"Endoscopic Fluorescence Imaging: Spectral Optimization and
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"Endoscopic Fluorescence Imaging: Spectral Optimization and
Résumé Depuis plusieurs décennies, les médecins peuvent accéder aux organes creux avec les méthodes endoscopiques, qui remplissent à la fois la fonction d’outil diagnostique et chirurgical dans nombre de disciplines de la médecine moderne (par ex. en urologie, pneumologie, gastroentérologie). Malheureusement, l’endoscopie conventionnelle en lumière blanche (LB) montre une sensibilité limitée aux lésions cancéreuses précoces. Par conséquent, plusieurs méthodes endoscopiques utilisant l’imagerie de fluorescence ont été développées pour surmonter cette limitation. La fluorescence endogène et exogène-induite a été étudiée, menant à des produits commercialisés. En effet, la bronchoscopie en autofluorescence, et la cystoscopie utilisant la fluorescence des porphyrines sont maintenant sur le marché. Les méthodes de dépistage endoscopiques utilisant la fluorescence montrent une sensibilité très élevée pour les lésions pré-cancéreuses, souvent manquées en LB, mais elles souffrent encore d’une spécificité limitée principalement due au taux élevé de faux-positifs. Bien que la plupart de ces faux-positifs puissent être facilement rejetés en observation LB, il est plus difficile d’identifier des anomalies tissulaires telles que les zone inflammatoires, les hyperplasies et les métaplasies. Cela résulte souvent en des biopsies supplémentaires, péjorant encore la spécificité. Par conséquent, le but de cette thèse est d’étudier une méthode novatrice, rapide et commode pour caractériser in situ les zones positives en fluorescence pendant l’endoscopie et, plus généralement, pour optimiser l’appareillage endoscopique existant. Dans cette thèse, plusieurs évaluations cliniques ont été effectuées soit dans l’arbre trachéo-bronchique, soit dans la vessie. Dans la vessie, l’imagerie de fluorescence pour la détection des tumeurs superficielles de la vessie utilise la production et l’accumulation sélective dans les tissus cancéreux de porphyrines fluorescentes, principalement la protoporphyrine IX (PpIX), après une instillation de R Hexvixpendant une heure. Dans cette thèse, nous avons adapté un cystoscope rigide pour observer la muqueuse vésicale avec la cystoscopie à grossissement élevé (CGE), ceci afin de distinguer les vrais- des faux-positifs détectés par fluorescence. L’optique permettant la CGE peut-être utilisée soit avec lumière blanche, soit en fluorescence, avec un grossissement variant entre 30× – pour l’observation standard – et 650×. Une molette permet l’ajustement continu in situ du grossissement pendant la cystoscopie. Dans le régime élevé de grossissement, le plus petit diamètre du champ visuel est de 600 microns et la résolution est de 2.5 microns, le cystoscope étant dans ce cas précis au contact avec la muqueuse vésicale. Avec ce cystoscope CGE, nous avons caractérisé – avec un éclairement en lumière blanche 370–700 nm – la vascularisation superficielle des zones positives en fluorescence afin de distinguer les tissus cancéreux des noncancéreux. Ce procédé nous a permis d’établir une classification utilisant les motifs vasculaires R ont été inclus dans observés. 72 patients opérés avec la cystoscopie de fluorescence Hexvix l’étude. La comparaison de la classification CGE avec les résultats d’histopathologie a confirmé 32/33 (97%) de biopsies cancéreuses, et a rejeté 17/20 (85%) de lésions non-cancéreuses. Aucun changement vasculaire n’a pu être visualisé sur la seule lésion positive qui était négative CGE, parce que ce carcinome sarcomatoïde trouvait son origine ailleurs que dans l’urothélium. Nous avons montré avec cette étude qu’un grossissement de l’ordre de 80–100× pouvait constituer un bon compromis entre l’endoscopie macroscopique en fluorescence et microscopie en réflectance. Afin de rendre cette approche plus quantitative, des algorithmes de traitement d’images (segmentation, extraction de squelette, extraction de l’information globale) ont été également implémentés dans cette thèse. vi Résumé Afin de mieux visualiser les vaisseaux, nous avons augmenté leur contraste par rapport à l’arrière-plan par des méthodes optiques. Puisque l’hémoglobine est un absorbeur puissant, nous avons visé ses deux pics d’absorption en plaçant deux filtres passe-bande (405±50 nm bleu, 550±50 nm vert) dans la fontaine de lumière. La cystoscopie CGE a été alors exécutée séquentiellement avec l’illumination blanche, bleue et verte. Les deux dernières ont montré un contraste plus élevé des vaisseaux par rapport au fond, mettant en évidence la vascularisation à plusieurs profondeurs grâce à la pénétration différenciée des longeurs d’onde utilisées. Pendant la cystoscopie de fluorescence, nous avons souvent observé que les images sont floutées par un écran bleu-vert entre l’extrémité de l’endoscope et la muqueuse vésicale. Puisque cet effet est augmenté par la production d’urine, il est encore plus marqué avec les endoscopes flexibles (qui disposent d’un rinçage limité) et les imageurs qui utilisent seulement l’autofluorescence comme fond. En effet, quand la vessie n’est pas rinsée régulièrement, on observe facilement observer des écoulements bleu-vert sortant des uretères. Pour cette raison, on a supposé que quelques fluorophores contenus dans l’urine sont excités par la lumière d’excitation, et apparaissent bleu-vert à l’écran. Cet effet peut altérer la visualisation de la muqueuse vésicale et les lésions cancéreuses. Par conséquent, la sensibilité de la cystoscopie de fluorescence est diminuée. Dans cette thèse, nous avons identifié les principaux produits responsables de la fluorescence du liquide, et avons optimisé la conception spectrale en conséquence. Dans l’arbre trachéo-bronchique, le contraste de fluorescence utilise la forte diminution d’autofluorescence (AF) de la bande spectrale verte (environ 500 nm) sur les lésions cancéreuses précoces et une diminution relative moins importante de la bande spectrale rouge (> 600 nm), lorsque la muqueuse bronchique est excitée avec de la lumière bleu violet (environ 410 nm). Il a été montré au cours des dernières années que ce contraste peut être attribué à un effet combiné de l’épithélium épaissi et à une concentration plus élevée d’hémoglobine dans le tissu sous-jacent des lésions cancéreuses précoces. Dans cette thèse, nous avons contribué à la conception de plusieurs nouveaux prototypes, qui ont été plus tard évalués en clinique. En premier lieu, nous avons prouvé que l’excitation à bande étroite dans le bleu-violet pourrait augmenter le contraste tumeur-tissu sain dans la bande spectrale verte. Puis, nous avons mesuré les variations en intensité d’AF intra- et inter-patients afin d’optimiser la réponse spectrale de l’imageur endoscopique. A cette fin, nous avons développé une référence endoscopique à placer près de la muqueuse bronchique pendant la bronchoscopie. Finalement, nous avons évalué sur 144 patients un bronchoscope AF nouvellement équipé avec la lumière bleu-rétrodiffusée. Ce nouveau dispositif a montré une sensibilité augmentée pour les lésions pré-néoplasiques. A l’instar de ce que nous avons observé dans la vessie, il est probable que les nouveaux développements en imagerie (y compris l’imagerie vasculaire) facilitent la distinction des vrais et faux-positifs dans la bronchoscopie en AF. Dans cette étude, nous avons montré que le grossissement permettait de résoudre des vaisseaux d’un diamètre d’environ 30 microns. Cette résolution est probablement suffisante pour identifier les critères vasculaires de Shibuya (boucles, mailles, vaisseaux pointillés) sur les lésions positives en AF. Ces critères lui permettent d’identifier les lésions précancéreuses, et potentiellement permettrait d’abaisser le taux de faux-positifs avec notre imageur AF. Ce grossissement a également amélioré la bronchoscopie de routine, puisqu’il fournit des images plus structurées à l’opérateur. Mots-clés: tumeurs superficielles de la vessie, cystoscopie de fluorescence, endoscopie à grossisseR CysviewTM , hexylester d’acide aminolévulinique, motifs ment, imagerie vasculaire, Hexvix, vasculaires, angiogenèse, cancer bronchique, autofluorescence, imagerie et spectroscopie de fluorescence, phantomes optiques, évaluation clinique. Abstract Since several decades, the physicians are able to access hollow organs with endoscopic methods, which serve both as diagnostic and surgical means in a wide range of disciplines of the modern medicine (e.g. urology, pneumology, gastroenterology). Unfortunately, white light (WL) endoscopy displays a limited sensitivity to early pre-cancerous lesions. Hence, several endoscopic methods based on fluorescence imaging have been developed to overcome this limitation. Both endogenous and exogenously-induced fluorescence have been investigated, leading to commercial products. Indeed, autofluorescence bronchoscopy, as well as porphyrin-based fluorescence cystoscopy, are now on the market. As a matter of fact, fluorescence-based endoscopic detection methods show very high sensitivity to pre-cancerous lesions, which are often overlooked in WL endoscopy, but they still lack specificity mainly due to the high false-positive rate. Although most of these false positives can easily be rejected under WL observation, tissue abnormalities such as inflammations, hyperplasia, and metaplasia are more difficult to identify, often resulting in supplementary biopsies. Therefore, the purpose of this thesis is to study novel, fast, and convenient method to characterize fluorescence positive spots in situ during fluorescence endoscopy and, more generally, to optimize the existing endoscopic setup. In this thesis, several clinical evaluations were conducted either in the tracheo-bronchial tree and the urinary bladder. In the urinary bladder, fluorescence imaging for detection of non-muscle invasive bladder cancer is based on the selective production and accumulation of fluorescing porphyrins, mainly R during one hour. protoporphyrin IX (PpIX), in cancerous tissues after the instillation of Hexvix In this thesis, we adapted a rigid cystoscope to perform high magnification (HM) cystoscopy in order to discriminate false from true fluorescence positive findings. Both white light and fluorescence modes are possible with the magnification cystoscope, allowing observation of the bladder wall with magnification ranging between 30× – for standard observation – and 650×. The optical zooming setup allows adjusting the magnification continuously in situ. In the high magnification regime, the smallest diameter of the field of view is 600 microns and the resolution is 2.5 microns, when in contact with the bladder wall. With this HM cystoscope, we characterized the superficial vascularization of the fluorescing sites in WL (370–700 nm) reflectance imaging in order to discriminate cancerous from non-cancerous tissues. This procedure allowed us to R establish a classification based on observed vascular patterns. 72 patients subject to Hexvix fluorescence cystoscopy were included in the study. Comparison of HM cystoscopy classification with histopathology results confirmed 32/33 (97%) cancerous biopsies, and rejected 17/20 (85%) non-cancerous lesions. No vascular alteration could be observed on the only positive lesion that was negative in HM mode, probably because this sarcomatoid carcinoma was not originating in the bladder mucosa. We established with this study that a magnification ranging between 80× and 100× is an optimal tradeoff to perform both macroscopic PDD and HM reflectance imaging. In order to make this approach more quantitative, different algorithms of image processing (vessel segmentation and skeletonisation, global information extraction) were also implemented in this thesis. In order to better visualize the vessels, we improved their contrast with respect to the background. Since hemoglobin is a very strong absorber, we targeted the two hemoglobin absorption peaks by placing appropriate bandpass filters (blue 405±50 nm, green 550±50 nm) in the light source. HM cystoscopy was then performed sequentially with WL, blue and green illumination. The two latter showed higher vessel-to-background contrast, identifying different layers of vascularization due to the light penetration depth. viii Abstract During fluorescence cystoscopy, we often observed that the images are somehow “blurred” by a greenish screen between endoscope tip and bladder mucosa. Since this effect is enhanced by the urine production, it is more visible with flexible scopes (lower flushing capabilities) and imaging systems that collect only autofluorescence as background. Indeed, when the bladder is not flushed regularly, greenish flows coming out of the ureters can easily be observed. For this reason, it is supposed that some fluorophores contained in the urine are excited by the photodetection excitation light, and appear greenish on the screen. This effect may impair the visualization of the bladder mucosa, and thus cancerous lesions, and lowers sensitivity of the fluorescence cystoscopy. In this thesis, we identified the main metabolites responsible for the liquid fluorescence, and optimized the spectral design accordingly. In the tracheo-bronchial tree, the fluorescence contrast is based on the sharp autofluorescence (AF) decrease on early cancerous lesions in the green spectral region (around 500 nm) and a relatively less important decrease in the red spectral region (> 600 nm) when excited with blueviolet light (around 410 nm). It has been shown over the last years, that this contrast may be attributed to a combined effect of epithelium thickening and higher concentration of hemoglobin in the tissues underneath the (pre-)cancerous lesions. In this thesis, we contributed to the definition of the input design of several new prototypes, that were subsequently tested in the clinical environment. We first showed that narrow-band excitation in the blue-violet could increase the tumor-to-normal spectral contrast in the green spectral region. Then, we quantified the intra- and inter-patient variations in the AF intensities in order to optimize the spectral response of the endoscopic fluorescence imaging system. For this purpose, we developed an endoscopic reference to be placed close to the bronchial mucosa during bronchoscopy. Finally, we evaluated a novel AF bronchoscope with blue-backscattered light on 144 patients. This new device showed increased sensitivity for pre-neoplastic lesions. Similar to what we observed in the bladder, it is likely that developing new imaging capabilities (including vascular imaging) will facilitate discriminating true from false positive in AF bronchoscopy. Here, we demonstrated that this magnification allowed us to resolve vessels with a diameter of about 30 µm. This resolution is likely to be sufficient to identify Shibuya’s vascular criteria (loops, meshes, dotted vessels) on AF positive lesions. This criteria allow him to recognize pre-cancerous lesions, and thus can potentially decrease the false-positive rate with our AF imaging system. This magnification was also showed to be better for routine bronchoscopy, since it delivers sharper and more structured images to the operator. Keywords: bladder cancer, fluorescence cystoscopy, high magnification, vascular imaging, R CysviewTM , hexaminolevulinate, vessel patterns, angiogenesis, bronchial cancer, autHexvix, ofluorescence, bronchoscopy, fluorescence imaging and spectroscopy, optical phantoms, clinical evaluation.