IOTest 3
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 tests; 0.5 mL
20 µL / test
IOTest 3
Conjugated Antibodies
TABLE OF CONTENTS
ENGLISH ...................................................................................................................................................................................... 2
FRANÇAIS .................................................................................................................................................................................... 4
DEUTSCH..................................................................................................................................................................................... 6
ESPAÑOL ..................................................................................................................................................................................... 8
ΔΛΛΗΝΙΚΑ .................................................................................................................................................................................. 10
ITALIANO.................................................................................................................................................................................... 12
PORTUGUÊS ............................................................................................................................................................................. 14
SVENSKA ................................................................................................................................................................................... 16
ČESKY ........................................................................................................................................................................................ 18
РУССКИЙ ................................................................................................................................................................................... 20
TÜRKÇE ..................................................................................................................................................................................... 22
SLOVENSKY .............................................................................................................................................................................. 24
APPENDIX .................................................................................................................................................................................. 26
1 / 26
A07730 2014-05-12_TABLE OF CONTENTS
Specificity
Specification of
constituent 1
Not applicable
Specification of
constituent 2
Not applicable
CD19
Clone
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hybridoma
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Immunogen
Non-biological hapten
Non-biological hapten
Lymphoma cells SKLY18
Immunoglobulin
IgG1
IgG1
IgG1,
Species
Mouse
Mouse
Mouse
Source
Ascites fluid or supernatant of in Ascites fluid or supernatant of in Ascites fluid or supernatant of in
vitro cultured hybridoma cells
Purification
Affinity chromatography
Fluorochrome
Fluorescein isothiocyanate
(FITC)
R Phycoerythrin (PE)
R Phycoerythrin-Texas Red-X
(ECD)
Molar ratio
2.5 – 5.0
0.5 – 1.5
0.5 – 1.5
488 nm
488 nm
488 nm
Emission peak
525 nm
575 nm
613 nm
Buffer
PBS pH 7.2 plus 2 mg / mL BSA and 0.1% NaN3
IOTest 3
ENGLISH
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 tests; 0.5 mL
20 µL / test
IOTest 3
Conjugated antibodies
excitation
IVD
USE
This fluorochrome-conjugated antibody mixture
(Negative Control-FITC / Negative Control-PE /
CD19-ECD) is a negative control suitable for
multiparametric analysis using flow cytometry as
an aid to gating. It enables the demonstration of
the non-specific staining of all the IOTest 3s
which use CD19-ECD.
PRINCIPLE
This test is based upon the ability of non-specific
monoclonal antibodies to reproduce the nonspecific staining of specific antibodies.
In parallel with the staining of leucocytes, which
is performed by incubating the sample with a
specific IOTest 3 reagent, a staining is also
performed on the same sample with this IOTest 3
negative control. The erythrocytes from the two
preparations are then removed by lysis and the
leucocytes, unaffected by this process, are
analyzed by flow cytometry.
The flow cytometer analyzes light diffusion and
the fluorescence of cells. It makes possible the
localization of cells within the electronic window
defined on a histogram, which correlates the
orthogonal diffusion of light ("Side Scatter" or
SS)
with
the
fluorescence
of
ECD,
corresponding to CD19 staining. Other
histograms combining two of the different
parameters available on the cytometer are also
used in the gating stage.
The comparison of the levels of fluorescence
obtained on the target population, on the one
hand, with this negative control and, on the
other hand, with the specific IOTest 3 staining,
enables stained cells to be discriminated from
non-stained cells (1, 2).
PRECAUTIONS
1. Do not use the reagent beyond the expiry
date.
2. Do not freeze.
3. Let it come to room temperature (18 – 25°C)
before use.
4. Minimize exposure to light.
5. Avoid microbial contamination of the
reagents, or false results may occur.
6. Antibody solutions containing sodium azide
(NaN3) should be handled with care. Do not
take internally and avoid all contact with the
skin, mucosa and eyes.
Moreover, in an acid medium, sodium azide
can form the potentially dangerous
hydrazoic acid. If it needs to be disposed of,
it is recommended that the reagent be
diluted in a large volume of water before
pouring it into the drainage system so as to
avoid the accumulation of sodium azide in
metal pipes and to prevent the risk of
explosion.
7. All blood samples must be considered as
potentially infectious and must be handled
with care (in particular: the wearing of
protective gloves, gowns and goggles).
8. Never pipette by mouth and avoid all contact
of the samples with the skin, mucosa and
eyes.
9. Blood tubes and disposable material used
for handling should be disposed of in ad hoc
containers intended for incineration.
SAMPLES
The conjugated liquid forms must be kept at
between 2 and 8°C and protected from light,
before and after the vial has been opened.
Stability of closed vial: see expiry date on vial.
Stability of opened vial: the reagent is stable for
90 days.
Venous blood or bone marrow samples must be
taken using sterile tubes containing an EDTA
salt as the anticoagulant. The use of other
anticoagulants is not recommended.
The samples should be kept at room
temperature (18 – 25°C) and not shaken. The
samples should be homogenized by gentle
agitation prior to taking the test sample.
The samples must be analyzed within 24 hours
of venipuncture.
REAGENT CONTENTS
METHODOLOGY
Contact Beckman Coulter Customer Service to
obtain the antibody concentration in the IOTest 3
reagent.
NECESSARY MATERIAL NOT SUPPLIED
Sampling tubes and material necessary for
sampling.
Automatic pipettes with disposable tips for
20, 100 and 500 µL.
Plastic haemolysis tubes.
Calibration beads: Flow-Set Fluorospheres
(Ref. 6607007).
To obtain optimal results, the following
reagents are recommended:
- Lysing reagent: IOTest 3 Lysis Solution
(Ref. A07799).
STORAGE AND STABILITY
EVIDENCE OF DETERIORATION
Any change in the physical appearance of the
reagents may indicate deterioration and the
reagent should not be used.
In case of packaging deterioration or if data
obtained show some performance alteration,
please contact your local distributor or use the
following e-mail address :
[email protected]
2 / 26
Specification of
constituent 3
- Fixation reagent: IOTest 3 Fixative Solution
(Ref. A07800).
- One of the specific conjugated antibody
solutions from the IOTest 3 range which uses
CD19-ECD as an aid to gating.
Buffer (PBS: 0.01 M sodium phosphate;
0.145 M sodium chloride; pH 7.2).
Centrifuge.
Automatic agitator (Vortex type).
Flow cytometer.
PROCEDURE
For each sample analyzed, in addition to a
control tube, a test tube is required in which the
cells will be mixed with the specific IOTest 3
conjugated antibody solution.
1. Into each control tube, add 20 ιL of the
negative control and into each test tube,
20 ιL of the specific IOTest 3 conjugated
antibody solution.
2. Add 100 µL of the test sample to the
2 tubes. Vortex the tubes gently.
3. Incubate for 15 to 20 minutes at room
temperature (18 – 25°C), protected from
light.
4. Then perform lysis of the red cells, if
necessary, by adding 2 mL of IOTest 3 Lysis
Solution (Ref. A07799) at its working
concentration (1X). Vortex immediately and
incubate for 10 minutes at room
temperature, protected from light. If the
sample does not contain red cells, add 2 mL
of PBS.
5. Centrifuge for 5 minutes at 300 x g at room
temperature.
6. Remove the supernatant by aspiration.
7. Resuspend the cell pellet using 3 mL of
PBS.
8. Repeat stage 5.
9. Remove the supernatant by aspiration and
resuspend the cell pellet using:
0.5 mL or 1 mL of IOTest 3 Fixative Solution
(Ref. A07800) at its working concentration
(1X), if the preparations are to be kept for
more than 2 hours and for less than
24 hours,
0.5 mL or 1 mL of PBS without
formaldehyde, if the preparations are to be
analyzed within 2 hours.
NOTE: In all cases, keep the preparations
between 2 and 8°C and protected from light
A07730 2014-05-12_GB
PERFORMANCE
SPECIFICITY
J3-119 monoclonal antibody (mAb) was
assigned to CD19 during the 4th HLDA
Workshop on Human Leucocyte Differentiation
Antigens, held in Vienna, Austria, in 1989 (3, 4).
MAb 679.1Mc7 has structural characteristics
identical to those of monoclonal antibodies
specific to the IOTest 3 range but lacks any
specificity regarding cellular antigens (1).
LINEARITY
To test the linearity of CD19 staining of this
reagent, a positive cell line (RAMOS) and a
negative cell line (HPBALL) were mixed in
different proportions with a constant final
number of cells, so that the positive
line/negative line ratio of the mixture ranged
from 0 to 100%.
Aliquots were stained using the procedure
described above and linear regression between
the expected values and the observed values
was calculated.
Specificity
CD19
Linear regression
Linearity
(R2)
Y = 0.996 X + 1.66
0.999
EXPECTED VALUES
Each laboratory must compile a list of reference
values based upon a group of healthy donors
from the local population. This must be done by
taking age, sex and ethnic group into account,
as well as any other potential regional
differences.
In our laboratories, the whole blood samples of
50 healthy adults were treated using the reagent
described above. The results obtained in the
leucocyte sub-populations of interest in these
50 donors are shown in the tables below:
Lymphocytes
CD19+
Number
Mean
(%)
SD
CV
(%)
50
10.8
5.7
53
INTRA-LABORATORY REPRODUCIBILITY
On the same day and using the same
cytometer, 12 measurements of the percentage
of staining of a positive target (RAMOS) were
carried out. The results obtained are given in the
following table as a percentage of stained cells
for CD19 and as a Mean Fluorescence Intensity
(MFI) for non-specific conjugated FITC and PE
antibodies:
RAMOS
Number
Mean
SD
CV
(%)
CD19+ (%)
12
99.9
0.05
0.05
FITC (MFI)
12
0.84
0.01
1.8
PE (MFI)
12
0.12
0.05
1.27
6. In certain disease states, such as severe
renal failure or haemoglobinopathies, lysis
of red cells may be slow, incomplete or even
impossible. In this case, it is recommended
to isolate mononucleated cells using a
density gradient (Ficoll, for example) prior to
staining.
7. Due to the tandem structure of the
fluorochrome, ECD also emits light at
575 nm. This secondary emission peak
varies from lot-to-lot of ECD. Therefore, for
multi-color analysis, the compensation
matrix should be carefully checked when
changing the lot of a ECD-conjugate.
MISCELLANEOUS
LIMITATIONS OF THE TECHNIQUE
See the Appendix for examples and references.
1. Flow cytometry may produce false results if
the cytometer has not been aligned
perfectly, if fluorescence leaks have not
been correctly compensated for and if the
regions have not been carefully positioned.
2. It is preferable to use a RBC lysis technique
with a washing step as this reagent has not
been optimized for "no wash" lysis
techniques.
3. Accurate and reproducible results will be
obtained as long as the procedures used
are in accordance with the technical insert
leaflet and compatible with good laboratory
practices.
4. The conjugated antibodies of this reagent
are calibrated so as to offer the best specific
signal/non-specific signal ratio. Therefore, it
is important to adhere to the reagent
volume/sample volume ratio in every test.
5. In the case of a hyperleucocytosis, dilute the
blood in PBS so as to obtain a value of
approximately 5 x 109 leucocytes/L.
TRADEMARKS
Beckman Coulter, the stylized logo, COULTER,
ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest and XL are
trademarks of Beckman Coulter, Inc., and
registered with the USPTO.
3 / 26
Texas Red-X is a trademark of Molecular
Probes, Inc.
MANUFACTURED BY:
IMMUNOTECH SAS
a Beckman Coulter Company
130 avenue de Lattre de Tassigny
B.P. 177 – 13276 Marseille Cedex 9
France
Customer Services: (33) 4 91 17 27 27
www.beckmancoulter.com
Printed in France.
Made in France.
© 2014 Beckman Coulter, Inc.
All Rights Reserved.
A07730 2014-05-12_GB
Spécificité
Spécifications du
constituant 1
Non applicable
Spécifications du
constituant 2
Non applicable
CD19
Clone
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hybridome
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Immunogène
Haptène non biologique
Haptène non biologique
Cellules de lymphome SKLY18
Immunoglobuline
IgG1
IgG1
IgG1,
Espèce
Souris
Souris
Souris
Source
Ascite ou surnageant de culture
in vitro de cellules hybridomes
Purification
Chromatographie d’affinité
Fluorochrome
Isothiocyanate de fluorescéine
(FITC)
R Phycoérythrine (PE)
R Phycoérythrine-Texas Red-X
(ECD
Ratio Molaire
IOTest 3
FRANÇAIS
Neg. Ctrl-FITC /
Neg. Ctrl-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 tests ; 0,5 mL
20 µL / test
IOTest 3
Anticorps Conjugués
IVD
Spécifications du
constituant 3
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
d’excitation
488 nm
488 nm
488 nm
Pic d’émission
525 nm
575 nm
613 nm
Tampon
PBS pH 7,2 additionné de 2 mg / mL BSA et de 0,1% NaN3
UTILISATION
Ce mélange d'anticorps conjugués à des
fluorochromes (Contrôle Négatif-FITC / Contrôle
Négatif-PE / CD19-ECD) est un contrôle négatif
adapté à l'analyse multiparamétrique par
cytométrie en flux comme aide au fenêtrage. Il
permet de mettre en évidence le marquage non
spécifique de tous les IOTest 3 qui utilisent le
CD19-ECD.
PRINCIPE
Ce test repose sur la capacité d’anticorps
monoclonaux non spécifiques de reproduire le
marquage non spécifique des anticorps
spécifiques.
Parallèlement au marquage des leucocytes qui
est réalisé en incubant l’échantillon avec un
réactif IOTest 3 spécifique, on effectue, sur le
même échantillon, un marquage avec ce
contrôle négatif IOTest 3. Les érythrocytes des
deux préparations sont ensuite éliminés par lyse
et les leucocytes, non affectés par cette étape,
sont analysés par cytométrie en flux.
Le cytomètre en flux mesure la diffusion de la
lumière ainsi que la fluorescence des cellules. Il
permet de circonscrire les cellules à l'intérieur
d’une fenêtre électronique, définie sur un
histogramme qui corrèle la diffusion orthogonale
de la lumière ("Side Scatter" ou SS) et la
fluorescence de l’ECD, correspondant au
marquage en CD19. D’autres histogrammes
combinant deux des différents paramètres
disponibles sur le cytomètre sont également
utilisables comme supports à l’étape de
fenêtrage électronique.
La comparaison des niveaux de fluorescence
obtenus sur la population ciblée, d’une part,
avec ce contrôle négatif et, d’autre part, avec le
marquage spécifique IOTest 3, permet de
discriminer les cellules marquées des cellules
non marquées (1, 2).
INDICATIONS DE DETERIORATION
tout changement d’apparence physique du
produit peut indiquer une deterioration et le
produit ne doit pas être utiliser.
En cas de déterioration de l'emballage ou si les
résultats obtenus montrent une perte de
perfomance du produit, veuillez contacter notre
service Support Technique :
Tel : 04 91 17 27 27 Fax : 04 91 17 27 25
e-mail : [email protected]
PRECAUTIONS
Les formes conjuguées liquides se conservent
entre 2 et 8°C et à l'abri de la lumière, avant et
après ouverture du flacon.
Stabilité flacon fermé : voir la date de péremption du réactif indiquée sur le flacon.
Stabilité flacon ouvert : le réactif reste stable
pendant 90 jours.
1. Ne pas utiliser le réactif au-delà de la date
de péremption.
2. Ne pas congeler.
3. Laisser revenir à température ambiante
(18 – 25°C) avant utilisation.
4. Minimiser les temps d’exposition à la
lumière.
5. Eviter la contamination microbienne des
réactifs ou des résultats erronés peuvent
apparaître.
6. Les solutions d'anticorps contenant de
l'azoture de sodium (NaN3) sont à manipuler
avec précaution. Ne pas avaler et éviter tout
contact avec la peau, les muqueuses et les
yeux.
Par ailleurs, en milieu acide, l'azoture de
sodium est susceptible de former un acide
hydrazoïque potentiellement dangereux. S'il
est nécessaire d’éliminer le réactif, il est
recommandé de le diluer dans un grand
volume d'eau avant de le verser dans les
canalisations, afin d'éviter l'accumulation
d'azoture de sodium dans les conduites
métalliques et de prévenir les risques
d'explosion.
7. Tout échantillon sanguin doit être considéré
comme potentiellement infectieux et doit
être manipulé avec les précautions d'usage
(en particulier: port de gants, de blouse et
de lunettes de protection).
8. Ne jamais pipeter à la bouche et éviter tout
contact des échantillons avec la peau, les
muqueuses et les yeux.
9. Les tubes de sang et le matériel à usage
unique ayant servi à la manipulation doivent
être éliminés dans des conteneurs ad hoc
destinés à l'incinération.
CONTENU DES REACTIFS
SPECIMENS
Contactez le Service clients Beckman Coulter
pour connaître la concentration en anticorps du
réactif IOTest 3.
Les prélèvements de sang veineux ou de moelle
osseuse doivent s'effectuer sur tubes stériles
contenant un sel d'EDTA comme anticoagulant.
L'utilisation d'un autre anticoagulant n'est pas
recommandée.
Les échantillons se conservent à température
ambiante (18 – 25°C) et sans agitation. Avant
CONSERVATION, STABILITE
4 / 26
d'effectuer la prise d'essai, il est recommandé
d'homogénéiser le prélèvement par agitation
douce.
Les échantillons doivent être analysés dans les
24 heures qui suivent le prélèvement.
METHODOLOGIE
MATERIEL NECESSAIRE NON FOURNI
Tubes à prélèvement et matériel nécessaire
aux prélèvements.
Pipettes automatiques et embouts jetables
pour prélever des quantités de 20, 100 et
500 µL.
Tubes à hémolyse en plastique.
Billes de calibration : Fluorosphères Flow-Set
(Réf. 6607007)
Pour obtenir des résultats optimaux, les
réactifs suivants sont recommandés :
- Réactif de lyse : Solution de Lyse IOTest 3
(Réf. A07799).
- Réactif de fixation : Solution de Fixation
IOTest 3 (Réf. A07800).
- Une des solutions d’anticorps conjugués
spécifiques de la gamme IOTest 3 qui
utilisent le CD19-ECD comme aide au
fenêtrage.
Tampon (PBS : 0,01 M phosphate de
sodium; 0,145 M chlorure de sodium;
pH 7,2).
Centrifugeuse.
Agitateur automatique (type Vortex).
Cytomètre en flux.
PROCEDURE
Pour chaque échantillon analysé, prévoir en
plus du tube contrôle, un tube test dans lequel
les cellules seront mises en présence de la
solution
d'anticorps
conjugués
IOTest 3
spécifique.
1. Dans chaque tube contrôle, introduire 20 µL
du contrôle négatif et dans chaque tube test,
20 µL de la solution d'anticorps conjugués
IOTest 3 spécifique.
2. Ajouter 100 µL de l’échantillon à tester
dans les 2 tubes. Vortexer doucement.
3. Incuber 15 à 20 minutes à température
ambiante (18 – 25°C) et à l'abri de la
lumière.
4. Procéder à la lyse des globules rouges, si
nécessaire, en ajoutant 2 mL de Solution
de Lyse IOTest 3 (Réf. A07799) à sa
concentration de travail (1X). Vortexer
immédiatement et incuber 10 minutes à
température ambiante et à l'abri de la
lumière. Si l’échantillon ne contient pas de
globules rouges, ajouter 2 mL de PBS.
5. Centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes à
température ambiante.
A07730 2014-05-12_FR
6. Eliminer le surnageant par aspiration.
7. Resuspendre le culot cellulaire dans 3 mL
de PBS.
8. Répéter l’étape 5.
9. Eliminer le surnageant par aspiration et
resuspendre le culot cellulaire dans :
0,5 mL ou 1 mL de Solution de Fixation
IOTest 3 (Réf. A07800) à sa concentration
de travail (1X), si les préparations sont
destinées à être conservées plus de
2 heures, et moins de 24 heures,
0,5 mL ou 1 mL de PBS sans formaldéhyde,
si les préparations sont destinées à être
analysées dans les 2 heures.
NOTA BENE : Dans tous les cas, conserver les
préparations entre 2 et 8°C et à l'abri de la
lumière.
REPRODUCTIBILITE INTRA-LABORATOIRE
Le même jour et sur le même cytomètre,
12 déterminations du pourcentage de marquage
d’une cible positive (RAMOS) ont été menées.
Les résultats obtenus, en pourcentage de
cellules marquées pour le CD19 et en moyenne
d’intensité de fluorescence (MIF) pour les
anticorps non spécifiques conjugués FITC et
PE, sont regroupés dans le tableau suivant :
PERFORMANCES
1. Les résultats de cytométrie en flux peuvent
être erronés si le cytomètre n’est pas
parfaitement
aligné,
les
fuites
de
fluorescence correctement compensées et
les
régions
de
conditionnement
soigneusement placées.
2. Utiliser de préférence une technique de lyse
GR avec lavage car ce réactif n'a pas été
optimisé pour les techniques de lyse dites
"sans lavage".
3. On obtiendra des résultats précis et
reproductibles dans la mesure où les
procédures utilisées sont conformes aux
instructions des fiches techniques et
compatibles avec les bonnes pratiques de
laboratoire.
4. Les anticorps conjugués de ce réactif sont
calibrés afin d'offrir le meilleur rapport signal
spécifique/signal non spécifique. C'est
pourquoi il est important de respecter le
rapport volume du réactif/volume de
l'échantillon pour chaque test.
5. En cas d'hyperleucocytose, diluer le sang
dans du PBS de façon à obtenir une valeur
située autour de 5 x 109 leucocytes / L.
6. Au cours de certaines pathologies, comme
les insuffisances rénales graves ou les
hémoglobinopathies, la lyse des globules
rouges peut être ralentie, voire incomplète ou
impossible. Dans ce cas, il est recommandé
d'isoler les cellules mononucléées par
gradient de densité (par exemple : Ficoll)
avant marquage.
SPECIFICITE
L’anticorps monoclonal (AcM) J3-119 a été
assigné au CD19 au cours du 4e HLDA
Workshop sur les Antigènes de Différenciation
des Leucocytes Humains, de Vienne, Autriche,
en 1989 (3, 4).
L’AcM 679.1Mc7 présente des caractéristiques
structurelles identiques à celles des anticorps
monoclonaux spécifiques de la gamme IOTest 3
mais il est dénué de toute spécificité vis à vis
d’antigènes cellulaires (1).
LINEARITE
Pour tester la linéarité de marquage du CD19 de
ce réactif, une lignée cellulaire positive
(RAMOS) et une lignée cellulaire négative
(HPBALL) ont été mélangées en différentes
proportions et à quantité cellulaire finale
constante, de manière à ce que le rapport lignée
positive / lignée négative du mélange
s’échelonne de 0 à 100%.
Des aliquotes ont été marquées selon la
procédure décrite ci-dessus et la régression
linéaire entre valeurs attendues et valeurs
observées a été calculée.
Spécificité
Régression linéaire
Linéarité
(R2)
CD19
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
RESULTATS ATTENDUS
Chaque laboratoire doit établir une liste de
valeurs de références basée sur un groupe de
donneurs sains appartenant à la population
locale. Ceci doit être fait en tenant compte de
l'âge, du sexe, de l'appartenance ethnique, ainsi
que de toute autre différence régionale
potentielle.
Dans nos laboratoires, le sang total de
50 adultes sains a été traité, en utilisant le
réactif décrit ci-dessus. Les résultats obtenus
sur les sous-populations leucocytaires d'intérêt
de ces 50 donneurs sont regroupés dans le
tableau ci-après :
Lymphocytes
CD19+
Nombre
Moy.
(%)
Ecarttype
CV
(%)
50
10,8
5,7
53
RAMOS
Nombre
Moy.
Ecarttype
CV
(%)
CD19+ (%)
12
99,9
0,05
0,05
FITC (MIF)
12
0,84
0,01
1,8
PE (MIF)
12
0,12
0,05
1,27
LIMITES DE LA TECHNIQUE
5 / 26
7. Du fait de la structure en tandem du
fluorochrome, le ECD émet également à
575 nm. Ce second pic d'émission varie
d'un lot de ECD à l'autre. Par conséquent,
en cas d'analyse multi-couleur, il convient
de vérifier attentivement la matrice de
compensation à chaque changement de lot
d'un conjugué ECD.
DIVERS
Voir l’annexe (APPENDIX) pour les illustrations
(EXAMPLES) et la bibliographie (REFERENCES).
MARQUES COMMERCIALES
Beckman Coulter, le logo stylisé COULTER,
ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest and XL sont des
marques déposées de Beckman Coulter; Inc., et
sont enregistrées auprès du USPTO.
Texas Red-X est une marque déposée de
Molecular Probes, Inc.
FABRIQUE PAR :
IMMUNOTECH SAS
France
Service Client : (33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Tous droits réservés.
A07730 2014-05-12_FR
Spezifität
Spezifikationen der
Komponente 1
Nicht zutreffend
Spezifikationen der
Komponente 2
Nicht zutreffend
CD19
Klon
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hybridom
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Immunogen
Nicht biologisches Hapten
Nicht biologisches Hapten
SKLY18 Lymphom-Zellen
Immunglobulin
IgG1
IgG1
IgG1,
Art
Reinigung
Maus
Aszitesflüssigkeit oder
Überstand der in-vitro
kultivierten Hybridomzellen
Affinitätschromatographie
Maus
Maus
Fluorochrom
Fluoresceinisothiocyanat (FITC)
(ECD)
Molares Verhältnis
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
Anregungs-
488 nm
488 nm
488 nm
Emissionspeak
525 nm
575 nm
613 nm
Puffer
PBS pH 7,2 plus 2 mg / mL BSA und 0,1% NaN3
IOTest 3
DEUTSCH
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 Tests; 0,5 mL
20 µL / Test
Quelle
IOTest 3
Konjugierte Antikörper
IVD
ANWENDUNG
Diese Kombination aus mit Fluorochromen
konjugierten
Antikörpern
(NegativkontrolleFITC / Negativkontrolle-PE / CD19-ECD) ist eine
zur
Multiparameteranalyse
im
Durchflusszytometer geeignete Negativkontrolle,
die
den
Nachweis
der
unspezifischen
Markierung aller IOTest 3 ermöglicht, bei denen
CD19-ECD zum Einsatz kommt.
PRINZIP
Dieser Test beruht auf der Fähigkeit
unspezifischer monoklonaler Antikörper die
unspezifische Markierung der spezifischen
Antikörper nachzuvollziehen.
Parallel zur Markierung der Leukozyten, die
durch Inkubieren der Probe mit einem
spezifischen IOTest 3-Reagenz erfolgt, wird
dieselbe
Probe
mit
dieser
IOTest 3
Negativkontrolle markiert. Die Erythrozyten der
beiden Präparate werden anschließend durch
eine Lyse eliminiert. Die von diesem Prozess
verschonten
Leukozyten
werden
im
Durchflusszytometer untersucht.
Das
Durchflusszytometer
misst
die
Lichtverteilung sowie die Fluoreszenz der
Zellen. Dabei werden die Zellen innerhalb eines
in einem Histogramm definierten elektronischen
Fensters
untersucht,
das
die
Seitwärtslichtstreuung ("Side Scatter" oder SS)
und die Fluoreszenz von ECD (der Markierung
an CD19 entsprechend) wiedergibt. Es sind
auch andere Histogramme, die zwei der am
Zytometer
vorhandenen
Parameter
kombinieren, als Grundlage zum elektronischen
Gating anwendbar.
Der Vergleich der erzielten Fluoreszenzstärken
an der Target-Population zum einen mit der
Negativkontrolle und zum anderen mit der
spezifischen IOTest 3 Markierung dient zur
Unterscheidung der markierten und nicht
markierten Zellen (1, 2).
LAGERUNG, STABILITÄT
Die flüssigen konjugierten Formen werden vor
und nach Öffnen des Fläschchens bei 2 bis 8°C
vor Lichteinstrahlung geschützt aufbewahrt.
Stabilität des geschlossenen Fläschchens: siehe
Haltbarkeitsdatum des Reagenzes auf dem
Fläschchen.
Stabilität des geöffneten Fläschchens: Das
Reagenz ist 90 Tage nach Öffnen haltbar.
REAGENZIENBESTANDTEILE
Wenden Sie sich an den Kundendienst von
Beckman Coulter, um die Antikörperkonzentration
im IOTest 3 Reagenz zu erfahren.
VERFALLSANZEICHEN
Jegliche Veränderung der physikalischen
Eigenschaften der Reagenzien kann auf eine
Alterung hinweisen, das Reagenz sollte dann
nicht mehr verwendet werden.
Im Falle von Verpackungsschäden oder einer
Leistungbeeinträchtigung
des
Produkts,
kontaktieren Sie bitte Ihren lokalen Vertrieb oder
benutzen Sie die folgende e-mail :
[email protected]
WICHTIGE HINWEISE
1. Das
Reagenz
nicht
über
das
Haltbarkeitsdatum hinaus anwenden.
2. Nicht einfrieren.
3. Vor der Anwendung auf Raumtemperatur
(18 – 25°C) erwärmen lassen.
4. Lichteinstrahlung
auf
ein
Minimum
begrenzen.
5. Kontamination durch Mikroorganismen der
Reagenzien vermeiden. Dies könnte zu
falschen Ergebnissen führen.
6. Natriumazid
(NaN3)
enthaltende
Antikörperlösungen sind vorsichtig zu
handhaben. Verschlucken und jeglicher
Kontakt mit der Haut, den Schleimhäuten
und den Augen ist zu vermeiden.
Zudem kann Natriumazid in einem sauren
Medium potentiell gefährliches Azoimid
bilden. Zur Entsorgung wird empfohlen, das
Reagenz in einer großen Menge Wasser zu
verdünnen und es anschließend in den
Abfluss zu gießen. So kann eine Anhäufung
von Natriumazid in den Metallleitungen
vermieden und einer Explosionsgefahr
vorgebeugt werden.
7. Jede Blutprobe muss als potentiell infektiös
betrachtet und daher mit den üblichen
Vorsichtsmaßnahmen gehandhabt werden
(insbesondere Tragen von Handschuhen,
Kittel und Schutzbrille).
8. Nie mit dem Mund pipettieren und jeglichen
Kontakt der Proben mit der Haut, den
Schleimhäuten und den Augen vermeiden.
9. Die Blutröhrchen und das zur Handhabung
verwendete Einwegmaterial müssen in zur
Verbrennung
vorgesehenen
ad
hocContainern entsorgt werden.
PROBEN
Die Blutabnahmen von venösem Blut bzw. die
Knochenmarkpunktionen müssen mit sterilen
Röhrchen vorgenommen werden, die ein EDTASalz als gerinnungshemmende Substanz
enthalten.
Die
Benutzung
anderer
Antikoagulanzien wird nicht empfohlen.
6 / 26
Spezifikationen der
Komponente 3
Die Proben müssen bei Raumtemperatur (18 –
25°C) und ruhend aufbewahrt werden. Vor
Durchführung des Tests wird empfohlen, die
Probe
durch
leichtes
Schütteln
zu
homogenisieren.
Die Proben müssen innerhalb von 24 Stunden
nach der Probeentnahme analysiert werden.
METHODE
ERFORDERLICHES, NICHT GELIEFERTES
MATERIAL
Röhrchen zur Blutabnahme und weiteres für
die Blutabnahme erforderliches Material.
Automatische Pipetten und Einweghülsen zur
Entnahme folgender Mengen: 20, 100 und
500 µL.
Hämolyseröhrchen aus Kunststoff.
Eich-Beads: Flow-Set Fluorospheres (Art.
6607007)
Folgende Reagenzien werden für das
Erreichen optimaler Ergebnisse empfohlen:
- Lysereagenz: IOTest 3 Lyselösung
(Art. A07799).
- Fixationsreagenz: Fixationslösung IOTest 3
(Art. A07800).
- Eine der spezifischen Antikörperlösungen
der IOTest 3-Reihe, bei der CD19-ECD als
Gating-Hilfe angewendet wird.
Puffer (PBS: 0,01 M Natriumphosphat;
0,145 M Natriumchlorid; pH 7,2).
Zentrifuge.
Automatischer Rüttler (Typ Vortex).
Durchflusszytometer.
TESTVERFAHREN
Für jede getestete Probe zusätzlich zum
Kontrollröhrchen ein Teströhrchen vorsehen, in
dem die Zellen mit der spezifischen IOTest 3Antikörperlösung in Kontakt gebracht werden.
1. In
jedes
Kontrollröhrchen
20 µL
Negativkontrolle und in jedes Teströhrchen
20 µL spezifische IOTest 3-Antikörperlösung
geben.
2. In beiden Röhrchen 100 µL der zu
testenden Probe hinzufügen. Leicht rütteln
(Vortex).
3. 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur
(18 –25°C) und vor Lichteinstrahlung
geschützt inkubieren.
4. Erythrolyse durchführen. Dazu wenn
erforderlich 2 mL IOTest 3 Lyselösung (Art.
A07799) in Arbeitskonzentration (1X)
hinzufügen. Sofort rütteln und 10 Minuten
bei
Raumtemperatur
und
vor
Lichteinstrahlung geschützt inkubieren.
Wenn die Probe keine roten Blutkörperchen
enthält, 2 mL PBS hinzufügen.
A07730 2014-05-12_DE
5. 5 Minuten bei 300 x g und Raumtemperatur
zentrifugieren.
6. Überstände durch Absaugen entfernen.
7. Zellpellet in 3 mL PBS resuspendieren.
8. Schritt 5 wiederholen.
9. Überstände durch Absaugen entfernen und
Zellpellet resuspendieren in:
0,5 mL oder 1 mL IOTest 3 Fixationslösung
(Art. A07800) in Arbeitskonzentration (1X),
wenn die Proben zwischen 2 und
24 Stunden vor dem Test aufbewahrt
werden sollen,
0,5 mL oder 1 mL PBS ohne Formaldehyd,
wenn die Proben innerhalb von 2 Stunden
getestet werden.
HINWEIS: In jedem Fall müssen die Proben
zwischen 2 und 8°C und vor Lichteinstrahlung
geschützt aufbewahrt werden.
MERKMALE
SPEZIFITÄT
Der monoklonale Antikörper (mAk) J3-119
wurde 1989 auf dem 4. HLDA-Workshop über
die Differenzierungsantigene der menschlichen
Leukozyten in Wien, Österreich (3, 4) dem
Molekül CD19 zugeordnet.
Der mAk 679.1Mc7 hat dieselben strukturellen
Eigenschaften
wie
die
spezifischen
monoklonalen Antikörper der IOTest 3–Reihe,
weist jedoch keinerlei Spezifität gegenüber
zellulären Antigenen auf (1).
LINEARITÄT
Zum Testen der CD19-Markierungslinearität
dieses Reagenzes wurden eine positive
(RAMOS) und eine negative (HPBALL) Zelllinie
in unterschiedlichen Proportionen jedoch bei
gleichbleibender
endgültiger
Zellmenge
vermischt, so dass sich das Verhältnis zwischen
positiver und negativer Population der Mischung
zwischen 0 und 100% bewegt.
Es wurden gemäß dem vorausgehend
beschriebenen Verfahren Aliquote markiert und
die lineare Regression zwischen den erwarteten
und beobachteten Werten berechnet.
Spezifität
CD19
Lineare Regression
Linearität
(R2)
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
ERWARTETE ERGEBNISSE
Jedes
Labor
muss
eine
Liste
von
Referenzwerten erstellen, die auf einer Gruppe
von gesunden Spendern aus der lokalen
Population
beruht.
Dies
hat
unter
Berücksichtigung
von
Alter,
Geschlecht,
ethnischer Zugehörigkeit sowie allen anderen
potentiellen regionalen Unterschieden zu
erfolgen.
In unseren Laboren wurde Vollblut von
50 gesunden Erwachsenen unter Anwendung
des oben beschriebenen Reagenz behandelt.
Die
bei
den
relevanten
Leukozytensubpopulationen dieser 50 Spender
erzielten
Ergebnisse
werden
in
der
nachfolgenden Tabelle aufgeführt:
Lymphozyten
CD19+
Anzahl
Durch
schnitt
(%)
SD
VK
(%)
50
10,8
5,7
53
REPRODUZIERBARKEIT INNERHALB EINES
LABORS
Am gleichen Tag und am gleichen Zytometer
wurden
12
prozentuale
Analysen
der
Markierung eines Positiv-Targets (RAMOS)
durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse – als
Prozentzahlen markierter Zellen für CD19 und
als mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) für die
FITC- und PE-konjugierten unspezifischen
Antikörper – werden in der folgenden Tabelle
zusammengefasst:
RAMOS
Anzahl
Durch
schnitt
SD
VK
(%)
CD19+ (%)
12
99,9
0,05
0,05
FITC (MFI)
12
0,84
0,01
8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
EINSCHRÄNKUNGEN DER TECHNIK
1. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie
können falsch sein, wenn das Zytometer nicht
richtig
eingestellt
und
die
Fluoreszenzstreuung
nicht
richtig
kompensiert wird. Außerdem müssen die
Regionen korrekt gewählt werden.
2. Vorzugsweise sollte eine Lysetechnik der
Erythrozyten mit Waschschritten angewendet
werden, da dieses Reagenz nicht für
Lysetechniken ohne Waschschritte optimiert
wurde.
3. Genaue und reproduzierbare Ergebnisse
werden erzielt, wenn die angewendeten
Verfahren den Anleitungen der Datenblätter
und der richtigen Laborpraxis entsprechen.
4. Die konjugierte Antikörper dieses Reagenzes
sind so kalibriert, dass das beste
spezifische / nicht-spezifische
Signalverhältnis erzielt wird. Deshalb ist es wichtig,
das Verhältnis Reagenz/Probenvolumen in
jedem Test einzuhalten.
7 / 26
5. Bei einer Hyperleukozytose das Blut in PBS
verdünnen, so dass man einen Wert von ca.
5 x 109 Leukozyten/ L erhält.
6. Bei manchen Pathologien wie z. B. schwerer
Niereninsuffizienz oder Hämoglobinopathien
kann die Lyse der roten Blutkörperchen
verlangsamt, unvollständig oder sogar
unmöglich sein. In diesem Fall wird
empfohlen, die einkernigen Zellen vor dem
Markieren durch einen Dichtegradienten (z.
B. Ficoll) zu isolieren.
7. Aufgrund
der
Tandem
struktur
des
Fluorochroms emittiert ECD auch 575 nm.
Diese zweite Emissionsspitze schwankt bei
ECD
je
nach
Charge.
Bei
einer
Mehrfarbanalyse
sollte
die
Kompensationsmatrix daher sorgfältig geprüft
werden, wenn die Charge ECD-Konjugat
gewechselt wird.
DIVERSES
Darstellungen
(EXAMPLES)
und
Literaturhinweise (REFERENCES) siehe Anhang
(APPENDIX).
HANDELSMARKEN
Beckman Coulter, das stilisierte Logo,
COULTER, ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest and
XL sind Marken von Beckman Coulter, Inc., und
sind beim USPTO eingetragen.
Texas Red-X ist eine Marke von Molecular
Probes, Inc.
HERGESTELLT VON :
IMMUNOTECH SAS
Frankreich
Kundenservice: (33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Alle Rechte vorbehalten.
A07730 2014-05-12_DE
Especificidad
Especificaciones del
componente 1
No aplicable
componente 2
No aplicable
componente 3
CD19
Clon
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hibridoma
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Inmunógeno
Hapteno no biológico
Hapteno no biológico
Células de linfoma SKLY18
Inmunoglobulina
IgG1
IgG1
IgG1,
Especie
Ratón
Líquido ascítico o sobrenadante
de células de hibridoma
cultivadas in vitro
Cromatografía de afinidad
Ratón
cultivadas in vitro
Ratón
cultivadas in vitro
Fluorocromo
Isotiocianato de fluoresceína
(FITC)
R Ficoeritrina (PE)
R Ficoeritrina-Texas Red-X
(ECD)
Relación molar
IOTest 3
ESPAÑOL
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 determinaciones; 0,5 mL
20 µL / determinación
Fuente
Purificación
IOTest 3
Anticuerpos Conjugados
IVD
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
de excitación
488 nm
488 nm
488 nm
Pico de emisión
525 nm
575 nm
613 nm
Tampón
PBS pH 7,2 al que se le adicionan 2 mg / mL de BSA y 0,1% NaN3
APLICACIÓN
Esta mezcla de anticuerpos conjugados a
fluorocromos (Control Negativo-FITC / Control
Negativo-PE / CD19-ECD) es un control
negativo
diseñado
para
el
análisis
multiparamétrico por citometría de flujo. Permite
determinar la tinción inespecífica de todos los
IOTest 3 que utilizan el CD19-ECD.
PRINCIPIO
Esta determinación se basa en la capacidad de
los anticuerpos monoclonales inespecíficos de
reproducir la tinción inespecífica de los
anticuerpos específicos.
En paralelo a la tinción de los leucocitos que se
realiza incubando la muestra con un reactivo
IOTest 3 específico, se efectúa, en la misma
muestra, una tinción con este control negativo
IOTest 3.
Los
eritrocitos
de
ambas
preparaciones son eliminados a continuación
por lisis, y los leucocitos, no afectados por esta
etapa, son analizados por citometría de flujo.
El citómetro de flujo analiza la dispersión de la
luz y la fluorescencia de las células. Permite
acotar las células dentro de una ventana
electrónica, definida en un histograma que
correlaciona la dispersión lateral de la luz ("Side
Scatter" o SS) con la fluorescencia del ECD,
correspondiente a la tinción en CD19. También
pueden utilizarse como apoyo para la fase de
creación de una ventana electrónica otros
histogramas que combinen dos de los distintos
parámetros disponibles en el citómetro.
La comparación de los niveles de fluorescencia
obtenidos con este control negativo en la
población blanco, por una parte, y con la tinción
específica IOTest 3, por otra parte, permite
discriminar las células con tinción positiva de las
células no marcadas (1, 2).
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Los anticuerpos conjugados en forma líquida se
conservan entre 2 y 8°C en un lugar protegido
de la luz, antes y después de abrir el frasco.
Estabilidad del frasco cerrado: véase la fecha
de caducidad del reactivo indicada en el frasco.
Estabilidad del frasco abierto: el reactivo es
estable durante 90 días.
COMPOSICIÓN DEL REACTIVO
Póngase en contacto con el Servicio al Cliente
de Beckman Coulter para obtener la
concentración de anticuerpos en el reactivo
IOTest 3.
SIGNOS DE DETERIORO
Cualquier cambio en la apariencia física de los
reactivos puede indicar deterioro. En tal caso, el
reactivo no debe utilizarse.
En caso de detectar un deterioro en el
embasado del producto ó que los resultados
expresen una alteración en las características
del mismo, contactar con el Distribuidor local ó
notificar a la dirección de e-mail :
[email protected]
PRECAUCIONES
1. No utilizar el reactivo después de la fecha de
caducidad.
2. No congelar.
3. Esperar que esté a la temperatura ambiente
(18 – 25°C) antes de utilizarlo.
4. Minimizar el tiempo de exposición a la luz.
5. La contaminación microbiana de los
reactivos puede generar resultados erróneos.
6. Las soluciones de anticuerpo que contienen
azida sódica (NaN3) deben manipularse con
precaución. No ingerir y evitar todo contacto
con la piel, las mucosas y los ojos.
Por otra parte, en medio ácido, la azida
sódica puede formar un ácido hidrazoico
potencialmente peligroso. Si fuera necesario
eliminar el reactivo, se recomienda diluirlo en
un gran volumen de agua antes de verterlo
en las canalizaciones, para evitar la
acumulación de azida sódica en los sistemas
metálicos de conducción y los riesgos de
explosión.
7. Toda muestra de sangre debe considerarse
como
potencialmente
infecciosa
y
manipularse con las precauciones de uso (en
particular; utilización de guantes, bata y
gafas protectoras).
8. No pipetear nunca con la boca y evitar todo
contacto de las muestras con la piel, las
mucosas y los ojos.
9. Los tubos de sangre y el material desechable
que se hayan empleado durante la
manipulación
deben
desecharse
en
contenedores ad hoc destinados a la
incineración.
MUESTRAS
Las muestras de sangre venosa o de médula
ósea deben recogerse en tubos estériles que
contengan
una
sal
de
EDTA
como
anticoagulante. No se recomienda el uso de otro
anticoagulante.
Las muestras se conservan a temperatura
ambiente (18 – 25ºC) y en reposo. Antes de
efectuar el análisis de la muestra, se
recomienda homogeneizarla mediante agitación
suave.
Las muestras deben analizarse en las 24 horas
siguientes a su obtención.
8 / 26
METODOLOGÍA
MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO
Tubos de recogida de muestra y material
necesario para el procesamiento de las
muestras.
Pipetas automáticas y puntas desechables
para volúmenes de 20,100 y 500 µL.
Tubos de hemólisis de plástico.
Microesferas de calibración: Fluoroesferas
Flow-Set (Ref. 6607007).
Para
obtener
resultados
óptimos,
recomendamos los siguientes reactivos:
- Reactivo de lisis: Solución de Lisis IOTest 3
(Ref. A07799).
- Reactivo de fijación: Solución de Fijación
IOTest 3 (Ref. A07800).
- Una de las soluciones de anticuerpos
conjugados específicos de la gama IOTest 3
que utilizan el CD19-ECD como apoyo a la
selección electrónica por ventana.
Tampón (PBS: fosfato sódico 0,01 M; cloruro
sódico 0,145 M; pH 7,2).
Centrífuga.
Mezclador automático (tipo Vórtex).
Citómetro de flujo.
PROCEDIMIENTO
Para cada muestra analizada, además del tubo
problema, se debe incluir un tubo control en el
que se incubarán las células con la solución de
anticuerpos conjugados IOTest 3 específica.
1. En cada tubo control, introducir 20 µL del
control negativo y en cada tubo problema,
20 µL de la solución de anticuerpos
conjugados IOTest 3 específica.
2. Añadir 100 µL de la muestra que debe
probarse en los 2 tubos. Mezclar
suavemente en el Vórtex.
3. Incubar 15 a 20 minutos a temperatura
ambiente (18 – 25°C) y en un lugar protegido
de la luz.
4. Proceder, si es necesario, a la lisis de los
glóbulos rojos añadiendo 2 mL de Solución
de Lisis IOTest 3 (Ref. A07799) a su
concentración de trabajo (1X). Mezclar
inmediatamente en el Vórtex e incubar
10 minutos a temperatura ambiente y en un
lugar protegido de la luz. Si la muestra no
contiene glóbulos rojos, añadir 2 mL de PBS.
5. Centrifugar 5 minutos a 300 x g y a
temperatura ambiente.
6. Eliminar el sobrenadante por aspiración.
7. Resuspender el botón celular en 3 mL de
PBS.
8. Repetir la etapa 5.
A07730 2014-05-12_ES
9. Eliminar lo sobrenadante por aspiración y
resuspender el botón celular en:
0,5 mL o 1 mL de Solución de Fijación
IOTest 3 (Ref. A07800) a su concentración de
trabajo (1X), si las preparaciones deben
conservarse más de 2 horas y menos de
24 horas,
0,5 mL o 1 mL de PBS sin formaldehído, si
las preparaciones se analizan antes de
2 horas.
ADVERTENCIA: De todos modos, las
preparaciones deben conservarse entre 2 y 8°C
en un lugar protegido de la luz.
RENDIMIENTO DE LA DETERMINACIÓN
ESPECIFICIDAD
El AcMo J3-119 se asignó al CD19 en el
transcurso del 4º HLDA Workshop sobre los
Antígenos de Diferenciación de los Leucocitos
Humanos, Viena, Austria, en 1989 (3, 4).
El AcMo 679.1Mc7 presenta características
estructurales idénticas a las de los anticuerpos
monoclonales específicos de la gama IOTest 3
pero carece de toda especificidad frente a los
antígenos celulares (1).
LINEALIDAD
Para comprobar la linealidad de tinción del
CD19 de este reactivo, se mezclaron una línea
celular positiva (RAMOS) y una línea celular
negativa (HPBALL) en distintas proporciones
para obtener una concentración celular final
constante, de modo que la proporción línea
positiva/línea negativa de la mezcla fuera de 0 a
100%.
Se procesaron las alícuotas según el
procedimiento anteriormente descrito y se
calculó la regresión lineal entre los valores
esperados y los valores observados.
Especificidad
CD19
Regresión lineal
Linealidad
(R2)
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
VALORES ESPERADOS
Cada laboratorio debe establecer una lista de
valores de referencia basados en un grupo de
donantes sanos que pertenecen a la población
local. Esto debe hacerse teniendo en cuenta la
edad, el sexo, el origen étnico, y cualquier otra
posible diferencia regional.
En nuestros laboratorios, se trató la sangre
entera de 50 adultos sanos, utilizando el
reactivo mencionado
anteriormente.
Los
resultados obtenidos para las subpoblaciones
leucocitarias de interés de estos 50 donantes se
agrupan en las tablas siguientes:
Linfocitos
CD19+
Número
Media
(%)
DE
CV
(%)
50
10,8
5,7
53
REPRODUCIBILIDAD INTRALABORATORIO
El mismo día y con el mismo citómetro, se
realizaron 12 determinaciones del porcentaje de
tinción de una población blanco (RAMOS). Los
resultados obtenidos, en porcentaje de células
marcadas para el CD19 y en intensidad media
de fluorescencia (MFI) para los anticuerpos
inespecíficos conjugados FITC y PE, se
agrupan en la tabla siguiente:
RAMOS
Número
Media
DE
CV
(%)
CD19+ (%)
12
99,9
0,05
0,05
FITC (MFI)
12
0,84
0,01
1,8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
LIMITACIONES DE LA TÉCNICA
1. Los resultados de citometría de flujo pueden
ser erróneos si el citómetro no se alinea
perfectamente, las fluorescencias no se
compensan correctamente y las ventanas de
selección no se ajustan cuidadosamente.
2. Utilizar preferentemente una técnica de lisis
de los eritrocitos con lavado, ya que este
reactivo no ha sido optimizado para las
técnicas de lisis denominadas "sin lavado".
3. Los
resultados
serán
precisos
y
reproductibles en la medida en que los
procedimientos
utilizados
sigan
las
instrucciones de las fichas técnicas y sean
compatibles con las buenas prácticas de
laboratorio.
4. El anticuerpo conjugado de este reactivo
está calibrado para ofrecer una relación
señal específica/señal inespecífica óptima.
Por ello, es importante respetar la proporción
entre el volumen de reactivo y el volumen de
muestra en cada determinación.
5. En caso de hiperleucocitosis, se debe diluir la
sangre en PBS hasta una concentración
aproximada de 5 x 109 leucocitos/L.
6. En ciertas patologías, como las insuficiencias
renales graves o las hemoglobinopatías, la
lisis de los glóbulos rojos puede ser parcial o
imposible. En tales casos, se recomienda
aislar las células mononucleadas por
gradiente de densidad (por ejemplo: Ficoll)
antes de la tinción.
7. Debido a la estructura tándem del
fluorocromo, ECD también emite a 575 nm.
Este pico secundario de emisión varía de un
lote de ECD a otro. Por ello, en caso de
análisis
multicolor,
debe
verificarse
atentamente la matriz de compensación cada
vez que se cambie de lote de conjugado
ECD.
9 / 26
OTROS
Véase el Anexo (APPENDIX)
ilustraciones (EXAMPLES) y la
para las
bibliografía
(REFERENCES).
MARCAS COMERCIALES
Beckman Coulter, el logotipo estilizado,
COULTER, ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest y XL
son marcas registradas de Beckman Coulter,
Inc., inscritas en la Oficina de Marcas y
Patentes de Estados Unidos (USPTO).
Texas Red-X es una marca comercial de
FABRICADO POR :
IMMUNOTECH SAS
France
Servicio al cliente: (33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Todos los derechos reservados.
A07730 2014-05-12_ES
Εμεηδίθεπζε
Υαξαθηεξηζηηθά ηνπ
ζπζηαηηθνύ 1
Μδ εθανιόζζιδ
Μδ εθανιόζζιδ
CD19
Κιώλνο
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Τβξίδωκα
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Αλνζνγόλν
Μδ αζμθμβζηό απηέκζμ
Μδ αζμθμβζηό απηέκζμ
Κύηηανα θειθώιαημξ SKLY18
Αλνζνζθαηξίλε
IgG1
IgG1
IgG1,
Eίδνο
Πμκηζηόξ
Uβνό αζηίηδ ή οπενηείιεκμ
ηςκ in vitro ηαθθζενβδιέκςκ
οαδνζδςιαηζηώκ ηοηηάνςκ
Χνςιαημβναθία ζοββέκεζαξ
Πμκηζηόξ
Uβνό αζηίηδ ή οπενηείιεκμ ηςκ
in vitro ηαθθζενβδιέκςκ
Πμκηζηόξ
Uβνό αζηίηδ ή οπενηείιεκμ ηςκ
in vitro ηαθθζενβδιέκςκ
Ιζμεεζμηοακζηό μλύ
θεμνζμζηεΐκδξ (FITC)
R Φοημενοενίκδ (PE)
R Φοημενοενίκδ -Texas Red-X
(ECD)
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
IOTest 3
ΕΛΛΗΝΙΚΑ
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 δμηζιαζίεξ, 0,5 mL
20 µL / δμηζιαζία
Πεγή
Καζαξηζκόο
Φζνξηόρξωκα
IOTest 3
΢πδεπγκέλα Αληηζώκαηα
IVD
Γξακκνκνξηαθή
αλαινγία
δηέγεξζεο
488 nm
488 nm
488 nm
Κνξπθή εθπνκπήο
525 nm
575 nm
613 nm
Ρπζκηζηηθό δηάιπκα
PBS pH 7,2 ειπθμοηζζιέκμ ιε 2 mg / mL BSA ηαζ 0,1% NaN3
ΥΡΗ΢Η
Αοηό ημ ιείβια ζογεοβιέκςκ ακηζζςιάηςκ ηαζ
θεμνζμπνςιάηςκ (Ανκδηζηόξ Έθεβπμξ-FITC /
Ανκδηζηόξ Έθεβπμξ-PE / CD19-ECD) απμηεθεί
ανκδηζηό
έθεβπμ
πνμζανιμζιέκμ
ζηδκ
πμθοπαναιεηνζηή ακάθοζδ ιέζς ηοηηανμιεηνίαξ
νμήξ ςξ ανςβό ημο πενζμνζζιμύ. Δπζηνέπεζ ηδ
ιδ εζδζηή ζήιακζδ όθςκ ηςκ IOTest 3 πμο
πνδζζιμπμζμύκ ημ CD19-ECD.
ΑΡΥΗ
Η δμηζιαζία αοηή ααζίγεηαζ ζηδκ ζηακόηδηα ηςκ
ιδ ελεζδζηεοιέκςκ ιμκμηθςκζηώκ ακηζζςιάηςκ
κα ακαπανάβμοκ ηδ ιδ εζδζηή ζήιακζδ ηςκ
ελεζδζηεοιέκςκ ακηζζςιάηςκ.
Πανάθθδθα ιε ηδ ζήιακζδ ηςκ θεοημηοηηάνςκ
πμο πναβιαημπμζείηαζ ιέζς ηδξ επώαζδξ ιε
έκα ελεζδζηεοιέκμ ακηζδναζηήνζμ IOTest 3,
πναβιαημπμζείηαζ, ζημ ίδζμ δείβια, ιζα ζήιακζδ
ιε αοηόκ ημκ ανκδηζηό έθεβπμ IOTest 3. Δκ
ζοκεπεία, ηα ενοενμηύηηανα ελαθείθμκηαζ ιέζς
θύζδξ ηαζ ηα θεοημηύηηανα, πμο παναιέκμοκ
ακεπδνέαζηα από αοηό ημ αήια, ακαθύμκηαζ
ιέζς ηοηηανμιεηνίαξ νμήξ.
Ο ηοηηανμιεηνδηήξ νμήξ ακαθύεζ ηδ δζάποζδ ημο
θςηόξ όπςξ ηαζ ημκ θεμνζζιό ηςκ ηοηηάνςκ.
Δπζηνέπεζ ημκ πενζμνζζιό ηςκ ηοηηάνςκ ζημ
εζςηενζηό εκόξ δθεηηνμκζημύ παναεύνμο, πμο
μνίγεηαζ από έκα ζζηόβναιια πμο ζοζπεηίγεζ ηδ
μνεμβώκζα ζηέδαζδ ημο θςηόξ ("Side Scatter" ή
SS) ηαζ ημκ θεμνζζιό ημο ECD, πμο ακηζζημζπεί
ζηδ ζήιακζδ CD19. Άθθα ζζημβνάιιαηα πμο
ζοκδοάγμοκ
δύμ
από
ηζξ
δζαεέζζιεξ
δζαθμνεηζηέξ παναιέηνμοξ ημο ηοηηανμιεηνδηή
ιπμνμύκ
ελίζμο
κα
πνδζζιμπμζδεμύκ
οπμζηδνζηηζηά ηαηά ημ ζηάδζμ ημο δθεηηνμκζημύ
πενζμνζζιμύ.
Η ζύβηνζζδ ηςκ επζπέδςκ θεμνζζιμύ πμο
ελήπεδζακ ιε αοηόκ ημκ ανκδηζηό έθεβπμ από
ημκ πθδεοζιό ζηόπμ, από ηδ ιζα πθεονά, ηαζ ιε
ηδκ εζδζηή ζήιακζδ IOTest 3, από ηδκ άθθδ,
επζηνέπεζ ηδ δζάηνζζδ ηςκ ζδιαζιέκςκ
ηοηηάνςκ από ηα ιδ ζδιαζιέκα ηύηηανα (1, 2).
ζοβηέκηνςζδ ακηζζώιαημξ ζημ ακηζδναζηήνζμ
IOTest 3.
ΕΝΔΕΙΞΕΙ΢ ΑΛΛΟΙΧ΢Η΢
Η μπμζαδήπμηε αθθαβή ζηδ θοζζηή ειθάκζζδ
ηςκ ακηζδναζηδνίςκ ιπμνεί κα οπμδεζηκύεζ
αθθμίςζδ ηαζ ημ ακηζδναζηήνζμ δεκ πνέπεζ κα
πνδζζιμπμζείηαζ.
΢ε πενίπηςζδ επζδείκςζδξ ζοζηεοαζίαξ ή εάκ
ηα απμηεθέζιαηα πμο πνμέηορακ έπμοκ
ηνμπμπμίδζδ απόδμζδξ, παναηαθώ εθάηε ζε
επαθή ιε ημκ ημπζηό δζακμιέα ζαξ ή
πνδζζιμπμζήζηε ηδκ αηόθμοεδ δζεύεοκζδ
δθεηηνμκζημύ ηαποδνμιείμο :
[email protected]
ΠΡΟΦΤΛΑΞΕΙ΢
Οζ οβνέξ ζογεοβιέκεξ μοζίεξ δζαηδνμύκηαζ ζε
εενιμηναζίεξ ιεηαλύ 2 ηαζ 8°C πνμζηαηεοιέκεξ
από ημ θςξ, πνζκ ηαζ ιεηά από ημ άκμζβια ημο
θζαθζδίμο.
΢ηαεενόηδηα
ηθεζζημύ
θζαθζδίμο:
αθέπε
διενμιδκία θήλδξ ημο ακηζδναζηδνίμο όπςξ
αοηή ακαβνάθεηαζ ζημ θζαθίδζμ.
΢ηαεενόηδηα
ακμζβιέκμο
θζαθζδίμο:
ημ
ακηζδναζηήνζμ δζαηδνείηαζ βζα 90 διένεξ.
1. Μδ πνδζζιμπμζείηε ημ ακηζδναζηήνζμ ιεηά
ηδκ διενμιδκία θήλδξ.
2. Μδκ ημ ρύπεηε.
3. Αθήζηε ημ ακηζδναζηήνζμ κα επακέθεεζ ζε
εενιμηναζία πενζαάθθμκημξ (18 – 25°C)
πνζκ από ηδ πνήζδ.
4. Γζαηδνήζηε ζημ εθάπζζημ ημκ πνόκμ έηεεζδξ
ζημ θςξ.
5. Απμθύβεηε ηδ ιόθοκζδ ηςκ ακηζδναζηδνίςκ
από ιζηνόαζα ώζηε κα απμθύβεηε ηδκ
ειθάκζζδ θακεαζιέκςκ απμηεθεζιάηςκ.
6. Χεζνζζηείηε ηα δζαθύιαηα ακηζζςιάηςκ πμο
πενζέπμοκ NaN3 ιε πνμζμπή. Μδκ εζζπκέεηε
ηαζ απμθεύβεηε ηάεε επαθή ιε ημ δένια,
ημοξ αθεκκμβόκμοξ ηαζ ηα ιάηζα.
Αηόιδ, ζε όλζκμ πενζαάθθμκ, ημ NaN3 είκαζ
δοκαηό κα ζπδιαηίζεζ οδνμγςσηό μλύ πμο
είκαζ πζεακά επζηίκδοκμ. Δάκ είκαζ
απαναίηδηδ δ απόποζδ ημο ακηζδναζηδνίμο,
ζοζηήκεηαζ δ αναίςζή ημο ζε ιεβάθμ όβημ
κενμύ πνζκ από ηδ νίρδ ημο ζημοξ αβςβμύξ
οδάηςκ,
ώζηε
κα
απμθεοπεεί
δ
ζοζζώνεοζδ NaN3 ζημοξ ιεηαθθζημύξ
αβςβμύξ ηαζ δ πζεακόηδηα έηνδλδξ.
7. Κάεε δείβια αίιαημξ εα πνέπεζ κα εεςνείηαζ
πζεακά ιμθοζιαηζηό ηαζ ηάεε ιέηνμ
πνμθύθαλδξ εα πνέπεζ κα ηδνείηαζ ηαηά ηδ
πνήζδ ημο (εζδζηόηενα: δ πνήζδ βακηζώκ,
ζημθήξ ηαζ πνμζηαηεοηζηώκ βοαθζώκ).
8. Απμθύβεηε ηάεε επαθή ηδξ πζπέηηαξ ιε ημ
ζηόια ηαεώξ ηαζ ηάεε επαθή ηςκ
δεζβιάηςκ ιε ημ δένια, ημοξ αθεκκμβόκμοξ
ηαζ ηα ιάηζα.
9. Σα θζαθίδζα αίιαημξ ηαζ ηα πνδζζιμπμζδιέκα
οθζηά ιζαξ πνήζδξ εα πνέπεζ κα
απμννίπημκηαζ ζε ηαηάθθδθα δμπεία πμο
πνμμνίγμκηαζ βζα απμηέθνςζδ.
΢Τ΢ΣΑΣΙΚΑ ΑΝΣΙΔΡΑ΢ΣΗΡΙΟΤ
ΔΕΙΓΜΑΣΑ
΢ΤΝΣΗΡΗ΢Η, ΢ΣΑΘΕΡΟΣΗΣΑ
Δπζημζκςκήζηε ιε ηδκ Δλοπδνέηδζδ Πεθαηώκ
ηδξ Beckman Coulter βζα κα θάαεηε ηδ
Σα δείβιαηα θθεαζημύ αίιαημξ ή ιοεθμύ ηςκ
μζηώκ εα πνέπεζ κα δζαηδνμύκηαζ ζε
10 / 26
απμζηεζνςιέκα θζαθίδζα πμο πενζέπμοκ EDTA
ςξ ακηζπδηηζηό. Η πνήζδ άθθμο ακηζπδηηζημύ δε
ζοκίζηαηαζ.
Σα δείβιαηα δζαηδνμύκηαζ ζε εενιμηναζία
πενζαάθθμκημξ
(18 – 25°C)
ηαζ
πςνίξ
ακαηίκδζδ. Πνζκ από ηδ δμηζιαζηζηή θήρδ
ζοκίζηαηαζ δ μιμβεκμπμίδζδ ημο δείβιαημξ
ιέζς ήπζαξ ακαηίκδζδξ.
Η ακάθοζδ ηςκ δεζβιάηςκ πνέπεζ κα θαιαάκεζ
πώνα εκηόξ 24 ςνώκ από ηδ θήρδ ημοξ.
ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ
ΑΠΑΡΑΙΣΗΣΑ ΤΛΙΚΑ ΠΟΤ ΔΕΝ ΠΑΡΕΥΟΝΣΑΙ
΢ςθήκεξ βζα ηδ θήρδ δεζβιάηςκ ηαζ οθζηά
απαναίηδηα βζα ηδ θήρδ αοηή.
Αοηόιαηεξ πζπέηηεξ ηαζ εζδζηά νύβπδ ιζαξ
πνήζδξ βζα ηδ θήρδ πμζμηήηςκ όβημο 20,
100 ηαζ 500 µL.
Πθαζηζημί ζςθήκεξ αζιόθοζδξ.
΢θαζνίδζα ααειμκόιδζδξ: Φεμνμζθαζνίδζα
Flow-Set (Κςδ. 6607007).
Γζα ηδκ απόηηδζδ αέθηζζηςκ απμηεθεζιάηςκ,
ζοζηήκμκηαζ ηα παναηάης ακηζδναζηήνζα:
- Ακηζδναζηήνζμ θύζδξ: Γζάθοια Λύζδξ
IOTest 3 (Κςδ. A07799).
- Ακηζδναζηήνζμ ζηενεόηδηαξ: ΢ηενεςηζηό
Γζάθοια IOTest 3 (Κςδ. A07800).
Μία
από
ηζξ
ελεζδζηεοιέκεξ
θύζεζξ
δζαθοιάηςκ ζογεοβιέκςκ ακηζζςιάηςκ ηδξ
ηθίιαηαξ IOTest 3 πμο πνδζζιμπμζμύκ ημ
CD19-ECD ςξ ανςβό πενζμνζζιμύ.
Ροειζζηζηό
δζάθοια
(PBS
:
0,01 M
θςζθμνζηό κάηνζμ; 0,145 M πθςνζμύπμ
κάηνζμ; pH 7,2).
΢οζηεοή θοβμηέκηνζζδξ.
Αοηόιαημξ ακαδεοηήναξ (ηύπμο Vortex).
Κοηηανμιεηνδηήξ νμήξ.
ΔΙΑΔΙΚΑ΢ΙΑ
Γζα ηάεε δείβια πνμξ ακάθοζδ, πνμαθέρηε
εηηόξ ημο δμηζιαζηζημύ ζςθήκα, έκακ ζςθήκα
εθέβπμο ιέζα ζημκ μπμίμ ηα ηύηηανα εα
ανίζημκηαζ
οπό
ηδκ
πανμοζία
ημο
ελεζδζηεοιέκμο
δζαθύιαημξ
ζογεοβιέκςκ
ακηζζςιάηςκ Test 3.
1. ΢ε ηάεε δμηζιαζηζηό ζςθήκα, ημπμεεηήζηε
20 µL ημο ελεζδζηεοιέκμο δζαθύιαημξ
ζογεοβιέκςκ ακηζζςιάηςκ IOTest 3 ηαζ
ιέζα ζε ηάεε ζςθήκα εθέβπμο αάθηε 20 µL
ημο ηαηάθθδθμο ανκδηζημύ εθέβπμο.
2. Πνμζεέζηε 100 µL ημο πνμξ ελέηαζδ
δείβιαημξ ζημοξ 2 ζςθήκεξ. Ακαηζκήζηε ιε
Vortex εθαθνά ημοξ ζςθήκεξ.
3. Δπςάζηε βζα 15 έςξ 20 θεπηά ζε
εενιμηναζία πενζαάθθμκημξ (18 – 25°C) ηαζ
ιαηνζά από εζηίεξ θςηόξ.
A07730 2014-05-12_GR
4. Πνμπςνήζηε ζηδ θύζδ ηςκ ενοενώκ
αζιμζθαζνίςκ, εάκ αοηό είκαζ απαναίηδημ,
πνμζεέημκηαξ 2 mL Γζαθύιαημξ Λύζδξ
IOTest 3 (Κςδ. A07799) ζηδκ ζοβηέκηνςζή
πνήζδξ ημο (1X). Ακαηζκήζηε ιε Vortex
αιέζςξ ηαζ επςάζηε βζα 10 θεπηά ζε
εενιμηναζία πενζαάθθμκημξ ηαζ ιαηνζά από
εζηίεξ θςηόξ. Δάκ ημ δείβια δεκ πενζέπεζ
ενοενά αζιμζθαίνζα, πνμζεέζηε 2 mL PBS.
5. Φοβμηεκηνίζηε ζηα 300 x g βζα 5 θεπηά ζε
εενιμηναζία πενζαάθθμκημξ.
6. Απαθθαπεείηε από ημ οπενηείιεκμ ιέζς
ακαννόθδζδξ.
7. Δκαζςνήζηε λακά ημ ηοηηανζηό ίγδια ζε
3 mL PBS.
8. Δπακαθάαεηε ημ αήια 5.
9. Απαθθαπεείηε από ημ οπενηείιεκμ ιέζς
ακαννόθδζδξ ηαζ εκαζςνήζηε λακά ημ
ηοηηανζηό ίγδια ζε:
0,5 mL ή 1 mL ΢ηενεςηζημύ Γζαθύιαημξ
IOTest 3 (Κςδ. A07800) ζηδκ ζοβηέκηνςζδ
πνήζδξ ημο (1X), εάκ ηα παναζηεοάζιαηα
πνόηεζηαζ κα ζοκηδνδεμύκ βζα πενζζζόηενμ
ηςκ 2 ςνώκ, ηαζ θζβόηενμ ηςκ 24 ςνώκ,
0,5 mL ή 1 mL PBS πςνίξ θμνιαθδεΰδδ,
εάκ ηα παναζηεοάζιαηα πνόηεζηαζ κα
οπμζημύκ ακάθοζδ ιέζα ζηζξ επόιεκεξ
2 ώνεξ.
΢ΗΜΔΙΩ΢Η: ΢ε
όθεξ
ηζξ
πενζπηώζεζξ,
δζαηδνείζηε
ηα
παναζηεοάζιαηα
ζε
εενιμηναζίεξ ιεηαλύ 2 ηαζ 8°C ηαζ ιαηνζά από
εζηίεξ θςηόξ.
ΕΠΙΔΟ΢ΕΙ΢
ΕΞΕΙΔΙΚΕΤ΢Η
Σμ ιμκμηθςκζηό ακηίζςια (ΜΑ) J3-119
ζοζπεηίζηδηε ιε ημ CD19 ηαηά ηδ δζάνηεζα ημο 4μο
΢οκεδνίμο
HLDA
βζα
ηα
Ακηίβμκα
Γζαθμνμπμίδζδξ
ηςκ
Ακενώπζκςκ
Λεοημηοηηάνςκ, Βζέκκδ, Αοζηνία, ημ 1989 (3, 4 ).
Σμ ΜΑ 679.1Mc7 πανμοζζάγεζ πανόιμζα δμιζηά
παναηηδνζζηζηά ιε αοηά ηςκ ελεζδζηεοιέκςκ
ιμκμηθςκζηώκ ακηζζςιάηςκ ηδξ ηθίιαηαξ
IOTest 3 αθθά ζηενείηαζ ηάεε ελεζδίηεοζδξ ζε
ζπέζδ ιε ηα ηοηηανζηά ακηζβόκα (1).
ΓΡΑΜΜΙΚΟΣΗΣΑ
Πνμηεζιέκμο κα εθεβπεεί δ βναιιζηόηδηα
ζήιακζδξ ημο CD19, ιζα εεηζηή ηοηηανζηή ζεζνά
(RAMOS) ηαζ ιζα ανκδηζηή ηοηηανζηή ζεζνά
(HPBALL)
ακαιίπεδηακ
ζε
δζαθμνεηζηέξ
ακαθμβίεξ ηαζ ιε ζηαεενή ηεθζηή ηοηηανζηή
πμζόηδηα, έηζζ ώζηε δ ακαθμβία ηδξ εεηζηήξ
ζεζνάξ/ανκδηζηήξ ζεζνάξ ημο ιείβιαημξ κα
ηοιαίκεηαζ από 0 έςξ 100%.
Σα ηιήιαηα ζδιάκεδηακ ζύιθςκα ιε ηδ
δζαδζηαζία πμο πενζβνάθδηε παναπάκς ηαζ δ
βναιιζηή παθζκδνόιδζδ ηςκ ακαιεκόιεκςκ
ηζιώκ έκακηζ ηςκ ηζιώκ πμο παναηδνήεδηακ
οπμθμβίζηδηε.
Δλεζδίηεοζδ
CD19
Γναιιζηή
παθζκδνόιδζδ
Γναιιζηόηδηα
(R2)
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
΢ηα ενβαζηήνζά ιαξ, ελεηάζηδηε ημ μθζηό αίια
50 οβζώκ εκδθίηςκ, πνδζζιμπμζώκηαξ ημ
ακηζδναζηήνζμ πμο πενζβνάθδηε παναπάκς. Σα
απμηεθέζιαηα πμο ελήπεδζακ από ημοξ
θεοημηοηηανζημύξ οπμ-πθδεοζιμύξ αοηώκ ηςκ
50 δμηώκ μιαδμπμζήεδηακ ζημκ παναηάης
πίκαηα:
Λειθμηύηηανα
CD19+
Ανζειόξ
MΟ
(%)
ΣΑ
΢Γ
(%)
50
10,8
5,7
53
ΕΝΔΟΕΡΓΑ΢ΣΗΡΙΑΚΗ ΕΠΑΝΑΛΗΦΙΜΟΣΗΣΑ
ΑΠΟΣΕΛΕ΢ΜΑΣΧΝ
Σδκ ίδζα διένα ηαζ ιέζς ημο ίδζμο
ηοηηανμιεηνδηή νμήξ, πναβιαημπμζήεδηακ
12 πνμζδζμνζζιμί ημο πμζμζημύ πνώζδξ ζε
έκακ
πθδεοζιό
ζηόπμ
(RAMOS).
Σα
απμηεθέζιαηα πμο ελήπεδζακ, ζε πμζμζηό
ζεζδιαζιέκςκ ηοηηάνςκ βζα ημ CD19 ηαζ ζε
Μέζδ Έκηαζδ Φεμνζζιμύ (MΔΦ ή MFI) βζα ηα
ιδ ελεζδζηεοιέκα ζογεοβιέκα ακηζζώιαηα ιε
FITC ηαζ ΡΔ μιαδμπμζήεδηακ ζημκ παναηάης
πίκαηα:
Ανζειόξ
MΟ
ΣΑ
΢Γ
(%)
CD19+ (%)
12
99,9
0,05
0,05
FITC (MFI))
12
0,84
0,01
1,8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
RAMOS
ΠΕΡΙΟΡΙ΢ΜΟΙ ΣΗ΢ ΣΕΥΝΙΚΗ΢
1. Σα απμηεθέζιαηα ηδξ ηοηηανμιεηνίαξ νμήξ
ιπμνεί κα είκαζ θακεαζιέκα εάκ μ
ηοηηανμιεηνδηήξ νμήξ δεκ είκαζ ηέθεζα
εοεοβναιιζζιέκμξ, εάκ δεκ έπμοκ θδθεεί
ζςζηά οπόρδ μζ δζαννμέξ θεμνζζιμύ ηζ εάκ
μζ πενζμπέξ πενζμνζζιμύ δεκ έπμοκ
ημπμεεηδεεί επζιεθώξ.
2. Χνδζζιμπμζείηε ηαηά πνμηίιδζδ ιζα ηεπκζηή
θύζδξ ηςκ ενοενμηοηηάνςκ ιε πθύζδ
ηαεώξ
δ
θεζημονβία
αοημύ
ημο
ακηζδναζηδνίμο δεκ είκαζ δ αέθηζζηδ βζα ηζξ
ηεπκζηέξ θύζδξ "πςνίξ πθύζδ".
3. Αηνζαή ηαζ επακαθήρζια απμηεθέζιαηα
ελάβμκηαζ ζημ ιέηνμ πμο μζ ηεπκζηέξ πμο
πνδζζιμπμζμύκηαζ είκαζ ζύιθςκεξ ιε ηζξ
ηεπκζηέξ μδδβίεξ ηαζ ζοιααηέξ ιε ηζξ
αέθηζζηεξ ενβαζηδνζαηέξ πναηηζηέξ.
4. Σμ ζογεοβιέκμ ακηίζςια αοημύ ημο
ακηζδναζηδνίμο είκαζ ααειμκμιδιέκμ ώζηε
κα πνμζθένεζ ηδκ ηαθύηενδ ακαθμβία
εζδζηήξ ζήιακζδξ / ιδ εζδζηήξ ζήιακζδξ. Γζα
αοηό ημ θόβμ, είκαζ ζδιακηζηό κα ηδνείηε ηδκ
ακαθμβία όβημο ακηζδναζηδνίμο / όβημο
δείβιαημξ ζε ηάεε δμηζιαζία.
5. ΢ε
πενίπηςζδ
οπενθεοημηοηηάνςζδξ,
αναζώζηε ημ αίια ιε PBS ώζηε κα επζηύπεηε
ιζα ηζιή πμο κα πνμζεββίγεζ ηα 5 x 109
θεοημηύηηανα / L.
6. ΢ε ηάπμζεξ ζοβηεηνζιέκεξ παεμθμβζηέξ
ηαηαζηάζεζξ, όπςξ μζ ζμαανέξ κεθνζηέξ
ακεπάνηεζεξ ή μζ αζιμζθαζνζκμπάεεζεξ, δ
θύζδ ηςκ ενοενώκ αζιμζθαζνίςκ ιπμνεί κα
επζαναδοκεεί, αηόιδ ηαζ κα βίκεζ αηεθήξ ή
ηαζ αδύκαηδ. ΢ε αοηήκ ηδκ πενίπηςζδ,
ζοζηήκεηαζ δ απμιόκςζδ ηςκ ιμκμπύνζκςκ
ηοηηάνςκ ιε αάζδ ημ ααειό ποηκόηδηαξ
ημοξ (βζα πανάδεζβια: Ficoll) πνζκ από ηδ
ζήιακζδ.
7. Λόβς
ηδξ
δίδοιδξ
δμιήξ
ημο
θεμνζμπώιαημξ, ημ ECD εηθύεζ επίζδξ θςξ
ζηα 575 nm. Αοηή δ δεοηενμβεκήξ ημνοθή
έηθοζδξ δζαθένεζ ζημ ECD από πανηίδα ζε
πανηίδα. Δπμιέκςξ, βζα ηδκ πμθοπνςιαηζηή
ακάθοζδ δ ιήηνα ακηζζηάειζζδξ πνέπεζ κα
εθεβπεεί πνμζεηηζηά ηαηά ηδκ αθθαβή ηδξ
πανηίδαξ ημο ζογεοβιέκμο-ECD.
ΔΙΑΦΟΡΑ ΢ΥΟΛΙΑ
Βθέπε ημ πανάνηδια (APPENDIX) βζα
παναδείβιαηα (EXAMPLES) ηαζ ηδ αζαθζμβναθία
(REFERENCES).
ΕΜΠΟΡΙΚΕ΢ ΕΠΟΝΟΜΑ΢ΙΕ΢
Σα Beckman Coulter, ηοπμπμζδιέκμ θμβόηοπμ,
COULTER, ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest ηαζ
XL είκαζ ειπμνζηά ζήιαηα ηδξ Beckman Coulter,
Inc. ηαζ έπμοκ ηαηαπςνδεεί ζημ Γναθείμ
Δονεζζηεπκζώκ ηαζ Διπμνζηώκ ΢διάηςκ ηςκ
Ηκςιέκςκ Πμθζηεζώκ (USPTO).
Σμ Texas Red-X είκαζ ειπμνζηό ζήια ηδξ
ΚΑΣΑ΢ΚΕΤΗ :
IMMUNOTECH SAS
France
Δλοπδνέηδζδ Πεθαηώκ: (33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Με ηδκ επζθύθαλδ πακηόξ δζηαζώιαημξ.
ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΑ ΑΠΟΣΕΛΕ΢ΜΑΣΑ
Κάεε ενβαζηήνζμ μθείθεζ κα ηαεζενώζεζ ιζα
θίζηα ιε ηζιέξ ακαθμνάξ ααζζζιέκεξ ζε ιζα
μιάδα από οβζείξ δόηεξ πμο ακήημοκ ζημκ
κηόπζμ πθδεοζιό. Γζα ηδ θίζηα αοηή πνέπεζ κα
θδθεμύκ οπόρδ δ δθζηία, ημ θύθμ, δ εεκζηή
ηαηαβςβή, ηαεώξ ηαζ μπμζαδήπμηε άθθδ πζεακή
ημπζηή δζαθμνά.
11 / 26
A07730 2014-05-12_GR
Specificità
Caratteristiche del
componente 1
Non applicabile
Caratteristiche del
componente 2
Non applicabile
CD19
Clone
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Ibridoma
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Immunogeno
Aptene non biologico
Aptene non biologico
Cellule linfatiche SKLY18
Immunoglobulina
IgG1
IgG1
IgG1,
Specie
Topo
Topo
Topo
Fonte
Fluido ascite o surnatante di
cellule ibridoma coltivate in vitro
Purificazione
Cromatografia di affinità
Fluorocromo
Isotiocianato di fluoresceina
(FITC)
R Ficoeritrina (PE)
R Ficoeritrina-Texas Red-X
(ECD)
Rapporto molare
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
d’eccitazione
488 nm
488 nm
488 nm
Picco d’emissione 525 nm
575 nm
613 nm
IOTest 3
ITALIANO
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 test; 0,5 mL
20 µL / test
IOTest 3
Anticorpi Coniugati
IVD
Tampone
UTILIZZO
Questa miscela di anticorpi coniugati a
fluorocromi (Controllo Negativo-FITC / Controllo
Negativo-PE / CD19-ECD) è un controllo
negativo indicato per l’analisi multiparametrica in
citometria a flusso di supporto al gating. Essa
consente di determinare la marcatura non
specifica di tutti i reagenti IOTest 3 che utilizzano
il CD19-ECD.
PRINCIPIO
Il principio sul quale si basa questo test è la
capacità degli anticorpi monoclonali di controllo
negativo di riprodurre la marcatura non specifica
che si ottiene con anticorpi specifici.
Su uno stesso campione, parallelamente alla
marcatura dei leucociti, realizzata tramite
incubazione con un reagente IOTest 3 specifico,
si effettua una marcatura utilizzando questo
controllo negativo IOTest 3. Successivamente,
gli eritrociti dei due preparati vengono eliminati
tramite lisi e i leucociti, non coinvolti in questa
fase, vengono analizzati in citometria a flusso.
Il citometro a flusso misura la diffusione della
luce nonché la fluorescenza delle cellule.
Questo strumento consente di circoscrivere le
cellule all’interno di una finestra di analisi in un
istogramma che correla la diffusione ortogonale
della luce ("Side Scatter" o SS) e la
fluorescenza dell’ECD, corrispondente alla
marcatura CD19. Gli istogrammi, che correlano
due dei parametri disponibili sul citometro,
costituiscono un supporto alla fase di gating.
Il confronto dei livelli di fluorescenza ottenuti
sulla popolazione target, da una parte con
questo controllo negativo e, dall’altra, con la
marcatura specifica IOTest 3, consente di
distinguere le cellule marcate da quelle non
marcate (1, 2).
CONSERVAZIONE E STABILITÀ
Le forme coniugate liquide si conservano a una
temperatura compresa tra i 2 e gli 8°C e al
riparo dalla luce, prima e dopo l’apertura del
flacone.
Stabilità flacone chiuso: vedere la data di
scadenza del reagente indicata sul flacone.
Stabilità flacone aperto: il reagente mantiene la
sua stabilità per 90 giorni.
MATRICE DEL REAGENTE
Contattare il servizio di assistenza clienti di
Beckman Coulter per ottenere la concentrazione
dell’anticorpo nel reagente IOTest 3.
INDICI DI DETERIORAMENTO
Qualsiasi cambiamento nell’aspetto fisico dei
reagenti potrebbe indicare un deterioramento; in
tal caso, il reagente non deve essere utilizzato.
Caratteristiche del
componente 3
PBS pH 7,2 addizionato con 2 mg / mL di BSA e lo 0,1% di NaN3
In caso il kit fosse danneggiato o i dati ottenuti
mostrino un alterazione della performance, si
prega di contattare il distributore locale o di
scrivere al indizzo e-mail seguente :
[email protected]
PRECAUZIONI
1. Non utilizzare il reagente dopo la data di
scadenza.
2. Non congelare.
3. Attendere che il flacone raggiunga la
temperatura ambiente (18 – 25°C) prima di
utilizzarlo.
4. Ridurre al minimo l’esposizione alla luce.
5. Evitare la contaminazione microbica dei
reagenti onde evitare l’apparizione di
risultati errati.
6. Le soluzioni di anticorpi contenenti sodio
azide (NaN3) devono essere manipolate con
cautela. Non ingerire ed evitare il contatto
con la pelle, le mucose e gli occhi.
Inoltre, ricordare che, in ambienti acidi, il
sodio azide può formare un acido idrazoico
potenzialmente pericoloso. Qualora fosse
necessario provvedere allo smaltimento del
reagente, si raccomanda di diluirlo in un
grande volume di acqua prima di versarlo
nelle tubazioni, in modo da evitare
l’accumulo di sodio azide nei condotti
metallici e prevenire rischi di esplosione.
7. Ogni singolo campione di sangue deve
essere considerato potenzialmente infettivo
e deve essere manipolato seguendo le
apposite precauzioni d’uso (in particolare, si
raccomanda di indossare guanti, camice e
occhiali protettivi).
8. Non pipettare con la bocca ed evitare il
contatto dei campioni con la pelle, le
mucose e gli occhi.
9. Le provette di sangue e il materiale usa e
getta utilizzato per la manipolazione devono
essere smaltiti in appositi recipienti
destinatiall’incenerimento.
PRELIEVI
Il sangue venoso o il midollo osseo da
analizzare devono essere messi in provette
sterili contenenti EDTA come anticoagulante. È
sconsigliato l'uso di altri anticoagulanti.
I campioni vanno conservati a temperatura
ambiente (18 – 25°C) senza agitare. Prima di
effettuare
il
test,
si
raccomanda
di
omogeneizzare il contenuto della provetta
agitandola leggermente.
I campioni devono essere analizzati entro 24 ore
dal prelievo.
12 / 26
METODOLOGIA
MATERIALE NECESSARIO NON FORNITO
Provette per prelievo e materiale necessario
ai prelievi.
Pipette automatiche e puntali usa e getta
destinati a prelevare quantità di 20, 100 e
500 µL.
Provette di plastica per effettuare l’emolisi.
Sfere di calibrazione: Fluorosfere Flow-Set
(Rif. 6607007)
Per ottenere risultati ottimali, si raccomanda
l’uso dei seguenti reagenti:
- Reagente di lisi: Soluzione di Lisi IOTest 3
(Rif. A07799).
- Reagente fissante: Soluzione Fissante
IOTest 3 (Rif. A07800).
- Una delle soluzioni di anticorpi coniugati
specifici della gamma IOTest 3 che utilizzano
il CD19-ECD come supporto al gating.
Tampone (PBS: 0,01 M fosfato di sodio;
0,145 M cloruro di sodio; pH 7,2).
Centrifuga.
Agitatore automatico (tipo Vortex).
Citometro a flusso.
PROCEDURA
Per ogni campione analizzato, è necessario
prevedere, oltre alla provetta test, 1 provetta di
controllo nella quale saranno messe le cellule in
presenza della soluzione di anticorpi coniugati
IOTest 3 specifica.
1. In ogni provetta di controllo, aggiungere
20 µL del controllo negativo e in ogni
provetta test aggiungere 20 µL della
soluzione specifica di anticorpi coniugati
IOTest 3.
2. Aggiungere 100 µL del campione da testare
nelle 2 provette. Agitare delicatamente
nell’agitatore.
3. Incubare per 15 - 20 minuti a temperatura
ambiente (18 – 25°C) e al riparo dalla luce.
4. Se necessario, procedere alla lisi dei globuli
rossi, aggiungendo 2 mL di Soluzione di Lisi
IOTest 3
(Rif.
A07799)
alla
sua
concentrazione di lavoro (1X). Agitare
immediatamente nell’agitatore e incubare
per 10 minuti a temperatura ambiente e al
riparo dalla luce. Se il campione non
contiene globuli rossi, aggiungere 2 mL di
PBS.
5. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g e a
6. Eliminare il surnatante tramite aspirazione.
7. Risospendere il pellet (fondello) cellulare in
3 mL di PBS.
8. Ripetere il punto 5.
9. Eliminare il surnatante tramite aspirazione e
risospendere il pellet cellulare in:
A07730 2014-05-12_IT
0,5 o 1 mL di Soluzione Fissante IOTest 3
(Rif. A07800) alla sua concentrazione di
lavoro (1X), se i preparati devono essere
conservati per più di 2 ore e meno di 24 ore,
0,5 o 1 mL di PBS senza formaldeide, se i
preparati devono essere analizzati entro
2 ore.
N.B.: In ogni caso, conservare i preparati a una
temperatura compresa tra i 2 e gli 8°C e al
riparo dalla luce.
CARATTERISTICHE
SPECIFICITÀ
L'anticorpo monoclonale (MoAb) J3-119 è stato
riconosciuto come specifico per l’antigene CD19
nel corso del 4° HLDA Workshop sugli Antigeni
di Differenziazione dei Leucociti Umani, tenutosi
a Vienna, Austria, nel 1989 (3, 4).
Il MoAb 679.1Mc7 esprime caratteristiche
strutturali identiche a quelle degli anticorpi
monoclonali specifici della gamma IOTest 3,
tuttavia non presenta alcuna reazione specifica
nei confronti degli antigeni cellulari (1).
LINEARITÀ
Per testare la specificità di marcatura del CD19
di questo reagente, sono state mescolate, in
proporzioni diverse pur mantenendo costante il
numero totale di cellule, una linea cellulare
positiva (RAMOS) e una linea cellulare negativa
(HPBALL). Il rapporto linea positiva/negativa
fornisce un dato lineare ordinabile su una scala
da 0 a 100%.
Alcune aliquote sono state testate in base alla
procedura descritta sopra. È stata inoltre
calcolata la regressione lineare tra valori attesi e
valori osservati.
Specificità
Regressione lineare
Linearità
(R2)
CD19
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
RISULTATI ATTESI
Ogni laboratorio deve redigere un elenco di
valori di riferimento basato su un gruppo di
donatori sani appartenenti alla popolazione
locale. Ciò deve essere fatto tenendo conto
dell’età, del sesso, dell’appartenenza etnica e di
qualsiasi altra potenziale differenza regionale.
Nei nostri laboratori, sono stati analizzati i
campioni di sangue intero di 50 soggetti adulti
sani utilizzando il reagente sopra descritto. Nelle
tabelle che seguono sono riportati i valori medi
dei risultati ottenuti sulle sottopopolazioni
leucocitarie interessate dal test eseguito su
questi 50 donatori:
Linfociti
Numero
Media
(%)
DS
CV
(%)
CD19+
50
10,8
5,7
53
RIPRODUCIBILITÀ INTRALABORATORIO
Lo stesso giorno e con lo stesso citometro, sono
state effettuate 12 determinazioni della
percentuale di marcatura di un target positivo
(RAMOS). Nella tabella seguente sono riportati
il numero di cellule, espresso in percentuale, i
marcate per il CD19 e l’Ιntensità Media di
Fluorescenza (MFI) usando gli anticorpi non
specifici coniugati FITC e PE:
RAMOS
Numero
Media
DS
CV
(%)
CD19+ (%)
12
99,9
0,05
0,05
FITC (MFI)
12
0,84
0,01
1,8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
5. In In caso di iperleucocitosi, diluire il sangue
in un po’ di PBS fino a ottenere un valore
intorno a 5 x 109 leucociti/L.
6. Nel corso di determinate patologie, come le
insufficienze
renali
gravi
o
le
emoglobinopatie, la lisi dei globuli rossi può
risultare rallentata, se non addirittura
incompleta o impossibile. In questo caso, è
consigliabile isolare le cellule mononucleate
mediante gradiente di densità (ad esempio:
Ficoll) prima della marcatura.
7. A causa della struttura a tandem del
fluorocromo, ECD emette anche luce a
575 nm. Questo picco emissione secondario
varia da lotto a lotto di ECD. Di
conseguenza, per un’analisi multi -colore, è
necessario controllare con attenzione la
matrice compensazione al momento del
cambiamento del lotto di un coniugato ECD.
ALTRO
LIMITI DELLA TECNICA
1. I risultati di citometria a flusso potrebbero
rivelarsi errati qualora non si fosse
provveduto al perfetto allineamento del
citometro, alla corretta compensazione delle
fluorescenze e al preciso posizionamento
delle regioni da analizzare.
2. È preferibile utilizzare una tecnica di lisi
degli eritrociti con lavaggio perché il
reagente non è stato ottimizzato per le
cosiddette tecniche di lisi “senza lavaggio”.
3. Si otterranno risultati precisi e riproducibili a
condizione che le procedure applicate siano
conformi alle istruzioni riportate nelle schede
tecniche e compatibili con le buone pratiche
di laboratorio.
4. L’anticorpo coniugato di questo reagente è
calibrato in modo tale da offrire il miglior
rapporto segnale specifico/segnale non
specifico. È dunque importante mantenere
per ogni test il rapporto volume del
reagente/volume del campione.
Per le illustrazioni (EXAMPLES) e la bibliografia
(REFERENCES), consultare l’allegato (APPENDIX).
MARCHI COMMERCIALI
Beckman Coulter, il logo stilizzato, COULTER,
ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest e XL sono dei
marchi registrati di Beckman Coulter, Inc., e
sono registrati in USPTO.
Texas Red-X è un marchio depositato di
fabbrica di Molecular Probes, Inc.
PRODOTTO DA :
IMMUNOTECH SAS
Francia
Servizio Clienti: (33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Tutti i diritti riservati.
13 / 26
A07730 2014-05-12_IT
Especificidade
Especificações do
constituinte 1
Não aplicável
Especificações do
constituinte 2
Não aplicável
CD19
Clone
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hibridoma
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Imunogénio
Hapteno não-biológico
Hapteno não-biológico
Células do Linfoma SKLY18
Imunoglobulina
IgG1
IgG1
IgG1,
Espécies
Ratinho
Fluido de ascite ou
sobrenadante de células de
hibridoma por cultura in vitro
Cromatografia da afinidade
Ratinho
Fluido de ascite ou
Ratinho
Fluido de ascite ou
Fluorocromo
Isotiocianato de Fluoresceína
(FITC)
R Ficoeritrina (PE)
(ECD)
Razão molar
2.5 – 5.0
0.5 – 1.5
0.5 – 1.5
excitação
488 nm
488 nm
488 nm
Pico da Emissão
525 nm
575 nm
613 nm
Tampão
PBS pH 7.2 mais 2 mg / mL BSA e 0.1% NaN3
IOTest 3
PORTUGUÊS
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 testes; 0.5 mL
20 µL / teste
Fonte
Purificação
IOTest 3
Anticorpos Conjugados
IVD
USO
Esta mistura de anticorpos conjugados com
fluorocromos (Controlo Negativo -FITC /
Controlo Negativo-PE / CD19-ECD) é um
controlo negativo utilizado em análises
multiparamétricas com citometria de fluxo, o
qual actua como um adjudante da aquisição.
Permite a demonstração da coloração não
específica de todos os IOTest 3 que usam
CD19-ECD.
PRINCIPIO
Este teste esta baseado na capacidade que
têm os anticorpos monoclonais para reproduzir
a coloração não específica dos anticorpos
específicos.
Paralelamente com a coloração dos leucócitos,
a qual é realizada por incubação da amostra
com o reagente específico IOTest 3, é realizada
também uma coloração sobre a amostra com o
controlo negativo IOTest 3. Os eritrócitos das
duas preparações são removidos por lise e os
leucócitos, os quais não são afectados por este
processo, são analisados por citrometría de
fluxo.
O citómetro de fluxo analisa a difusão da luz e
a fluorescência das células. Esto permite a
localização das células dentro da janela
electrónica definida sobre um histograma que
correlaciona a difusão da luz ortogonal
(“Expressão Ligeira ou SS”) com a
fluorescência do ECD, correspondendo à
coloração do CD19. Os outros histogramas que
combinam dois dos diferentes parâmetros
avaliáveis sobre o citómetro, são também
usados na plataforma da aquisição electrónica.
A comparação dos níveis de fluorescência
obtidos sobre a população seleccionada
permite, por uma parte, com este controlo
negativo e por a outra parte, com a coloração
especifica IOTest 3, a coloração das células de
modo a poderem ser descriminadas das não
coradas (1, 2).
CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE
A forma de líquidos conjugados deve ser
mantida entre 2 e 8°C e protegida da luz, antes
e depois do frasco ter sido aberto.
Estabilidade do frasco fechado: ver data de
expiração do frasco.
Estabilidade do frasco aberto: o reagente é
estável por 90 dias.
CONSTITUIÇÃO DOS REAGENTES
Contacte o serviço de assistência ao cliente
Beckman Coulter para obter a concentração de
anticorpos no reagente IOTest 3.
SINAL DE DETERIORAÇÃO
Qualquer alteração no aspecto físico dos
reagentes poderá indicar deterioração e o
reagente não deverá ser utilizado.
Se a embalagem estiver deteriorada ou se os
dados obtidos demonstrarem alguma alteração
do desempenho, contacte o seu distribuidor
local ou use o seguinte correio electrónico :
[email protected]
PRECAUÇÕES
1. Não use o reagente após a data de
expiração.
2. Não refrigere.
3. Deixe alcançar à temperatura ambiente
antes de usar (18 – 25°C).
4. Evite a exposição à luz.
5. Evite a contaminação microbiana dos
reagentes,
podem
obter-se
falsos
resultados.
6. As soluções de anticorpos contendo azida
sódica (NaN3) devem ser manipuladas com
cuidado. Não utilize para uso interno e
evite o contacto com a pele, mucosas e
olhos. Além disso, em meio ácido, a azida
sódica pode formar o ácido hidrazoico
potencialmente perigoso. Para evitar esta
possibilidade,
recomenda-se
que
o
reagente seja diluído em um grande
volume de água antes de o colocar no
sistema de drenagem, para evitar a
acumulação de azida sódica nos tubos de
metal e para previr o risco de explosão.
7. Todas as amostras de sangue devem ser
consideradas
como
potencialmente
infecciosas e devem ser manipuladas com
cuidado (em particular: uso de luvas, fatos
e óculos).
8. Nunca pipetar com a boca e evitar qualquer
contacto das amostras com a pele, mucosa
e olhos.
9. Os tubos de sangue e qualquer material
descartável usado na manipulação, deve
ser descartado num frasco especial
fechado para incineração.
AMOSTRAS
Amostras de sangue ou de medula óssea
devem ser colhidas utilizando tubos estéreis e
contendo
um
sal
de
EDTA
como
anticoagulante. Não é recomendado o uso de
outros anticoagulantes.
As amostras devem ser mantidas à
temperatura ambiente (18 – 25°C) e não devem
ser agitadas. As amostras devem ser
homogeneizadas por agitação suave antes de
tomar a amostra do ensaio.
14 / 26
Especificações do
constituinte 3
As amostras devem ser analisadas dentro das
24 horas seguintes à colheita.
METODOLOGIA
MATERIAL NECESSÁRIO NÃO FORNECIDO
Tubos de ensaio e material necessário para
amostragem.
Pipetas
automáticas
com
pontas
descartáveis para 20, 100 e 500 µL.
Tubos plásticos de hemólise.
Esferas
de
calibração:
Flow-Set
Fluorospheres (Ref. 6607007).
Para
obter
melhores
resultados,
recomendam-se o uso dos seguintes
reagentes:
- Reagente de Lise: IOTest 3 Solução Lise
(Ref. A07799).
- Reagente de Fixação: IOTest 3 Solução de
Fixação (Ref. A07800).
Uma combinação de anticorpos conjugados
específicos da linha IOTest 3 que usa o
CD19-ECD como um ajudante para a
aquisição electrónica.
Tampão (PBS: 0.01 M fosfato de sódio;
0.145 M cloreto de sódio; pH 7.2).
Centrífuga.
Agitador automático (tipo Vortex).
Citómetro de fluxo.
PROCEDIMENTO
Por cada amostra analisada, adicionalmente
ao tubo controlo, deverá ser utilizado um tubo
teste no qual as células serão misturadas com
a solução de anticorpos conjugados IOTest 3
específica.
1. Adicione 20 ιL do controlo negativo em
cada tubo controlo e 20 ιL da solução de
anticorpos conjugados IOTest 3 específica
em cada tubo teste.
2. Adicione 100 µL da amostra teste aos dois
tubos. Agite no vortex os tubos
suavemente.
3. Incube por 15 a 20 minutos à temperatura
ambiente (18 – 25°C), protegido da luz.
4. Realize, se necessário, lise dos glóbulos
vermelhos adicionando 2 mL de Solução
Lise IOTest 3 (Ref. A07799) à concentração
de trabalho (1X). Agitar no vortex
imediatamente e incube por 10 minutos à
temperatura ambiente, protegido da luz. Se
a amostra não contem glóbulos vermelhos,
adicione 2 mL de PBS.
5. Centrifugue por 5 minutos a 300 x g a
6. Retire o sobrenadante por aspiração.
7. Ressuspenda o pellet celular usando 3 mL
de PBS.
8. Repita o passo 5.
A07730 2014-05-12_PT
9. Retire o sobrenadante por aspiração e
ressuspenda o pellet celular usando:
0.5 mL ou 1 mL de Solução de Fixação
IOTest 3 (Ref. A07800) à concentração de
trabalho (1X), se as preparações devem
ser mantidas por mais de 2 horas e menos
de 24 horas.
0.5 mL ou 1 mL de PBS sem formaldeido,
se as preparações vão ser analisadas em
2 horas.
REPRODUTIBILIDADE INTRA-LABORATÓRIO
No mesmo dia e utilizando o mesmo citómetro,
foram
processadas
12
medições
da
percentagem de coloração de un alvo positivo
(RAMOS). Os resultados obtidos são
apresentados na tabela seguinte como a
percentagem das células coradas para o CD19
e como a Média da Intensidade da
Fluorescência (MFI) para os anticorpos não
específicos conjugados FITC e PE:
RAMOS
Número
Média
(%)
SD
CV
(%)
CD19+ (%)
12
99.9
0.05
0.05
REALIZAÇÃO
FITC (MFI)
12
0.84
0.01
1.8
ESPECIFICIDADE
O anticorpo monoclonal (mAb) J3-119 foi
atribuído ao CD19 no 4° HLDA Workshop
(Human Leucocyte Differentiation Antigens),
que decorreu em Vienna, Austria, em 1989 (3,
4).
O mAb 679.1Mc7 tem características
estruturais idênticas as dos anticorpos
monoclonais específicos da linha IOTest 3, mas
não tem especificidade alguma em relação aos
antigénios celulares (1).
LINEARIDADE
Para testar a linearidade da coloração do
reagente CD19, misturaram-se uma linha
cellular positiva (RAMOS) e uma linha cellular
negativa (HPBALL) em diferentes proporções
com um número final constante de células, más
de modo que a razão linha positiva/linha
negativa da mistura encontre-se dentro do
intervalo de 0 a 100%.
Foram coloridas alíquotas utilizando o
procedimento descrito sobre e fora calculada
uma regressão linear entre os valores
observados e os esperados.
PE (MFI)
12
0.12
0.05
1.27
Nota: Seja qual for o caso, mantenha as
preparações entre 2 e 8ºC e protegidas da luz.
Especificidade
Regressão Linear
Linearidade
(R2)
CD19
Y = 0.996 X + 1.66
0.999
VALORES ESPERADOS
Cada laboratório deve compilar uma lista de
valores de referência baseados num grupo de
dadores saudáveis da população local. Deve
ser feito tomando em conta a idade, sexo e
grupo étnico assim como alguma outra
potencial diferença regional.
Nos nossos laboratórios, o sangue total de
50 adultos saudáveis foi tratado usando o
reagente anteriormente descrito. Os resultados
obtidos nas subpopulações de leucócitos de
interesse destes 50 dadores, são apresentados
nas tabelas seguintes:
Linfócitos
CD19+
Número
Média
(%)
SD
CV
(%)
50
10.8
5.7
53
LIMITAÇÕES DA TÉCNICA
1. A citometria de fluxo pode produzir falsos
resultados se o citómetro não for alinhado
perfeitamente,
se
o
escape
de
fluorescência não foi correctamente
compensado e, se as regiões não foram
cuidadosamente posicionadas.
2. É preferível utilizar a técnica de lise dos
glóbulos vermelhos com lavagem quando o
reagente não foi optimizado pelas técnicas
lise "sem lavagem".
3. Resultados seguros
e
reprodutíveis
poderão ser obtidos na medida em que o
procedimento usado esteja de acordo com
a técnica descrita no folheto incluído e seja
compatível com as boas praticas de
laboratório.
4. O anticorpo conjugado deste reagente é
calibrado de modo a oferecer a melhor
razão sinal específico/sinal não específico.
Por conseguinte, é importante aderir à
razão de volume de reagente/volume da
amostra em cada teste.
5. No caso de hiperleucocitose, dilua o
sangue em PBS até obter um valor de
aproximadamente 5 x 109 leucócitos/L.
6. Em alguns estados de doença, tais como
deficiência
renal
grave
ou
hemoglobinopatia, a lise dos glóbulos
vermelhos pode ser baixa, incompleta ou
impossível. Neste caso recomenda-se
isolar as células mononucleadas usando
um gradiente de densidade, antes da
coloração (por exemplo Ficoll).
7. Devido à estrutura em tandem do
fluorocromo, a ECD também emite luz a
575 nm. Este pico secundário da emissão
varia de lote para lote da ECD. Por isso, na
análise
multicolor,
a
matriz
de
compensação deve ser cuidadosamente
verificada quando é mudado um lote de
conjugado de ECD.
15 / 26
ANEXOS
Ver apêndice (APPENDIX) para obter exemplos
(EXAMPLES) e bibliografia (REFERENCES).
MARCAS COMERCIAIS
Beckman Coulter, o logótipo estilizado,
COULTER, ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest e XL
são marcas comerciais da Beckman Coulter,
Inc., e estão registadas junto da USPTO.
Texas Red-X é uma marca registada da
REALIZADO POR :
IMMUNOTECH SAS
France
Apoio ao cliente : (33) 4 91 17 27 27
Beckman Coulter do Brasil Com e Imp de Prod
de Lab Ltda
Estr dos Romeiros, 220 - Galpao G3 - Km 38.5
zip code 06501-001 - Sao Paulo - SP - Brasil
CNPJ: 42.160.812/0001-44
Made in France.
Todos os Direitos Reservados.
A07730 2014-05-12_PT
Specificitet
Specifikationer för
komponent 1
Ej tillämpligt
komponent 2
Ej tillämpligt
CD19
Klon
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hybridoma
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Immunogen
Icke-biologiskt hapten
Icke-biologiskt hapten
SKLY18 Lymfom celler
Immunoglobulin
IgG1
IgG1
IgG1,
Art
Mus
Mus
Mus
Källa
Ascitesvätska eller supernatant
från in vitro-odlade
hybridomceller
Ascitesvätska eller
supernatant från in vitroodlade hybridomceller
hybridomceller
Rening
Affinitetskromatografi
Fluorokrom
Fluorescein isothiocyanate
(FITC)
(ECD)
Molarförhållande
2.5 – 5.0
0.5 – 1.5
0.5 – 1.5
IOTest 3
SVENSKA
Neg. Ctrl.-FITC /
Neg. Ctrl.-PE /
CD19-ECD
REF A07730
25 tests; 0.5 mL
20 µL / test
IOTest 3
Konjugerade Antikroppar
488 nm
488 nm
488 nm
Emission Peak
525 nm
575 nm
613 nm
Buffert
PBS pH 7.2 plus 2 mg / mL BSA och 0.1% NaN3
excitation
IVD
komponent 3
ANVÄNDNING
Denna blandning av fluorokromkonjugerade
antikroppar (Negativ Kontroll-FITC/Negativ
Kontroll-PE/CD19-ECD) är en negativ kontroll
som är lämplig för multiparametrisk analys med
flödescytometri som ett stöd för gating. Den gör
det möjligt att visa den icke-specifika förgningen
hos samtliga IOTest 3 där CD19-ECD används.
PRINCIP
Testet är baserat på förmågan hos ickespecifika
monoklonala
antikroppar
att
reproducera den icke-specifika färgningen hos
specifika antikroppar.
Parallellt med att man färgar leukocyter genom
inkubation med ett specifikt IOTest 3-reagens
utför man även en färgning på samma prov
med
denna
negativa
IOTest 3-kontroll.
Erytrocyterna i de båda proverna avlägsnas
därefter genom lysering och leukocyterna, som
ej påverkas av denna process, analyseras med
flödescytometri.
Med flödescytometern analyseras cellernas
ljusspridning och fluorescens. Den gör det
möjligt att lokalisera celler i det elektroniska
fönster som är definierat i ett histogram, som
korrelerar den rätvinkliga ljusspridningen (“Side
Scatter” eller SS) med fluorescensen hos det
ECD som motsvarar inmärkningen av CD19.
Andra histogram där man kombinerar två av de
olika parametrar som finns på cytometern
används också vid gating.
Genom att jämföra de fluorescensnivåer som
erhålls på målpopulationen med å ena sidan
den negativa kontrollen och å andra sidan med
den specifika IOTest 3-färgningen kan man
särskilja färgade celler från icke färgade (1, 2).
LAGRING OCH STABILITET
Konjugerade lösningar måste förvaras mellan 2
och 8°C och skyddas från ljus, före och efter
öppning av ampullen.
Stabilitet för oöppnad ampull: se utgångsdatum
på ampullen.
Stabilitet för öppnad ampull: reagenset är stabilt
i 90 dagar.
REAGENSINNEHÅLL
Kontakta Beckman Coulter kundtjänst för att
uppnå antikroppkoncentrationen i reagenset
IOTest 3.
TECKEN PÅ PRODUKTFÖRSÄMRING
Varje förändring av det fysiska utseendet hos
reagensen kan vara ett tecken på försämring
och reagenset ska i sådana fall inte användas.
Om förpackningen är skadad eller om erhållna
data tyder på förändrade egenskaper, ber vi er
kontakta er lokala distributör eller använda
följande e-postadress :
[email protected]
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
1. Använd inte reagenset efter utgångsdatum.
2. Frys inte reagenset.
3. Rumstemperera
(18 – 25°C)
före
användning.
4. Minimera exponering för ljus.
5. Undvik
mikrobiell
kontamination
av
reagenset, i annat fall kan missvisande
resultat uppkomma.
6. Antikroppslösningar
som
innehåller
natriumazid (NaN3) ska hanteras med
försiktighet. Använd inte invärtes och
undvik all kontakt med hud, slemhinnor och
ögon.
Vidare kan natriumazid under sura
förhållanden bilda den mycket farliga
hydrazinsyran. Om reagenset måste
kasseras rekommenderas utspädning med
stora mängder vatten innan det hälls ut i
avloppssystemet. Detta för att undvika
ansamling av natriumazid i avloppsrören
med explosionsrisk som följd.
7. Alla blodprov måste behandlas som
potentiellt infektiöst material och behandlas
med försiktighet (tänk på: användning av
skydds-handskar, -rockar och -glasögon).
8. Pipettera aldrig med munnen och undvik all
kontakt med provet med hud, slemhinnor
och ögon.
9. Blodrör och engångsmaterial som använd
vid preparering ska kastas i där för avsedda
kärl och brännas.
PROVER
Venblod eller benmärgsprov måste tas i sterila
rör med EDTA salt som antikoagulant.
Användning
av
andra
antikoagulantia
rekommenderas inte.
Proverna ska förvaras i rumstemperatur (18 –
25°C) och får inte skakas. Provet ska
homogeniseras genom varsam blandning innan
pipettering.
Proverna måste analyseras inom 24 timmar
efter provtagning.
METODER
NÖDVÄNDIGT MATERIAL, INTETILLHANDAHÅLLET
Blodprovrör och material nödvändigt för
provtagning.
Automatpipetter
med
tillhörande
engångsspetsar för 20, 100 och 500 µL.
Provrör i plast.
Kalibreringskulor: Flow-Set Fluorospheres
(Ref. 6607007).
16 / 26
För optimala resultat rekommenderas
följande reagens:
- Lyseringsreagens: IOTest 3 Lyseringslösning
(Ref. A07799).
- Fixeringsreagens: IOTest 3 Fixeringslösning
(Ref. A07800).
En av lösningarna med specifik konjugerad
antikropp från IOTest 3-serien där CD19ECD används som en hjälp för gating.
Buffert (PBS: 0.01 M natriumfosfat; 0.145 M
natriumklorid; pH 7.2).
Centrifug.
Automatisk blandare (Vortex typ).
Flödescytometer.
PROCEDUR
För varje prov som analyseras krävs utöver
kontrollröret ett rör med prov, där cellerna
blandas med den specifika konjugerade
IOTest 3-antikroppen.
1. Tillsätt 20 µL av den specifika konjugerade
IOTest 3-antikroppen till varje provrör och
20 µL lämplig negativ kontroll till varje
kontrollrör.
2. Tillsätt 100 µL prov i varje rör. Vortexa
rören försiktigt.
3. Inkubera 15–20 minuter i rumstemperatur
(18 – 25°C) på mörk plats.
4. Lysera därefter vid behov de röda
blodkropparna genom att tillsätta 2 mL
IOTest 3 Lyseringslösning (Ref. A07799) i
brukskoncentration (1X). Vortexa genast
och
inkubera
i
10
minuter
vid
rumstemperatur på mörk plats. Om provet
inte innehåller några röda blodkroppar
tillsätt 2 mL PBS.
5. Centrifugera 5 minuter vid 300 x g i
rumstemperatur.
6. Sug bort supernatanten.
7. Slamma upp cellpelleten i 3 mL PBS.
8. Upprepa steg 5.
9. Sug bort supernatanten och slamma upp
cellpelleten i:
0,5 mL eller 1 mL IOTest 3 Fixeringslösning
(Ref. A07800) i brukskoncentration (1X) om
de beredda proverna skall stå mer än
2 timmar och mindre än 24 timmar,
0,5 mL eller 1 mL PBS utan formaldehyd,
om de beredda proverna skall analyseras
inom 2 timmar.
OBS! I samtliga fall måste de beredda proverna
förvaras vid mellan 2°C och 8°C på mörk plats.
A07730 2014-05-12_SE
PRESTANDA
Lymfocyter
SPECIFICITET
Den monoklonala antikroppen (mAb) J3-119
bestämdes till CD19 under den 4th HLDA
Workshop on Human Leucocyte Differentiation
Antigens, som hölls i Wien, Österrike, 1989 (3,
4).
MAb
679.1Mc7
har
identiska
strukturegenskaper
med
monoklonala
antikroppar som är specifika för IOTest 3-serien
men saknar helt specificitet för cellulära
antigener (1).
LINEARITY
För att testa linjäriteten hos detta reagens vid
CD19-färgning blandades en positiv cellinje
(RAMOS) och en negativ cellinje (HPBALL) i
olika proportioner med ett konstant slutligt antal
celler, så att kvoten positiv cellinje/negativ
cellinje hos blandningen låg mellan 0 och
100 %.
Aliquoter infärgades enligt ovanstående
procedur och linjär regression mellan de
förväntade värden och de erhållna värdena
beräknades.
Specificitet
CD19
Linjär regression
Y = 0.996 X + 1.66
Linjäritet
(R2)
CD19+
50
Medel
(%)
SD
CV
(%)
10.8
5.7
53
INTRA-LABORATORIE
REPRODUCERBARHET
På samma dag och med samma cytometer
utfördes 12 mätningar av den procentuella
färgningen av ett positivt mål (RAMOS). De
erhållna resultaten ges i följande tabell som en
procentandel CD19-positiva celler och som
medianfluorescensintensiteten (MFI) för ickespecifika konjugerade FITC- och PEantikroppar:
RAMOS
Antal
Medel
(%)
SD
CV
(%)
0.05
CD19+ (%)
12
99.9
0.05
FITC (MFI)
12
0.84
0.01
1.8
PE (MFI)
12
0.12
0.05
1.27
5.
6.
7.
Vid leukocytos, späd blodet i PBS för att
erhålla ett värde på ungefär 5 x 109
leukocyter/L.
Vid vissa sjukdomstillstånd, som svår
njursjukdom eller hemoglobinopatier, kan
hemolys av erytrocyter ta längre tid, vara
ofullständig eller till och med omöjlig. I
sådana fall är det rekommenderat att
isolera
mononukleära
celler
med
användning av densitetsgradient (till
exempel Ficoll) innan infärgning.
Till följd av tandemstrukturen hos
fluorokromen sänder ECD även ut ljus vid
575 nm. Denna sekundära emissionstopp
varierar mellan olika batcher av ECD.
Därför måste man vid flerfärgsanalys
noga kontrollera kompensationsmatrisen
när man byter till en ny batch av ECDkonjugatet.
DIVERSE
TEKNISKA BEGRÄNSNINGAR
Se APPENDIX för EXEMPEL och referenser.
1.
VARUMÄRKEN
Beckman Coulter, den stiliserade logotypen,
COULTER, ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest, och
XL är varumärken som tillhör Beckman Coulter,
Inc., och som är registrerade i USPTO.
2.
0.999
FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Varje laboratorium måste kompilera en
referensvärdestabell baserad på en grupp friska
donatorer från den lokala populationen. Hänsyn
måste tas till så väl ålder, kön och etnisk
tillhörighet som andra potentiella regionala
skillnader.
På våra laboratorier behandlades prover med
helblod från 50 friska vuxna med det ovan
beskrivna reagenset. De resultat som erhölls i
leukocytsubpopulationerna av intresse för
dessa 50 givare visas i följande tabeller:
Antal
3.
4.
Flödescytometri kan ge falska resultat om
cytometern inte har blivit perfekt inställd,
om fluorescenserna inte har blivit korrekt
kompenserade och om regionerna inte
har blivit omsorgsfullt satta.
Det
är
bäst
att
använda
en
lyseringsmetod med tvätt eftersom detta
reagens
inte
är
optimerat
för
lyseringsmetoder av typen "no wash".
Exakta och reproducerbara resultat
erhålls så länge som de använda
metoderna överensstämmer med det
tekniska produktbladet och är förenliga
med god laboratoriesed.
Reagensets konjugerade antikroppar är
kalibrerade till att ge bästa kvot: specifik
signal/icke-specifik signal. Därför är det
viktigt att hålla fast vid kvoten:
reagensvolym/provvolym vid varje analys.
Texas Red-X är ett varumärke som tillhör
TILLVERKAT AV :
IMMUNOTECH SAS
Frankrike
Kundservice : (33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Med ensamrätt.
17 / 26
A07730 2014-05-12_SE
Neg. Ctrl-FITC /
Neg. Ctrl-PE /
CD19-ECD
REF
Specificita
Specifikace výrobku
součást 1
Není relevantní
součást 2
Není relevantní
součást 3
CD19
Klon
679.1Mc7
679.1Mc7
J4.119
Hybridom
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Imunogen
Syntetický hapten
Syntetický hapten
Lymfomové buňky Skly 18
Imunoglobulin
IgG1
IgG1
IgG1,
Ţivočišný druh
Zdroj
Myš
Ascitická tekutina nebo
supernatant hybridomových
buněk kultivovaných in vitro
Afinitní chromatografie
Myš
Myš
Fluorochrom
Fluorescein isothiokyanát
(FITC)
R phycoerythrin (PE)
R phycoerythrin-Texas Red-X
(ECD)
Molární poměr
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
ι excitace
488 nm
488 nm
488 nm
Maximum emise
525 nm
575 nm
613 nm
Tlumivý roztok
PBS pH 7,2 plus 2 mg / mL BSA a 0,1% NaN3
ČESKY
IOTest 3
A07730
25 testů; 0,5 mL
20 µL / test
Purifikace
IOTest 3
Konjugovaná protilátka
IVD
POUŢITÍ
OBSAH REAGENCIÍ
Tato
směs
protilátek
konjugovaných
s fluorochromy (negativní kontrola-FITC /
negativní kontrola-PE / CD19-ECD) je negativní
kontrolou
pro
víceparametrovou
analýzu
prováděnou na průtokovém cytometru, kde její
použití usnadňuje výběr buněčné populace (tzv.
„gatování“). Reagencie slouží k průkazu
případné nespecifické vazby protilátek řady
IOTest 3, které obsahují CD19-ECD.
Kontaktujte Beckman Coulter zákaznický servis
pro získání koncentrace protilátek v IOTest 3
činidla.
PRINCIP
Test využívá vazebné vlastnosti nespecifických
monoklonálních protilátek, která je obdobou
nespecifické vazby specifických monoklonálních
protilátek.
Obdobně jako při značení leukocytů, které se
provádí inkubováním vzorku s reagencií
IOTest 3, je vzorek označen touto negativní
kontrolou řady IOTest 3. Červené krvinky jsou
z obou vzorků odstraněny lýzou a leukocyty,
které lýzou nejsou ovlivněny, je možno
analyzovat průtokovým cytometrem.
Průtokový cytometr analyzuje rozptyl světla a
fluorescenci buněk. Buňky jsou lokalizovány
uvnitř
elektronicky
vytvořeného
okna
definovaného histogramem, který koreluje
kolmou difúzi světla ("Side Scatter", neboli SS)
s fluorescencí ECD, jež odpovídá stanovení
CD19. Další dva různé parametry dostupné na
cytometru jsou kombinovány v histogramech a
používány při elektronickém výběru populace
buněk (tzv. "gatování"). Buněčná populace takto
"gatovaná" je s využitím dalších dvou
fluorescencí dále rozdělena na subpopulace
buněk.
Porovnáním fluorescenčního signálu, získaného
po označení buněk cílové populace negativní
kontrolou resp. specifickými protilátkami řady
IOTest 3, je umožněno odlišit označené buňky
od neoznačených (1, 2).
SKLADOVÁNÍ A STABILITA
Konjugované protilátky ve formě roztoku musí
být uchovávány při 2 – 8 °C bez přístupu světla
předtím i poté, co byla lahvička otevřena.
Stabilita obsahu dosud neotevřených lahviček:
viz datum exspirace uvedené na štítku lahvičky.
Stabilita obsahu jednou již otevřené lahvičky:
reagencie je stabilní po dobu 90 dní.
ZNÁMKY ZNEHODNOCENÍ
Jakákoli změna fyzického vzhledu reagencií
může signalizovat znehodnocení. Reagencii v
takovém případě nepoužívejte.
V případě závažného poškození obalu, nebo
jestliže získané výsledky nejsou ve shodě
s analytickými parametry stanovení, kontaktujte
prosím naše odborné pracovníky :
[email protected]
VAROVÁNÍ
1. Nepoužívejte reagencie s prošlým datem
exspirace.
2. Nezamrazujte.
3. Před použitím ponechejte vytemperovat na
laboratorní teplotu (18 – 25 °C).
4. Omezte působení světla na minimum.
5. Vyvarujte se mikrobiální kontaminace
reagencie, která může být příčinou
chybných výsledků.
6. Roztoky protilátek obsahují azid sodný
(NaN3), proto s nimi musí být zacházeno
opatrně. Nepoužívejte vnitřně a vyvarujte se
kontaktu reagencie s pokožkou, sliznicemi a
očima.
V kyselém prostředí může z azidu sodného
vznikat
potenciálně
nebezpečná
hydrazidová kyselina. Pokud je třeba
reagencie zlikvidovat, doporučuje se naředit
je před vylitím do odpadu velkým množstvím
vody, aby se předešlo nahromadění azidu
v kovovém potrubí a tím i riziku exploze.
7. Všechny krevní vzorky musí být považovány
za potenciálně infekční a při zacházení
s nimi
je
nutno
dodržovat
zásady
bezpečnosti práce (zejména používat
osobní ochranné pomůcky: rukavice, plášť
a brýle).
8. Nikdy nepipetujte ústy a vyvarujte se
kontaktu reagencií s pokožkou, sliznicemi a
očima.
9. Zkumavky s krví a použitý jednorázový
materiál je třeba likvidovat spálením ve
speciálních kontejnerech.
VZORKY
Vzorky žilní krve nebo kostní dřeně musí být
odebrány do sterilních zkumavek obsahujících
antikoagulační činidlo EDTA. Používání jiných
antikoagulačních látek se nedoporučuje.
Vzorky by měly být uchovávány bez míchání při
laboratorní teplotě (18 – 25 °C). Před
18 / 26
odebíráním vzorků z odběrové zkumavky do
testových zkumavek je třeba vzorky jemně
promíchat. Vzorky musí být analyzovány do
24 hodin od odběru.
METODIKA
POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ
DODÁVÁN S VÝROBKEM
Zkumavky k odběru vzorků a materiál
potřebný pro odběr.
Automatické pipety s výměnnými špičkami
k dávkování objemů 20, 100 a 500 L.
Plastové hemolyzační zkumavky.
Kalibrační částice: FlowSet Fluorospheres
(ref. č. 6607007).
Pro získání optimálních výsledků jsou
doporučeny následující reagencie:
Lyzační činidlo: lyzační roztok IOTest 3 (ref.
č. A07799).
Fixační činidlo: fixační roztok IOTest 3 (ref. č.
A07800).
Některý
z roztoků
specifických
konjugovaných protilátek řady IOTest 3,
který obsahuje pro usnadnění výběru
buněčné populace CD19-ECD.
Tlumivý roztok (PBS: 0,01 M fosforečnan
sodný, 0,145 M chlorid sodný, pH 7,2).
Centrifuga.
Automatický přístroj k míchání vzorků
(vortex).
Průtokový cytometr.
POSTUP
Pro každý analyzovaný vzorek je třeba připravit
kromě kontrolní zkumavky rovněž zkumavku
s testovaným vzorkem, kde jsou buňky
smíchány
s roztokem
specifických
konjugovaných protilátek řady IOTest 3.
1. Do každé kontrolní zkumavky přidejte 20 L
negativní kontroly a do každé testové
zkumavky přidejte 20 L specifických
konjugovaných protilátek řady IOTest 3.
2. Do obou zkumavek přidejte 100
L
testovaného vzorku. Zkumavky jemně
promíchejte na vortexu.
3. Inkubujte 15 až 20 minut při laboratorní
teplotě (18 – 25 °C) bez přístupu světla.
4. Pokud je zapotřebí provést lýzu červených
krvinek, přidejte 2 mL lyzačního roztoku
IOTest 3 (ref. č. A07799) naředěného na
pracovní
koncentraci
(1x).
Ihned
promíchejte na vortexu a inkubujte 10 minut
při laboratorní teplotě bez přístupu světla.
Jestliže vzorek neobsahuje erytrocyty,
přidejte 2 mL PBS.
5. Centrifugujte 5 minut při 300 x g při
A07730 2014-05-12_CZ
laboratorní teplotě.
6. Odsajte supernatant.
7. Resuspendujte buněčnou peletu ve 3 mL
PBS.
8. Opakujte krok 5.
9. Odsajte supernatant a resuspendujte
buněčnou peletu:
v objemu 0,5 mL nebo 1 mL fixačního
roztoku IOTest 3 (ref. č. A07800) naředěného
na pracovní koncentraci (1x) v případě, kdy
je třeba vzorky před analýzou skladovat po
dobu více než 2 hodiny a méně než
24 hodin,
v 0,5 mL nebo 1 mL PBS bez formaldehydu,
pokud budou vzorky analyzovány do 2 hodin
od zpracování.
POZN.: Zpracované vzorky vždy uchovávejte při
teplotě 2 – 8 °C bez přístupu světla.
CHARAKTERISTIKA VÝROBKU
SPECIFICITA
Specificita
rozeznání
CD19
klonem
monoklonální protilátky (mAb) J4.119 byla
uznána v rámci 4. HLDA konference o lidských
leukocytárních diferenciačních antigenech ("4th
HLDA Workshop on Human Leucocyte
Differentiation Antigens"), která se konala v roce
1989 ve Vídni v Rakousku (WS kód: B191,
sekce B) (3, 4).
MAb 679.1Mc7 strukturně odpovídá specifickým
monoklonálním protilátkám řady IOTest 3, avšak
neváže specificky žádný z buněčných antigenů
(1).
LINEARITA
K ověření linearity stanovení při použití protilátky
proti CD19 obsažené v této reagencii byly
v různých poměrech smíchány buňky pozitivní
buněčné linie (RAMOS) a buňky negativní
buněčné linie (HPBALL) tak, aby konečný počet
buněk byl konstantní a poměr buněk pozitivní
linie/negativní linie ve směsi byl v rozmezí 0 %
až 100 %.
Alikvoty byly zpracovány výše popsaným
způsobem a byla provedena lineární regrese pro
očekávané a získané hodnoty. Parametry
rovnice lineární regrese byly použity k určení
koeficientu linearity a rozsahu měření pro
každou specifickou protilátku.
Specificita
CD19
Lineární regrese
Linearita
(R2)
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
V našich laboratořích byla plná krev získaná od
50 zdravých dospělých dárců testována s výše
popsanou reagencií. Výsledky získané pro
leukocytární subpopulace těchto 50 dárců jsou
uvedeny v následujících tabulkách:
Lymfocyty
+
CD19
Počet
měření
50
Průměr
(%)
10,8
SD
5,7
CV
(%)
53
REPRODUKOVATELNOST VÝSLEDKŦ
V RÁMCI LABORATOŘE
V průběhu jednoho dne bylo na tomtéž
průtokovém cytometru provedeno 12 měření
procentuálního zastoupení pozitivních buněk
cílové populace (RAMOS). Výsledky stanovení
procentuálního počtu CD19 pozitivních buněk a
průměrné hodnoty intenzity fluorescence („Mean
Fluorescence Intensity“, MFI) pro nespecifickou
reakci protilátek konjugovaných s FITC a PE
shrnuje následující tabulka:
RAMOS
CD19+
Počet
měření
12
Průměr
SD
99,9
0,05
CV
(%)
0,05
FITC (MFI)
12
0,84
0,01
1,8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
OMEZENÍ METODY
1. Pokud cytometr není řádně seřízen,
fluorescenční překryvy nejsou vhodně
zkompenzovány a v případě nesprávně
umístěných oblastí (regionů) mohou při
měření na průtokovém cytometru vznikat
zavádějící výsledky.
2. Reagencie dosud nebyla optimalizována pro
použití v lyzační technice bez promývání,
proto je vhodnější použít metodu lýzy s
následným promýváním vzorku.
3. Přesné a reprodukovatelné výsledky lze
získat pouze pokud použité metody
odpovídají
postupům
uvedeným
v příbalovém letáku a jsou kompatibilní se
zásadami správné laboratorní praxe.
4. Protilátky obsažené v reagencii jsou
kalibrovány tak, aby poskytovaly co nejlepší
poměr
specifického
signálu
k nespecifickému. Z tohoto důvodu je
důležité v každém testu dodržovat objemy
reagencií a doporučený počet buněk.
5. V případě hyperleukocytózy nařeďte krev
PBS na koncentraci přibližně 5 x 109
leukocytů/L.
6. Za určitých patologických stavů, jako je
např.
těžké
selhání
ledvin
nebo
hemoglobinopatie, může lýza červených
krvinek probíhat pomalu, nekompletně nebo
ji dokonce vůbec nelze provést. V těchto
případech je doporučeno izolovat před
stanovením mononukleární buňky na
hustotním gradientu (např. Ficoll).
7. Vzhledem
k
tandemové
struktuře
fluorochromu ECD rovněž emituje světlo o
vlnové délce 575 nm. Toto sekundární
emisní maximum je u různých šarží ECD
různé. Proto je třeba u vícebarevné analýzy
při změně šarže konjugátu s ECD pečlivě
zkontrolovat kompenzační matici.
RŦZNÉ
Literární zdroje (REFERENCES) a
(EXAMPLES)
jsou
uvedeny
v
(APPENDIX).
OCHRANNÉ ZNÁMKY
Beckman Coulter, stylizované logo, COULTER,
ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest e XL jsou ochranné
známky společnosti Beckman Coulter, Inc., a jsou
registrovány u USPTO.
Texas Red-X je ochranná známka společnosti
VÝROBCE :
IMMUNOTECH SAS
B.P. 177 - 13276 Marseille Cedex 9
Francie
Služby zákazníkům: (33) 4 91 17 27 27
Made in France
Všechna práva vyhrazena.
OČEKÁVANÉ HODNOTY
Každá laboratoř musí shromáždit soubor
vlastních referenčních hodnot založených na
skupině zdravých dárců vybraných z místní
populace. V úvahu je třeba brát věk, pohlaví a
etnickou příslušnost dárců, stejně jako další
potenciální regionální rozdíly.
19 / 26
příklady
dodatku
A07730 2014-05-12_CZ
Специфичность
Спецификации
первого компонента
Не применимо
второго компонента
Не применимо
третьего компонента
CD19
Клон
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Гибридома
X63x Balb/c
X63x Balb/c
NS1 x Balb/c
Иммуноген
Не биологический гаптен
Не биологический гаптен
Клетки лимфомы SKLY18
Иммуноглобулин
IgG1
IgG1
IgG1, κ
Вид
Источник
Мышь
Aсцитическая жидкость или
супернатант гибридомных клеток,
льтивированных in vitro
Мышь
Мышь
Очистка
Аффинная хроматография
Флуорохром
Флуоресцеина изотиоцианат
(FITC)
R Фикоэритрин (PE)
R Фикоэритрин-Техасский
красный-X (ECD)
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
IOTest 3
РУССКИЙ
Neg. Ctrl-FITC /
Neg. Ctrl-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 определений; 0,5 мл
20 мкл / определение
IOTest 3
Конъюгированное антитело
IVD
Молярная
концентрация
возбуждения
488 нм
488 нм
488 нм
Пик эмиссии
525 нм
575 нм
613 нм
Буфер
ФСБ pH 7,2 плюс 2 мг / мл БСА и 0,1% NaN3
НАЗНАЧЕНИЕ
Данная смесь конъюгированных с флуорохромами
антител (Negative Control-FITC/Negative ControlРЕ/CD19-ECD) из серии IOTest 3 предназначена для
многопараметрического анализа лейкоцитов с
помощью проточной цитометрии. Реагент позволяет
провести корректное гейтирование целевой популяции
клеток и оценить степень неспецифического
связывания с лейкоцитами человека конъюгированных
антител из серии IOTest 3, третьим компонентом
которых является CD19-ECD.
ПРИНЦИП АНАЛИЗА
Принцип использования негативного контроля
предполагает,
что
окрашивание
образца
неспецифическими моноклональными антителами
отражает
степень неспецифического связывания
специфических антител с лейкоцитами в образце.
При исследовании любого образца параллельно с
инкубацией образца со специфическим реагентом из
серии
IOTest 3 необходимо также провести
окрашивание образца данным негативным контролем.
Затем выполняется лизис эритроцитов в обеих
пробирках. Интактные лейкоциты анализируются на
проточном цитофлуориметре.
Проточный
цитофлуориметр
анализирует
светорассеивание и флуоресценцию клеток. Он
позволяет выделить (гейтировать) интересующую
популяцию на двухпараметрической гистограмме,
отображающей
светорассеивание
в
боковом
направлении (Side Scatter или SS) и флуоресценцию
ECD, соответствующую экспрессии CD19. Для
гейтирования популяций также можно использовать
другие двухпараметровые гистограммы.
Сравнение
уровней
флуоресценции
целевой
популяции
при
связывании
с отрицательным
контролем с уровнями флуоресценции целевой
популяции при окрашивании специфическими
антителами серии IOTest 3 позволяет отличить
окрашенные клетки от неокрашенных (1,2).
УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И СТАБИЛЬНОСТЬ
До и после распечатки флакона жидкие конъюгаты
антител необходимо хранить при температуре 2–8°C в
защищенном от света месте.
Стабильность реагента в нераспечатанном флаконе:
см. срок годности, указанный на этикетке флакона.
Стабильность реагента в распечатанном флаконе:
90 дней.
СОСТАВ РЕАГЕНТОВ
Связаться компании Beckman Coulter обслуживания
клиентов, чтобы получить концентрацию антител в
IOTest 3 реагента.
ПРИЗНАКИ РАЗРУШЕНИЯ
Любое изменение физического внешнего вида
реактивов может быть признаком их распада. Такие
реактивы не следует использовать.
В случае серьезного повреждения упаковки, или в
случае несоответствия полученных результатов
аналитическим
характеристикам
обратитесь,
пожалуйста, к нашим специалистам:
e-mail : [email protected]
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Не используйте реагент с истекшим сроком
годности.
Не замораживайте.
Перед использованием реагента необходимо
дождаться, пока его температура достигнет
комнатной (18 25°C).
Воздействие света на реагент должно быть
сведено к минимуму.
Избегайте
контаминации
реагента
микроорганизмами, в противном случае возможно
получение недостоверных результатов.
Растворы антител, содержащие азид натрия
(NaN3), требуют осторожного обращения. Не
проглатывайте, избегайте любого контакта с
кожей, слизистыми оболочками и глазами.
В кислой среде азид натрия образует
азотисто-водородную
кислоту,
являющуюся
потенциально опасным соединением. При
утилизации
реагента
перед
сливом
в
водопроводно-канализационную
систему
рекомендуется развести реагент большим
объемом воды. Это позволит избежать
накопления азида натрия в металлических трубах
и предотвратить образование взрывчатых
веществ.
Все образцы крови следует рассматривать как
потенциально инфицированные. При работе с
ними необходимо соблюдать все меры
предосторожности (в частности, использовать
защитные перчатки, халат и очки).
Никогда не отбирайте образец через пипетку ртом.
Избегайте контакта образца с кожей, слизистыми
оболочками и глазами.
После завершения работы пробирки с кровью и
все одноразовые материалы необходимо
поместить в специальные контейнеры для
утилизации.
20 / 26
ОБРАЗЦЫ
Венозную кровь или образцы костного мозга
необходимо отбирать в стерильные пробирки,
содержащие соль ЭДТА в качестве антикоагулянта.
Использование
других
антикоагулянтов
не
рекомендуется.
Образцы должны храниться при комнатной
температуре (18–25°C). Встряхивание образцов не
допускается. Перед отбором аликвоты образец
следует гомогенизировать, аккуратно перемешав.
Анализ образцов необходимо выполнить в течение
24 часов после отбора.
МЕТОДИКА
НЕОБХОДИМЫЕ, НО НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ
МАТЕРИАЛЫ
Пробирки и материалы для отбора проб.
Автоматические пипетки с одноразовыми
наконечниками объемом 20, 100 и 500 мкл.
Пластиковые пробирки для гемолиза.
Калибровочные частицы: флуоросферы Flow-Set
(каталожный номер 6607007).
Для получения оптимальных результатов
рекомендуется
использовать
следующие
реагенты:
– реагент для лизиса эритроцитов IOTest 3 Lysis
Solution (каталожный номер A07799);
– реагент для фиксации IOTest 3 Fixative Solution
(каталожный номер A07800);
– одна из смесей коньюгатов специфических
антител из серии IOTest 3, в которой CD19-ECD
используется для гейтирования.
Буфер (PBS: 0,01 M фосфат натрия; 0,145 M
хлорид натрия; pH 7,2).
Центрифуга.
Перемешивающее устройство (вортекс).
Проточный цитофлуориметр.
ПОДГОТОВКА ПРОБ
При исследовании каждого образца помимо
контрольной пробирки необходимо проанализировать
дополнительную пробирку, содержащую смесь образца
со специфическими конъюгированными антителами
серии IOTest 3.
1.
2.
3.
В каждую из пробирок для анализа контроля
добавьте по 20 мкл отрицательного контроля, а в
каждую из пробирок для анализа клинических
образцов — по 20 мкл специального раствора
конъюгированных антител IOTest 3.
В обе пробирки добавьте по 100 мкл образца.
Аккуратно перемешайте на вортексе.
Инкубируйте в течение 15 20 минут при
комнатной температуре (18 25°C) в защищенном
от света месте.
A07730 2014-05-12_RU
4.
5.
6.
7.
8.
9.
–
–
Если требуется, выполните лизис эритроцитов,
добавив 2 мл раствора IOTest 3 Lysis Solution
(каталожный номер. A07799) в рабочей
концентрации (1X). Немедленно перемешайте на
вортексе. Инкубируйте 10 минут при комнатной
температуре в защищенном от света месте. Если
образец не содержит эритроцитов, добавьте 2 мл
PBS.
Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 300 g
при комнатной температуре.
Удалите супернатант аспирацией.
Ресуспендируйте осадок клеток в 3 мл PBS.
Повторите шаг 5.
Удалите
супернатант
аспирацией
и
ресуспендируйте клетки:
в 0,5 мл или 1 мл раствора IOTest 3 Fixative
Solution (каталожный номер A07800) в рабочей
концентрации (1X), если подготовленная проба
будет храниться от 2 до 24 часов;
в 0,5 мл или 1 мл PBS без формальдегида, если
подготовленная проба будет проанализирована в
течение 2 часов.
ЗАМЕЧАНИЕ. Независимо от способа подготовки
готовые пробы необходимо хранить при температуре
2 8°C в защищенном от света месте.
СПЕЦИАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
СПЕЦИФИЧНОСТЬ
На четвертой Международной конференции по
дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека
(4th HLDA Workshop), проходившей в Вене, Австрия, в
1989 г., было подтверждено, что моноклональные
антитела J3-119 направлены против CD19 (3, 4).
Моноклональные антитела 679.1Mc7 имеют такие же
структурные характеристики, как и все специфические
моноклональные антитела из серии IOTest 3, однако
они не имеют специфичности в отношении
любых клеточных антигенов (1).
ДИАПАЗОН ЛИНЕЙНОСТИ
Для проверки линейности окрашивания CD19 данным
реагентом были смешаны в различных пропорциях
клетки положительной линии (RAMOS) и клетки
отрицательной линии (HPBALL). Общее количество
клеток
в
образце
оставалось
постоянным.
Соотношение клеток положительной и отрицательной
линий изменялось от 0 до 100%.
Аликвоты были окрашены в соответствии с описанной
выше методикой. На основании полученных и
ожидаемых
значений
вычислялась
линейная
регрессия.
Специфичность
CD19
Линейная регрессия
Линейность
(R2)
Y = 0,996 X + 1,66
0,999
ОЖИДАЕМЫЕ ЗНАЧЕНИЯ
Каждая лаборатория должна определить собственные
референсные интервалы на основании исследования
образцов здоровых доноров местной популяции. При
этом необходимо учитывать возраст, пол и этническую
принадлежность доноров, а также другие возможные
межрегиональные различия.
В наших лабораториях было проведено исследование
образцов цельной крови 50 здоровых людей с
использованием
вышеописанного реагента. В
следующих таблицах представлены результаты
подсчета субпопуляций лейкоцитов у этих 50 человек:
Лимфоциты
CD19+
Кол-во
образцов
Среднее
(%)
SD
CV (%)
50
10,8
5,7
53
ВНУТРИЛАБОРАТОРНАЯ ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ
РЕЗУЛЬТАТОВ
В один день на одном цитофлуориметре определялось
процентное
содержание
окрашенных
клеток
положительной
линии
(RAMOS).
Измерение
выполнялось
12 раз.
Полученные
результаты
представлены в следующей таблице в виде
процентного содержания окрашенных клеток для CD19
и в виде показателя средней интенсивности
флуоресценции (MFI) для неспецифических антител,
конъюгированных с FITC и PE.
Клетки линии
RAMOS
Кол-во
измерений
Среднее
SD
CV (%)
CD19+ (%)
12
99,9
0,05
0,05
FITC (MFI)
12
0,84
0,01
1,8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА
1. При неправильной настройке цитофлуориметра,
неверной
компенсации
флуоресценции
и
неправильном определении регионов могут быть
получены недостоверные результаты.
2. Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов с
отмывкой, поскольку данный реагент не
оптимизирован для процедуры лизирования без
отмывки.
3.
4.
5.
6.
7.
Для получения точных и воспроизводимых
результатов
необходимо
соблюдать
все
приведенные инструкции и следовать нормативам
надлежащей лабораторной практики (GLP).
Конъюгаты
антител
данного
реагента
откалиброваны для получения наилучшего
соотношения специфического и неспецифического
сигнала. Поэтому в каждом исследовании
необходимо строго соблюдать соотношение между
объемом реагента и объемом образца.
При гиперлейкоцитозе образец следует развести
в PBS до концентрации примерно 5 109
лейкоцитов/л.
При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая
почечная недостаточность или гемоглобинопатия,
лизис эритроцитов может происходить медленно,
не полностью или совсем не происходить. В этом
случае перед окрашиванием рекомендуется
выделить мононуклеарные клетки в градиенте
плотности (например, фиколла).
В связи с тандемной структурой флуорохрома
ECD также излучает свет при 575 нм. Этот
вторичный пик эмиссии различен в разных сериях
ECD. Поэтому для целей многоцветного анализа
компенсационную матрицу следует тщательно
контролировать при смене серии ECD-конъюгата.
РАЗНОЕ
Примеры (Examples) и ссылки (References) смотрите в
Приложении (Appendix).
ТОРГОВЫЕ МАРКИ
Beckman Coulter, стилизованный логотип, COULTER,
ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest и XL являются
товарными
знаками
Beckman
Coulter
Inc.,
зарегистрированными в USPTO.
Texas Red-X является товарным знаком компании
ИЗГОТОВИТЕЛЬ :
IMMUNOTECH SAS
Франция
Отдел обслуживания клиентов:
(33) 4 91 17 27 27
Made in France.
Все права защищены.
21 / 26
A07730 2014-05-12_RU
Özgünlük
1. bileşenin
spesifikasyonları
Not applicable
2. bileşenin
spesifikasyonları
Not applicable
CD19
Klon
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hibridoma
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
İmmunogen
Biyolojik olmayan hapten
Biyolojik olmayan hapten
SKLY18 Lenfoma hücreleri
İmmunoglobulin
IgG1
IgG1
IgG1,
Türler
Fare
Asit sıvısı veya in vitro
kültürlenmiş hibridoma
hücrelerden süpernatant
Fare
Fare
Saflaştırma
Afinite kromatografisi
Florokrom
Floresan izotiyosiyanat (FITC)
R Fikoeritrin (PE)
R Fikoeritrin-Texas Red-X
(ECD)
Mol Oranı
IOTest 3
TÜRKÇE
Neg. Ctrl-FITC /
Neg. Ctrl-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 test ; 0,5 mL
20 µL / test
Kaynak
IOTest 3
Konjuge Antikor
IVD
3. bileşenin
spesifikasyonları
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
uyarılma
488 nm
488 nm
488 nm
Emisyon piki
525 nm
575 nm
613 nm
Tampon
PBS pH 7,2 ve 2 mg / mL BSA ve %0,1 NaN3
KULLANIM
Bu florokrom-konjuge antikor karışımı (Negatif
Kontrol-FITC / Negatif Kontrol-PE / CD19-ECD)
kapılama için bir yardımcı olarak akış
sitometrisinin kullanıldığı çok parametreli analiz
için uygundur. CD19-ECD kullanan tüm
IOTest 3'lerde
non-spesifik
boyanmanın
gösterilmesine imkan verir.
PRENSİP
Bu test non-spesifik monoklonal antikorların,
spesifik antikorların non-spesifik boyanmasını
gerçekleştirme becerisine dayanır.
Lökositlerin, numunenin bir spesifik IOTest 3
reaktifi ile inkübe edilerek boyanmasına paralel
olarak, aynı numune üzerinde de bu IOTest 3
negatif kontrolü ile bir boyama gerçekleştirilir.
Daha
sonra
iki preparattaki
eritrositler
parçalanarak uzaklaştırılır ve bu işlemden
etkilenmeyen lökositler akış sitometrisiyle analiz
edilir.
Akış
sitometresi
ışık
difüzyonunu
ve
hücrelerdeki floresansı analiz eder. Işığın dikey
difüzyonunu ("Yana Saçılım" veya SS) CD19
boyanmasına karşılık gelen ECD floresansı ile
ilişkilendiren bir histogram üzerinde tanımlanan
elektronik
pencere
içinde
hücrelerin
lokalizasyonunu mümkün kılar. Sitometre
üzerinde mevcut farklı parametrelerin ikisini
birleştiren diğer histogramlar da gating
(kapılama) basamağında kullanılabilir.
Hedef popülasyonda, bir yanda bu negatif
kontrol ve diğer yanda spesifik IOTest 3 boyama
ile
elde
edilen
floresans
düzeylerinin
karşılaştırılması,
boyanmış
hücrelerin
boyanmamış hücrelerden ayırt edilmesine imkan
verir (1, 2).
SAKLAMA VE STABİLİTE
Konjuge likit formlar flakon açılmadan önce ve
açıldıktan sonra 2 ila 8°C arasında saklanmalı
ve ışıktan korunmalıdır.
Kapalı flakonun stabilitesi: flakon üzerindeki son
kullanma tarihine bakınız.
Açılmış flakonun stabilitesi: reaktif 90 gün
boyunca stabildir.
Paketteki bozulma veya alınan verilerde
değişiklik olduğu durumlarda lütfen yerel
distribütörünüzü arayınız veya aşağıdaki e-mail
adresini kullanınız :
[email protected]
ÖNLEMLER
1. Reaktifi son kullanma tarihinden sonra
kullanmayın.
2. Dondurmayın.
3. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (18 –
25°C) gelmesini bekleyin.
4. Işığa maruz kalımı en aza indirin.
5. Reaktifleri mikrobiyal kontaminasyondan
uzak tutun, aksi halde yanlış sonuçlar ortaya
çıkabilir.
6. Sodyum azid (NaN3)
içeren antikor
çözeltileri dikkatle kullanılmalıdır. Yutmayın
ve deri, mukoza ve gözlerle her türlü
temasından kaçının.
Ayrıca, asidik bir ortamda, sodyum azid
potansiyel olarak tehlikeli hidrazoik asit
oluşturabilir. Atılması gerekirse, sodyum
azidin metal borular içinde birikmesinden
kaçınmak ve patlama riskini önlemek üzere,
kanalizasyon sistemine dökmeden önce
reaktifin çok miktarda su içinde seyreltilmesi
önerilir.
7. Tüm kan numuneleri potansiyel olarak
enfeksiyöz kabul edilmeli ve dikkatle
(özellikle: koruyucu eldiven, önlük ve gözlük
takılarak) kullanılmalıdır.
8. Asla ağızla pipetleme yapmayın ve
numunelerin cilt, mukoza ve gözlerle her
türlü temasından kaçının.
9. Çalışma sırasında kullanılan kan tüpleri ve
tek kullanımlık malzemeler yakma işlemi için
tasarlanmış
spesifik
kaplarda
imha
edilmelidir.
NUMUNELER
IOTest 3 reaktifte antikor konsantrasyonunu
elde etmek için Beckman Coulter Müşteri
Hizmetleri ile görüşün.
Venöz kan veya kemik iliği numuneleri mutlaka
antikoagülan olarak EDTA tuzu içeren steril
tüpler
kullanılarak
alınmalıdır.
Başka
antikoagülanların kullanımı önerilmez.
Numuneler oda sıcaklığında saklanmalı (18 –
25°C) ve çalkalanmamalıdır. Numuneler test
örneği alınmadan önce yavaşça sallanarak
homojen hale getirilmelidir.
Numuneler damardan alındıktan sonra 24 saat
içerisinde analiz edilmelidir.
BOZULMA BELİRTİLERİ
METODOLOJİ
Reaktiflerin fiziksel görüntüsünde herhangi bir
değişiklik bozulmaya dair bir gösterge olabilir ve
bu durumda reaktif kullanılmamalıdır.
BİRLİKTE VERİLMEYEN GEREKLİ
MALZEMELER
Numune alımı için gereken numune tüpleri
ve malzemeler.
REAKTİF İÇERİĞİ
22 / 26
-
20, 100 ve 500 µL'lik tek kullanımlık uçlar ile
otomatik pipetler.
Plastik hemoliz tüpleri.
Kalibrasyon
boncukları:
Flow-Set
Fluorospheres (Ref. 6607007).
Optimal sonuçlar elde etmek için aşağıdaki
reaktifler önerilir:
Parçalama reaktifi: IOTest 3 Parçalama
Çözeltisi (Ref. A07799).
Fiksasyon reaktifi: IOTest 3 Fiksatif Çözelti
(Ref. A07800).
IOTest 3 serisinden kapılamaya yardımcı
olarak CD19-ECD kullanan spesifik konjuge
antikor çözeltilerinden biri.
Tampon (PBS: 0.01 M sodyum fosfat;
0.145 M sodyum klorür; pH 7.2).
Santrifüj.
Otomatik karıştırıcı (Vorteks tipi).
Akış sitometresi.
PROSEDÜR
Analiz edilen her numune için, bir kontrol tübüne
ek olarak, hücrelerin spesifik IOTest 3 konjuge
antikor çözeltisi ile karıştırılacağı bir test tübü
gereklidir.
1. Her kontrol tübüne 20 µL negatif kontrol ve
her test tübüne 20 µL spesifik IOTest 3
konjuge antikor çözeltisi ekleyin.
2. İki tübe test numunesinden 100 µL ekleyin.
Tüpleri yavaşça vorteksleyin.
3. Işıktan koruyarak, oda sıcaklığında (18 –
25°C) 15 ila 20 dakika süreyle inkübe edin.
4. Ardından kırmızı hücrelerin parçalanma
işlemini,
gerekirse
çalışma
konsantrasyonunda (1X) 2 mL IOTest 3
Parçalama
Çözeltisi
(Ref.
A07799)
ekleyerek
gerçekleştirin.
Derhal
vorteksleyin ve ışıktan koruyarak, oda
sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Numune
kırmızı hücre içermiyorsa, 2 mL PBS
ekleyin.
5. Oda sıcaklığında, 5 dakika süreyle 300 x
g'de santrifüj ediniz.
6. Süpernatanı aspirasyon ile alın.
7. 3 mL PBS kullanarak hücre peletini tekrar
süspansiyon haline getiriniz.
8. Adım 5’i tekrarlayın.
9. Süpernatanı aspirasyon ile alın ve
aşağıdakileri kullanarak hücre peletini tekrar
süspansiyon haline getirin:
Preparatlar 2 saatten uzun ve 24 saatten
kısa
süre
saklanacaksa,
çalışma
konsantrasyonunda (1x) 0,5 mL veya 1 mL
IOTest 3 Fiksatif Çözeltisi (Ref. A07800),
A07730 2014-05-12_TR
Preparatlar 2 saat içerisinde analiz
edilecekse, formaldehitsiz 0,5 mL veya 1 mL
PBS.
NOT: Her zaman, preparatları 2 ila 8°C arasında
ve ışıktan koruyarak saklayınız
PERFORMANS
SPESİFİKLİK
J3-119 monoklonal antikoru (mAb) 1989'da
Viyana, Avusturya'da gerçekleştirilen 4. HLDA
(Human Leucocyte Differentiation Antigens)
Workshopu sırasında CD19'a atanmıştır (3, 4).
MAb 679.1Mc7 IOTest 3 serisine spesifik
monoklonal antikorlarla aynı yapısal özelliklere
sahiptir ancak hücresel antijenler açısından
herhangi bir spesifikliği yoktur (1).
DOĞRUSALLIK
Bu reaktifin CD19 boyamasının doğrusallığını
test etmek amacıyla, bir pozitif hücre dizisi
(RAMOS) ve bir negatif hücre dizisi (HPBALL)
nihai hücre sayısı sabit tutularak, karışımın
pozitif dizi / negatif dizi oranı %0-100 arasında
olacak şekilde farklı oranlarda karıştırılmıştır.
Numuneden alınan küçük kısımlar yukarıda tarif
edilen prosedürle boyanmış ve beklenen
değerler ile gözlenen değerler arasındaki lineer
regresyon hesaplanmıştır.
Spesifiklik
CD19
Lineer regresyon
Doğrusallık
(R2)
Y = 0.996 X + 1.66
0.999
BEKLENEN DEĞERLER
Her laboratuvar yerel popülasyondaki bir grup
sağlıklı donöre dayanarak bir referans değerler
listesi derlemelidir. Bu derleme yaş, cinsiyet ve
etnik grup ile birlikte herhangi diğer potansiyel
bölgesel farklılıklar dikkate alınarak yapılmalıdır.
Bizim
laboratuvarlarımızda,
50
sağlıklı
yetişkinden alınan tam kan numuneleri yukarıda
açıklanan reaktif kullanılarak işleme tabi
tutulmuştur. Bu 50 donörde ilgilenilen lökosit alt
popülasyonlarından elde edilen sonuçlar
aşağıdaki tablolarda gösterilmektedir:
Lenfositler
CD19+
Sayı
Ort.
(%)
SD
CV
(%)
50
10.8
5.7
53
LABORATUVAR İÇİ TEKRARLANABİLİRLİK
Aynı günde, aynı sitometre kullanılarak, pozitif
hedefin (RAMOS) boyanma yüzdesi için 12
ölçüm gerçekleştirilmiştir. Elde edilen sonuçlar
aşağıdaki tablolarda CD19 için boyanmış
hücrelerin yüzdesi ve non-spesifik konjuge FITC
ve PE antikorları için Ortalama Floresan
Yoğunluğu (MFI) olarak gösterilmektedir:
Sayı
Ort.
SD
CV
(%)
CD19+ (%)
12
99.9
0.05
0.05
FITC (MFI)
12
0.84
0.01
1.8
PE (MFI)
12
0.12
0.05
1.27
RAMOS
TEKNİĞİN SINIRLAMALARI
1. Eğer
sitometre
mükemmel
şekilde
hizalanmamış, floresan sızıntıları düzgün
şekilde kompanse edilmemiş ve bölgeler
dikkatli bir şekilde konumlandırılmamışsa,
akış sitometrisi yanlış sonuçlar verebilir.
2. Bu reaktif “yıkamasız” parçalama teknikleri
için optimize edilmediğinden yıkama adımlı
bir RBC parçalama tekniğinin kullanılması
tercih edilir.
3. Kullanılan prosedürler teknik prospektüse
uygun ve iyi laboratuvar uygulamalarıyla
uyumlu
olduğu
sürece
doğru
ve
tekrarlanabilir sonuçlar elde edilecektir.
4. Bu reaktifin konjuge antikorları en iyi spesifik
sinyal/spesifik olmayan sinyal oranını
sunacak şekilde kalibre edilmiştir. Bu
nedenle, her testte reaktif hacmi/numune
hacmi oranına bağlı kalınması önemlidir.
5. Hiperlökositoz durumunda, yaklaşık 5 x 109
lökosit/L’lik bir değer elde etmek için kanı
PBS içinde seyreltin.
6. Ağır
böbrek
yetmezliği
veya
hemoglobinopatiler gibi belirli hastalık
durumlarında,
kırmızı
hücrelerin
parçalanması yavaş, eksik ve hatta
imkansız olabilir. Bu durumda, boyamadan
önce bir yoğunluk gradyanı (örneğin, Ficoll)
kullanılarak mononükleer hücrelerin izole
edilmesi önerilir.
23 / 26
7. Florokromun art arda dizilmiş yapısından
dolayı ECD 575 nm’de de ışık yayar. Bu
ikincil emisyon piki ECD’de lottan lota
değişkenlik gösterir. Bu nedenle, çok renkli
analizlerde bir ECD–konjugesinin lotu
değiştirilirken
kompanzasyon
matriksi
dikkatle kontrol edilmelidir.
ÇEŞİTLİ
Örnekler
(Examples)
ve
Referanslar
(References) için Ek (Appendix) kısmına bakın.
TİCARİ MARKALAR
Beckman
Coulter,
biçimlendirilmiş
logo,
COULTER, ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest ve
XL Beckman Coulter, Inc.’nin ticari markalarıdır
ve USPTO'da tescillidir.
Texas Red-X, Molecular Probes, Inc. şirketinin
ticari markasıdır.
ÜRETİCİ :
IMMUNOTECH SAS
Fransa
Müşteri Hizmetleri: (33) 4 91 17 27 27
Made in France
Tüm Hakları Saklıdır.
A07730 2014-05-12_TR
Špecificita
Špecifikácia výrobku
súčasť 1
Neuvedené
súčasť 2
Neuvedené
súčasť 3
CD19
Klon
679.1Mc7
679.1Mc7
J3-119
Hybridom
X63 x Balb/c
X63 x Balb/c
NS1 x Balb/c
Imunogén
Nebiologický haptén
Nebiologický haptén
Lymfómové bunky SKLY 18
Imunoglobulín
IgG1
IgG1
IgG1, κ
Ţivočíšny druh
Myš
hybridomceller
Afinita Chromatografia
Myš
hybridomceller
Myš
hybridomceller
Fluorochrom
Fluoresceín izotiokyanát
(FITC)
R-fykoerytrín (PE)
R-fykoerytrín-Texas
Red-X (ECD)
Molárny pomer
2,5 – 5,0
0,5 – 1,5
0,5 – 1,5
488 nm
488 nm
488 nm
Maximum emisie
525 nm
575 nm
613 nm
Tlmivý roztok
PBS pH 7,2 plus 2 mg/ml BSA a 0,1% NaN3
IOTest 3
SLOVENSKY
Neg. Ctrl-FITC /
Neg. Ctrl-PE /
CD19-ECD
REF
A07730
25 testov ; 0,5 mL
20 µL / test
Zdroj
Purifikácia
IOTest 3
Konjugovaná protilátka
IVD
excitácia
POUŢITIE
Táto
zmes
protilátky
konjugovanej
s
fluorochrómom (negatívny kontrolný roztok FITC /
negatívny kontrolný roztok PE / CD45-ECD) je
negatívny
kontrolný
roztok
vhodný
na
viacparametrovú
analýzu
na
prietokovom
cytometri a ako pomôcka pre gating. Umožňuje
demonštráciu nešpecifického farbenia všetkých
IOTestov 3, ktoré používajú CD19-ECD.
PRINCÍP
Test je založený na schopnosti nešpecifických
monoklonálnych
protilátok
reprodukovať
nešpecifické farbenie špecifických protilátok.
Súbežne s farbením leukocytov, ktoré sa
vykonáva inkubovaním vzorky so špecifickou
reagenciou IOTest 3, sa na rovnakej vzorke
vykonáva farbenie pomocou tohto negatívneho
roztoku IOTest 3. Erytrocyty sa potom z týchto
dvoch preparátov odstránia lýzou a leukocyty,
ktoré lýzou nie sú ovplyvnené, sa analyzujú na
prietokovom cytometri.
Prietokový cytometer analyzuje svetelný rozptyl a
fluorescenciu buniek. Umožňuje lokalizáciu buniek
v
rámci
elektronicky
vytvoreného
okna
definovaného histogramom, ktoré koreluje bočný
svetelný rozptyl („Side Scatter“ (granularita) alebo
SS) s fluorescenciou ECD, čo zodpovedá farbeniu
CD19. Iné histogramy kombinujúce dva z rôznych
parametrov dostupných na cytometri sa tiež
používajú pri gatingu.
Porovnanie úrovní fluorescencie získaných na
cieľovej populácii s týmto negatívnym kontrolným
roztokom na jednej strane a so špecifickým IOTest
3 farbením na strane druhej, umožňuje odlíšenie
sfarbených buniek od nesfarbených buniek (1, 2).
SKLADOVANIE A STABILITA
Konjugované protilátky vo forme roztoku musia
byť uchovávané teplote pri 2 – 8 °C bez prístupu
svetla predtým aj potom, ako bola fľaštička
otvorená.
Stabilita zatvorenej fľaštičky: pozri dátum
exspirácie na fľaštičke.
Stabilita otvorenej fľaštičky: reagencia je stabilná
90 dní.
OBSAH REAGENCIÍ
Pre získanie informácií o koncentrácii protilátok
v reagencii IOTest 3 kontaktujte zákaznícky servis
spoločnosti Beckman Coulter.
ZNÁMKY ZNEHODNOTENIA
Akákoľvek zmena fyzického vzhľadu činidiel môže
byť príznakom znehodnotenia a v takom prípade
sa činidlo nesmie používať.
V prípade závažného poškodenia obalu, alebo
pokiaľ získané výsledky nie sú v zhode
s analytickými
parametrami
stanovenia,
kontaktujte prosím našich odborných pracovníkov:
[email protected]
BEZPEČNOSTNÉ OPATRENIA
1. Nepoužívajte reagenciu po dátume exspirácie.
2. Nezamrazujte.
3. Pred použitím ponechajte vytemperovať na
laboratórnu teplotu (18 – 25 °C).
4. Obmedzte vystavenie svetlu na minimum.
5. Vyvarujte sa mikrobiálnej kontaminácie
reagencie, ktorá môže byť príčinou chybných
výsledkov.
6. Roztoky protilátok obsahujú azid sodný
(NaN3), preto sa s nimi musí zaobchádzať
opatrne. Nepoužívajte vnútorne a vyvarujte sa
kontaktu s pokožkou, sliznicami a očami.
V kyslom prostredí môže z azidu sodného
vznikať potenciálne nebezpečná kyselina
azidovodíková. Ak je treba reagenciu
zlikvidovať, odporúča sa nariediť ju pred
vyliatím do odpadu veľkým množstvom vody,
aby sa predišlo nahromadeniu azidu
v kovovom potrubí, a tým i riziku explózie.
7. Všetky krvné vzorky sa musia považovať za
potenciálne infekčné a pri zaobchádzaní
s nimi je nutné dodržiavať zásady bezpečnosti
práce (konkrétne: nosenie ochranných
rukavíc, plášťov a okuliarov).
8. Nikdy nepipetujte ústami a vyvarujte sa
kontaktu vzoriek s pokožkou, sliznicami a
očami.
9. Skúmavky s krvou a použitý jednorazový
materiál je treba likvidovať spálením v
špeciálnych kontajneroch.
VZORKY
Vzorky venóznej krvi alebo kostnej drene sa
musia
odobrať
do
sterilných
skúmaviek
obsahujúcich
dvojsodnú
soľ
EDTA
ako
antikoagulant. Použitie iných antikoagulantov sa
neodporúča.
Vzorky sa musia uchovávať bez miešania pri
laboratórnej teplote (18 – 25 °C). Pred odberom
testovanej vzorky je treba vzorky homogenizovať
jemným premiešaním.
Vzorky musia byť analyzované do 24 hodín od
odberu.
METODIKA
NEDODÁVANÝ POTREBNÝ MATERIÁL
• Skúmavky a materiál potrebný na odber.
• Automatické pipety s jednorazovými špičkami
na dávkovanie objemov 20, 100 a 500 ιl
• Plastové hemolyzačné skúmavky
• Kalibračné
častice:
čiastočky
FlowSet
Fluorospheres (ref. č. 6607007).
• Na získanie optimálnych výsledkov sú
odporúčané nasledujúce reagencie:
24 / 26
Lyzačná reagencia: Lyzačný roztok IOTest 3
(ref. č. A07799).
- Fixačná reagencia: Fixačný roztok IOTest 3
(ref. č. A07800).
- Jeden
zo
špecifických
roztokov
konjugovaných protilátok z radu IOTest 3, ktorý
používa CD19-ECD ako pomoc pri gatingu.
• Tlmivý roztok (PBS: 0,01 M fosforečnan
sodný, 0,145 M chlorid sodný, pH 7,2).
• Centrifúga
• Automatický prístroj na miešanie vzoriek (typ
Vorte)
• Prietokový cytometer
POSTUP
Na každú analyzovanú vzorku je okrem kontrolnej
skúmavky treba pripraviť aj testovaciu skúmavku,
kde sa bunky zmiešajú so špecifickým roztokom
konjugovaných protilátok IOTest 3.
1. Do každej kontrolnej skúmavky pridajte 20 ιL
negatívneho kontrolného roztoku a do každej
testovacej
skúmavky
pridajte
20
ιL
špecifického roztoku konjugovaných protilátok
IOTest 3.
2. Do oboch skúmaviek pridajte 100 ιL
testovanej
vzorky.
Skúmavky
jemne
premiešajte na vortexe.
3. Inkubujte 15 až 20 minút pri laboratórnej
teplote (18 – 25 °C) bez prístupu svetla.
4. Ak je treba lýzovať erytrocyty, pridajte 2 mL
lyzačného roztoku IOTest 3 (ref. č. A07799)
nariedeného na pracovnú koncentráciu (1X).
Ihneď premiešajte vo vortexe a inkubujte
10 minút pri laboratórnej teplote bez prístupu
svetla. Ak vzorka neobsahuje erytrocyty,
pridajte 2 mL PBS.
5. Centrifugujte 5 minút pri 300 x g pri
laboratórnej teplote.
6. Odsajte supernatant.
7. Resuspendujte bunkový pelet v 3 mL roztoku
PBS.
8. Opakujte krok 5.
9. Odsajte supernatant a resuspendujte bunkový
pelet pomocou:
0,5 ml alebo 1 mL fixačného roztoku IOTest 3
(ref. č. A07800) nariedeného na pracovnú
koncentráciu (1X) v prípade, ak je treba
vzorky pred analýzou skladovať viac než
2 hodiny a menej než 24 hodín,
0,5 mL alebo 1 mL PBS bez formaldehydu, ak
budú preparáty analyzované do 2 hodín.
POZNÁMKA: Spracované vzorky vždy uchovávajte
pri teplote 2 – 8 °C bez prístupu svetla.
-
CHARAKTERISTIKA VÝROBKU
ŠPECIFICITA
Špecificita
rozoznania
antigénu
CD19
monoklonálnou protilátkou J3-119 bola potvrdená
A07730 2014-05-12_SK
počas 4. konferencie HLDA Workshop on Human
Leukocyte Differentiation Antigens, ktorá sa
konala vo Viedni, v Rakúsku, v roku 1989 (3, 4).
Monoklonálna protilátka 679.1Mc7 má štrukturálne
charakteristiky
rovnaké
ako
monoklonálne
protilátky špecifické pre rad IOTest 3, ale nemá
žiadnu špecificitu v prípade bunkových antigénov
(1).
LINEARITA
Na testovanie linearity CD19-farbenia tejto
reagencie boli v rôznych pomeroch zmiešané
pozitívne bunkové línie (RAMOS) a negatívne
bunkové línie (HPBALL) pri konštantnom
konečnom
počte
buniek,
takže
pomer
pozitívnej/negatívnej línie v zmesi sa pohyboval
v rozmedzí 0 % až 100 %.
Alikvotné čiastky boli sfarbené pomocou vyššie
uvedeného postupu a bola vypočítaná lineárna
regresia medzi očakávanými hodnotami a
pozorovanými hodnotami.
Špecificita
Lineárna regresia
CD19
Y = 0,996 X + 1,66
Linearita
(R²)
0,999
OČAKÁVANÉ HODNOTY
Každé laboratórium si musí zhromaždiť súbor
vlastných referenčných hodnôt založených na
skupine zdravých darcov vybraných z miestnej
populácie. Do úvahy je treba brať vek, pohlavie a
etnickú príslušnosť darcov, rovnako ako ďalšie
potenciálne regionálne rozdiely.
V našich laboratóriách boli vzorky plnej krvi
získané od 50 zdravých dospelých darcov, a boli
testované s vyššie popísaným reagenčným
činidlom. Výsledky získané u záujmových
subpopulácií leukocytov od týchto 50 darcov sú
uvedené v nasledujúcich tabuľkách:
Lymfocyty
CD19+
Počet
meraní
50
Priemer
(%)
10,8
SD
5,7
CV
(%)
53
OBMEDZENIA METÓDY
RÔZNE
1. Ak cytometer nie je správne nastavený,
fluorescenčné prekryvy nie sú správne
kompenzované a v prípade nesprávne
umiestnených oblastí môže pri meraní na
prietokovom cytometri dôjsť k chybným
výsledkom.
2. Táto reagencia doteraz nebola optimalizovaná
na použitie v lyzačnej metóde bez
premývania, preto je vhodnejšie použiť
metódu RBC lýzy s premývaním.
3. Presné a reprodukovateľné výsledky sa
získajú len vtedy, ak použité metódy
zodpovedajú
postupom
uvedeným
v technickom príbalovom letáku a sú
kompatibilné
so
zásadami
správnej
laboratórnej praxe.
4. Konjugované protilátky tejto reagencie sú
kalibrované tak, aby poskytovali čo najlepší
pomer špecifického signálu k nešpecifickému.
Z tohto dôvodu je dôležité v každom teste
dodržiavať pomer objemu reagencie a objemu
vzorky.
5. V prípade hyperleukocytózy narieďte krv
pomocou PBS na koncentráciu približne 5 x
109 leukocytov/l.
6. Za určitých patologických stavov, ako je napr.
ťažké
zlyhanie
obličiek
alebo
hemoglobinopatie, môže lýza erytrocytov
prebiehať pomaly, nekompletne alebo ju
dokonca vôbec nemožno vykonať. V týchto
prípadoch sa pred farbením odporúča izolovať
mononukleárne bunky pomocou hustotného
gradientu (napr. Ficoll).
7. V dôsledku tandemovej stavby fluorochrómu
ECD takisto vyžaruje svetlo s hodnotou
575 nm. Vrchol sekundárneho vyžarovania je
pri každej šarži ECD iný. Preto je sa na účely
viacfarebnej analýzy musí dôkladne preveriť
matica kompenzácie pri zmene šarže ECDkonjugátu.
Literárne zdroje (REFERENCES) a príklady
(EXAMPLES)
sú
uvedené
v dodatku
(APPENDIX).
OBCHODNÉ ZNÁMKY
Beckman Coulter, štylizované logo, COULTER,
ECD, EPICS, Flow-Set, IOTest a XL sú
ochrannými známkami spoločnosti Beckman
Coulter, Inc., a sú zaregistrované na USPTO.
Texas Red-X je registrovaná ochranná známka
spoločnosti Molecular Probes, Inc.
VÝROBCA:
IMMUNOTECH SAS
Francúzsko
Služby zákazníkom: (33) 4 91 17 27 27
Made in France
Všetky práva vyhradené.
REPRODUKOVATEĽNOSŤ
VÝSLEDKOV
V
RÁMCI LABORATÓRIA
V priebehu jedného dňa bolo na tom istom
cytometri vykonaných 12 meraní percenta
farbenia pozitívneho cieľa (RAMOS). Získané
výsledky sú uvedené v nasledovnej tabuľke ako
percento sfarbených buniek pre CD19 a ako
priemerná fluorescenčná intenzita (MFI) pre
nešpecifické konjugované FITC a PE protilátky:
CD19+ (%)
Počet
meraní
12
Priemer
(%)
99,9
0,05
FITC (MFI)
12
0,84
0,01
1,8
PE (MFI)
12
0,12
0,05
1,27
RAMOS
SD
CV
(%)
0,05
25 / 26
A07730 2014-05-12_SK
APPENDIX TO REF A07730
EXAMPLES
REFERENCES
Conjugated Antibodies (Ref. A07730). Lysis and fixation are with
IOTest 3 Lysing Solution (Ref. A07799) and IOTest 3 Fixative Solution
(Ref. A07800) respectively.
Acquisition is performed with a COULTER EPICS XL flow cytometer
equipped with System II software and analysis is with EXPO32 ADC
software.
The 2 histograms below are biparametric representations of a normal
peripheral whole blood specimen.
1.
2.
3.
4.
Stewart, C.C., Stewart, S.J., "Cell preparation for the identification of
leukocytes", 1994, Methods Cell Biol., Chap3, 41, 39-60.
Borowitz, M., Bauer, K.D., Duque, R.E., Horton, A.F., Marti, G.,
Muirhead, K.A., Peiper, S., Rickman, W., "Clinical applications of
flow cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of
lymphocytes; approved guideline", 1998, NCCLS, 21, 18.
“CD Guide “ Compiled by the organizing committee, 1989, Leucocyte
Typing IV, White Cell Differentiation Antigens. W. Knapp, et al., Eds.,
Oxford University Press, 1078.
“Listing of all Fourth Workshop antibodies“, 1989, Leucocyte Typing
IV, White Cell Differentiation Antigens. W. Knapp, et al., Eds., Oxford
University Press, 1094-1110.
Figure 1:
Biparametric representation (Fluorescence Intensity versus Side
Scatter) in order to gate on positive events (i.e. CD19+).
Figure 2:
Biparametric representation (Fluorescence Intensity versus
Fluorescence Intensity) gated on CD19+ events.
26 / 26
A07730 2014-05-12_APPENDIX

table of contents

Transcription

Documents pareils

COULTER® AC•T RINSE™ Shutdown Diluent

Golf V GT GTI

COULTER AC•T 5diff Hgb Lyse

wall stickers - Wizard + Genius

sissel® medi support

Mouse anti-TRAcP, Clone ZY-9C5

GS313 Glass Break Detector Adhesive Kit for Laminated Glass