamine B12 liée est utilisée à plus de 95% par un
anticorps bloquantspécifique anti-IF.
Des études complémentaires ont montré que la cobinamide (un analogue de la vitamine
B12) avait une réaction croisée de moins de 0.02% lorsqu'on utilisait le coffret SimulTRACS de ICN Pharmaceuticals, Inc.
15
Sensibilité:
La sensibilité définie par une concentration à 90% du marquage est de 60 pg/mL pour la
B12 et de 0.25 ng/mL pour les folates.
16
TABLE 1
SimulTRAC-S SOLID PHASE RADIOASSAY KIT:
TABULATED DATA*
Vitamin B 12 [57Co] Data
Tube
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Sample
17
18
cpm
Corrected
cpm
Average
cpm
20012
20289
479
464
9154
9173
7571
7587
6506
6278
5048
5085
3358
3505
2453
2388
19540
19817
----8683
8702
7100
7116
6035
5807
4577
4614
2887
3034
1982
1917
19679
6499
6523
6027
6051
% Bound
% Trace
Binding
472
8693
44.2
81.7
81.9
69.4
66.8
52.7
53.1
33.2
34.9
22.8
22.0
69.3
69.6
17
Vitamin B 12
pg/mL pmol/L
Blank
Blank
Trace
Trace
100
100
200
200
400
400
1000
1000
2000
2000
Blank
Blank
Trace
Trace
74
74
148
148
296
296
740
740
1480
1480
197
195
145
144
TABLE 1
SimulTRAC-S SOLID PHASE RADIOASSAY KIT:
TABULATED DATA*
Folate [125I] Data
Tube
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Sample
17
18
cpm
Corrected
cpm
Average
cpm
31951
31779
755
728
16641
16991
12098
12385
9699
9721
6887
6646
4001
4185
2644
2590
31209
31037
----15899
16249
11356
11643
8957
8979
6145
5904
3259
3443
1902
1848
31123
10924
10668
10182
9926
% Bound
% Trace
Binding
742
16074
70.6
72.4
55.7
55.9
38.2
36.7
20.3
21.4
11.8
11.5
Blank
Blank
Trace
Trace
1.0
1.0
2.0
2.0
4.0
4.0
10.0
10.0
20.0
20.0
Blank
Blank
Trace
Trace
2.3
2.3
4.5
4.5
9.1
9.1
23
23
45
45
63.3
61.8
1.44
1.54
3.3
3.3
51.6
18
Folate
ng/mL nmol/L
FIGURE 1
SimulTRAC-S VITAMIN B 12/FOLATE RADIOASSAY
TYPICAL STANDARD CURVES WITH LOGIT-LOG TRANSFORMATION
19
FIGURE 2
20
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
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21
Manufactured by:
ICN Pharmaceuticals, Diagnostics Division
13 Mountain View Avenue
Orangeburg, New York 10962-1294
Customer Service
Fax:
Technical Service:
(800) 888-7008
(949) 260-1079
(800) 437-1705
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QER Q01-243
4/02
22