La rhinopneumonie équine
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La rhinopneumonie équine
Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1993, 12 (2), 493-504 La rhinopneumonie équine : épidémiologie moléculaire et diagnostic par sondes moléculaires à partir d'organes S. ZIENTARA et C. SAILLEAU * Résumé : Les auteurs rappellent brièvement les formes cliniques de la rhinopneumonie équine et présentent les modifications de la nomenclature des herpèsvirus équins. Ils décrivent l'intérêt des profils de restriction dans le cadre d'études épidémiologiques en prenant l'exemple de souches virales isolées en France. D'autre part, sont présentées une méthodologie d'obtention de sondes moléculaires ainsi que l'utilisation de ces sondes comme outils de diagnostic direct à partir de prélèvements biologiques. MOTS-CLÉS : Diagnostic - Herpèsvirus équins - Profils de restriction Rhinopneumonie équine - Sondes moléculaires. INTRODUCTION A l'origine de troubles respiratoires, abortifs ou nerveux, les herpèsvirus équins (ou equine herpes virus) 1 et 4 ( E H V - 1 et E H V - 4 ) sont responsables de lourdes p e r t e s économiques à la fois au niveau de l'élevage et de l ' e n t r a î n e m e n t . Bien q u e la vaccination soit maintenant largement répandue, les faibles propriétés immunogènes et la biologie de ces herpèsvirus (notamment les phénomènes de latence - réactivation) expliquent l'apparition régulière d'épizooties dans les régions d'élevage. Depuis une dizaine d'années, la biologie moléculaire a permis, d'une part de mieux appréhender le monde des herpèsvirus en général et des herpèsvirus équins en particulier et, d'autre part, de disposer d'outils moléculaires susceptibles d'améliorer considérablement le diagnostic de ces infections. LES DIFFÉRENTS HERPÈSVIRUS ÉQUINS ET L'ÉVOLUTION DE LA NOMENCLATURE Les herpèsvirus des différentes espèces animales ont des caractéristiques structurales communes : un corps c o n t e n a n t une molécule d'acide désoxyribonucléique ( A D N ) linéaire double brin, une capside icosaédrique et une enveloppe hérissée de spicules * Centre national d'études vétérinaires et alimentaires, Laboratoire central de recherches vétérinaires, 22, rue Pierre-Curie, 94703 Maisons-Alfort, France. 494 glycoprotéiques. Cette famille des Herpesviridae est divisée en trois sous-familles en fonction de leurs propriétés biologiques (16) : les alpha herpesvirinae, les bêta herpesvirinae et les gamma herpesvirinae. Depuis une dizaine d'années, la classification des herpèsvirus équins a évolué en même temps que se précisaient les connaissances sur le génome et la biologie de ces virus et qu'étaient isolés de nouveaux virus, notamment à partir d'asins (15). TABLEAU I Les différents herpèsvirus (24) Génome Sousfamille G +C Herpesvirus équin 1 EHV-1 ; virus de l'avortement a Herpesvirus équin 2 EHV-2 ; cytomegalovirus Herpesvirus équin 3 EHV-3 ; virus de l'exanthème coital Herpesvirus équin 4 Groupe Taille (kb) 57 D 142 ß a 57 A 192 66 D 148 EHV-4 ; virus de la rhinopneumonie équine a 56 D 148 Herpesvirus équin 5 EHV-5 Herpesvirus équin 6 HV-1 asinien ß a Herpesvirus équin 7 HV-2 asinien Herpèsvirus équin 8 HV-3 asinien Désignation Nom commun (%) 150 ß a G + C (% ) : pourcentage de guanine + cytosine kb : kilobase Huit herpèsvirus ont été décrits dans la famille des équidés (Tableau I). Chez le cheval, les principaux virus sont les suivants : - le virus E H V - 1 ou virus de l ' a v o r t e m e n t , r e s p o n s a b l e é g a l e m e n t d e troubles respiratoires ou nerveux, - le virus EHV-2, ou cytomégalovirus, dont le pouvoir pathogène est peu connu, - le virus E H V - 3 , ou virus de l ' e x a n t h è m e coïtal, à l'origine vénériennes, d'infections - le virus EHV-4, ou virus de la rhinopneumonie équine stricto sensu, à l'origine de troubles respiratoires essentiellement (mais parfois isolé chez des avortons). Les deux herpèsvirus EHV-1 et EHV-4, responsables de la rhinopneumonie équine au sens large, sont à l'origine d'énormes pertes économiques et sont l'objet de très n o m b r e u x travaux de recherche, n o t a m m e n t dans le domaine de l'immunologie, la prophylaxie médicale pouvant parfois s'avérer déficiente. Les sous-types 1 et 2 d'un même virus dit de la rhinopneumonie équine sont décrits depuis une vingtaine d'années et ont pu être différenciés par la t e c h n i q u e de neutralisation sérologique. L'analyse des variations génétiques des A D N génomiques 495 de ces deux sous-types viraux, initialement p a r l'emploi d'enzymes de restriction (18,20) puis par séquençage, a permis ultérieurement de modifier la taxonomie virale et de distinguer les sous-types 1 et 2 en deux virus, EHV-1 et EHV-4 respectivement. LES FORMES CLINIQUES DE LA RHINOPNEUMONIE La rhinopneumonie se manifeste sous diverses formes cliniques dont l'épidémiologie est différente. La forme respiratoire La forme respiratoire affecte le poulain nouveau-né et le poulain d'un an au cours de l'automne et de l'hiver. Les adultes sont plus rarement atteints. Après deux à vingt jours d'incubation, le cheval présente une hyperthermie pouvant atteindre 40,5 °C à 41 °C pendant cinq à sept jours. Apparaissent ensuite un jetage séreux abondant, parfois du larmoiement, et une toux sèche et improductive qui peut être déclenchée par palpation du pharynx. La maladie évolue en une à deux semaines. Cette évolution est rarement fatale. Il est toutefois possible d'observer des complications, sous la forme de rhinite mucopurulente due à u n e infection b a c t é r i e n n e secondaire ( s t r e p t o c o q u e s ) , de pharyngite purulente, d'atteinte des poches gutturales, de toux persistante, de bronchopneumonie et de pneumonie interstitielle chez le poulain nouveau-né. La forme abortive En F r a n c e , le virus E H V - 1 est la p r e m i è r e cause d ' a v o r t e m e n t d'origine virale chez le cheval. La prévalence varie d'une a n n é e à l'autre et d é p e n d de l'apparition d'épizooties (7, 12, 13). D a n s de rares cas, le virus E H V - 4 p e u t é g a l e m e n t être à l'origine d'avortement (1,20). e e L'avortement survient généralement entre le 6 et le 1 1 mois de gestation avec une plus grande fréquence entre le 8 et le 1 0 mois. La j u m e n t ne présente aucun signe précurseur. Le fœtus est expulsé rapidement, suivi du placenta. e e Dans le cas d'infections tardives de l'utérus et du fœtus, le poulain, à la naissance, est faible, hypotrophique ou apparemment sain. Mais rapidement, il cesse de téter, ne peut se tenir sur ses membres, présente une détresse respiratoire, parfois de la diarrhée et meurt en quelques jours. La forme nerveuse La forme nerveuse est caractérisée par de la parésie, de l'incoordination motrice, de la paralysie et peut entraîner la mort. Elle peut apparaître chez des poulinières après avortement mais aussi, après des troubles respiratoires, chez des chevaux ou des juments de tout âge. En France, dominent les formes respiratoires et abortives qui ont pour conséquence, chaque année, de sérieuses pertes économiques, tant au haras qu'à l'entraînement. Les mesures sanitaires préventives ainsi que le développement de la prophylaxie médicale à l'aide de vaccins (virus atténués, virus inactivés, sous-unités virales et bientôt virus recombinants) permettent de diminuer l'incidence de cette pathologie. 496 LA LATENCE DES HERPÈSVIRUS U n e des propriétés communes à l'ensemble des herpèsvirus des mammifères est leur capacité à persister dans l'organisme, dans des sites spécifiques (leucocytes, neurones) à l'état quiescent (8). Ce p h é n o m è n e de latence virale est très i m p o r t a n t dans l'épidémiologie de ces infections. Après plusieurs mois ou années, le virus va retrouver sa virulence, suite à une réactivation dont les causes sont mal connues. Chez le cheval, les virus EHV-1 et EHV-4 peuvent être hébergés par leur hôte dans un état de non réplication. Après réactivation, les animaux infectés constituent une source dangereuse d'infection dans un troupeau. Le prototype des alpha herpèsvirus (le virus herpes simplex humain) est connu pour entraîner une infection latente des ganglions nerveux chez l'Homme, la souris et lé lapin (11,17,24). D e n o m b r e u x auteurs ont m o n t r é que l'administration de fortes doses de corticostéroïdes à des chevaux sains permettait de réactiver et de réisoler les virus EHV-1 et E H V - 4 (5,6). Contrairement à de nombreux autres alpha herpèsvirus, les virus EHV-1 et EHV-4 ne semblent pas présenter de neurotropisme. Les lésions du système nerveux central dans les formes neurologiques de la r h i n o p n e u m o n i e sont, semble-t-il, la conséquence de vascularites dues à la multiplication du virus EHV-1 dans les cellules endothéliales et non à une infection des neurones par ce virus (9,14). PROFILS DE RESTRICTION ET ÉPIDÉMIOLOGIE MOLÉCULAIRE Le développement spectaculaire de la biologie moléculaire depuis dix ans a permis de mieux a p p r é h e n d e r le m o n d e des herpèsvirus équins. Les p r e m i e r s travaux de comparaison de souches par profil de restriction datent de 1981 (18,20,21). La possibilité d'identifier les deux types viraux sans ambiguïté - et ceci de façon plus précise que par des méthodes sérologiques - permet de mieux cerner l'épidémiologie de ces virus. En effet, les enzymes de restriction sont des endonucléases bactériennes qui clivent l ' A D N en des sites très spécifiques (de quatre à six paires de bases en moyenne). Les fragments d ' A D N génomique ainsi obtenus peuvent être séparés en fonction de leur poids moléculaire et visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose en présence de bromure d'éthidium. La perte ou l'acquisition de sites de restriction, conséquences d'une modification de la séquence génétique de l ' A D N viral, se traduit par une modification du profil de restriction (disparition ou apparition de nouveaux segments d ' A D N ) . Ainsi, la comparaison des profils électrophorétiques de différentes souches virales permettra de les classer selon leurs différences génétiques. 497 C'est ainsi que les deux sous-types 1 et 2 du virus E H V - 1 ont été reconnus comme étant deux virus distincts du cheval, respectivement EHV-1 et EHV-4. D ' a u t r e p a r t , la variabilité g é n é t i q u e de ces virus a pu être confirmée p a r la comparaison des profils de restriction de souches virales avant et après de nombreux passages en cultures cellulaires hétérologues (10,23). Par contre, A l l e n et coll. ont m o n t r é que le g é n o m e du virus E H V - 1 était suffisamment stable lors de la réplication du virus en cultures cellulaires d'origine équine p o u r p e r m e t t r e d'utiliser les profils de restriction c o m m e m é t h o d e de comparaison de souches virales entre elles (2). Les Figures 1 et 2 représentent les profils de restriction de vingt souches virales de EHV-1 isolées au Laboratoire central de recherches vétérinaires à partir d'écouvillons respiratoires ou d'organes d'avortons. Seule la souche n° 15 (Fig. 1 et 2) est un virus EHV-4 de référence. Deux enzymes furent utilisées pour analyser ces virus (Bam H 1 et Pst 1). La première a permis de différencier les virus EHV-1 et EHV-4 (11,20). L'enzyme Pst 1, q u a n t à elle, n ' a jamais été employée et possède un très grand nombre de sites de restriction sur l ' A D N du virus E H V - 1 induisant un profil de restriction particulièrement chargé en fragments génomiques, p e r m e t t a n t ainsi une comparaison très précise entre les souches. Toutes les souches isolées en France ont un profil de restriction comparable à celles décrites par Allen et coll. (1) sous le nom de «profil type EHV-1.1P». Un autre profil variant a été décrit simultanément, le profil 1 B, qui n'a pas été observé dans la présente étude. M : marqueurs de poids moléculaire N° 1 à 14 : souches d'herpèsvirus équin 1 N° 15 : souche d'herpèsvirus équin 4 FIG.l Profils de restriction obtenus par digestion par l'enzyme Bam H 1 de l'acide désoxyribonucléique génomique de 14 souches d'herpèsvirus équin 1 et d'une souche d'herpèsvirus équin 4 498 M : marqueurs de poids moléculaire N° 1 à 14 : souches d'herpèsvirus équin 1 N° 15 : souche d'herpèsvirus équin 4 FIG.2 Profils de restriction obtenus avec l'enzyme Pst 1 de 14 souches d'herpèsvirus équin 1 et d'une souche d'herpèsvirus équin 4 UTILISATION DE SONDES MOLÉCULAIRES POUR LE DIAGNOSTIC DIRECT À PARTIR D'ORGANES Dans le but d'améliorer la sensibilité et la spécificité des méthodes de diagnostic, et grâce aux possibilités techniques qu'offrent les outils moléculaires, les auteurs ont développé des sondes moléculaires en vue de caractériser, à partir d'échantillons cliniques, les virus EHV-1 et EHV-4 (Fig. 3). Méthodologie d'obtention des sondes moléculaires L ' A D N génomique d'une souche de virus E H V - 1 isolée au Laboratoire central de recherches vétérinaires à partir d'un avorton est extrait après deux passages en cultures cellulaires et traitement au sodium dodécyl sulfate (SDS) et à la protéinase K, par le phénol/chloroforme. L ' A D N , précipité par l'alcool, est soumis à une digestion totale par l'enzyme Pst 1. Les fragments d ' A D N ainsi o b t e n u s sont insérés dans un vecteur de clonage (le plasmide p B R 322). Le vecteur recombinant (ADN messager + plasmide) est transfecté dans des bactéries (Escherichia coli) afin d'amplifier les inserts d'origine virale. Les bactéries transformées sont mises en culture sur des boîtes c o n t e n a n t le milieu nécessaire à leur croissance et en présence du m a r q u e u r de sélection (dans le cas présent, l'ampicilline). Les bactéries ayant intégré un plasmide r e c o m b i n a n t ne se diviseront pas en présence d'ampicilline, les bactéries ayant un plasmide sans insert se diviseront en présence de tétracycline et d'ampicilline. 499 EHV-l ADN AMP TET pBR 322 R R : herpèsvirus équin 1 : acide désoxyribonucléique : gène de résistance à l'ampicilline : gène de résistance à la tétracycline : plasmide, vecteur de clonage FIG.3 Méthodologie d'obtention des sondes moléculaires 500 L ' A D N plasmidique recombinant, contenu dans les clones sélectionnés, sera digéré par l'enzyme de restriction Pst 1 et la taille des fragments insérés p o u r r a être déterminée (Fig. 4). Les inserts sont localisés (après transfert sur gel de nitrocellulose par la méthode du Southern blot et hybridation moléculaire) sur l ' A D N génomique viral : chaque insert est utilisé comme sonde et hybridé avec l'ADN génomique digéré par les enzymes Pst 1 et Bam H 1 (dont les sites de restriction sur l'ADN du virus EHV-1 sont connus). Par comparaison, pour un insert donné, entre les régions d'hybridation sur l'ADN digéré par Pst 1 et B a m H 1, les inserts obtenus par Pst 1 peuvent être localisés sur la carte de restriction par Bam H 1 du virus E H V - 1 . M : marqueurs Colonnes 1 et 17 : souche d'herpèsvirus équin 1 Colonnes 2 à 16 : acide désoxyribonucléique plasmidique et inserts FIG. 4 Analyse par électrophorèse sur gel d'agarose des fragments de l'acide désoxyribonucléique d'herpèsvirus équin 1 clonés dans le plasmide pBR 322 après digestion par l'enzyme Pst 1 Utilisation des sondes pour le diagnostic direct Les différentes sondes o b t e n u e s ont été soumises à un m a r q u a g e radioactif, dit marquage à chaud (avec des atomes radioactifs comme le P par exemple) ou à un marquage non radioactif, dit marquage à froid. Ce dernier offre l'avantage de ne pas utiliser de radionucléides qui, o u t r e le danger que r e p r é s e n t e leur manipulation, imposent de disposer de locaux agréés et de respecter des n o r m e s de protection particulièrement contraignantes pour le personnel du laboratoire. 3 2 Les procédés de marquage à froid ont considérablement évolué ces dernières années et rendent les sondes froides pratiquement aussi sensibles que les sondes chaudes. 501 Les organes d'avortons (foie, p o u m o n s , thymus, etc.) sont broyés et l ' A D N total (cellulaire et é v e n t u e l l e m e n t viral) en est extrait selon le p r o t o c o l e décrit précédemment. L ' A D N est fixé sur un filtre de nitrocellulose qui est introduit dans un sachet en plastique dans lequel sont versées les solutions de p r é h y b r i d a t i o n et d'hybridation contenant les sondes (Fig. 5 ; dans cet exemple, des sondes chaudes sont utilisées). Le sachet est scellé par la chaleur et incubé à une température permettant l'hybridation. Ensuite, les filtres sont lavés, séchés et mis en contact avec des films radiophotographiques à - 70 °C pendant 24 heures. FIG. 5 Détection de l'acide désoxyribonucléique de l'herpèsvirus équin 1 à partir d'organes d'avortons avec l'une des sondes Les échantillons cliniques sont numérotés de 1 à 19. Le dépôt témoin n° 20 correspond à de l'acide désoxyribonucléique total extrait d'organes non infectés (foie et poumons) La Figure 5 présente les résultats des hybridations (épreuves du dot blot). Aucune hybridation n'est décelée avec l ' A D N total extrait de foie non infecté (n° 20) ; il existe une très bonne corrélation entre les organes réagissant à l'épreuve du dot blot (n° 1,3, 5 à 9, et 12 à 19) d'une part et l'isolement de virus à partir de ces mêmes échantillons cliniques d ' a u t r e part. A partir des échantillons n° 2, 4 , 1 0 et 11, aucun virus n'a pu être réisolé, les titres viraux é t a n t p a r t i c u l i è r e m e n t faibles (inférieurs à 10 doses cytopathogènes 50/ml). 2 Les outils moléculaires p e r m e t t e n t de d é t e c t e r l'acide nucléique g é n o m i q u e directement, c'est-à-dire qu'il n'est pas nécessaire que le virus soit encore infectieux. Les conditions d'envoi et de conservation des échantillons cliniques (notamment pour 502 les pays chauds) ne sont donc plus des facteurs pouvant limiter la mise en évidence au laboratoire de l'agent pathogène. Le délai de réponse est considérablement diminué puisque 24 à 48 heures peuvent suffire pour donner une réponse. C e p e n d a n t , la sensibilité des sondes p e u t être quelquefois inférieure au simple isolement par culture cellulaire et, dans certains cas, des produits biologiques peuvent inhiber la réaction d'hybridation. D'autre part, la spécificité de la réaction d'hybridation moléculaire peut être réduite lorsque la sonde s'hybride de façon non spécifique avec un acide nucléique hétérologue de séquence voisine. L'amplification génique (amplification en chaîne par polymérase : P C R ) s'avère p r o m e t t e u s e p o u r le diagnostic direct à partir d'écouvillons respiratoires ou d'échantillons cliniques (4,19). La connaissance des phénomènes pathogéniques des infections à E H V (notamment les phénomènes de latence - réactivation) sera sans nul doute favorisée par cette méthode qui s'avère rapide, sensible et spécifique (22). - CONCLUSION G r â c e au spectaculaire d é v e l o p p e m e n t de la biologie moléculaire et plus précisément des biotechnologies, les connaissances fondamentales en virologie générale ont considérablement évolué. La virologie animale a profité de ces progrès techniques et les m é t h o d e s de diagnostic se sont affinées (sondes, P C R mais aussi anticorps monoclonaux). E n ce qui concerne les herpèsvirus équins, leur structure g é n o m i q u e et leur biologie ont fait l'objet de n o m b r e u x travaux qui ont considérablement enrichi nos connaissances. L'épidémiologie, par l'analyse génétique des souches virales isolées, peut désormais être mieux comprise et l'efficacité des méthodes de prophylaxie médicale davantage appréciée. Quant au diagnostic, grâce à l'emploi de sondes moléculaires et de la PCR, il sera considérablement amélioré, à la fois par la rapidité, la sensibilité, la spécificité et la facilité qui définissent ces nouvelles méthodes. REMERCIEMENTS Nous tenons à exprimer nos profonds remerciements pour leur aide et leurs conseils aux D o c t e u r s C. Crucière et E. Plateau, ainsi q u ' a u D o c t e u r A. J a c q u e t (Institut Pasteur) pour son analyse critique du manuscrit. * * * E Q U I N E R H I N O P N E U M O N I T I S : M O L E C U L A R E P I D E M I O L O G Y AND DIAGNOSIS BY MEANS OF MOLECULAR PROBES PREPARED FROM ORGANS.S. Zientara and C. Sailleau. Summary: The authors briefly review the clinical forms of equine rhinopneumonitis and indicate changes in the nomenclature of equine herpesviral infections. The value of restriction profiles for epidemiological studies is described, taking as an example the strains of virus isolated in France. 503 A technique is given for preparing molecular probes, as well as the application of these probes in direct diagnosis from biological specimens. KEYWORDS : Diagnosis - Equine herpesvirus - Equine rhinopneumonitis Molecular probes - Restriction profiles. * LA R I N O N E U M O N Í A E Q U I N A : E P I D E M I O L O G Í A M O L E C U L A R Y DIAGNÓSTICO POR SONDAS MOLECULARES A PARTIR D E ÓRGANOS. S. Zientara y C. Sailleau. Resumen: Los autores recuerdan brevemente las formas clínicas de la rinoneumonía equina y presentan las modificaciones de la nomenclatura de los herpesvirus equinos. Muestran el interés de los perfiles de restricción en el marco de estudios epidemiológicos tomando como ejemplo cepas virales aisladas en Francia. Por otra parte, presentan una metodología de obtención de sondas moleculares así como de utilización de estas sondas como herramientas de diagnóstico directo a partir de muestras biológicas. P A L A B R A S C L A V E : Diagnóstico - Herpesvirus equinos - Perfiles de restricción - Rinoneumonía equina - Sondas moleculares. * * * BIBLIOGRAPHIE 1. ALLEN G.P., YEARGAN M.R., TURTINEN M.S., BRYANS J.T. & MCCOLLUM W.H. ( 1 9 8 1 ) . - Molecular epizootiologic studies of equine herpesvirus-1 infections by restriction endonuclease fingerprinting of viral DNA. Am. J. vet. Res., 44 ( 2 ) , 2 6 3 - 2 7 1 . 2. ALLEN G.P., Y E A R G A N M.R. & BRYANS J . T . 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