Nouveaux outils diagnostiques ( PDF

De prochains outils pour le diagnostic des
infections respiratoires communautaires?
Elyanne Gault
Laboratoire de Bactériologie-Virologie
Hôpital Ambroise Paré
Université de Versailles St. Quentin en Yvelines
UFR des Sciences de la Santé
Les voies respiratoires (vues par un virologue)
pharynx
nasopharynx
oropharynx
trachée
Bronches souche
bronches lobaires, segmentaires,
sous-segmentaires (x12-15)
3000 bronchioles lobulaires
parenchyme pulmonaire
VIRUS RESPIRATOIRES (communautaires)
Exemple d’espèce Génome
env
Orthomyxoviridæ Influenzavirus
grippe
ARN (-) seg
oui
Paramyxoviridæ
(Pneumovirinae) Pneumovirus
(Paramyxovirinæ) Paramyxovirus
VRS, HMPV
HPIV-1, -2, -3 et-4
ARN (-)
ARN (-)
oui
oui
Famille
Genre
Picornaviridæ
Enterovirus
Rhinovirus
Paréchovirus
entérovirus
HRV
paréchovirus
ARN (+)
ARN (+)
ARN (+)
non
non
non
Coronaviridæ
Coronavirus
coronavirus
ARN (+)
oui
Adenoviridæ
Mastadénovirus adénovirus
ADN
non
Polyomaviridæ
Polyomavirus
ADN
non
KIpyV
WUpyV
VIRUS RESPIRATOIRES (autres)
Herpesviridae
HSV, VZV, CMV
Paramyxoviridae
Rougeole
Les infections respiratoires virales
Réinfections
Porte d’entrée: VAS
CoronaV
Diffusion variable selon le terrain
Les infections respiratoires virales
Rhino-pharyngite…
Bronchiolite, pneumopathie
Diffusion de proche en proche: statut immunitaire / âge
Quels agents infectieux rechercher?
Saisons 2000-2006 au CHU de Caen
Freymuth, Réanimation 2007
Saison 2010-2011 à Ambroise Paré
760 échantillons (65% pédiatriques)
54% prélèvements positifs
60%
50%
40%
30%
20%
60% grippe A / 40% grippe B
10%
HMPV associé dans 25% des
cas à un autre virus
0
Grippes A+B
VRS
HMVP
PIV-1
PIV-3
Milieu hospitalier: autres virus?
rhinoV
Fréquence+++
bronchiolites, pneumopathies, décompensations
Conséquences pratiques du diagnostic??
adenoV
Pneumopathies sévères
(immunodéprimé)
CMV
Pneumopathies sévères
(immunodéprimé)
Traitement anti-viral spécifique
HSV, VZV
Complications spécifiques
(contexte)
Traitement anti-viral spécifique
rougeole
Y penser…
Mesures prophylactiques
Et les bactéries?
Streptococcus pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Legionella pneumophila
Chlamydophila pneumoniae
Bordetella pertussis
Et les bactéries?
Streptococcus pneumoniae
Tests rapides
Tests conventionnels
Antigène urinaire
peu spécifique
Culture
24h
Examen direct crachat
peu sensible
Hémoculture
24h
Culture
plusieurs jours
Bordetella pertussis
Antigène urinaire
Sensible et spécifique
Examen direct crachat
peu sensible
Legionella pneumophila
Culture
24h
Approches diagnostiques: bactéries
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae
Sérologie
Peu spécifique chez l’adulte
Délais (interprétation sur l’augmentation des titres d’Ac entre 2 sérums prélevés à 15j)
Approches diagnostiques: virus
Techniques traditionnelles
Isolement viral en culture cellulaire
Technique de référence
Influenza – VRS – PIV – HMPV – Adénovirus – Coronavirus – Rhinovirus
Délais 5-10 jours
Approches diagnostiques: virus
Techniques traditionnelles
Recherche d’Antigènes viraux par
immunofluorescence
Influenza – VRS – PIV – HMPV – Adénovirus
Immunofluorescence approche
« multiplexe rapide »
Anticorps monoclonaux
Marqués à la fluorescéine
flu A
flu B
PIV-1
PIV-2
PIV-3
Défaut de sensibilité
VRS
ADV
HPMV
Tests rapides grippe A/B - VRS
Recherche d’Antigènes viraux par
immunochromatographie
Cible limitée
Sensibilité (et spécificité) très médiocre
surtout vis-à-vis de la grippe,
surtout H1N1v
Biologie moléculaire: approche innovante?
Ultra-sensibilité
Multiplex
Biologie moléculaire
Biologie moléculaire: approche innovante?
Ultra-sensibilité
Multiplex
Biologie moléculaire
Compliqué
(techniquement)
Coût
Biologie moléculaire: approche innovante?
PCR « traditionnelle »
● simplex
● multiplex
Belau-Pujol, 2005
Très long
Peu de prélèvements gérables
Interprétation délicate
Risque de contaminations
Complémentaire d’approches traditionnelles
Biologie moléculaire: approche innovante?
PCR « temps réel »
● simplex
● multiplex
Grippe A (VIC)
Papillard, 2011
Grippe B (NED)
VRS (FAM)
Biologie moléculaire: approche innovante?
PCR « temps réel »
● simplex
● multiplex
PIV-1 (VIC)
hMPV (NED)
PIV-3 (FAM)
Biologie moléculaire: approche innovante?
PCR « temps réel »
● simplex
● multiplex
C. pneu (VIC)
Alb (NED)
M. pneu (FAM)
Biologie moléculaire: approche innovante?
PCR « temps réel »
● simplex
● multiplex
Grippe A (VIC)
Papillard, 2011
Grippe B (NED)
½ journée
8 agents respiratoires majeurs
1ère intention
Pas adenoV ni rhinoV (ni pneumocoque)
Technique « maison »
VRS (FAM)
Biologie moléculaire: les techniques innovantes
Les plus complètes
Trousses commerciales
PCR multiplex (15-20 agents détectés)
analyse sur séquenceur automatique
Seeplex® RV/PB18 ASE Detection / RespiFinder® SMART 22
17 Virus respiratoires
13 Virus respiratoires
Influenza A virus
Influenza B virus
RSV A - RSV B
rhinovirus
coronavirus OC43 - 229E/NL63
adenovirus
parainfluenza virus 1, 2, 3
bocavirus
enterovirus
5 Bactéries
Mycoplasma pneumoniae
Haemophilus influenzae
Streptococcus pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae
Legionella pneumophila
Influenza A virus
Influenza A virus/H1N1v
Influenza B virus
RSV A - RSV B
rhinovirus/enterovirus
coronavirus OC43-229E-NL63HKU1
metapneumovirus
adenovirus
parainfluenza virus 1, 2, 3,4
bocavirus
4 Bactéries
Mycoplasma pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae
Legionella pneumophila
Seeplex® RV/PB18 ASE Detection / RespiFinder® SMART 22
Extraction  RT  Hybridation-ligation  Amplification  marquage-détection
2 journées
Risque de contamination
Coût élevé (60€/test) – accès à un séquenceur
Biologie moléculaire: les techniques innovantes
Un peu plus simple (à peine)
Trousses commerciales
PCR multiplex (15-20 agents détectés)
analyse par approche Luminex
Luminex xTAG® Respiratory Viral Panel (RVP)
I. Multiplex PCR
A multiplexed PCR reaction is performed to amplify the regions of interest in the target
human or infectious agent genes.
II. Exo/SAP treatment of PCR Product
The PCR reaction is treated to remove excess nucleotides and primers.
III. Multiplex ASPE/TSPE
The PCR reaction is then subjected to a primer extension step that is specific for the
allele or the infectious agent that is being analyzed: Allele Specific Primer Extension
(ASPE) or Target Specific Primer Extension (TSPE). The 5’ end of the ASPE or TSPE
primers is attached to an xTAG universal tag sequence.
IV. Universal Array Sorting
The 5’ universal tag sequence is hybridized to the complementary anti-tag sequence
coupled to a particular xMAP bead set.
Wash (Remove in Streamlined)
V. Detection
The hybridized beads are read by the Luminex xMAP system and results are analyzed
by the data analysis software.
Luminex xTAG® Respiratory Viral Panel (RVP)
Luminex xTAG® Respiratory Viral Panel (RVP)
RSV A - RSV B
Influenza A
Non-specific influenza A
H1 subtype
H3 subtype
H5 subtype
Influenza B
Parainfluenza 1, 2, 3, 4
Pas de bactéries
Extraction  RT  Hybridation-ligation  Amplification 
marquage-détection
1 journée
Metapneumovirus
Risque de contamination
Adenovirus
Coût élevé (150$/test pour 24 tests) – accès à un luminex
Entero-Rhinovirus
Corona NL63-HKU1-229E-OC43
SARS
Bocavirus
Film Array® Respiratory Panel (Idaho)
Film Array® Respiratory Panel (Idaho)
Film Array® Respiratory Panel (Idaho)
RSV
Influenza A
Non-specific influenza A
Influenza H1 - H1 2009 - H3
Influenza B
Parainfluenza 1, 2, 3, 4
Metapneumovirus
Adenovirus
Entero-Rhinovirus
Corona NL63-HKU1
Pas de bactéries, pas de bocavirus, pas tous les corona
1 heure (dont 5 minutes de manips) mais test unitaire
Pas de risque de contamination
Coût élevé (130$/test) – équipement dédié
Pourquoi tout ça ?
Conséquences
(prise en charge)
Terrain
Pertinence du résultat
microbiologique
Pédiatrie
Bronchiolites du nourrisson
VRS
influenza A et B
parainfluenza 1,2,3
metapneumovirus
Risque de décompensation brutale
Risque d’apnée du sommeil
Syndrome grippal
tableaux atypiques
(neurologiques, myocardites…)
Pédiatrie
Hospitalisation du tout-petit
VRS
influenza A et B
Virus
Tableau neurologique – arrêt des investigations
Moins
d’examens complémentaires
d’antibiotiques
diagnostic dans la journée
Réanimation
influenza A et B
Syndrome grippal, surinfections
VRS
parainfluenza 1,2,3
metapneumovirus
Décompensations BPCO…
Grippe
adenovirus
rougeole
Pneumopathies sévères
Virus
Moins
d’examens complémentaires
d’antibiotiques
(+ PCT)
Milieu hospitalier
Services de pédiatrie
Services de médecine - Réanimation
influenza A et B
rougeole
Infections nosocomiales
Mesures d’isolement
Traitement prophylactique
Le terrain
Pédiatrie
En urgence
Rapidement
VRS / grippes
Mycoplasme
Coqueluche
Tous virus respiratoires
Le terrain
Réanimation (adulte)
En urgence
Rapidement
Grippes
Rougeole
Pneumocoque
Legionnelle
Adenovirus
Tous virus respi
Le terrain
Immunodéprimé
En urgence
Rapidement
VRS/Grippes
Rougeole
Adenovirus
Tous virus respi
Toutes bactéries
Pertinence du résultat microbiologique
Pertinence d’un résultat négatif
Pertinence d’un résultat positif
Pertinence d’un résultat négatif
Sensibilité des moyens diagnostiques
Test rapide < Immunofluorescence < Biologie moléculaire
Biologie moléculaire
Evaluation des tests?
Multiplex < simplex
Tests maison/trousses commerciales
Pertinence d’un résultat négatif
Nature / Qualité du prélèvement
Pédiatrie
Aspiration nasopharyngée
Adulte
Ecouvillonnage des fosses nasales
Ecouvillonnage des fosses nasales
Prélèvement
Écouvillon stérile
Ajouter 1ml de sérum
physiologique
Virocult
Pertinence d’un résultat négatif
Nature / Qualité du prélèvement
Pédiatrie
Adulte
Formes sévères
Aspiration nasopharyngée
Ecouvillonnage des fosses nasales
Aspiration bronchique
LBA
(négatif au niveau des fosses nasales)
Pertinence d’un résultat positif
17 Virus respiratoires
Influenza A virus
Influenza A virus/H1N1v
Influenza B virus
RSV A - RSV B
rhinovirus/enterovirus
coronavirus OC43-229E-NL63HKU1
Résultats inattendus
Coronavirus  et alors?
metapneumovirus
adenovirus
parainfluenza virus 1, 2, 3,4
bocavirus
4 Bactéries
Infections multiples
Mycoplasma pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Chlamydophila pneumoniae
Legionella pneumophila
virus-virus ou virus/bactérie
Et la sérologie?
Et la sérologie?
Prévalence des Ac dans la population
CoronaV
M. pneu
Sérologie : nouvelles approches
Méthodes actuelles (pour les virus respiratoires)
Antigènes viraux produits par culture virale
 ELISA/microplaques: détection d’IgG (IgM)
 réactions de fixation du complément
 réactions d’inhibition de l’hemagglutination
Ciblage spécifique des antigènes viraux et bactériens
Identification et production de protéines / domaines peptidiques
antigéniques
Profil de réponse anticorps
 Primo-Infection / réinfection
 Infection ancienne / infection récente
Criblage multiplex des antigènes viraux et bactériens
Les « puces sérologiques » - Technologie luminex
Puces sérologiques
Diagnostic par syndrome
Exemples en développement
Infections prothèses articulaires
→ S. aureus, S. epidermidis, P. acnes
Infections respiratoires
→ S. pneumoniae, L. pneumophila, M. pneumoniae, C. pneumoniae, B.
pertussis
Infections génitales hautes
→ C. trachomatis, mycoplasmes uro-génitaux
Infections materno-néonatales
→ streptocoque B, E. coli
De prochains outils pour le diagnostic des
infections respiratoires communautaires?
Concept
Diagnostic « microbiologique »
Recherche au « coup par coup » de bactéries et/ou de virus
Concept
Diagnostic « de pathologie infectieuse respiratoire »
Prélèvement respiratoire  Biologie moléculaire
Prélèvement
Prélèvement sanguin  Sérologie
Approche multiplex
Recherche d’agents infectieux
De prochains outils pour le diagnostic des
infections respiratoires communautaires?
Approche multiplex
Recherche d’agents infectieux