Nouveaux tests globaux de l`hémostase: génération de thrombine

Nouveaux tests globaux de
l’hémostase:
génération de thrombine,
thromboélastogramme, microparticules
ARL 16/03/06
Nouveaux tests globaux de
l’hémostase
• Mesure de la génération de thrombine dans le
plasma pauvre en plaquettes (PPP) et le plasma
riche en plaquettes (PRP)
• Thromboélastogramme: étudie le sang total
• Mesure des microparticules procoagulantes
dans le sang
Pourquoi des nouveaux tests
en hémostase ?
• Les tests d’exploration de l’hémostase que
nous utilisons ont une performance limitée
et un caractère statique.
• La thrombomoduline et les autres
partenaires du pool vasculaire sont absents
de ces tests.
• Nous avons besoin de tests plus proches de
la réalité physiologique.
La réalité physiologique
K.G. Mann et al. BCMD 2006
Formation du caillot
hémostase primaire
(plaquettes)
hémostase secondaire
(coagulation)
CAILLOT
hémostase tertiaire
(fibrinolyse)
Hémostase primaire
1. Adhésion plaquettaire
2. Activation plaquettaire
3. Agrégation plaquettaire
Sous-endothélium
Lésion de l’endothélium
Hémostase secondaire
Thrombine
Coagulation
Fibrinogène
Fibrine
Sous-endothélium
Lésion de l’endothélium
Initiation de la coagulation
Facteur tissulaire
F VIIa
Clou
plaquettaire
primaire
FX
Prothrombine
F Xa
TFPI/FXa
Fibrinogène
Thrombine
Fibrine
Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI)
Fibrine liée à la thrombine
Amplification de la coagulation
Complexe tenase
F IXa
F VIIIa
FIXa
FVIIIa
Membrane plaquettaire
FX
F Xa
F V et F VIII
Complexe prothrombinase
F Xa
F Va
Activation de plus de plaquettes
Génération de plus de fibrine
Stabilisation du caillot
F XIIIa
Prothrombine
Antithrombine
Thrombine
F XIII
Voie de la protéine C
activation
VIII
IXa VIIIa
X
inhibition
V
P A
S P
C
PC
Xa Va
prothrombine
thrombine
thrombomoduline
Les complexes procoagulants et
anticoagulants vitamine K dépendants et
leurs régulateurs
K.G. Mann et al. BCMD 2006
Cascade de la coagulation
Mesure de la génération de
thrombine
• initialement développé en
1953
• renouveau important car:
automatisation de sa
technique et
informatisation des
résultats
• mime les mécanismes de
coagulation
physiologiques
Thrombogram-Thrombinoscope
Comparaison avec les tests de
coagulation classiques
• Les temps de coagulation:
-temps ou taux de prothrombine, TP
-temps de thromboplastine partielle activée, aPTT
sont utilisés en routine pour pour évaluer la coagulation
de manière globale
• MAIS, ces tests ne mesurent pas la génération de
thrombine, car au moment ou la caillot est formé,
seulement 3% de la prothrombine est activée
La mesure de la génération de
thrombine
• Méthode de base ancienne et établie dans le
domaine de la recherche sur la coagulation,
• décrit toutes les phases du processus de
génération de thrombine
• Thrombogram-Thrombinoscope (Hemker):
méthode automatisée utilisant un substrat
chromogène (usage d’un Fluoroscan de Thermo®)
• CEPENDANT: une standardisation des conditions
pré-analytiques et de la méthode est nécessaire
avant son introduction en routine
La mesure de la génération de
thrombine
• On peut utiliser du PPP et du PRP
• Intérêt dans l’investigation d’une diathèse
hémorragique
• MAIS AUSSI dans les états
hypercoagulables
• Utile aussi pour évaluer les troubles de la
fonction plaquettaire
MAIS les conditions pré-analytiques
doivent être standardisées
Le vide peut créer une activation des plaquettes et une
diminution de la sensibilité à la protéine C activée
Changements visibles
immédiatement après
la prise de sang,
variabilité entre les
donneurs
V. Régnault et al.
Thrombosis Research
2004, 114:539-545
Génération de thrombine après activation de la voie du
facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes
Activation du TAFI* en TAFIa
thrombine (nM)
200
* Thrombine Activatable Fibrinolysis Inhibitor
Phase
de pr o
pa ga ti
on
100
50
Xa
0
libre
VIIa / FT
n
ti o
sa
ali
u tr
ne
de
a se
Ph
150
L’activation du TAFI en
TAFIa rend le caillot plus
résistant à sa dissolution
(fibrinolyse).
PROTHROMBINASE
TENASE
IXa+VIIIa+ PS
Formation
Formation du
du caillot
caillot
PREMIÈRES TRACES [activation des plaquettes, du FVIII et du FV
DE THROMBINE
Phase d’initiation
0
(D ’après C. Hemker et K. Mann)
10
temps (min)
20
Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004
Génération de thrombine après activation de la voie du
facteur tissulaire dans un plasma riche en plaquettes
200
Tmax
Cmax
thrombine (nM)
150
Valeurs normales
Temps de latence
Cmax
Tmax
ETP*
100
ETP
3,5± 1 min
200 ± 30 nM
9 ± 2 min
1500 ± 100 nMxmin
Endogenous Thrombin Potential: « Man
hours» of thrombin activity (Hemker
1993)
50
Temps de
latence
0
+ FT (5 pM)
0
(D ’après C. Hemker et K. Mann)
Temps correspondant aux TP ou aPTT
10
temps (min)
20
Grigoris T. Gerotziafas, Meyer M. Samama 2004
Déficits en facteurs de la coagulation, déficits plaquettaires
Pourquoi des hémorragies ?
200
N
P ha se
de pr o
p agati
on
thrombine (nM)
n
ti o
isa
bi l
s ta
de
a se
Ph
150
100
50
caillot N.
initiation
hémophiles
def. plaquettaires
0
caillot lâche
(déficits)
FT (10(10-25pM)
0
10
temps (min)
20
Effet des contraceptifs oraux
sur la génération de thrombine
K.G. Mann et al. BCMD 2006
Influence d’un inhibiteur du facteur
Xa sur la génération de thrombine
K.G. Mann et al. BCMD 2006
Phénotype d’un déficit constitutionnel en
antithrombine
CONTROL
Déficit en antithrombine
V. Régnault et al. Thrombosis Research 2004, 114:539-545
Phénotype d’un déficit constitutionnel
en protéine C
CONTROL
Déficit en protéine C
Thromboéleastogramme
(Haemoscope®)
Thromboélastogramme (1)
• Développé en 1948
• Utilisé comme outil de recherche depuis
• Plus récemment: guide pour décider de
l’administration des transfusions durant la
transplantation hépatique et la chirurgie
cardiaque
Thromboélastogramme (2)
• donne une impression globale de la coagulation,
• nous fournit des données sur le caillot après le
début de la formation de fibrine,
• reflète l’interaction entre les plaquettes, la
cascade de la coagulation et la fibrinolyse,
• mesure aussi la fermeté du caillot,
• TEG standard et TEG modifié par une héparinase
(inactive l’héparine).
Thromboéleastogramme
Mesure des microparticules
procoagulantes dans le sang
Que sont les microparticules du sang ?
• Observées pour la première fois dans le sang en
1967 par P. Wolf : « poussière de plaquettes »
• 1988-1991: génération des microparticules
durant l’activation plaquettaire (P.S. Sims et S.J.
Shattil)
• Ces microparticules plaquettaires sont
procoagulantes: lient le facteur Va et
soutiennent l’activité prothrombinase ainsi que la
liaison du facteur VIII
Depuis, des centaines d’études ont été
publiées sur les microparticules du sang…
• La plupart du temps, les microparticules sont
mesurées par cytométrie de flux
• Même si la plupart des microparticules sont issues
des plaquettes sanguines, certaines dérivent des
cellules endothéliales, des leucocytes, des cellules
musculaires lisses ou des érythrocytes, par exemple
• Leur distribution et leur nombre peut varier dans le
sang en fonction des conditions physiologiques et
pathologiques
Les microparticules procoagulantes
• Dérivées des plaquettes, des cellules
endothéliales et des leucocytes
• Les microparticules plaquettaires riches en
phosphatidylsérine fournissent une surface
procoagulante pour la génération de thrombine
• Les microparticules endothéliales pourraient être
associées à certains états hypercoagulables
• Peuvent aussi être issues des cellules tumorales
Facteur tissulaire circulant (contenu
dans les microparticules)
N. Mackman, BCMD 2006
Définition d’une microparticule du
sang et limite des méthodes de
mesure habituelles
• diamètre < 1 µm (200-800 nm)
• vu sa taille, elle se confond avec le bruit de fond
électronique lorsqu’elle est comptée par
cytométrie de flux
• La cytométrie de flux par la méthode du « light
scattering » ne peut pas déterminer la taille
d’une particule quand la taille de cette particule
est du même ordre de grandeur que la longueur
d’onde du laser utilisé (488 nm)
Mesure des microparticules sanguines
dans le cancer avancé: cytométrie de
flux avec impédance
• Cytomètre de flux: NPE Systems Quanta
• Utilise l’impédance pour mesurer la taille de la
microparticule
• Marquage des particules avec un anticorps antifacteur tissulaire, de façon à quantifier les
microparticules procoagulantes
• Échantillons de plasma de sujets normaux et de
patients avec un cancer de stade avancé.
Etude préliminaire
• Microparticules positives pour le facteur
tissulaire: présentes dans 1/3 patients avec un
cancer avancé
• Nombre: 11’000 – 1’600’000 particules par
microlitre
• Taille: 332 - 501 nm
• Rôle probable de ces microparticules dans les
complications thromboemboliques du cancer
B. Furie et al., BCMD 2006